JPH07506495A

JPH07506495A - 可溶性ｔ受容体のサブユニットの共トランスフェクションによる産生，得られた生成物の用途

Info

Publication number: JPH07506495A
Application number: JP6512850A
Authority: JP
Inventors: ボンヌビル，マルク
Original assignee: アンスティテュ　ナシオナル　ドゥ　ラ　サントゥ　エ　ドゥ　ラ　ルシェルシェ　メディカル　（イーエヌエスエーエールエム）; イミュノテク
Priority date: 1992-11-25
Filing date: 1993-11-25
Publication date: 1995-07-20
Also published as: EP0624201A1; US5723309A; AU5566894A; FR2698880A1; FR2698880B1; WO1994012648A3; WO1994012648A2; CA2128705A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】可溶性Ｔ受容体のサブユニットの共トランスフェクションによる産生、得られた生成物の用途本発明は可溶性Ｔ受容体に関し、さらに詳しくは分泌形の可溶性Ｔ受容体（ｓＴＲ）（ＤＶａＣａ／ＶＢＣＢ、ＶｒＣｒ／Ｖ６Ｃ６＊ｔ：はＶαＣδ／ＶβＣγ 、およびこれらの診断用および治療用の用途に関する。

１９２８球は、高度に特異的な方式で莫大な数の抗原（Ａｇ）を認識することができる。このことは免疫グロブリン（Ｉｇ）のスーパーファミリーに属する極めて多様な表面構造のＴ受容体（ＴＲ）に基づいている。

ヒトおよびマウスでは、成熟体の１９２８球は大部分のものが、αおよびβと呼ばれる二つの可変糖タンパク質サブユニットで構成されているｓＴＲを発現する。これらのサブユニットは、Ｉｇの重鎮と軽鎖と同様に、アミノ末端の可変（Ｖ）領域とカルボキシ末端の定常（Ｃ）領域を含有し、その上、ごく一般的に、連鎖間のジスルフィド架橋によって互いに共有結合している。αβＴ受容体が認識する抗原の性質は比較的よく確認されている。すなわちこれらの抗原は、いわゆるクラスＩもしくは■の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＭＣ）に属する多形性遺伝子の産物と密接に連結したオリゴペプチド抗原（内因性または外因性タンパク質の細胞内分解によって誘導される）で形成された複合体である。αβＴ受容体とＭＢＣ／Ａｇ複合体間の相互作用は、通常いわゆる共受容体（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）すなわち補助分子（ＣＤ４およびＣＤ８）によって強化され、これらの分子はクラス■と■のＭＨＣ分子それぞれの保存部分を認識する。

上記のＴ受容体をコードする遺伝子（γとδ）の性質によって識別することができる１９２８球の別の副集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）がごく最近報告されている。６８１９２８球とは異なり、γδＴ細胞の抗原特異性は依然として明らかになっていない。Ｔ受容体のαβ連鎖とγδβ連鎖一次配列が比較的相同性であることに基づいて、何人かのαが、これらの受容体に対するリガンドの構造が類似していると予想した。この仮説に合致して、７６１９２８球のクラクションが、６８１９２８球が通常認識するＭＨＣの産物に構造が類似もしくは同一の分子に対して特異的であることが見出された。しかし、一層遠隔構造の分子例えばストレスタンパク質またはＣＤ４８のようなある種の活性化分子を上記のＴ副集団が認識するいくつかの例がある。

本発明の発明者らはγδＴ受容体の“可溶性”　（分泌）形の生成を探究した。

これら受容体は、（１ｇ類と同様に）特異的なリガンドの単離、局在化および精製を可能にするプローブとして使用できるであろう。

さらにこれらの可溶性Ｔ受容体には多数の臨床用途がある。

Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（ｒｗｕｎｏｌ、　Ｔｏｄａｙ、　１０巻、２９頁、　１９８９年）は可溶性Ｔ受容体を製造する試みを報告している。すなわち、７Ｍ領域をコードする配列の上流に翻訳終止コドンを導入することによってα連鎖またはβ連鎖のトランスメンプラン（ＴＭ）部分を除くことからなる方法であるが、不成功に終り、分泌は全く検出されなかった。

これらの初期の失敗に続いて、他の方法が採用された。はとんどの場合、その原理は、免疫グロブリンのＣ領域またはグリコジルホスファチジルイノシトール（ＧＰｒ）タイプのアンカーに結合された、αおよびβのサブユニットのＶ領域またはＶとＣ領域で構成されているキメラタンパク質を構築することである。ＴＲ／Ｉｇ融合タンパク質の場合、主な問題点は、モノマーもしくはホモニ量体型が時に顕著に分泌されることであることが分かった。さらにαβδＴＲのへテロニ量体型が時々、メンプラン型に対して著しい構造上の差異を示し、その場合特に αとβの２連鎖はごく一般的に非共有結合で結合していた。このことは、その結果、これらキメラ分子の全構造と、すぐれた抗原特異性に影響を与えることがあった。“脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）“Ｔ受容体（ＧＰ　Ｉ配列によってメンプランに固定化されたＴ受容体）の場合、時には非常に高い比率の共有結合αβ ヘテロ二量体が得られることがあった。しかしこの方法の主な欠点は、Ｔ受容体を培地中に放出させるため酵素処理（ホスホリパーゼＣによる処理）を行う必要があり、それ故多大の費用がかかりかつ低収率の製造法であることである。Ｖα 領域をＶβ領域に、ペプチド架橋を通じて結合することからなるいわゆるモノ連鎖Ｔ受容体の製造方法がごく最近提案された。しかしこの方法を利用するには細心の注意を要することが分かった。特に、これらのモノ連ｌＩＴ受容体をハイドソリュブル（ｈｙｄｒｏｓｏｌｕｂｌｅ）にするために、未変性のタンパク質の通常はマスクされているＶ領域のある種の疎水性領域中に多数の突然変異が導入されると考えられる。

文献に記載されている可溶型のＴ受容体産生の例はすべて、ハイブリッド型のすべての場合に、一つの連鎖の組合わせ（ｃｈａｉｎｃｏｍｂｉｎａｔ　１ｏｎ）から別の連鎖組合わせにすると効率が極端に変動することを示している。

本発明の発明者らは、トランスメンプラン部分を欠失させた成分のＴ受容体サブユニットの各々をコードするＤＮＡ分子を製造し、次いでこれらのＤＮＡを宿主細胞中に共トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）することからなる方法によって、可溶性Ｔ受容体を、使用される連鎖の組合わせにかかわらず高収率で容易に得ることができることを発見したのである。

また本発明の課題は、Ｔ受容体のトランスメンブラン部分を欠失させた成分のＴ受容体サブユニットの各々をコードするＤＮＡ配列を宿主細胞中に共トランスフェクトする、可溶性Ｔ受容体の製造方法である。

本発明によれば、Ｔαβ受容体のトランスメンブラン部分を欠失させたＴαβ受容体のαとβのサブユニットをコードするＤＮＡ配列を、宿主細胞中に共トランスフェクトすることによって、ＶαＣα／ＶβＣβ可溶性Ｔ受容体が産生される。

また、Ｔγδ受容体のトランスメンブラン部分を欠失させたＴγδ受容体のγと δのサブユニットをコードするＤＮＡ配列を、宿主細胞中に共トラン不フエクトすることによって、ＶγＣγ／Ｖ６Ｃδ可溶性Ｔ受容体が産生される。

さらに、ＶαＣγ／ＶβＣδおよびＶαＣδ／ＶβＣγヘテロニ量体の可溶性Ｔ受容体は、トランスメンブラン部分を欠失させたＴγδ受容体のγとδのサブユニットのＣγとＣδ領領域コードするＤＮＡ配列をそれぞれ、ＶαＣγ／ＶβＣ δ受容体を得るためＴαβ受容体のαとβのサブユニットのＶαとＶβ領域をコードするＤＮＡ配列に融合するか、またはＶαＣδ／ＶβＣγ受容体を得るためＴαβ受容体のβとαのサブユニットのＶβとＶαの領域をコードするＤＮＡ配列に融合して、その融合ＤＮＡ配列を宿主細胞に共トランスフェクトすることによって、成分サブユニットを共有結合で結合して産生される。

またＶγＣγ／ＶαＣδハイブリッド可溶性Ｔ受容体は、トランードするＤＮＡ配列を、Ｔαβ受容体のαサブユニットのＶα領域をコードするＤＮＡ配列に融合したδサブユニットのＣδ領領域コードするＤＮＡ配列とともに、宿主細胞に共トランスフェクトすることによって産生される。この構築法は、特に、ある種のＶα遺伝子がαβクローンまたはγδクローンによって使用できる点によって特に有利である。

Ｖδ２とＶγ９遺伝子のＤＮＡ配列は、本発明の可溶性Ｔ受容体を構築するため、可変部分に用いるのに有利である。

しかし、一方でＶγ９　ＤＮＡ配列を用い、およびＶγＣγ／ＶαＣδハイブリッド受容体の構築について先に述べたのと同じ理由のために、Ｖδ２　ＤＮＡ配列を他のＶδＤＮＡ配列と置換することによってＶγＣγ／ＶδＣδ受容体を産生ずる利点がある。この構築によって、抗α抗体、またはＶδ２とは異なったＶ δに対する抗体を得ることができる。

逆に、Ｖδ２　ＤＮＡを保存し、Ｖγ９　ＤＮＡ配列を他のＶγＤＮＡ配列で置換して、抗−Ｖγ抗体を得ることができる。

また本発明には、ＶγＣγ／■δＣδの可溶性Ｔ受容体のこれらの実施態様が含まれる。

いくつかのＶδ上セグメント特にＶδ１）は、Ｔ受容体のαもしくはδの連鎖によって等しく使用できるという意味でＶαとみなすことができることに留意すべきである。したがって、本発明で提供される可溶型で産生される受容体の実施例は、γとδのみならずαの可変領域に対するモノクローナル抗体を精製する枠組み内でのプロセスの有用性を特に例証すると考えられる。

成分下受容体サブユニットのトランスメンブラン部分の欠失は、特に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による突然変異誘発によって、上記のサブユニットのトランスメンブラン部分をコードする配列の上流に翻訳終止コドンを導入することによって実施することが有利である。

上記のＤＮＡ配列はゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡの配列である。

共トランスフェクションは、真核細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）中に実施することが好ましい。

また本発明の課題は、可溶性Ｔ受容体とペプチド配列との間で形成される融合タンパク質である。そしてそのペプチド配列は一つのペプチドもしくはタンパク質で構成され、またその融合タンパク質は、上記のペプチドもしくはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、そのトランスメンブラン部分を欠失させたＴ受容体のサブユニットをコードするＤＮＡの連鎖のうちの一つもしくは二つの連鎖に融合させ、次いでこのように融合されたＤＮＡ配列を宿主細胞中に共トランスフェクトすることによって得られる。

この場合、上記のペプチド配列としてはインターロイキン−２（ＩＬ−２）の配列が有利である。

また本発明の課題は、本発明の方法で得られる可溶性Ｔ受容体または上記定義の５ＴＲ−ＩＬ２融合融合タンパ音質するヒトもしくは動物のポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体である。

本発明のモノクローナル抗体は通常の方法によって製造することができる。このような趣旨で、可溶性Ｔ受容体は、任意にインターロイキン−２または他のタンパク質と融合させ、必要に応じて、ビスジアゾ化ベンジジンのようなカップリング剤を用いて、破傷風トキソイドのような免疫原性因子にカップリングさせることができる。

また本発明には、本発明のモノクローナル抗体のフラグメントおよび誘導体が含まれる。これらのフラグメントは、特に本発明の抗体分子をペプシンによって酵素分解することによって得ることができるＦ（ａｂ’　）！フラグメント；　Ｆ（ａｂ’　）、フラグメント上のジスルフィド架橋を還元することによって得ることができるＦａｂ’フラグメント：および還元剤の存在下、パパインを用いて本発明の抗体分子を酵素分解することによって得ることができるＰａｂフラグメントである。またこれらのフラグメントならびにＦｃフラグメントは遺伝子工学の方法で得ることもできる。

モノクローナル抗体の誘導体は、例えば、放射能同位元素のようなマーカーが連結されている抗体またはこれら抗体のフラグメントである。またモノクローナル抗体の誘導体は、治療するのに活性な分子が連結されている抗体またはこれら抗体のフラグメントである。

また本発明の課題は、上記ペプチド配列に対して特異的なモノクローナル抗体と産生ずるハイプリドーマである。これらのハイブリドーマは、抗原によって生体外で活性化された牌臓細胞間の細胞融合の通常の方法によって、または本発明のペプチド配列に対して免疫化させた動物および骨髄腫細胞系由来の細胞から得ることができる。

また本発明の課題は、本発明の方法によって得られる可溶性Ｔ受容体、またはｓＴＲペプチド配列特にｓＴＲＩＬ２すなわち上記定義の融合タンパク質、またはあるいは本発明によるモノクローナル抗体からなる診断用組成物である。

本発明の診断用組成物は、Ｔ受容体に連結される細胞特異性の型別（ｔｙｐｉｎｇ）を行うのに使用することができる。実際には、可溶性Ｔ受容体だけで使用できる。しかし可溶性Ｔ受容体はその特異的リガンドに対するアフィニティーが恐らく弱いので、その原子価を増大することによってその結合力を増大するため支持体に可溶性Ｔ受容体をカップリングすることが有利である。

その支持体としては、有機もしくは磁気ビーズのような伝統的に使用されているいずれの支持体でもよい。

このような支持体としては、例えば可溶性Ｔ受容体が免疫グロブリンと同様の方法で結合されるＥＬＩＳＡ試験法に用いられるプラスチックプレート；トシル活性化磁気ビーズ例えばノルウェー、オスローのＤｙｎａ１社が市販しているもの二またはＢＩＯＲＡＤ社が市販しているようなＡＦＦＩＧＥＬタイプの活性化ゲルがある。

そのカップリング法は、従来利用されている方法であり、市販されている支持体の販売者が示している。

これらの方法は、化学的カップリングかまたは問題の可溶性Ｔ受容体に対するモノクローナル抗体による方法であり、可溶性Ｔ受容体はそれ自体、化学的カップリング法によって支持体にカップリングされる。

診断用組成物は、上記の融合タンパク質からなり、その融合タンパク質は、可溶性Ｔ受容体および特異的抗体が利用できる抗原決定基で構成されている。

かような診断組成物は、従来の血清学的方法では検出されない細胞内特異性の型別に使用することができる。

また本発明の診断組成物は、上記のモノクローナル抗体、および好ましくは、本発明によって得られ予め精製された可溶性Ｔ受容体に対して動物を免疫化することによって得られる、Ｔ受容体の連鎖のＶとＣの部分に対するモノクローナル抗体のパネルを含有している。

上記の免疫化のを動性を改善するため、前記定義の５ＴＲ−ＩＬ２融合融合タンパ音質射することもできる。

このような診断組成物は、例えばＴ白血病の際に遭遇するようなモノクローナルもしくはオリゴクローナルの増殖を検出するのに特に使用することができる。

本発明によれば、本発明の診断組成物を生物学的試料、例えば病的な１９２８球を含存する血液試料と接触させ、次いでＴ受容体および可溶性Ｔ受容体に特異的なリガンドで形成された複合体：または可溶性Ｔ受容体および抗原決定基からなる融合タンパク質二または本発明のモノクローナル抗体と可溶性Ｔ受容体によって形成された複合体；または上記モノクローナル抗体が特異的に生成される可溶性Ｔ受容体−ル２融合タンパク質が検出される。

これらの方法は、ＲＩＡ、　ＲＩＰＡまたはＩＲＭＡタイプの放射線免疫法または、帯状体（ｓｔｒｉｐ）上のウェスタンプロット形もしくはＥＬＩＳＡ形の免疫酵素法に基づいている。

これらの検出法を実施するのに、標識なしの非放射能分子、またはビオチンもしくはその誘導体、ペルオキシダーゼのような酵素、フルオレセインのような蛍光マーカー、放射能マーカーなどの適切なマーカーによって標識を付けた分子が用いられる。

これらの生体外での診断法は、例えば下記のステップで構成されている。すなわち一可溶性Ｔ受容体、抗原決定基と融合された可溶性受容体、または可溶性Ｔ受容体に対する本発明のモノクローナル抗体、または本発明の可溶性Ｔ受容体−インターロイキン２融合タンパク質を含有する組成物の所定量を、微量滴定プレートのウェル中またはビーズもしくはニトロセルロースメンプランのような他の支持体上に堆積させ；一ウェル中に被検生物学的試料を堆積させるか、または被検生物学的試料を、飽和剤（ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）の存在下、もしくは活性化支持体を予め飽和させた後にビーズもしくはメンプランとともにインキュベートしニー徹量滴定プレートまたはビーズをインキュベートしすすいだ後、生成した可溶性Ｔ受容体−リガント複合体を明らかにする系を、ウェル中に入れるかまたはビーズとともにインキュベートする；ステップである。

本発明の診断法を実施するのに用いるキットには以下のものが含まれている。

本発明の少なくとも一つの診断組成物；生物学的試料中に存在するリガンド間の複合体を産生ずるのに適切な培地を作製するのに用いる試薬；生成した複合体と反応することができる一つ以上の任意に標識を付けた試薬：である。

また本発明の課題は、本発明の方法によって得た可溶性Ｔ受容体、または上記定義の融合タンパク質特に本発明の５ＴＲ−ＩＬ２を含有しいることを特徴とする治療用組成物である。

かような治療用組成物は、例えばＴ白血病もしくはリンパ腫およびある種の自己免疫疾患のような１９２３球の小クローンの（ｐａｕｃｉｃｌｏｎａｌ）の増殖がみられる病的過程を治療するのに特に有用である。

この組成物は適切な担体中に入れて、注射および投与することが好ましい。

この治療用組成物の投与には二重の目的がある。この組成物は、一方では、抗イデイオタイプ免疫応答を誘発して、この場合これらのイディオタイプを有する細胞が活発にかつ選択的に除かれ、そして他方では競合によって自己免疫増殖の場合の自己由来抗原の認識を阻止することができる。

本発明の治療用組成物は、有利に、上記定義のへテロニ量体の可溶性Ｔ受容体を含有し、この受容体は融合タンパク質によって任意に保持されている。

また本発明の治療用組成物は、本発明のモノクローナル抗体を含有し、この抗体は任意に、治療上活性な分子例えば細胞障害性分子または上記のようなモノクローナル抗体のフラグメントもしくは誘導体にカップリングされている。

このような組成物によって、ある種のＴ白血病で遭遇するモノクローナルもしくはオリゴクローナル細胞を直接除去することができる。

ＴＲγδの場合の可溶性Ｔ受容体の産生について、下記の添付図面を参照して以下に詳細に説明する。

図１は、γとδの遺伝子のアッセンブリーの産物を示す。可溶性Ｔγδ受容体を産生できるｃＤＮＡ　（γＳとδＳのｃＤＮＡ）を増幅するのに使用される５′ および３′のプライマーの配列はそれぞれ、γとδのｃＤＮＡの上側と下側に示しである。終止コドンの位置は太文字で示しである。γとδのｃＤＮＡの３′末端におけるグレー色の部分は疎水性トランスメンプラン（ＴＭ）領域に相当する。

図２は、上記の可溶性Ｔ受容体を構築するのに用いるクローンの可溶性のδとγ の連鎖の対応するヌクレオチド配列とペプチド配列を示す。

図３は、γＳ／δＳでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からパッケージされた培地内のｓＴＲγδをＩＲＭＡ法で検出する試験の結果を示す。

ＳＮは、非関連ｃＤＮＡ　（ｎｏｎ−ｐｅｒｔｉｎｅｎｔ　ｃＤＮＡ）　（Ｃ）または本発明の可溶のγとδのサブユニット（Ｓγδ）のｃＤＮＡでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の培養物由来の上澄み液を示す。

育意な放射線免疫学的シグナルを与えるモノクローナル抗体は太い長方形で示す。

図４は、抗−Ｖ　７７ＯＳ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社、市販）をカップリングさせたアフィニティーカラムから溶出した両分の可溶性ＴＲの活性をＩＲＭＡ試験法（ｓａｎｄｗｉｃｈ法、７Ｂ６／ＴｉＶδ２）によって測定した滴定結果（μｇ／ｍｌで表す）を示す。なおこのカラムには、γδ５Ｆ５−ＣＨＯ細胞の上記培養物由来の上澄み液約５００ｍ１を加えた。

図５は、可溶性ＴＲの活性について陽性の画分の５ＯＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示し、これは抗−Ｖ７９Ｂ６抗体でカップリングしたアフィニティーカラムから溶出した両分をＩＲＭＡ試験法（ｓａｎｄｗｉｅｈ法、７Ｂ６／ＴｉＶδ２）で測定した結果である。

二つの独立の製剤（＃１と＃２）を非還元条件下（左側）と還元条件下（右側）で分析した。ＭＷ＝分子量マーカー。

Ｔ　Ｖ９ＪＰＣ１７／　Ｖ２Ｄ３ＪＩＣδ受容体を発現するγδｓ　Ｇ１１５ヒト白血球クローン（可溶性のδとγの連鎖に対応する該クローンのヌクレオチドとペプチドの配列はそれぞれ図２のＡとＢに示す）を、γδＳ遺伝子の構築と可溶性Ｔ受容体の発現に用いた。

このクローンはいくつもの理由から使用したがその主な理由は下記のとおりである。

一末梢血液のヒト白血球のγδＴ受容体の大部分は、類似のＶ（Ｄ）Ｊ領域を含有しているので、使用された特異的ＴＲの可溶型で得られる構造および機能の結果は、大比率のγδ細胞で発現されたＴＲに容易に適用できる。

−ＣγｉＣδ、Ｖδ９およびＶδ２の領域に対して特異的なモノクローナル抗体は容易に入手可能であるので、可溶性ＴＲ分子の産生と精製を監視するのに使用できる。

一大部分のγδＶδｌ−陽性ヒトＴリンパ球と異なりＧ１１５クロー合し、培地へのその分泌を行った後この架橋によってその分子が高度に安定化される。

−０１１５クローンの抗原特異性はかなりよく知られている。特にこのクローンはバーキットリンパ１！　（Ｄａｄｉと呼ばれている）の細胞を殺し、またマイコバクテリウム・ラベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔυｂｅｒｃｕｌｏｓｊｓ）の水溶性抽出物中に存在する抗原も認識する。

ヒト末梢血液白血球由来のＴγδリンパ球から得たＧ１１５クローンは、８％ヒト血清、２＋ｎＭＬ−グルタミンおよびＩＳＯＢＲＭＰ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｐｒｏｇｒａｍ）　Ｉ１１位のＩＬ２を含有するＲＰＭｌ　１６４０培地中に保持し、０．５μｇ７ｒｎＬのロイコアグルチニン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、フランス）、照射末梢血液白血球、および照射されＥＢＶで形質転換されたリンパ芽細胞によって１〜２週間刺激した。

リン酸塩緩衝食塩溶液で２回洗浄した後、１００ｍＭ　Ｎａ１ｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．５重量％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ１００を含有するトリス−ＨＣｌ緩衝液（８０ｍＭ、　ｐＨ７，５）中で氷上にて５Ｘ１０’の細胞を溶解した。遠心分離した後、上澄み液を収穫し、同容積のフェノールを６５°Ｃにて混合した。そのＲＮＡをフェノール／ＣＨＣｌ、で処理して抽出し、２．５倍容積のエタノールで沈澱させ、１０ｍＭ　トリス／　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　４０μ！中で可溶化した。図１に示すようにｌｙｓ！４７とＱｌｎ１ｆｆ４のコドンに続いて、 γとδの遺伝子の疎水化トランスメンブラン領域の上流に存在する翻訳終止コドン（５０ｐＭの濃度）：４種のｄＮＴＰ　（各々１ｍＭの濃度）：およびマウス乳癌ウィルス逆転写酵素（ＭＭＴＶ）　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、ドイツ）　（２００単位）を含有する３′−リン酸（３’　−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｄ）プライマーによって、最終容積２５μｌにて、全ＲＮＡ　５０μ ｌの逆転写を３７°Ｃにて１時間行った。１３ＩｎＭトリスーＨＣＩ（１）８８．２）、　６６ｍＭ　ＫＣｌ、２μｌを上記の逆転写によって得られた物質に添加し、次いで増幅サイクル（９４°Ｃで１分間、４５°Ｃで１分間、７２°Ｃで１分間）を３０回実施した。増幅させたＤＮＡを低融点アガロースゲルによる電気泳動を実施してから精製し、次いでＳｍａ　Ｉで消化したプラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋（米国、カリフォルニア州、う・ホーヤ所在のＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中にクローン化した。配列決定は、ＵＳＢ　５ｅｑｕｅｎａｓｅキツトのメーカーが提供している方法にしたがい、二本鎖鋳型の系を使用して実施した。得られるフラグメントは、ＲｃｏＲＩで消化した発現ベクターｐＫＣＲ６（Ｍａｔｒｉｓｉａｎら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、、　８３巻、　９４１３頁）中にクローン化した。

上記のプラスミドＤＮＡは、リン酸カルシウム沈澱法（Ｗｉｇｌｅｒら。

Ｃｅ１１．１６巻、７７７頁、　１９７９年）によって８％ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、チミジン、アデノシンおよびデオキシアデノシンで補充した（各々ｌｏμｌ　／ｍｌ）　ＲＰＭＩ　１６４０培地中で培養したＤＨＰＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）陰性ハムスター卵巣細胞ＤＬＩＫＸ−Ｂｌ　ｌ中安定なトランスフェクト体を限界希釈法によってクローン化した。

可溶性ＴＲの検出に泪いられるモノクローナル抗体に、Ｉｏｄｏｇｅｎ法によって１１１７で標識を付けた（　Ｆｒａｋｅｒら、　Ｂｉｏｃｈｅａ＋、　−Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、　８０巻、８４９頁、　１９７８年）。Ｔ受容体は、γとδの連鎖に対して特異的なモノクローナル抗体の対を用いて、サンドイッチ免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）によって検出した。

［ｍｍｕｌｏｎ−１微量滴定プレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社、フランス、マルス）未結合部位を、０．５％のウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝食塩水で、室温下１時間飽和させた。次に被分析試料４０μｌを、標識をつけたＴｉＶδ ２モノクローナル抗体ｌＯμｌと同時に添加した。

３７°Ｃで９０分間インキュベートした後、ウシ血清アルブミンを補充したリン酸緩衝食塩水１００μｌでウェルを４回すすいだ。

捕捉された放射能をγシンチレーションカウンターで測定した。

下記ノセットの抗体すなわち抗−Ｖ７９抗体（Ｙ２Ｏ２，Ｂ３７．７８６）、抗 −Ｃ７抗体（Ｂ　１２１）オよび抗−ｖδ２抗体（ＴｉＶδ２）を用いて、ＩＲＭＡ法によって可溶性ＴＲ７δの分泌を測定した（Ｍｉｏｓｓｅｃら、　Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、　１７１巻、　１１７１頁、　１９８９年）。またＩＬ２に対して特異的なモノクローナル抗体を陰性対照として用いた。

抗体の各種組合わせの場合、トランスフェクトされていないハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）の上澄み液、非関連ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の上澄み液、または端を切り取ったγＳ　ＣＤＮＡもしくは端を切り取ったδｓ　ｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞の上澄み液（図３）について、シグナルは全く観察されなかった。しかし、可溶性γδヘテロニ量体は、Ｖδ２／ＣγもしくはＶδ２／Ｖγ９に対して特異的な抗体の対を用いたとき、可溶性γおよび可溶性 δのアッセンブリー産物（γδＦ５−Ｃ）１０）で共トランスフェクトされたＣＨＯ細胞の上澄み液中に、ＩＲＭＡ　（放射免疫検定法）によって明確に検定された（図３）。このことは、γδＦ５−ＣＨＯ細胞が分泌した可溶性ＴＲ分子はへテロニ量体が支配的であったことを示唆している。

ｂ）可溶性Ｔ受容体の精製：クスＣＡｆｆｉｇｅｌ、米国、カリフォルニア州、リッチセント所在のＢｉｏｒａｄ社）に共存結合させた。

培養物の上澄み液を、４℃にて３０ｍ１／ｈの速度でアフィニティーカラムに加えた。リン酸緩衝食塩水で洗浄した後、捕捉された物質を０．２Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ２，５）で溶離した。溶出した画分はすべて直ちにＩ　Ｍ　Ｎａ、ＨＰ（ｉ４で中和した。

可溶性ＴＲ活性が陽性であることがＩＲＭＡ試験で証明された画分を混合し、蒸留水に対して一夜透析し、次いで蒸発によって濃縮した。

可溶性ＴＲの試料を、ゲル電気泳動用の緩衝液中還元剤ありまたはなしで調製し、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、次にメーカーの指示にしたがってニトロセルロース膜に移した。未結合部位をブロッキング緩衝液（乾燥脱脂乳とＴｗｅｅｎ　２０）で飽和した後、得られたフィンガープリントを一次抗体（ブロッキング緩衝液で１／３の濃度に稀釈されたハイブリドーマ上澄液）の存在下、室温で２時間インキュベートしはジアミノベンジジン（１ｍｇ／ｍｌ）　、ＨｔＯｔおよびＣｏＣ１＊で明らかにした。

代表的な製剤では、アフィニティーで精製したγδＴＲ３，３ｍｇ　（免疫グロブリンについて計算されている１％吸光の係数１．５を用いて計算した）を、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、　１５０ｍＭのＮａＣｌおよび４ｍＭＣａＣ１、を含有する緩衝液１ｍｌ中のビブリオ・コレ１（Ｖｉｂｒｉ。

ｃｈｏｌｅｒａｅ）ノイラミニダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）で、ｐＨ５，５゜３７°Ｃにて１時間処理した。

これらの条件下で、ＩＥＦ３−９　ＰｈａｓｔＧｅｌ媒体（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉａ社）中での等電点電気泳動法によって、消化された試料について対照実験を行って反応が完了したことを推定した。

試料は、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，３で希釈した後、３０、０００回転数のセントリペップ（ｃｅｎｔｒｉｐｅｐ）カラム（Ａｍｉｃｏｎ社）によって濃縮し次いでタンパク質分解を行った。

ノイラミニダーゼで処理したγδ受容体を、１．５ａＩＭの２−メルカプトエタノールおよび１．２５ｍＭ　ＥＤＴＡの存在下、酵素／基質比１１５００でパパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社）で３７℃にて３０分間消化した。この反応はＮ−エチルマレイミドを添加することにより完了させた。

これらの条件は、連鎖間のジスルフィド架橋を完全になくすのに充分であることは非還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析することによって証明された。酵素／基質比が高ければ高い程および／またはインキュベーション時間が長ければ長いほどその後にタンパク質の分解を全く示さない。次にその反応媒体を、Ｚｏｒｂａｘ　ＣＦ−２５０サイズ排除クロマトグラフイーのカラム（Ｄｕｐｏｎｔ−Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）に加えた。

このカラムによって、溶出後、未変性タンパク質の７５ＫＤａと比べて約６５ＫＤａの単一ピークの形態で、パパインとノイラミニダーゼで処理されたＴ受容体を得ることができる。連鎖解離の徴候は全く現われなかった。

上記物質は、セントリペップで濃縮した後、メーカーが推奨するとおりに、エンドグリコシダーゼＦとＮ−グリコシダーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社）の存在下、非変性条件下（０，１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，３）で３７℃にて一部インキユベートした。最終的な精製は、Ｍｏｎｏ　Ｑ高性能アニオン交換クロマトグラフィー〇カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）によって実施した。

アフィニティー精製Ｔ受容体３．３ｍｇからの全収量は１．１ｍｇですなわち約３４％の収率であった。

抗−Ｖ７９カラムから溶出された物質は、Ｖδ２に対して特異的なモノクローナル抗体で沈澱させたので特にγδヘテロニ量体で構成されていた。その上、還元性および非還元性の条件下での５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析によって、これらのへテロニ量体が共育結合で結合していることが分かった。

実際に、非還元性条件下で、見掛けの分子量が７５〜８０ＫＤの拡散主バンドが観察されたが、このバンドは還元性条件下で、４２ＫＤと４４ＫＤの二つの支配的な成分と、５０ＫＤと３９ＫＤの二つの非支配的な成分に分離した。同じパターンが、抗−Ｖγ９モノクローナル抗体と抗−Ｖδ２モノクローナル抗体によって段階的に沈澱させた物質によって得られた。この可溶性受容体に対して生成したモノクローナル抗体（モノクローナル抗体３６０と３８９、以下参照）によって、５０ＫＤと４４ＫＤのバンドがγ連鎖に相当し、かつ４２ＫＤと３９にＤのバンドが６連鎖に相当することが、ウェスタンプロット法で示すことができた。

可溶性のγとδの種の大きさの差は、以下に説明するように、Ｎ−グリコジル化度が異なっているためであった。

ａ）マウスを可溶性γδＴＲに対して免疫化した後の、可溶型γδＴＲに対するモノクローナル抗体の生成：ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、下記の方法にしたがって可溶性γδＴ受容体で免疫化した。０．９％ＮａＣ１溶液中に５０％の濃度で乳化させた完全フロインドアジュバント５００μ！中のタンパク質５０μｇを、１日目に四つの異なる場所に皮下注射した。２５日目に同じ方法を不完全フロインドアジュバントで繰り返した。０．９％ＮａＣ１２５０μｌ中各タンパク質１５μ ｇによって、５０日目、５１日目および５２日目に合計３回腹腔内注射を行うことによってブースター（追加抗原刺激）を行った。

にしたがい、ヨウ未標識可溶性Ｔ受容体を用いて、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）でスクリーニングした。

このような趣旨で、アビジン（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社）でコートした９６ウエルの微量滴定プレートを、ＰＢＳ、　ＢＳＡ、　ＮａＮ５中でビオチニル化抗マウスセギ免疫グロブリン（ＣＡＭＩＧ、　Ｉａｕｎｕｎｏｔｅｃｈ社）とともに４℃で一部インキユベートし、次いでＴｗｅｅｎ　ＰＢＳ中で３回洗浄した。放射能標識を付けた可溶性Ｔ受容体１００μｌ　（１０’ｃｐｍ）を室温で２時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。捕捉された放射能標識可溶性Ｔ受容体をγ計数によって検定した。

ヒトγδＴリンパ球をすべてもしくは一部認識する９個のモノクローナル抗体を免疫化マウス牌臓から得た。すなわち２個の抗−Ｖγ９抗体（２９２と３６０）、２個の抗−ｖδ２抗体（ｌおよび３８９）、１個のγδパン抗体（ｐａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）　（ＳＩＯ）およびγδ副集団に対する４個の抗体（４９，６０，１０３および５１５）である。

ｂ）抗−可溶性ＴＲモノクローナル抗体の、モノクローナルおよびポリクローナルのヒトリンパ系に対する反応性：ＲＩＡシグナルを産生じたモノクローナル抗体を、次に、免疫蛍光法で試験して、Ｇ９クローンのメンプランに結合したＴ受容体を認識する該抗体の性能を測定した。これらのモノクローナル抗体の優れた特異性を、そのＴ受容体の表現型が分かつている１９２３球のクローンとＴリンパ球系に対する反応性をスクリーニングすることによって最終的に試験した。

単一融合実験から、１６個のコロニー（接種されたウェルの３％）の上澄み液が陽性のＲＩＡシグナルを示した。そしてこれらコロニー中の１１個が、間接的免疫蛍光検定法で、Ｇ９クローンを認識するモノクローナル抗体を含有していた。

７個のモノクローナル抗体の特異性を流動細胞計測分析法で測定した。

三種のモノクローナル抗体（５２，１０６及び５１０）が、すべてのＴγδ受容体に共通しているがＴαβ受容体には共通していない決定基に対して生成した。

二つのモノクローナル抗体（２９２と３６０）はＶγ９領域を含有するＴ受容体に対して特異的であり、および二つのモノクローナル抗体（ｌと３８９）はγδ ２領域を含有するＴ受容体に対して特異的であった。明確な特異性は、残りのモノクローナル抗体（４９゜６０、１０３および５１５）にはなかった。そしてこれらの抗体は、γδリンパ球の副集団を認識するが、その反応性はＴ受容体の特定のＶ領域の存在とは相関関係がなかった（表■）。

これらのモノクローナル抗体はすべて、天然のＴ受容体（メンプランに連結されている）に対して生成した大部分のＶ特異的モノクローナル抗体と異なり、還元されていない可溶性Ｔ受容体をウェスタンプロット分析において認識することができ、かつまたいくつかは還元後単離されたγもしくはδの種と反応する（表■ ）ことに留意しなければならない。流動細胞計測実験から演桿した特異性の特質と一致して、モノクローナル抗体３８９と３６０はそれぞれ、各種の種（分子量が３９〜４２ＫＤａと４４〜５０ＫＤａの種）を認識したが、これらの種はそれぞれδとγ連鎖に相当している。その上に、γδ５２モノクローナル抗体と５１０パンモノクローナル抗体、およびＶδ２に対して特異的な抗体３８９は、３９〜４２ＫＤａの同じ種と反応しているから、このことはモノクローナル抗体５２と５１０がＣδ領領域対する抗体であることを示している（表Ｉ）。

鼾抗体−５ＴＲモノクローナル抗体によるＴγδのクローンの循環血球測定分析。

Ｔリンパ球クローンの表現型を、Ｔｉγα（抗−Ｖγ９）、ＴｉＶδ２およびＡｌ３（抗−Ｖ６１）抗体によりラベルすることによって決定した；ＮＲ（実施されなかった）。

表■ 抗−５ＴＲ抗体による可溶性Ｔ受容体のウェスターンプロット分析の結果。

個々の抗体により認識される種の見掛分子質量（ＫＤａ）（”　ＮＲ＝反応性なし、Ｒ＝反応性）他のγδ可溶性受容体を、発現ベクターｐＫＣＲ６の複数のクローニング部位の変性の後、下記のようにして調製した。

ａ）発現ベクターｐＫＣＲ６の複数のクローニング部位の変性真核システムの発現ベクターｐＫＣＲ６における可溶性γ及びδ鎖をコードする相補的ＤＮＡの配向された組込みを促進し、そして可能にするために、ベクターｐＫＣＳＲαのＸｂａ　ＩとＳａｌ　１部位との間に前もってクローン化された、ＤＮＡフラグメントを、このベクターのＫｐｎ１部位間に導入した。

このようにして変性されたベクター９ＫＣＲ６のＸｂａ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉ酵素の消化は、それらの２つの部位を生成し、そして配向されたクローニングを可能にし、ここでＸｈｏ　Ｉ部位はクローニング部位の５′端と３′端のＸｈａ　Ｉ部位との間に位置する。

ｂ）可溶性Ｖγ８鎖をコードする相補的ＤＮＡの生成りｌ）可溶性Ｖγ８のＰＣＲクローニングこのクローニングのために使用されるＲＮＡを、Ｔγδクローンから得る。

第１相補的ＤＮＡ　１の合成のために使用されるオリゴヌクレオチドブライマーは次の通りである。

５’　ＧＧＧ　ＴＴＡ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＴＡＧ　ＴＧＴ　ＡＴＣ３’ このｃＤＮＡの増幅を、アンチセンスプライマーとして及び翻訳開始コドンの上流にＸｈｏ　Ｉ制限酵素のための部位を含むセンスプライマーとして上記オリゴヌクレオチドにより行なった。このオリゴクレオチドの配列は次の通りである：５’　ＣＣＣＴＣＧ　ＡＧＡ　ＴＧＣＴＧＴ　ＴＧＧ　ＣＴＣＴＡＧ　ＣＴＣ３ ’この増幅の最後に得られるＤＮＡフラグメントを、Ｓｍａ　Ｉ制限酵素により開かれたベクターｐＢＳ−３Ｋ中にクローン化し、そして配列決定した。得られた配列は、文献（Ｃｅ１１．（１９８６）　４５　：　２３７〜２４６　）に記載される配列に一致しているが、但し、Ｊγ１セグメントを包含する連結配列を除く：Ｎ　Ｊ７１ＴＧＴ　ＧＣＣＡＣＣ￥！　ＧＡＣＡＧＴ　ＣＡＴ　ＴＡＴ　ＴＡＴ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＣＴＣＴＴＴｂ２）発現ベクター中への組込み及び真核細胞中へのトランスフェクション可溶性Ｖγ８ｆｆｌをコードするｃＤＮＡフラグメントを、制限酵素Ｘｈ。

Ｉ及びＸｂａ　Ｉによる消化後、ベクターｐＢＳ−３Ｋから抽出し、そして同じ酵素により消化されたａ）に記載される変性された発現ベクターｐＫＣＲ６中に組込んだ。

このようにして得られたベクターを、可溶性Ｖδ２鎖をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターと共に共ト、ランスフエクトした。

生成りローンのトランスフェクション、スクリーニングのための方法及び生成された可溶性ＴＣＲの精製方法は、可溶性■γ９Ｖδ２ＴＣＲの生成のための上記方法に類似する。

Ｃ）可溶性Ｖδ３鎖をコードする相補的ＤＮＡの生成ｃｌ）可溶性Ｖδ３鎖のＰＣＲクローニングこのクローニングのために使用されるＲＮＡをＴγδクローンから得る。

第１相補的ＤＮＡ　ｌの合成のために使用されるヌクレオチドブライマーは次の通りである：５’　ＧＧＧ　ＴＴＡ　ＣＴＴ　ＣＴＣＧＧＴ　ＡＴＧ　ＡＡＣＴＡＴ　ＧＧＣ３’このｃＤＮＡの増幅を、アンチセンスプライマーとして及び翻訳開始コドンの上流にＸｌ＋ｏ　Ｉ制限酵素のための部位を含むセンスプライマーとして上記オリゴヌクレオチドにより行なった。このオリゴヌクレオチドの配列は次の通りである：５　’　ＧＡＣＴＣＧ　ＡＧＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＴＡＣＴＧＴ　ＧＧＧ　３　’この増幅の最後に得られるＤＮＡフラグメントを、Ｓｍａ　Ｉ制限酵素により開かれたベクターｐｕｓ−ＳＫ中にクローン化し、そして配列決定した。得られた配列は、文献（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、（１９８９）　１６９　：　３９３〜４０５〕に記載される配列に一致しているが、但し、Ｄδ２．　Ｄδ３及びＪδｌセグメントを包含する連結配列を除く：ｃ２）発現ベクター中への組込み及び真核細胞中へのトランスフェクション可溶性Ｖδ３鎖をコードするｃＤＮＡフラグメントを、制限酵素Ｘｈ。

工及びＸｂａ　Ｉによる消化後、ベクター１）ＢＳ−３Ｋから抽出し、そして同じ酵素により消化されたａ）に記載される変性された発現ベクターｐＫＣＲＧ中に組込んだ。

このようにして得られたベクターを、可溶性Ｖγ９鎖をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターと共に共トランスフェクトした。

生成りローンのトランスフェクション、スクリーニングのための方法及び生成された可溶性ＴＣＨの精製方法は、可溶性ＴＣＲＶγ９Ｖγ２の生成のための上記方法に類似する。

ｄ）可溶性Ｖδｌ鎖をコードする相補的ＤＮＡの生成、Ｓａｌ　ｉ及びＢａｍ）ＩＩ制限部位間のベクターｐＢＳ−ＳＫ中にクローン化された全体のＶδＩ　Ｃ δ鎖に相補的なりＮＡを用いた。

このフラグメントを完全に配列決定し、そして文献（Ｂｕｒ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８９）　１９　：　１５４５〜１５４９）に記載される配列に比較して変動を示さないが、但し、Ｄδ２及びＪ６１セグメントを包含する連結配列は例外である二ＶδＩＤ６２ＮＴＧＴ　ＧＣＴ　ＣＴＴ　ＧＧＧ　ＧＡＣＴＴＣＣＴＡ　ＡＡＧ　ＧＧＴ　ＴＣＡ　ＧＧＴ　ＡＣＣＡＣＣＴＡＴｅ）発現ベクター中への組込み及び真核細胞中へのトランスフェクションＶ６１　Ｃ６ｃＤＮＡを含むヘク９　９ＢＳ−ＳＫ（ＤＸｈｏ　Ｉ及ヒＥｃｏＲＩ制限酵素による消化は、連結領域とユニークＥｃｏＲＩ部位との間に全可変部ＶδＩＤδ２　Ｊδ１及び不変部Ｃδの第１エキソンの部分をコードするＤＮＡフラグメントを生成する。

このＤＮＡフラグメントを、　Ｘｈｏ　Ｉ及びＥｃｏＲＩ制限酵素により消化した後、精製し、そして可溶性Ｖδ３鎖を含む発現ベクターｐＫＣＲｅ中に組込んだ。従って、この方法は、可変部Ｖδ１による可変部Ｖδ３の置換を及び従って、可溶性Ｖδ１鎖をコードするｃＤＮＡの構成を可能にした。

トランスフェクション、生成りローンのスクリーニング及び生成された可溶性ＴＣＲの精製のための方法は、可溶性ＴＣＲＶγ９　ｖδ２の生成のために記載される方法に類似する。

２、他の可溶性Ｔγδ受容体の検出及び精製ａ）種々の可溶性受容体の検出、特異性の制御上記と同じ態様で、２種のＩＲＭＡを、相抗体として抗体５１０及びトレーサーとして抗体３６０及び３８９を用いて生成した。これらの２種（７）ＩＲＭＡを、遺伝子Ｖ７９／Ｖ６ｊ２．Ｖ７９／Ｖδ３．Ｖｙ８／Ｖδ２によりトランスフェクトされたＣＩＯの上清液に対して試験した。

トランスフェクトされたＶに対応するトレーサーのみがシグナルを付与し、従って特異性の良好な制御を提供する。

ｂ）精製の一般的方法の開発Ｖγ９ｖδ２受容体を単離するためのこれまで記載された精製は、抗−Ｖγ９抗体（Ｙ２Ｏ２又は７８６）による免疫精製から成っていた。同じタイプではあるが、しかし上記に記載され、そしてゾルタネ変鎖の決定基を認識する抗体５１０を用いてのアフィニティーカラムを用いた。この新しい精製の利点は、それらが含むγ、δ及びα、β可変鎖さえも関係なく本発明のいづれかの可溶性受容体の精製の可能性である。この方法はまず第１に、Ｖγ９／Ｖδ３を含む可溶性受容体を精製するために試験された。

されたセファロース４Ｂビーズ（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ、　Ｕｐｓａｌｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）のマド、リックスＩｇに共有結合した。

トランスフェクシントγ９δ３の培養物からの上溝液を、このようにして形成されたアフィニティーカラムに室温で１０ｍ１／時の速度で適用した。リン酸緩衝塩溶液ＰＢＳ（０，ＯＩＭのリン酸塩、０．１４ＭのＮａＣ１，ｐＨ７，２，同じ流速）により洗浄した後、結合された材料を、ｐＨ３，０での０．０５Ｍのクエン酸溶液により溶出した。溶出された画分をすぐに、０．２Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ９）により中和した（溶出後１ｍｌ当たり緩衝液１００μり。

ＩＲＭＡ試験により証明される場合、可溶性ＴＲ活性に対して陽性の両分を組合し、そして製造業者の教授に従ってＣＥＮＴＲＩＣ０Ｎセル（３０ＫＤのバリヤー）　（ＡＭＩＣＯＮ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ、　ＵＳＡ）上でｌμｇ／ｍｌタンノくり質に濃縮した。

溶出させたタンパク質の分析を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターンプロットにより行なった。この分析は、γ９δ２に比較してわずかに異なった結果を与えた。実際、非還元条件下で、分子量６５．６８．７０ＫＤの３種のひじように有力なバンドが存在し、これらは４種の有力なバンド３２．５．３４．３６及び４０ＫＤに分離した〔原文のまま〕。抗体５１０（抗−Ｃδ）及び３６０（抗−Ｖγ ９）にするウェスターンプロット分析は、非還元条件下でこれまで観察されたすべての有力なノくンドが両抗体と反応したことを示した。還元条件下で、ノくンドは抗体３６０又は抗体５１０のいづれかと反応した。

この分析から、前記アフィニティーカラムから溶出された物質は、たぶんいくつかのグリコジル化異性体の形で存在する共有結合されたγδヘテロダイマーから実質的に成ることが結論づけられ得る。

フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５　Ｕ　９２８４−４ＣＣ１２Ｎ　５／１０Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ９２８２−４８２１１０８９１６１−４ＢＧＯＩＮ　３３１５６６　７０５５−２Ｊ（７２）発明者　ボンヌビル、マルクフランス国、エフ−４４０３５，ナンテ　セデ０１、ケモンクス、プラト　テクニークデュ　セアシュエール（番地なし）Ｉ

Claims

【特許請求の範囲】

１．可溶性Ｔ受容体の生成方法であって、前記Ｔ受容体のトランスメンブラン部分が欠失されている、個々の構成成分Ｔ受容体サブユニットをコードするＤＮＡ配列を、宿主細胞中に共トランスフェクトすることを特徴とする方法。
２．ＶαＣα／ＶβＣβ可溶性Ｔ受容体が、Ｔαβ受容体のトランスメンブラン部分が欠失されているＴαβ受容体のα及びβサブユニットをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞中にトランスフェクトすることによって生成される請求項１記載の方法。
３．ＶαＣα／ＶβＣβ可溶性Ｔ受容体が、Ｔαβ受容体のトランスメンブラン部分が欠失されているＴαβ受容体のα及びβサブユニットをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞中にトランスフェクトすることによって生成される請求項１記載の方法。
４．構成成分サプユニットが共有結合を通して会合されているＶαＣγ／ＶβＣ δヘテロダイマ−可溶性受容体が、Ｔαβ受容体のα及びβサプユニットのＶα 及びＶβドメインをコードするＤＮＡ配列にそれぞれ融合される、トランスメンブラン部分が欠失されているＴγδ受容体のγ及びδサプユニットのＣγ及びＣ δドメインをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞中に共トランスフェクトすることによって生成される請求項１記載の方法。
５．構成成分サプユニットが共有結合を通して会合されているＶαＣδ／ＶβＣ γヘテロダイマ−可溶性Ｔ受容体が、Ｔαβ受容体のβ及びαサプユニットのＶ β及びＶαドメインをコードするＤＮＡ配列にそれぞれ融合される、トランスメンブラン部分が欠失されているＴγδ受容体のγ及びδサプユニットのＣγ及びＣδドメインをコードするＤＮＡ配列を宿主細胞中に共トランスフェクトすることによって生成される請求項１記載の方法。
６．ＶγＣγ／ＶαＣδハイブリッド可溶性Ｔ受容体が、Ｔαβ受容体のαサプユニットのＶαドメインをコードするＤＮＡ配列に融合されるδサプユニットのＣδドメインをコードするＤＮＡ配列と共に、そのトランスメンブラン部分が欠失されているＴγδ受容体のγサプユニットをコードするＤＮＡを宿主細胞中に共トランスフェクトすることにより生成される請求項１記載の方法。
７．構成成分Ｔ受容体サプユニットのトランスメンブラン部分の欠失が、それらのサプユニットのトランスメンブラン部分をコードする配列の上流に翻訳停止コドンを導入することによって、特にＰ．Ｃ．Ｒ．指図された変異誘発により行なわれる請求項１〜６のいづれか１項記載の方法。
８．前記共トランスフェクションが、真核細胞、特にハムスター卵巣細胞中で実施される請求項１〜７のいづれか１項記載の方法。
９．可溶性Ｔ受容体及びペプチド配列から成る融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、トランスメンブラン部分が欠失されているＴ受容体のサプユニットをコードするＤＮＡの鎖の１つ又は２つの鎖に前記ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を融合し、続いて、このようにして融合されたＤＮＡ配列を宿主細胞中に共トランスフェクトすることによって得られることを特徴とする融合タンパク質。
１０．前記ペプチド配列がインターロイキン−２のペプチド配列である請求の範囲第９項記載の融合タンパク質。
１１．請求の範囲第１〜８のいづれか１項記載の方法により得られた可溶性Ｔ受容体又は請求の範囲第９項記載の融合タンパク質に対して向けられたポリクローナル又はモノクローナル抗体。
１２．請求の範囲第１１項記載のモノクローナル抗体のＦａｂ，Ｆａｂ′Ｆ（ａｂ′）２又はＦｃフラグメント。
１３．マーカ−又は治療的活性分子が連結されている、請求の範囲第１１項記載のモノクローナル抗体又は請求の範囲第１２項記載のモノクローナル抗体のフラグメントを含んで成るモノクローナル抗体の誘導体。
１４．請求の範囲第１１項記載のモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ。
１５．請求の範囲第１〜８のいづれか１項記載の方法により得られた可溶性Ｔ受容体、又は請求の範囲第９又は１０項記載の融合タンパク質、又は請求の範囲第１１項記載のモノクローナル抗体、又は請求の範囲第１２項記載のモノクローナル抗体のフラグメント、又は請求の範囲第１３項記載のモノクローナル抗体の誘導体を含んで成る診断用組成物。
１６．生物学的サンプルにおいてＴ受容体に連結される細胞特異性の類型を分けるための方法であって、前記生物学的サンプルが、任意に支持体に結合される、請求の範囲第１〜８のいづれか１項記載の方法により得られた可溶性Ｔ受容体、又は請求の範囲第９又は１０項記載の融合タンパク費と接触せしめられ、そして前記リガンド及び前記可溶性Ｔ受容体又は前記融合タンパク質により形成され得る複合体が検出されることを特徴とする方法。
１７．病理学的Ｔリンパ球のモノ又はオリゴクローナル増殖を検出するための方法であって、前記病理学的Ｔリンパ球を含む生物学的サンプルを、前記病理学的Ｔリンパ球により担持されるＴ受容体の構成鎖のＶ及びＣ部分に対して向けられた請求の範囲第１１項記載のモノクローナル抗体と接触せしめ、そして可能な免疫学的反応を検出することを特徴とする方法。
１８．請求の範囲第１６又は１７項記載の方法を供給するための方法であって：一本発明の少なくとも１種の診断用組成物、一生物学的サンプルに存在するリガンド間に複合体を生成するのに適切な媒体を調製するための試薬、一形成される複合体と反応できる１又は複数の任意にラベルされた試薬を含んで成るキット。
１９．治療用組成物であって、請求の範囲第１〜８のいづれか１項記載の可溶性Ｔ受容体、請求の範囲第９又は１０項記載の融合タンパク質、又は請求の範囲第１１項記載の抗体、又は請求の範囲第１２項記載のモノクローナル抗体のフラグメント、又は請求の範囲第１３項記載のモノクローナル抗体の誘導体を含んで成る組成物。
２０．請求の範囲第４〜６のいづれか１項記載の方法により得られたヘテロダイマ−又はハイブリッド可溶性Ｔ受容体又は請求の範囲第９項記載の融合タンパク質を含んで成り、ここで前記可溶性Ｔ受容体がヘテロダイマ−又はハイブリッド可溶性Ｔ受容体である請求の範囲第１９項記載の組成物。