JPH07506675A - 過酸化水素の検出用電極及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 過酸化水素の検出用電極及び方法 これは、１９８９年８月２日に出願された係属中の米国特許出願第３８９，２２ ６号の一部継続出願である。

ｌ五旦公１ 本発明は、過酸化水素、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの検出を高感度で行なえる電流 測定バイオセンサー又は電極及び方法に関する。より具体的には、本発明は、表 面が、３次元のレドックス重合体の網目又は網状の構造（ｎｅｔｗｏｒｋ）で実 質的に被覆され、その中にペルオキシダーゼ（過酸化酵素）が固定化され、望ま しくは化学的に結合された電極に関する。

及肌皇１１ 過酸化水素の検定（ａｓｓａｙ）は、分子酸素による酵素触媒反応の中で酸化さ れ、０□が過酸化水素に還元される生化学物質のアッセイと関連性がある。過酸 化水素のアッセイは、一般的には、分光光度法又は電気化学的によって行なわれ る。Ｈｏｏｔの電気化学的アッセイは、通常は＋Ｇ、７Ｖ　（ＳＣＥ）近傍でＨ ２Ｏ２から０．への電気酸化（ｅｌｅｃｔｒｏｏｘｉｄａｔｉｏｎ）、又は０． ＯＶ　（ＳＣＥ）近傍でＨ２０への電気還元（ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｄｕｃｔｉｏ ｎ）を伴うかもしれない（Ｈａｌｌ、　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ、　Ｐｒｅｎｔｉ ｃｘ　Ｈａｌｌ、　Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ　Ｃ１１ｆｆｓ、　ＮＪ、　１９９１． ｐ、　１６．１３５、　２２１．　２２４．　２８３−４；　Ｃａ５ｓ、　Ｂｉ ｏｓｅｎｓｏｒｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ釦且匹ｌ」、　０ｘｆｏｒｄ　Ｕ ｎｉｖ、　Ｐｒｅｓｓ、１９９０．　ｐｐ、　３３．３４）。

多くの生化学物質の検出と定量化は、関連酵素のコファクターとしてＮＡＤＨ及 びＮＡＤＰＨの選択的電気酸化に基づいて、電流測定アッセイにより行なわれる 。電気酸化の生成物であるＮＡＤ′″又はＮＡＤＰ＋は、酵素作用により再還元 され、電気触媒酵素電極により検出されることができる。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ＮＡＤ（Ｐ）”＋２ｅ−十Ｈ”　（１）ＮＡＤＨ／　ＮＡＤ” 結合ノ可逆性電位は、ｐＨ７チー　０．５５Ｖ　（ＳＣＥ）である（ＭｃＧｉｌ ｖｅｒｙ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　−Ａ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａ　ｒｏ ａｃｈ、　Ｗ、Ｂ、　５ａｕｎｄｅｒｓ　＆　Ｃｏ、、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈ ｉａ、　１９８３．　ｐ、　４０４）。この反応では、２個の電子と１個の陽子 が一緒に移動（ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）するから、反応は通常 は遅く、大部分の電極について実用的な速度を得るためには、高い過電位（ｏｖ ｅｒｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ）でのみ可能となる。これらの高い過電位では、ＮＡ Ｄ（Ｐ）Ｈの反応生成物と、生物学的流動体の他の構成成分は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ の電流アッセイと干渉する（Ｍｏｉｒｏｕｘ　ａｎｄ　Ｅｌｖｉｎｇ、　Ａｎａ ｌ、　Ｃｈｅｍ、、　１９７９．５１：３４６；　Ｂｌａｅｄｅｌ　ａｎｄ　Ｊ ｅｎｋｉｎｓ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｗ、、　１９７９．５１：３４６；Ｂｌａ ｅｄｅｌ　ａｎｄ　Ｊｅｎｋｉｎｓ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｍ、、　１９７５． ４７：１３３７）。

この問題があるために、ＮＡＤ　（Ｐ）　ＨのＮＡＤ（Ｐ）＋への変換が低い過 電位で速やかに行なわれる電極が開発された（ＤｅＧｒａｎｄ　ａｎｄ　Ｍｉｌ ｌｅｒ、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、、　１９８０．１０２：５７２ ８−３２；　Ｋｉｔａｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏ ｃ、、　１９８１．１０３ニア６３６−４１；　Ｆｕｋｕｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ 、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９８２．１０４：２８：　Ｌａｕ　ａｎｄ　Ｍ ｉｌｌｅｒ、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、１９８３，１０５：５２７１；　 Ｇｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ａｎａｌ、Ｃｈｉｍ、Ａｃｔａ、、１９９１，２ ５０：２０３−４８；　Ｃｅｎａｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａ ｌ、Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ、１９Ｂ５， １８９：１６３；　Ｋｕｌｙｓ、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ。

１９８６、２：３）。これらの電極の最大の成功は、電極結合された媒介体（ｍ ｅｄｉａｔｏｒｓ）、電極吸着された媒介体、又は自由拡散する媒介体であって 、酸化状態でキノイド構造を有するものを用いたことである（Ｇｏｒｔｏｎ　ｅ ｔ　ａｌ、　１９９Ｉｎｔｅｒｆａｃｉａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍ、　１９ ９０．２９２：１１５；　Ｂｒｅｍｌｅ　ｅｔａｌ、、　Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａ ｌ　ｓｉｓ、　１９９１．３ニア７−８６）。キノイド（Ｑ）はその効果的な触 媒作用により、０．０Ｖ　（ＳＥＣ）近傍の電位において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈから ＮＡＤ（Ｐ）＋への変換を促進する。

Ｑ”＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ＱＨ＋ＮＡＤ”　（２）ＱＨ＋　Ｏｓ　＋　）！”→Ｑ ”　＋　Ｈｏｏｔ　（３）この電極において、２個の電子と１個の陽子はＮＡＤ （Ｐ）Ｈからキノイド媒介体に移動させられる（反応（２））。特に有効な媒介 体は、水溶性の５−メチル−フェナゾニウムカチオン（ＰＭＳ”）であり、これ はＮＡＤ（Ｐ）Ｈから５−メチル−フェナジン（ＰＭＳＲ）に定量的に還元され る。次に、ＰＭＳＨは溶解された分子酸素により再酸化されてＰＭＳ＋となり、 Ｈ２Ｏ２に還元される（反応（３））。この反応において、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈのモ ル毎に、溶解分子酸素の存在下で１モルのａｄｏｓを生成する。ＮＡＤ）ｌ及び ＮＡＤＰＨの検出機構として以前に報告されたものに、酸素の消耗を電流測定に より検知する方法（Ｐｏｌｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｍｉｄｔ、　Ｔａ１ａｎｔ ａ、　１９８９．３６：８６４−８６６；　Ｈｕｃｋｅｔ　ａｌ、、　幻叫１１ ．１９８４．１０９：１４７−１５０）、又は反応により発生したＨ２０．を分 光光度法で測定する方法（Ｗｉｌｌｉａｍｓｅｔ　ａｌ、、Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ 、、１９７６、　４８　二１４８１−８４；　Ｅｕｒｏｐ、Ｐａｔ。

Ａｐｐｌ、　ＥＰ　３１７０７０．１９８９；　、Ｅｕｒｏｐ、　Ｐａｔ、　Ａ ｐｐｌ、　ＥＰ　２８５９９８、１９８９）がある。

このような間接的検出方法では、試験試料中の他の構成成分と干渉する問題があ り、有用な電流測定バイオセンサーとしての感度に乏しい問題がある。

Ｈ３Ｏ３、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨの検出用として、高い感度で、試験試料中の 物質との干渉による著しい妨害を受けない電流測定バイオセンサーが非常に望ま しい。

及皿９１遣 本発明は、従来の電流測定バイオセンサーの不都合を解消するものであって、高 感度で、生物学的試料中のＨ８０、、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨを精度良く測定で きるバイオセンサーを提供する。本発明の電極と方法は、次の反応により過酸化 水素を直接測定するもので、高精度かつ高感度で測定できる。

Ｈ＊Ｏ電＋　２ｅ−＋　２Ｈ”−２Ｈ＊０　（４）発明のバイオセンサーは電極 を含んでおり、該電極は３次元のレドックス重合体の網状構造によりほぼ被覆さ れる。網状構造の中に、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼに類似の分子が 固定化され、望ましくは化学的に結合される。このレドックス重合体網状構造は 、ペルオキシダーゼのレドックス中心を電極に電気的に接続する。

電子の移動は以下のシーケンスにより行なわれる；Ｈ７Ｏ３はペルオキシダーゼ を酸化し、水に還元される；ペルオキシダーゼは３次元のレドックス重合体網状 構造によって還元され、レドックス重合体網状構造は酸化される：そして、酸化 されたレドックス重合体網状構造は、電極から出される電子によって電気還元さ れる。ネット反応は、Ｈ２０，から水への電気触媒還元である。この反応は、電 極表面だけでなく、３次元の網状構造の全体を通じて行なわれるから、電流密度 と感度、例えば網目構造へのＨｌｏ、フラックス（ｆｌｕｘ）の電流への変換（ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）は高い。

さらにまた、拡散電子を移動（ｓｈｕｔｔｌｉｎｇ）させる媒介体は溶液全体へ のランダム拡散により、電極に達する前に消失するかもしれないが、そのような 媒介体は電荷の伝達中には必要としないから、Ｈ３０，電気還元反応の電流効率 もまた高い。電極から出る電子は、このように効率的に、レドックス重合体の網 状構造を通じて結合ペルオキシダーゼにリレーされる。Ｈ３島の存在下で、電流 は流れる。Ｈ８０，は、ペルオキシダーゼのレドックス中心を酸化させる分子、 例えば電子のこれらを減少させる分子である。ペルオキシダーゼからＨｔＯ＊に 移動した電子は、Ｈ２０、をＨ，０に還元する。Ｈｏｏｔ濃度がペルオキシダー ゼ抑制濃度、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼに対しては約３Ｘ　１０−’Ｍ を超えないとき、この電子の移動は、試験溶液中の）ＪｉＯｆ濃度に比例した電 流を表わしている。

このような直接検出によって、過酸化水素のアッセイを迅速かつ高感度で行なう ことが可能となり、またコファクターＮＡＤ）ｆ及びＮＡＤＰＨ並びにこれらの コファクターを利用する酵素の基質の検出と定量化（ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ）を迅速かつ高感度で行なうことも可能となる。

区血段皿皇奏１贋 図１は、本発明の詳細な説明図である。

図２は、重合体Ｉ　（ＰＶＰ−Ｏｓ−ＮＯｘ）の構造の略説明図である。

図３は、重合体Ｉ　Ｉ（ＰＶＩ−Ｏｓ）の構造の略説明図である。

図４は、重合体Ｉ　ＩＩ　（ＰＶＩ−Ｏｓ−ＮＯｘ）の構造の略説明図である。

図５は、本発明の電極における電子の移動の略説明図である。

図６は、本発明の二重層電極の略説明図である。

図７は、レドックス中心のない３次元重合体網状構造を有する電極におけるＨ＊ ０＊の電気還元を表わすグラフである。Ａ線はＨｔ　Ｏｔなしで測定され、Ｂ線 は１０−’ＭのＨ２Ｏ２で測定されたものである。

図８は、３次元レドックス重合体網状構造を有する回転電極におけるＨ３０！の 電気還元を表わすグラフである。

Ａ線は５００ｒｐｍにて、Ｈ＊０２なしで測定され、Ｂ線は５００ｒｐｍにて、 １０−’ＭのＨ２Ｏ１で測定され、Ｃ線は２０００ｒｐｍにて、５Ｘ　１０−’ ＭのＨ！０．で測定されたものである。

図９は、ＨＲＰ　：重合体Ｉの比率を変えて形成した電極におけるＨ、Ｏ□の電 気還元を表わすグラフである。

図１０は、窒素でパージされた空気飽和溶液中での本発明電極におけるＨ３Ｏ２ の電気還元を表わすグラフである。

図１１は、本発明の電極について、Ｈｌｏ、の濃度を変えたとき、Ｈ３０，の電 気還元を示すグラフである。

図１２は、本発明の方法に有用な複素環キノイド媒介体の化学構造を示す図であ る。

図１３は、５−メチルフェナゾニウム硫酸メチルを含有する試験溶液中でＮＡＤ Ｈに反応する本発明電極におけるＨ２０、の電気還元を表わすグラフである。

図１４は、５−メチルフェナゾニウム硫酸メチルを含有する試験溶液中でＮＡＤ ＰＨに反応する本発明電極におけるＨ１Ｏ２の電気還元を表わすグラフである。

図１５は、グルコースの存在下で、ＨＲＰ−グルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ） ノ二重層電極（０，２６−１３１μｇ／ＧＯＸを含有する）によって発生させら れた電流密度を表わすグラフである。

図１６は、グルコースの存在下で、ＨＲＰ−ＧＯＸの二重層電極（０，２６−１ ，３μｇ／ＧＯＸを含有する）によって発生させられた電流密度を表わすグラフ である。

図１７は、酸素飽和状態（開環（ｏｐｅｎ　ｃｉｒｃｌｅｓ））及び酸ス存在下 で、ＨＲＰ−ＧＯＸ二重層によって発生させられた電流密度を表わすグラフであ る。

図１８は、Ｄ−アラニンの存在下で、ペロキシダーゼ−Ｄ−アミノ酸オキシダー ゼ（ＡＡＯＸ）二重層電極によって発生させられた電流密度を表わすグラフであ る。

図１９は、Ｄ−チロシンの存在下で、ペルオキシダーゼ−ＡＡＯＸの二重層電極 によって発生させられた電流密度を表わすグラフである。

図２０は、コリンの存在下で、ペルオキシダーゼ−コリンオキシダーゼ電極（ペ ルオキシダーゼとコリンオキシダーゼが単一の電極層の中に存在している）によ って発生させられた電流密度を表わすグラフである。

光肌旦韮側友説１ 図１に示す如く、本発明のバイオセンサーは試験表面（１２）を有する電極（１ ０）を含んでいる。表面（１２）は、３次元のレドックス重合体（１４）でほぼ 被覆されており、該重合体の中にペルオキシダーゼ（１６）又はベルオキシダー ゼの類似分子がレドックス重合体に対して固定化、望ましくは化学的に結合され ている。３次元のレドックス重合体網状構造（１４）は、電極（１０）をペルオ キシダーゼ酵素（１６）に電気的に接続する。電極（１０）は、生体感応電極の 製造用として公知の任意の材料から形成することができる。

電極は、望ましくは、例えば金又はガラス質カーボン（ｇｌａｓｓｙ　ｃａｒｂ ｏｎ）の如き固体物質から形成される。適当な電極材料として、グラファイト、 白金、パラジウム、酸化錫及び導電性有機塩を更に例示することができる。

３次元のレドックス重合体は、少なくとも２以上の成分を含んでいる。これら成 分の少なくとも１つは、レドックス化合物、つまり酸化還元化合物であり、他の 成分の少なくとも１つは、ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼに類似の分子 である。３次元の分子構造は、レドックス中心を数多く有し、その中にペルオキ シダーゼ酵素を化学的に結合させている。

［固定化（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）Ｊという語は、ペルオキシダーゼ酵素、又 はペルオキシダーゼに類似する分子を意味するものとし、これはレドックス重合 体網状構造の中で保持され、自由に拡散しない。ペルオキシダーゼは取り込まれ るが、望ましくはレドックス重合体に化学的に結合され、より望ましくはレドッ クス重合体に共有結合される。

ペルオキシダーゼは西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）のペルオキシダーゼ でもよいし、分枝型アルトロミヶス（Ａ　ｒ　ｔ　ｈｒ叩圧邦ｒａｍｏｓｕｓ） から得られる菌類のペルオキシダーゼ等のより固着性（ｆａｓｔｅｒ）のペルオ キシダーゼでもよい。

或はまた、ヘム含有分子のようにペルオキシダーゼの類似分子として、例えば水 溶性ヘミン誘導体のイミダゾール、ビニルイミダゾール又はポリビニルイミダゾ ールの複合体でもよい。

ここで用いられる「ペルオキシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）　Ｊという語は 、ペルオキシダーゼに似た分子、つまりペルオキシダーゼ類似分子を含むもので ある。「ペルオキシダーゼ類似分子（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−１ｉｋｅ　ｍｏｌ ｅｃｕｌｅｓ月は、Ｈ３゜、によって酸化されて、電極がらの電子の移動により 電気化学的に還元されるレドックス中心を含む分子を意味するものとする。

ここで用いられる「レドックス化合物（ｒｅｄｏｘ　ｃｏａ＋ｐｏｕｎｄ月なる 語は、酸化と還元が行なわれる化合物を意味する。レドックス化合物は、還元と 酸化が可能な１又は２以上の機能部（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）を有していてもよい 。「レドックス化合物」なる語は、さらに、１又は２以上のレドックス中心を含 む化合物を意味し、［レドックス中心（ｒｅｄｏｘ　ｃｅｎｔｅｒ）Ｊは、電子 を受け取り、伝達する化学機能部を意味する。

本発明において有用なレドックス化合物、又は化合物に含まれるレドックス中心 は有機物でも無機物でもよい。

望ましいレドックス中心として、化学的安定性と様々な酸化状態、それら表面の 電子移動機構の点から、例えば、ビピリジン（ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）の如き有 機リガンドとの遷移金属複合体を挙げることができる。このような複合体の例と して、二価又は三価のオスミウムイオンのポリピリジン複合体を挙げることがで きる。しかし、これ以外にも、数多くの有機物をレドックス中心として用いるこ とはできる。このクラスの典型例として、ビオロゲン（Ｎ−Ｎ’−ビスアルキル −４，４゛−ビピリジン）の様々な誘導体を示すことができる。レドックス活性 中心を含有する橋かけ可能化合物として望ましい化合物は、数多く知られている 。

これら化合物の中には、酵素を添加するだけで、３次元の架橋膜（ｃｒｏｓｓｌ ｉｎｋｅｄ　ｆｉｌｍ）を形成するものがある。つまり、酵素が唯一必要とされ る架橋剤である。その他の化合物は、酵素中に存在する化学機能部（ｃｈｅｍｉ ｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）と直接反応せず、それゆえ３次元ネットワークを 形成するために別個の架橋剤を必要とする。本発明に用いられるレドックス重合 体の複合体の望ましい例として、図２に示す如（、ＰＶＰ−Ｏｓ−ＮＯｘの重合 体Ｉを示すことができる。重合体Ｉを作るために、ポリ（ビニルピリジン）は、 ［オスミウムビス（２，２−ビピリジン）ジクロライド］と複合化され、重合体 が省略された［０ｓ（ｂｐ）’）＊Ｃ１＊］を生ずる。この重合体（ＰＶＰ−Ｏ ｓ）は次に、例えば臭化水素酸ブロムエチルアミンで四級化され（ｑｕａｔｅｒ ｎｉｚｅｄ）、非常に親水性の橋かけ可能なレドックス重合体を生成する。この レドックス重合体は、図２に示す如く、ペンダントエチルアミン基（ＰＶＰ−Ｏ ｓ−ＮＯｘ）を含んでいる。

本発明に有用である新規なレドックス重合体は、例えば図３に示す如＜　、［０ ｓ（ｂｐｙ）＊Ｃ１］””と複合化されたポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）（Ｐ ＶＩ）の誘導体であり、ＰＶＩ−Ｏ５（重合体用を生成する。ＰＶＩ−Ｏｓはそ れ自体が橋かけ可能なレドックス重合体であるが、追加の架橋結合サイトのため に、四級化されテＰＶＩ−Ｏｓ−ＮＨ＊（ホ！Ｊ　７−１１１）ヲ生成してもよ い（図４参照〕。

望ましい実施例において、３次元のレドックス重合体網状構造として、ペルオキ シダーゼ酵素、架橋剤、並びに架橋剤及びペルオキシダーゼと反応できる橋かけ 可能な化合物を挙げることができる。橋がけ可能な化合物又は架橋剤の一方又は 両方は、少なくとも１つ、望ましくは多数のレドックス中心を含んでいる。

望ましい架橋剤として、酵素が安定な条件、つまりｐＨが約３〜９、温度が０〜 ５０”Ｃの水性溶液中で反応する水溶性化合物を示すことができる。この種の架 橋剤の中には、例えば、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ ＤＧＥ）　、カルボジイミド、ジアルデヒド、ポリアルデヒド、イミドエステル 、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの如き多官能エポキシドが含まれる。

水中での溶解度が限られている数多くの試剤を、アセトン、メタノール、アセト ニトリル又はジメチルホルムアミドの如き水混和性の有機溶剤の中に溶解させて 、用いることもできる。このカテゴリーに含まれる試剤として、塩化シアヌル、 テトラクロロベンゾキノン及びテトラシアノキノジメタン等を挙げることができ る。これらの試剤は、アミド、アルコール、チオール及びカルボン酸を含む１種 又は２種以上の機能部と反応するかもしれない。これらは、酵素の表面に存在し てもよいし、レドックス化合物の構造の中に含まれていてもよい。本発明電極の 作製に用いることのできる追加の架橋剤として、ジアジリジン、トリアシリジン 、及びポリアジリジン、例えば、ＣＨ８ ＨＯＣＨ＊Ｃ［ＣＨ＊０Ｃ（０）ＣＨｓＣＨＪ　１ｍＨｓ を挙げることができる。

橋かけ可能な望ましい化合物は、親水性であり、例えばアルコール、カルボン酸 、アミン、スルホン酸塩、硫酸塩、燐酸塩、ホスホン酸塩の如き化学基（ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　ｇｒｏｕｐｓ）を含んでいる。この化学基は、水中における構成成 分の溶解を促進する傾向にあり、水溶性酵素との接触を促進する。この化学基は 、変性に抗して固定化酵素の安定性を向上させる役割も果たす。

本発明の電極を形成するために、３次元のレドックス重合体網状構造の成分は、 適当な条件下で混合されて、化学反応により、内部でペルオキシダーゼ酵素が結 合した３次元レドックス重合体を作る。

ペルオキシダーゼと種々の重合体成分の混合物は溶液を共通にして、次に、その 溶液が電極表面に施される。

この施し方には、溶液を電極表面に滴下する方法、浸漬コーティング、スピンコ ーティング、溶液を電極表面にスプレーする方法等、種々の方法がある。溶液を 電極表面に施した後、固定化又は硬化させる工程（ｃｕｒｉｎｇ　ｏｒ　ｓｅｔ ｔｉｎｇ　５ｔｅｐ）が行なわれ、これは空気中又は真空中で乾燥させることに より行なう。或はまた、別の溶液内にある酵素成分と重合体成分を電極の表面に 添加し、混合し、空気中又は真空中で固定することもできる。

この物質が電極表面上に被覆されると、３次元の分子構造が、電極表面と、含ま れるペルオキシダーゼ酵素との間で電気的に接触をもたらす。

本発明の方法において、試験試料中のＨ，Ｏ□を直接検出するために発明の電極 が用いられる。この方法では、電極に発生した電子は、化学的に結合されたレド ックス重合体（例えば、エポキシ）の網状構造を通じて、ペルオキシダーゼ酵素 にリレーされる。図５に示される如く、電子はペルオキシダーゼ酵素にリレーさ れ、該酵素は＋〇。

３５Ｖ　（ＳＣＥ）から負の電位、一般的には０．０Ｖ（ＳＣＥ）の電位で電気 還元される。試験試料中にＨ２０，が存在する中で、電子は次に、還元されたペ ルオキシダーゼから過酸化水素に移動させられ、水を生成する（反応（４）参照 ）。電子は、電極から重合体網状構造及びペルオキシダーゼを通じて、過酸化水 素に移動するが、この電子の移動は電流の流れを意味する。この流れは、試験溶 液中のＨｏｏｔの濃度の関数である。この方法により、Ｈｏｏｔは約Ｉ　Ａｃｍ −’Ｍ−”の感度で検出される。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの濃度は、前述の（２）　（３）の反応により、化学量論的にＨ ２０，に翻訳される（ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）から、これらのコファクターもま た、この方法により、同じ感度で同じ電位で検出される。さらに、基質（ｓｕｂ ｓｔｒａｔｅｓ）の酵素触媒反応によりＨ３０，又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈを発生する から、基質は、本発明のバイオセンサー及び方法を用いて、関連のある感度でア ッセイされることができる。

図６に他の実施例を示しており１１本発明のバイオセンサーは、酵素を含有する ２つの層を電極に具えることができる。電気導電体、例えば電極（１０）の直ぐ 近傍に、第１のベルオキシダー含有層（１５）があり、これは、ペルオキシダー ゼ含有電極について説明したように、３次元レドックス重合体網状構造を通じて 、電極に電気的に接続されている（ｗｉｒｅｄ）。第２の酵素層（１８）は、ペ ルオキシダーゼ層（１５）と、試験されるべき溶液との間に配置されるもので、 過酸化水素の生成反応を促進する過酸化水素酵素（２０）を含有する。このよう な酵素（２０）の例として、グルコースオキシダーゼを挙げることができる。こ れは、グルコノラクトン及び過酸化水素への酸素によるグルコースの酸化を促進 する。

第２の酵素（２０）としての使用に適した酵素として、生物学的試料の中で検出 される基質の反応を誘導する酵素を挙げることができ、過酸化水素を発生させる 反応は電極のペルオキシダーゼ部分で検出されることができる。

このような酵素の例として、グルコースオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、 コレステロールオキシダーゼ、テオフィリンオキシダーゼ、サルコシンオキシダ ーゼ等を挙げることができる。

この二重層（ｂｉｌａｙｅｒ）のペルオキシダーゼのバイオセンサーは、過酸化 水素を発生させる第１酵素（２０）に誘導された反応により、生物学的基質を検 出することができる。Ｈａ’ｓは次に、０．ＯＶ　（ＳＣＥ）で効率良く電気還 元され、前述のペルオキシダーゼ電極システムによって検出される。得られる感 度は非常に高＜　、Ｏ，ＯＶ　（ＳＣＥ）で電気還元又は電気酸化されない生物 種を汚染することによる干渉を殆んど受けない。

二重層のペルオキシダーゼバイオセンサーの中で、ペルオキシダーゼ酵素（１６ ）と第２の酵素（２０）は、互いに電気的に絶縁されている。例えば、第２の酵 素（２０）は電極には電気的に接続されず、ペルオキシダーゼが結合されるレド ックス重合体網状構造に対しても電気的に接続されない。この電気的絶縁は、第 ２の酵素（２０）を含む外層がペルオキシダーゼ・レドックス重合体網状構造を 含む内層と物理的に分離されたセンサーの構造によって達成される。

或はまた、両方の酵素を含む単一層でもよい。この単一層は、電極に接触するペ ルオキシダーゼ層の中に、第２の酵素（２０）も含んでいるが、それでも、その レドックス中心は、例えば蛋白質又は糖蛋白質のシェルにより、レドックス網状 構造と絶縁されている。従って、第２の酵素は十分に接触されず、３次元のレド ックス網状構造と電気的に接続されない。このように絶縁されることにより、網 状構造による第２の酵素の還元、又はＨ＊Ｏｍ酸化されたペルオキシダーゼによ る第２の酵素の酸化は防止される。その基質により還元された後、０２と反応す ると、第２の酵素（２０）は過酸化水素を発生し、電気的に接続されたペルオキ シダーゼ網状構造を酸化し、これが感知される。

他の実施例において、Ｈ３Ｏ２を作る第２の酵素（２ｏ）は、３次元レドックス 網状構造と電気的に絶縁され、第２の酵素が酸化又は還元されない電位に網状構 造を維持することにより、ペルオキシダーゼを結合させてもよい。

「電気的接触」は、センサーの１又は２以上の層の中で酸化又は還元が生じた結 果、電流が外部回路を流れる状態とみなすことができる。

「電気的分離」と「電気的絶縁」は、分離又は絶縁された層の中で酸化又は還元 反応が生じた結果、電流が外部回路の中を流れない状態とみなすことができる。

第２の酵素（２０）は、３次元レドックス重合体（１４）及びペルオキシダーゼ （１６）と電気的に分離又は絶縁されれば、両方の酵素を同じ層の中に含めるこ とができる。例えば、Ｈ１Ｏ２を作り出す第２の酵素（２０）は３次元のレドッ クス重合体網状構造（１２）の中に埋め込むことができる。電極の動作電位、例 えば０．ＯＶ　（ＳＣＥ）にて、電流は、電極から過酸化水素への電子の流れに よってのみ作り出され、Ｈ，Ｏ，を作る第２酵素（２０）の直接の還元又は酸化 では電流は殆んど発生しないか又は全く発生しない。

寒施舅 以下の実施例は、本発明の概念を例示するために示される。実施例が本発明の全 ての特徴及び全ての具体例を表わすものと解すべきではなく、また発明の範囲を 限定するものと解すべきでない。

叉１を口、 Ｈ８０，知電】の１ 回転ディスク電極を、長さ１　ｃｍ、直径３ａ＋ｍのガラス質カーボンのロッド から作った。ディスク電極は、テフロンスリーブの一方の端部に圧入される。ス リーブの反対側の端部は、ステンレス鋼のロッドが圧入され、回転体に合わせて ネジが切られている。ガラス質カーボンロッドとステンレス鋼ロッドとの電気的 接触は、銀エポキシＥＰＯ−ＴＥＫ　Ｈ２０Ｅ（エポキシ・テクノロジー・イン コーポレイテッド、ビレリカ、マサチューセッツ）を用いて行なわれる。電極は 、まず最初に６μＭ１次に１μＭのダイヤモンド分散液（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ）でポリッシュした後、０３μＭのアルミナで更にポリッシュした。各々のポリ ッシュエ間超音波処理する。

西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）　（２ｍｇ）　（シグマＰ−８３７５タ イプＶｌ、　２６０単位／ｍｇ）を、０．ＩＭの重炭酸ナトリウム溶液１００μ Ｌの中で溶解した。１２ｍｇ／ｍｌの過ヨウ素酸ナトリウム５０μＬを添加した 後、酵素溶液は暗室の中で２．３時間、静置して培養した（ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ）。重合体Ｉの１０ｍｇ／ｍｌ溶液、オスミウムレドックスポリアミンを合成し 、これを図２に示す。合成法は、文献、Ｇｒｅｇｇ　ａｎｄ　Ｈｅ１ｌｅｒ、　 Ｊ。

Ｐｈｙｓ、　Ｃｈｅｗ、、　９９１．９５：５９７０−７５に基づいた。これを 用いて、酵素溶液のアリコートを希釈し、酵素：重合体Ｉ溶液が種々の比率もの を得る（１：　ｓ、　１：　１０．１：　ｓｏ、　ｌ：　１００）。

酵素：重合体Ｉ　（ＰＶＰ−Ｏｓ−ＮＨｓ）溶液１マイクロリツトルをポリッシ ュしたガラス質カーボン表面に施す。電極は、５〜１５分間部分的に乾燥させた 後、ポリ（エチレングリコール６００ジグリシジルエーテル）、工業的品質（Ｐ ＥＧＤＥ）（ポリサイエンシイズ、　Ｎｏ、８２１１）の１　ｍｇ／ｍｌ溶液を １マイクロリツトル施した。電極は、次に、室温で水飽和された空気中にて４時 間以上静置して固定化した。

電極は、先にＮａ１Ｏ，で酸化させたＨＲＰを、レドックス中゛心をもたないポ リアミンと共に固定化することにより作った。このポリアミンは、ポリビニルピ リジン（ＰＶＰ）　（Ｍｗ６０．０００）を２−ブロモエチルアミンと反応させ 、ピリジニウム−Ｎ−エチルアミン誘導体を生成して得られたもので、例えば、 重合体は、［０ｓ（ｂｐＹ）ｔｃ１］””＋レドックス中心のない重合体Ｉであ る。ＨＲＰは、前述の工程により、ＰＥＧＤＥを用いてポリアミンに架橋結合さ れる。

寒■ｔユ Ｈ！０１の検知電極の　用 実施例１で作製した電極を、Ｈ３０！を含有する試験溶液にさらした。

電極は修飾され（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）たダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の緩衝 液（ＰＢＳ）の中で使用した。なお、温度は室温、ｐＨは７゜４である。特に言 及しない限り、溶液はよく曝気（ａｅｒａｔｉｏｎ）されるものとする。全ての 媒介体溶液は、毎日作られ、使用するまで光から保護されている。電位は飽和力 ロメロ電極（ＳＣＥ）を参照電極とした。補助電極（ｃｏｕｎｔｅｒｅｌｅｃｔ ｒｏｄｅ）として白金線を用いた。クロノアンペロメトリーの実験を、ＥＧ＆Ｇ ポテンシオスタット／ガルバノスタットのモデル１７３で行ない、キップ＆ゾネ ン（Ｋｉｐｐ　ａｎｄ　Ｚｏｎｅｎ）　Ｘ　ＹレコーダＢＤ９１で記録した。サ イクリックポルタモグラムを、ＥＧ＆Ｇポテンシオスタット／ガルバノスタット のモデル２７３Ａで行ない、コンピュータが記録した。使用した回転体は、パイ ンインスツルメントＡＦＭＳＲＸで、ＡＣＭＤＩ　１９０６Ｃシヤフト付であっ た。

■、０．の電気還元は、レドックス中心のないポリアミン（図７）又はオスミウ ムレドックス中心を含むポリアミン（図８）の両方のエポキシ網状構造の中に化 学結合された西洋ワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含有する電極について 観察された。レドックス中心のないものは、０．２Ｖ　（ＳＣＥ）から負の電位 で、還元が起こるものがあった。ＩＸ　１０−’ＭのＨ２０，が存在するとき、 約１μＡｃｍ−”のプラトーはｏ　、　Ｉ　Ｖ　（ＳｃＥ）の付近で到達した（ 図７）。これに対して、オスミウムレドックス中心が数多く存在するレドックス エポキシ網状構造を有する本発明の電極を用いた場合、０、Ｏｖ　（ＳｃＥ）に おける電流密度は２桁大きくなり、約１００μＡｃｍ−″まで増大した。さらに 、図８に示されるように、ｕ、ｏ＊ノｉ気還元ハ、＋　０．４５Ｖ　（ＳＣＥ） の酸化電位においても観察され、定常状態の電気還元電流のプラトーは＋０３Ｖ 　（ＳＣＥ）の酸化電位で既に観察された。

これらの電極では、触媒によるＨ２Ｏ２の電気還元電流密度と、ＨＲＰ　：重合 体１の比率とはかなり独立性があった。

一連の電極について調べられた。これらの電極の作製は重合体１で記載した通り であるが、ベルオキシダーゼ二重合体の比率を変えている。

これらの電極について、触媒によるＨ、０□電電気光電流密度を測定した。その 結果を図９に示す。発生した電流の密度は、低濃度（例えば、ｌＸｌ０−’Ｍよ り低い）では、皿Ｐ：重合体の比率とは殆んど依存性はなかった。Ｈ８０，の濃 度がより高いところでは、重合体の網状構造のＨＲＰがリッチになるにつれて電 流密度は増大し、約１＝５の比率のときが最大であった。ＨＲＰ　：重合体Ｉを １：ｌＯで含む電極と、１：５で含む電極とでは電流密度に大きな違いはなかっ た。ＨＲＰ　：重合体Ｉが１：５の電極の場合、■、０２の濃度範囲が０〜ＬＸ 　１０−’Ｍにおいて、電極の感度はＩＡｃｍ−２Ｍ−’であった。例えば、Ｈ ２０，がＬＸ　１０−’Ｍのときの電流密度は１００　μＡｃｍ−’であった。

Ｈ３０！の濃度が０．２５ｍＭを超えると、電流は時間に依存して減少した。こ れは、恐ら＜　ＨＲＰの基質抑制によるためと思われる。ＨＲＰの存在しない重 合体Ｉの網状構造で作られた制御電極は、測定できるほどのＨ２０，の反応は示 さなかった。

図１０は、本発明電極の酸素分圧に対する不感受性（ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔ ｙ）を示しており、これはバイオリアクターの構成成分中、静脈血と動脈血の分 析に特に重要な特性である。図１０において、空気飽和溶液における測定はオー ブンサークル（開環）で示され、Ｎ２パージされた溶液における測定はクローズ ドサークル（閉環）で示されている。１　：　１００（ＨＲＰ　：重合体Ｉ）の 電極の検量線は、窒素パージされた溶液と空気飽和された溶液の間で、測定でき るほどの違いは見られなかった。ｌ　：　５（ＨＲＰ　二重合体Ｉ）の電極の場 合、僅かな違いがあり、空気の方の読みが窒素の方の読みよりも２％未満だけ超 えている。

ＨＲＰ電極の動的（ｄｙｎａｍｉｃ）範囲は、ＨＲＰ　：重合体■の比率が１： ５のＨＲＰを含む電極を用いて明らかにした。この電極を、約ＩＸ　１０−’Ｍ 乃至約ｌＸｌ０−’Ｍの３桁の範囲に亘って濃度の異なるＨｏｏｔを含有する試 験溶液と接触させたとき、図１１に示す如く、電流密度はＨ２Ｏ２濃度と共に直 線的に増加した（相関係数０．９９７　；勾配ｌＡｃｍ−”Ｍ−”）。低濃度で は、電極の時間応答は遅かった。Ｏ，ＯＭから１　ｘ　１０−’Ｍまで濃度を高 めてＨ２０，を注入した後、電流は約１０分間で定常状態に達した。より高濃度 では、応答時間は速く、例えばＩＸ　１０−’ＭのＨ２Ｃｈでは２分であった。

ノイズ等価のＨ２０，濃度は、例えばＬＸ　１０−’Ｍの８２０１では約３ｍＭ であり、ノイズに対する信号の比率は約３であった。電極を３０分間安定化させ た後に測定したバックグラウンド電流は、００Ｖ（ＳＣＥ）にて７０ｎＡｃｍ− ”であった。

実施例３ ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検知するために電気的接続されたＨＲＰ電極の使用 実施例１において作製された電極を、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのどちらかが添加 された溶液中に浸漬したとき、００Ｖ（ＳＣＥ）ではバックグラウンド電流に何 の変化も示さなかった。しかし、複素環キノイドを試験溶液に加えたとき、ＮＡ Ｄ（Ｐ）Ｈの濃度依存性カソード電流が観察された。図１２は、有用な複素環キ ノイドの構造を示しており、ＩｈＯｘの発生におけるこれら媒介体の相対的有効 性は、それらのりスティングのオーダで反映される。１０ｄよりも低濃度の試験 溶液に対して、これら媒介体のどれを添加しても、観察された電流に変化はなか った。

図１３に示す如（、ＨＲＰ：ポリマーの比率が１＝５と１＝１００で含有するＨ ＲＰ電極を、１．６ｍＭの５〜メチルフエナゾミウム硫酸メチル（ＰＭＳ＋）を 含有する試験溶液の中に浸漬し、ＮＡＤＨの濃度を変動させたとき、ＮＡＤＨ濃 度と電流密度の間に直線的な変化が観察された。電流密度のＮＡＤＨ濃度依存性 は、ＮＡＤＨの濃度範囲１〜１００μＭに亘って直線的のままであり、傾斜、つ まり感度は、先にＨ２Ｏ２濃度の場合で得られたものと同様で、Ｉ　Ａｃｍ”２ Ｍ−’であった。

ＮＡＤＰＨの存在下で、ＨＲＰ　：ポリマーの比率が１５の電極を用いて、実験 を繰り返した。得られたデータを図１４に示している。ＮＡＤＰＨ濃度に対する 電流密度の直線的依存性は１〜２００μＭのＮＡＤＰＨの範囲で観察され、感度 は又してもＩ　Ａｃｌ’Ｍ−’であった。

定常状態の測定のための平衡時間は、媒介体の濃度に依存した。例えば、高濃度 の媒介体を用いるとＨ３Ｏ２の生成は促進された。典型的には、ＮＡＤＨを注入 するための定常電流は、５−メチルフェナゾミウム硫酸メチル（ＰＭＳ＋）の濃 度３．３μＭで、５〜７分間平衡化した後、その最終値の５％以内であった。

前述の反応（３）から予測されるように、電気還元電流は、曝気溶液又は酸素が 供給された溶液の中でのみ観察された。空気よりも０．を溶液中に送り込んで泡 立たせたときに、電流は増加しなかった。また、０．の流れを空気と置き換えた とき、電流は減少しなかった。溶液にＮ、を送り込んで酸素をパージしたとき、 電流は逆転し、ＰＭＳＨ（ＰＭＳ”とＮＡＤＨ）含有溶液の中で僅かな電気酸化 電流が観察された。ＰＭＳＨの電気酸化は、ＨＲＰ含有レドックス網状構造で修 飾されているかどうかに拘わらず、ガラス質カーボン電極に起こった。しかしな がら、ＰＭＳＨ溶液を少し曝気しただけで電流は逆転した。このような逆転は、 レドックス重合体網状構造の中にＨＲＰを含有した電極にのみ認められた。

実施■１ ２　のＨ２Ｏ，矩型　の　１ ポリッシュした回転ディスク電極を、実施例１で記載したように、ガラス質カー ボンのロッドから作製した。

’　２０ｍｇ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のタイプＶ！溶液 を、０．１ＭのＮａＨＣＯ，の中で調製した。この溶液１００μｍを、５０μｍ のＮａｌＯａ（１２ｍｇ／ｍｌ）と反応させて、室温の暗室で２時間静置して培 養した。この酸化されたＨＲＰ　１０μｌを５０ｐ　１の重合体１　（ＰＶＰ− Ｏｓ−ＮＨｔ）（１０ｍｇ／ｍｌ）と、６０μｌのポリエチレングリコールジグ リシジルエーテル−４００（ＰＥＧＤＥ）に添加した。ポリッシュした電極は、 この混合物３μｍで被覆し、真空デシケータの中で４８時間静置して固定化した 。

２．９ｍｇ／ａ＋１のＡＡＯＸと０．７７％のグルタルアルデヒドを含有する溶 液のアリコート１０μｌを、固定化したＨＲＰ電極の中に導入し、この層を２時 間以上培養することにより、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＡＡＯＸ）の二重層電 極を作製した。

１００μｍのＧＯＸ（２０ｍｇ／ｍｌ）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳＳｐＨ８を、５ ０μｍのＮａＮａ１０４（１２／ａ＋１）と反応させ、この混合物を室温の暗室 で２時間静置して培養することにより、プルコースオキシダーゼ（ＧＯＸ）の電 極を作製した。培養後、酸化されたＧＯＸを、得られたＨＲＰ電極表面に塗布し 、２時間以上培養した。

去１１１互 二重　のペルオキシダーゼ−グルコースオキシダーゼ掻見使月 ＧＯＸの量を０．２６μｇ〜１３１μｇの範囲で変えて、実施例４で記載したよ うに、一連のグルコース電極を作製した。

これらの電極は、２５ａ＋１の燐酸緩衝溶液（０，１Ｍ、　ｐＨ７，４）を含む ３電極セル中のグルコースを検定するために使用した。作用電極はガラス質カー ボンであ・す、参照電極には飽和カロメル電極（ＳＣＥ）を用いた。補助電極に は白金線を用いた。全ての測定は、室温の大気中で、開放セルの中で行なわれた 。全ての定電位実験は、１１０００ｒｐ＋の回転には０．ＯＶ　（ＳＣＥ）で平 衡が保たれ（ｐｏｉｓｅｄ）、得られた電流が測定された。

ＧＯＸの量を種々変えて調製したペルオキシダーゼ−グルコースの二重層電極を 用いて、前述した要領にて、試験溶液中のグルコースを測定した。一般的な傾向 として、反応の大きさは、図１５に示す如く、グルコースオキシダーゼの量が増 すにつれて増加した。２６μｇ乃至１３１μｇのグルコースオキシダーゼで作製 した電極の電流応答は、約２ｍＭのグルコースで飽和した。動的範囲がこのよう に低いのは、電極表面に酸素が欠乏しているためと考えられる。０．２６μｇ乃 至１．３μｇのグルコースオキシダーゼで作製した電極は、全て、約１０ｍＭの グルコースまで直線反応を示した。これについては、図１６に良く示されている 。

グルコースオキシダーゼの量が２６μｇから２．６μｇまで変化したとき、接触 電流（ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｃｕｒｒｅｎｔ）に大きな減少が観察された。

上記の実験は、試験溶液に曝気される酸素の存在下又は不存在下で、１．３μｇ のＧＯＸを含む二重層のペルオキシダーゼ−グルコース電極を用いて、繰り返し 行なわれた。

図１７に示されるように、溶液が酸素で飽和されたとき、グルコース濃度が５ｍ Ｍよりも少ないところでは、接触電流の差異は小さかった。しかしながら、溶液 が酸素で飽和されたとき、グルコースが５ｍＭよりも大きいところでは、接触電 流に実質的な差異があった。

ペルオキシダーゼ−ＧＯＸ電極の安定性についての予備結果では、１／２寿命（ ｈａｌｆ−１ｉｖｅｓ）は、室温での連続的使用の場合、４０時間よりも大であ ることが示された。

寒ｍ Ｄ−アミノ　を　るために二重　の電　の　用実施例４で作製された二重層のペ ルオキシダーゼ−Ｄ−アミノ酸電極は、Ｄ−アラニン、Ｄ−チロシン及びＤ−シ スティンの検定に使用した。図１８及び図１９に示されるように、０．ＯＶ　（ ＳＣＥ）での定常電流応答は、Ｄ−アラニンに対してはθ〜２ｍＭ、　Ｄ−チロ シンに対しては０−１ｍＭの直線的な動的範囲を示した。Ｄ−システィンに対す る応答も観察された。

二重層ペルオキシダーゼ−ＡＡＯＸ電極についての予備結果では、電極が１７２ 寿命に達する時間、つまり電流が初期電流の半分まで減少したときの時間は、室 温で使用したときは約３０時間、これら電極を３７℃で連続使用したときは１６ 時間であった。

寒胤ｆＬ７− 電気的に絶縁された第２の酵、を　む 単一層の中に、コリンオキシダーゼと西洋ワサビのペルオキシダーゼを含む電極 を、下記の如く作製した。直径３ｎ＋ｍのガラス質カーボン電極を、ダイヤモン ドペーストを用いてポリッシュした。Ｎａｌ０ａの１２ｍｇ／ｍｌ溶液を０．１ ＭのＮ５ＨＣＯｓのＨＲＰ　（タイプｉｖ）の２Ｏｎ＋ｇ／ａ＋１溶液に、ｌ： ２の比率で添加することにより、ポリアルデヒド（例えば、Ｎａ１Ｏ４で酸化さ れた）の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の溶液を作製した。この溶液は 、暗室の中で２時間静置して培養した。次に、ＨＲＰ　：重合体Ｉの比率が１： ５の重合体■溶液１０ｍｇ／ｍｌと混合した。次に、この溶液１μｍは、２３ｍ ｇ／ｍｌのコリンオキシダーゼ溶液１μｌと、架橋剤として１　ｍｇ／ｍｌのＰ ＥＧＤＥ４００の１μｍと共に、ポリッシュした電極表面に施した。溶液は、電 極表面上で十分に混合し、４８時間以上乾燥させた。

得られたコリンオキシダーゼ−ペルオキシダーゼ電極は、０　、　ＯＶ　（ＳＣ Ｅ）において、コリン基質の濃度増加に対する定常電流応答を調べた。図２０に 示されるように、コミ位ｖｓ、ＳＣＥ　（ｍＶ）　− ＦＩＧ、　８ ０　１００　Ｘ）０　３００　１１）０　５００電位　ｖｓ　ＳＣＥ　（ｍＶノ ー ０　０．１　０．２　０．３　０．ｔ　Ｏ，５０，６Ｈ２０２濃度（ｍＭ）　− ＦＩＧ、　１０ Ｈ２Ｏ２濃度（ｍＭ）　− Ｈ２０２濃度　ｔμＮノー ＦＩＧ、１２ＣＦＩＧ、１２０ ＦＩＧ、　１２Ｅ　ＦＩＧ、　１２Ｆ ＦＩＧ、１２１　ＦＩＧ、１２Ｊ ＦＩＧ、　１３ ＮＡＤＨ濃度　（ＡＩＭ）呻 ０．１　１　１０　１００　１００Ｏ ＮＡＤＰＨ！２　（ＩＪＭノー ＦＩＧ、　１５ ０　ＴＯ２０３０１ｄ） グルコース　濃度（ｍＭソノ グルコース　濃度　（ｍＭノー申 ＦＩＧ、　１７ グルコース　濃度（ｍＭ）　− Ｄ−アラニン　濃度　（ｍＭソノ− ＦＩＧ、　１９ Ｄ−チロシン　濃度　（ｍＭソノ −ＩＧ、　２０ ０．００１　０．０１　０．１　７　１０コリン　濃度（ｍＭノー フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号７３６３−２Ｊ ７３６３−２Ｊ （８１）指定図　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ 、ＴＤ。

ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ。

ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、 ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ ＦＩ ＧＯＩＮ　２７／３０　３３１　Ｙ ２７／４６　３３６　Ｇ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）試験表面を有する電極；及び 電極の試験表面を実質的に被覆するトランスデュース層（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ ｇ　ｆｉｌｍ）を具えており、前記トランスデュース層は３次元のレドックス重 合体網状構造を具え、該網状構造は、 （ａ）多数のレドックス中心を有するレドックス化合物と、 （ｂ）レドックス中心が、拡散電子シャットルの不存在下で電極に電気的に接続 されているペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼに類似の分子 を具えている、過酸化水素の検出用電極。
2. （２）ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ類似分子は、レドックス重合体網 状構造に化学的に結合されている請求項１の電極。
3. （３）ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ類似分子は、レドックス重合体網 状構造に共有結合されている請求項２の電極。
4. （４）ペルオキシダーゼは西洋ワサビのペルオキシダーゼである請求項１の電極 。
5. （５）ペルオキシダーゼは、分枝型アルトロミケス（Ａｒｔｈｏｒｏｍｙｃｅｓ 　ｒａｍｏｓｕｓ）の菌性ペルオキシダーゼである請求項１の電極。
6. （６）ペルオキシダーゼはペルオキシダーゼに類似する分子である請求項６の電 極。
7. （７）ペルオキシダーゼ類似分子はヘム含有分子である請求項６の電極。
8. （８）レドックス化合物はビピリジンと複合化されたオスミウムイオンである請 求項１の電極。
9. （９）レドックス化合物はオスミウムビス（２，２′−ビピリジン）と複合化さ れたポリ（ビニルピリジン）である請求項９の電極。
10. （１０）レドックス化合物は、オスミウムビス（２，２′−ビピリジン）と複合 化されたポリ（Ｎ−ビニルイミダゾール）である請求項１０の電極。
11. （１１）網状構造に固定化された酵素層を具えており、酵素層は、反応によりＨ ２Ｏ２、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＰを発生させる基質−酵素反応を触媒する酵素を 含んでおり、酵素はペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ類似分子から分離さ れている請求項１の電極。
12. （１２）酵素層はペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ類似分子から物理的に 分離されている請求項１１の電極。
13. （１３）酵素層はペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ類似分子から電気的に 分離されている請求項１２の電極。
14. （１４）試験試料中の過酸化水素の存在を分析する方法であって、該方法は： 試験表面がトランスデュース層で実質的に被覆され、該トランスデュース層は、 多数のレドックス中心を有する３次元のレドックス重合体網状構造と、該網状構 造の中に固定化されたペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ類似分子を具えて いる電極に対して、試験試料を接触させる工程； 電極で電子を発生させる工程； 電子を、電極から３次元重合体網状構造を通じてペルオキシダーゼ又はペルオキ シダーゼ類似分子に移動させる工程； ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ類似分子にて過酸化水素を電気還元する 工程； ３次元レドックス重合体網状構造の中の過酸化水素を電気還元により電流を発生 させる工程；及び発生した電流を測定する工程、から構成される。
15. （１５）ペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ類似分子は、レドックス重合体 網状構造に共有結合されている請求項１４の方法。
16. （１６）試験試料中のＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの存在を分析する方法であって、 該方法は： ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨを、キノイドの存在下で試験試料中の溶解分子酸素と反 応させる工程； 試験表面がトランスデュース層で実質的に被覆され、該トランスデュース層は、 多数のレドックス中心を有する３次元のレドックス重合体網状構造と、該網状構 造の中に固定化されたペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ類似分子を具えて いる電極に対して、前記の反応させた試験溶液を接触させる工程；電極で電子を 発生させる工程； 電子を、電極から３次元重合体網状構造を通じてペルオキシダーゼ又はペルオキ シダーゼ類似分子に移動させる工程； 結合されたペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ類似分子にて過酸化水素を電 気還元する工程；電子の移動と過酸化水素の電気還元により電流を発生させる工 程；及び 発生した電流を定量化する工程、から構成される。
17. （１７）試験試料中に存在するＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨは、基質−酵素反応によ って発生し、発生した電流は試験試料中の基質の量と直接的な関係を有している 請求項１３の方法。
18. （１８）試験試料中に存在するＨ２Ｏ２は、基質−酵素反応によって発生し、発 生した電流は試験試料中の基質の量と直接的な関係を有している請求項１１の方 法。