JPH07507865A - 分析対象物の検出におけるまたはそれに関する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は分析対象物の検出のための装置、特定的にはバイオセンサ、および分 析対象物の存在を検出するための方法に関する。 発明の背景 溶液中における分析対象物の受容体への結合を調べるための装置および方法か知 られている。ＢＩＡｃｏｒｅ　（ＢＩＡｃｏｒｅはＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏ ｓｅｎｓｏｒ　ＡＢの商標であり、ＢＩＡは生物特異的相互作用分析を表わす） と称するこのような装置の１つ（およびその関連のコンピュータ制御およびデー タ処理手段）か考案されており、これはセンサチップ上に固定化された受容体へ の分析対象物の結合を調へるのに表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の現象を用いる 。この装置および理分に説明される。本質的に、この技術ては、センサチップの 特定表面に受容体を固定化し、チップを関心のある分析対象物を含むサンプルの 流れに接触させ、関心のある分析対象物の結合から起こる、センサチップ表面の 光学特性における変化を測定する。 抗体／抗原相互作用か特異的であることは、このような反応かＢ［Ａｃｏｒｅシ ステムを用いる研究に特に適することを意味する。たとえば、ヨーンソンら（１ ９９１年、先に引用したもの）は、濃度決定のため、親和性の高い抗体の使用を 開示している。このシステムでは、センサチップは各アッセイの後ＨＣＩでの再 生を必要とした。他にもいくつかの研究が報告されており、たとえば合成ペプチ ドの固定化モノクローナル抗体との相互作用（アールトシュ（Ａｌｔｓｃｈｕｈ ）ら、１９９２年、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　３±、 ６２９８−６３０４）や、固定化されたモノクローナルとＨＩＶコアタンパク質 ｐ２４との間の結合反応およびその逆反応を説明している（カールソン（Ｋａｒ ｌｓｓ。 ｎ）ら、１９９１年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍ ｅｔｈｏｄｓ↓土盈、２２９−２４０）。 クロマトグラフィーのオンラインモニタリング、発酵またはインビボでの使用等 に応用するためのセンサは、理想的にはタンパク質または他の生体分子の濃度に おける変化に対して、迅速で、可逆的、かつ敏感な応答を与えなくてはならない 。通常抗体は抗原に対して強い結合力を有し、濃度をモニタする薬量針として用 いられるにすぎない。このような応用については、抗体の再生（空の抗原結合部 位を再生する）、または使い捨てのものを使用することが必要である。しかしな がら、多くの環境において化学薬品での再生を行なうことはできない。 （再生の必要なく）可逆的に測定可能な、抗体に基づく固相バイオセンサについ て、抗体は、結合する抗原に対して高い解離速度定数（ｒｋ才）」）を有するべ きであることか先行技術より明らかであるが（アンダーソンおよびミラー（Ａｎ ｄｅｒｓｏｎ　ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ　）、１９８８年、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４．１４１７−１４２１）、この著者は継続的なオンライ ン検知のための高い解離速度定数を本来有する抗体またはそのフラグメントを開 示していない。 しかしながら、所望の特性を存する受容体分子（抗体等）を実際に得るのはかな り困難である。これは、適切な候補となる分子を探すためのスクリーニング法が 事実上どれも洗浄ステップを必要とするからである。このような洗浄ステップは 、そのためにスクリーニングしている特性を存する分子までも除去してしまう傾 向がある。 したがって、バイオセンサに関するどの先行技術の開示も、−次免疫処置および その後の適切な実験動物（典型的にはマウス）の刺激の結果として生成される［ 成熟」モノクローナル抗体の使用に関する。これらの抗体は抗原と強く結合する ので、反応を簡単に可逆的にするのは困難である。さらに、これらの抗体は典型 的にはハブテンに対して向けられる。報告されている（上述のアンダーソンおよ びミラー）最短の可逆的応答時間は、（５−１００ｍＭという分析対象物の濃度 が比較的高い範囲について）５−１５分の範囲にあり、これは多くのｒオンライ ン／リアルタイム」の用途のためのパラメータを追従するのに十分に速いとはい えない。さらに、そこで開示されている装置は透析チューブの使用を必要とする 。これは結果として研究できる分析対象物の分子量を大きく制限することとなる 。 発明の概要 第１の局面において、この発明はサンプル中の関心のある分析対象物の溶液中に おける存在を検出するための装置を提供し、この装置は、固体支持体および可逆 的結合受容体を含む固定化された結合パートナ−と、該受容体は関心のある分析 対象物に結合することができ、それによって結合パートナ−の特性に測定可能な 変化を起こすものであり、その測定可能な変化を検出するための検出手段とを含 む。 別の局面において、この発明はサンプル中の関心のある分析対象物の存在を検出 するための方法を提供し、第１の局面に従う装置にサンプルを接触させるステッ プと、結合パートナ−への分析対象物の結合に応答して、結合パートナ−の特性 における測定可能な変化を検出するステップとを含む。 本明細書の目的のため、可逆的結合受容体は、（特定の分析対象物について）１ 秒につきｌＯ−！を上回る解離速度定数（Ｋオフ）を有し、受容体／分析対象物 複合体の半減期は約６０秒に等しいか、それを下回る。 可逆的結合受容体は、好ましくは抗体全体であるか、またはそのフラグメント、 たとえばＦａｂフラグメント、ＦＶフラグメント、１本１ＪＩＦｖフラグメント （ｓｃＦｖ）、１本の重鎮または結合活性を有するペプチド（抗体遺伝子のヌク レオチド配列に基づく）であってもよい。他の例は「ディアボディズ（Ｄｉａｂ ｏｄｉｅｓ　）　Ｊ　（二価性の、すなわち二価の結合特性を有するポリペプチ ド（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）により１９９３年、Ｃｕｒｒｅｎｔ　０ｐｉｎ ｉｏｎ　ｉｎ　Ｉａｕａｕｎｏｌｏｇｙ旦、２５３−２５５に開示される）であ り、これは一方または両方の結合部位が必要な可逆的結合特性を有し得るもので ある。可逆的結合抗体はまた、融合タンパク質等の非免疫グロブリン領域を有し てもよく、そこではたとえば固体支持体に結合したり、またはトランスデユーサ へのシグナルトランスフォーメーションのための別の機能を備えるため、分子の 他のドメインを使用することができる。 代替的に可逆的結合受容体は本質的に全く免疫グロブリンでないものでもよい。 たとえば、受容体はペプチド（免疫グロブリンとは構造的に類似していない；た とえばラム（Ｌａｍ　）ら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ　３５４．８２−８４゜ ホートン（ｌｏｕｇｈｔｅｎ）ら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ　３５４．８４− ８６）であってもよく、またはヌクレオチド配列（たとえばターフおよびゴール ド（Ｔｕｅｒｋ　ａｎｄ　Ｇｏｌｄ）、１９９０年、５ｃｉｅｎｃｅ　２土且、 ５０５−５１０）であってもよい。 可逆的結合受容体（たとえば抗体ｒＡｂＪ　）と抗原「Ａｇ」　（関心のある分 析対象物である）との間の可逆反応が、２つの反応速度、すなわち順方向のＥオ ン」速度定数（Ｋ１）および逆方向の［才）」速度定数（Ｋ、）を有すると考え る。 本発明の装置の可逆的結合受容体は驚くほど高い「オフ」　（解離）速度定数を 有する。たとえば、可逆的結合受容体が抗体（またはそのフラグメント）であれ ば、このような分子は典型的には親和性の成熟を遂げない。 非常に高い解離速度定数は、受容体が分析対象物の存在を検出するために用いら れ、分析対象物の濃度が低下しても、固定化された受容体は分析対象物から迅速 に解離し、この発明の装置が分析対象物の濃度の変化に迅速に応答することを可 能にすることを意味する。この発明は、結果として、変化するパラメータの「オ ンライン」、「リアルタイム」測定に完璧に適しており、定量的にも定性的にも 用いることができる。 本発明の装置で使用するのに適切な抗体または抗体のフラグメントは、ハイブリ ドーマ、または最も好ましくは■遺伝子レパートリから得られる。レパートリは 、免疫処置された（ヒユーズ（Ｈｕｓｅ）ら、１９８９年、タラツクソン（Ｃ１ ａｃｋｓｏｎ）　ら、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ　３５２　、　６２４−６２８ ）または免疫処置されない（マルクス（Ｍａｒｋｓ　）ら、１９９１年、Ｊ、Ｍ ｏ１．Ｂｉｏｌ、２又叉、５８１−５９７）ヒトまたは動物のリンパ球からの転 移Ｖ遺伝子（ワード（Ｗａｒ２８１）のライブラリから得ることができる。単一 の抗体ドメインのレパートリを用いてもよく　（ワードら、１９８９年）、また はＶＨおよびＶＬ遺伝子のレパートリをランダムに組み換えることによって連合 したＶＨおよびＶＬドメインのレパートリを用いてもよい（ヒユーズら、１９８ ９年、先に引用したもの）。その代わりに、抗体Ｖ遺伝子は、■遺伝子セグメン トおよび合成（ランダム）超可変ループからインビトロで転移され得る（ホーゲ ンブーム（Ｈ。 ｏｇｅｎｂｏｏｍ）およびウィンター、１９９２年、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ 。 ２２７．３８１−３８８）。コードされた抗体フラグメントのレパートリはバク テリアから分泌され、抗原に結合することによってスクリーニングすることがで きる（たとえばワードら、１９８９年、先に引用したちの：ヒューズら、１９８ ９年、先に引用したもの）。レパートリはまた、繊維バクテリオファージ、およ び抗原への結合により選択された結合活性を有するファージの表面における表示 （ディスプレイ）をコードするものであってもよい（マツ力ファティ（ＭｃＣａ ｆｆｅｒｔｙ）ら、１９９０年、Ｎａｔｕｒｅ　ａ工１．５５２−５５４；マル クスら、１９９１年、先に引用したもの）。 抗体結合特異性がハイブリドーマから誘導されても、または遺伝子レパートリか ら誘導されても、さらにスクリーニングまたは選別によっても、抗体を抗原に接 触させることが必要であり、この後に洗浄ステップを行なうことかはとんと常に 必要である。所望の抗体は速い解離速度を有するので、抗原との相互作用を長く することが必要である。 これは、ハイブリドーマ上清の二価１ｇＧまたは二価１ｇＭ、もしくは多価ファ ージ粒子を、高い密度で被覆された固相抗原に結合させることで多価相互作用を 起こすことによって達成できる。したがって、抗体またはファージ抗体は、単一 抗体のヘットのそれぞれ単独でよりも高い活性を持って結合する。その代わりに 、−価の相互作用、たとえばＦａｂフラグメントを用いても、固相を高い密度の 抗原で被覆することによって、解離するフラグメントは表面に再結合することか できる。このようにして、速い解離動力学を備える単量体のフラグメントを、洗 浄ステップがあるにもかかわらず多価性を利用することによって、または再結合 を促進することによって識別することができ、そこにおいて受容体／抗原複合体 の解離の正味の速度は低減される（抗原が受容体によって検出されるべき分析対 象物であるか、またはそれに非常に類似している場合）。 さらに別のアプローチは、所望の特性をもたらすように抗体または抗原結合抗体 フラグメントのための既存の遺伝子を変えるか、または「組換える」ことであろ う。このような変更はおそらく可変領域のＣＤＲの変化を含むであろうが、枠組 みの変化をも伴なうであろう。このような変更は既知の方法（たとえば部位特異 的突然変位誘発）によってもたらされてもよい。所望の特性を生むのにどのアミ ノ酸残渣が変更されるべきかが直ちに明らかとなるわけではないが、試行錯誤を 繰返して適切な変更物を得ることは当業者の技量を超えるものではない。 好ましくは可逆的結合受容体は、ハブテン抗原ではなく「通常の」ポリペプチド 抗原に対して向けられる抗原結合フラグメントまたは抗体である。 本発明の装置がバイオセンサの基礎となり得ることが当業者には明らかになるで あろう。好ましくは、この装置はアッセイを行なうための関連の器具ならびにコ ンピュータ制御およびデータ処理手段と連結する。適切な器具、コンピュータ制 御およびデータ処理手段は周知である（たとえばＢ［Ａｃｏｒｅシステム、Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ＡＢ）。 好ましくは、測定可能な変化を経験する固定化された結合パートナ−の特性は光 学特性である。最も好ましくは、この特性は表面屈折率であるが、たとえば電気 的、電気化学的特性または圧電特性：エバネッセント波に基づく屈折率測定法、 エハネッセント波に基づく撮像：透過に基づく屈折率測定法、または表面弾性波 （ＳＡＷ）測定に基づく他の検出手段も知られている。 この発明の装置の好ましい具体例は１１０−２００ｎの濃度範囲の分析対象物を 定量的に検出することができることがわかった。さらに、この発明の好ましい具 体例は約２５秒の可逆的応答時間を有し、先行技術（アンダーソンおよびミラー 、１９８８年、先に引用したもの）で説明される最も迅速な装置よりもかなり速 いことがわかった。 好ましくは、検出手段は、たとえばＢ［Ａｃｏｒｅ装置のように、固定化された 結合パートナ−への分析対象物の結合を検出するのに表面プラスモン共鳴（ＳＰ Ｒ）の使用を伴なう。 この発明の種々の局面を以下の実施例および図面を参照してさらに説明する。 図１ａは本発明に従う装置の一実施例の概略側面図、および図１ｂはその概略上 面図を示す。 図２は、図１で示される装置の一部を拡大した概略側面図である。 図３は、本発明の装置および方法を用いたアッセイの濃度に対する用量／作用曲 線を示す。 図４は、時間に対する相対的応答のグラフを示す。 図５は、固定化された抗原を用いたセンサによる組換え抗体フラグメントの検出 に関し、時間に対する相対的応答のグラフを示すもので、３つの追跡記録を示す 。 図６８は、時間に対する共鳴信号のグラフで３つの追跡記録を示す。 図６ｂは、時間に対する共鳴信号の変化速度（ｄＲ／ｄｔ）のグラフで２つの追 跡記録を示す。 ４、

【図面の簡単な説明】

図１ａは、本発明に従う装置の一実施例を側面から模式的に示す。発光ダイオー ド（ＬＥＤ）１０によって照射された光は、コリメータ１２、集光レンズ１４お よびプリズム１６を介してセンサチップ１８に当たる。入射角が大きいため、光 は全反射し、プリズム１６を出て対物レンズ２０、シリンドリカルレンズ２２、 および平面偏光子２４を透過して光検出器２６に当たる。このシステムによって 、入射角（６６−６９°）の範囲が可能となり、光検出器が時間の関数として反 射角の変化をモニタすることを可能にする。矢印２８は最小反射率の仮説上の光 路を指す。この装置はまたコンピュータ制御およびデータ処理手段（図示せず） を含む。 同し実施例か図１ｂに模式的に上面図で示される。この装置はヨーンソンら（先 に引用した）によりよく説明されている。 図２はセンサチップ（図１ａＳ　ｌｂの１８）とフローチャネルとの間のインタ フェースを概略的に示す。センサチップ１８は、薄い（４７ｎｍ±１５ｎｍ）金 の膜３２で被覆されたガラス支持体３０を含む固定化された結合パートナ−とし て作用する。フレキシブルな親水性ポリマー（たとえばデキストラン）３４が、 金の膜３２に結合し、金の膜３２からフローチャネル３６の方に約１０１００ｎ 緩衝剤の条件に依存する）延びている。抗体３８は標準的な化学作用によってフ レキシブルな親水性ポリマー３４に結合する。したがって、この装置の固定化さ れた結合パートナ−は固体支持体３０および抗体３８を含む。抗体はフローチャ ネル３６を通るサンプル中の特定の分析対象物４０と相互作用することができる 。角度θは入射光の角度を示す。 Ｒは反射光である。 この発明の有用性を示すために、上述のものと同様の装置を用いていくつかの実 験を行なった。これらには本質的に２つのタイプかある。一方のグループの実験 は、抗体フラグメントによって結合される抗原のさまざまな濃度を検出するため にセンサチップ上に固定化された組換え抗体フラグメントを用いた。 第２のグループの実験は、「成熟ｊモノクローナル抗体フラグメントの挙動と比 較して、ゲルろ過カラムからの流出物としてセンサを通る、組換えなしの抗体フ ラグメントの結合（および放出）を検出するために、センサチップ上に固定化さ れた抗原を用いた。 第１のグループの実験は、効果的な「リアルタイム」免疫検知における抗体フラ グメントの有用性を示すために行なわれた。 アフィニティ精製された抗Ｆｏｇ　−１ｓ　ｃＦｖ　（９３８ＲＵ）が、１０ｍ Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ４，５）において約３ｕＭの溶液を用いるアミン結合キッ トを用いてＣＭ５センサチップ上に固定化された。溶出緩衝液において１１０− ２００ｎの範囲の濃度のヒト１ｇ０１カツパ（Ｆｏｇ−１抗原を有する）が、再 生を間にはさむことな（、各濃度について５サイクル、固定化された抗Ｆｏｇ− １ｓｃＦＶにかけられた。ＢＩＡｃｏｒｅシステムでの分析が、ＰＢＳＯ，２ｍ Ｍ　ＥＤＴＡｌｏ、０５％界面活性剤Ｐ２０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅ ｎｓｏｒ　ＡＢ）において１０ｕｌ／分で行なわれた。 各サンプル注入の２５秒後に達した応答レベルは用量作用曲線にプロットされ、 その結果が図３に示される。グラフが示すほぼ真っ直ぐな線は、用いられた条件 の下で応答が抗原の濃度に比例し、この比例がより広い濃度範囲にわったて続く ことを示している。 応答の迅速さを示すために、同じ濃度の抗原がマニュアルモードにおいて（コマ ンドを待ち行列に入れることによって）順に注入することによって、固定化され た抗Ｆｏｇ−１にかけられた。そして注入は、サブルーチン（針の洗浄およびル ープ充填に関する）がＢＩＡｃｏｒｅシステムによって処理できる限りで迅速に 行なわれた。濃度は２００．１Ｏ１４０，２０，１６０，８０および１２０ｎＭ であった。 一連の注入の間の時間遅延は１３０秒であった。同じサンプルが対照として裸の ＣＭ５チップにもかけられた（細い線）。 結果は、時間（秒）対応答（ＲＵ）のグラフである図４に示される。 グラフより、一連の濃度の各々について、次の濃度の抗原が注入される前に応答 がベースラインに戻ったことがわかる。このことは、ＢＩＡｃｏｒｅが、迅速、 可逆的、かつ半連続的な濃度の測定において決定的なファクターであることを意 味している。 第２のグループの実験では、２つの異なる組換え抗体フラグメント、すなわち合 成遺伝子ライブラリから誘導されたハブテン２−フェニルオキサゾール−５−オ ン（ｐｈ。 Ｘ）に対して親和性の低い５ｃＦｖ（ボーゲンブームおよびウィンター（１９９ ２年）によりＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、２２７．３８１−３８８に説明される）と 、ＦｏｇＬＩ　（ヒトＴｇＧｌカッパ抗原）に対して向けられたナイーブなライ ブラリから誘導された５ｃＦｖ（グリフイス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ　）ら、（１ ９９３年）、ＥＭＢＯＪ、旦、７２５−７３４に説明される）とにつき、オンラ インゲルろ過センサによる記録において異なる親和性の効果を分析した。これら の挙動は「成熟」モノクローナル抗体（ＭＡｂ）Ｄｌ、３　（鶏卵のリゾチーム 、ＨＥＬに対して向けられた）から誘導された５ｃＦｖと比較された。 実験は以下に述へるように行なわれ、親和効果の重要性を示している。 ＦＰＬＣ装置（Ｐｈａｎｎａｃｉａ−ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａ Ｂ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）が、はぼ上述したとおりのＢＩＡｃｏｒｅ 装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ＡＢＳＵｐｐｓａｌａ　、ス ウェーデン）にできるだけ近く置かれ、ＵＶ検出器からのアウトレットがオート サンプラーのコネクタブロックにおけるポンプチューブインレットに接続された 。０．５ｍｍのステンレス管が、流出物がフラクションコレクタに集められるよ う、フローセルからドレインに接続された。スーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅ ｘ）　７５　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラム１．ＯＸ３０ｃｍが、０゜５ｍ１／分の流速 てＰＢＳｏ、２ｍＭ　ＥＤＴＡにおいて用いられた。Ｂ［Ａｃｏｒｅ装置内に組 込まれたフロー系（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｆｌｕｉｄｉｃｓ　）　（Ｉ　Ｆ　 Ｃ）　ヘの損傷を避けるために、それより速い流速は用いなかった。ＵＶモニタ のアウトレットからＢＩＡｃｏｒｅ装置のインレットまでの距離は約１５ｃｍで あった。ＢＩＡＣＯｒｅ装置においてマニュアルでのセンサによる記録が取られ 、エクセル（Ｅｘｃｅｌ　）ソフトウェアで表現された（図５−６ｂ）。 適切な抗原が、アミン結合キット（ヨーンソンらによって（１９９１年）　Ａｎ ａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｉ　９８．２６８−２７７に説 明され、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ＡＢがら入手）を用いてＣ Ｍ５センサチップに固定化された。ハブテンｐｈｏｘはＢＳＡに結合され、結果 として生じる抗原はマルクスら（１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　 １０．７７９−７８３）によって説明される方法に従い約１３００相対的共鳴単 位（ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｕｎｉｔｓ　）　（ＲＵ）のレベルまでセンサに結合 され、１０ｍＭ酢酸塩緩衝液ｐＩ（５，０中のＨＥＬ２０ｕｇ／ｍｌ溶液を用い て、鶏卵リゾリームが約８゜ＯＲＵのレベルまで結合された。 カラムのサイズキャリブレーションが、各々が０５のＯＤを有するＢＳＡ、オボ アルブミンおよびＨＥＬの混合物を分離するためのカラムを用いて行なわれ、Ｂ ＩＡｃｏｒｅ装置を用いてカラムの流出物における屈折率変化を検出した。 この第２のグループの実験の最初の結果が図５に示され、異なる親和性および動 力学定数がＢＩＡｃｏｒｅシステムを用いての応答にいかに影響するかを示して いる。 図５は時間（秒）に対する相対的共鳴単位（ＲＵ）のグラフである。３つの追跡 記録か示され、適切な抗原で被覆されたＣＭ５チップへのゲルろ過流出物中の抗 体フラグメントの結合による特定的応答を示している。細い線は、Ｄｌ、３のア フィニティ精製された５ｃＦｖ　（ｒ成熟」抗ＨＥＬ抗体）の結合に対する記録 である。（この５ｃＦｖは、クラックソン（Ｃ１ａｃｋｓｏｎ）ら、［１９９１ 年］　、Ｎａｔｕｒｅ３５２．６２４−６２８に説明されるように、Ｃ末端ｍｙ Ｃ＝タグ（ｔａｇ）を用いる固定化抗体９ＥＩＯを用いた上清からのアフィニテ ィクロマトグラフィーによって精製された。）一番下（点線）の記録は、抗ｐｈ ＯＸ　５ｃＦｖクローン３１の結合に対するもので、最も太い記録は抗Ｆ□ｇ− １ｓｃＦｖの結合に対するものである。この結果は、３つの５ｃＦｖフラグメン トすへてかある程度集まり、Ｓｃ　Ｆ　ｖフラグメントの吸着が、５ｃＦｖ単量 体および二量体の溶出に対応する時間に起こったことを示している。親和性の高 いＤｌ、３ｓｃＦｖは、単量体および二量体の両方の溶出中に抗原表面に吸着さ れるが、他の２つの５ｃＦＶフラグメントは、二量体ピークの通過した後がなり 高い解離速度を示し、単量体の溶出に対応する点て再び吸着された。 Ｂ［Ａｃｏｒｅ装置を用いたオンライン検出の特異性を示すために、増殖培地に おけるｐｈＯＸに対する２つの組換え抗体フラグメントがゲルろ過に供された。 Ｂ２と称する一方のｓ　ｃＦｖはチェインンヤッフリング（ｃｈａｉｎ　ｓｈｕ ｆｆｌｉｎｇ）（マルクスら、１９９２年、先に引用したもの）によるライブラ リから誘導された。他方はＮＱＩＯと称するＦａｂフラグメントてあり、親和性 の高いＭＡｂがら誘導され、サイズマーカーとして用いられた。 ５ｃＦｖ　Ｂ２を含む増殖培養物の上清か、ＣｅｎｔｒｉｃｏｎｌＯ濃縮装置（ Ａｍｉｃｏｎ）での限外ろ過によって５倍に濃縮された。ＦａｂフラグメントＮ ＱＩＯは培養物の上清から直接得られた。 ２つのゲルろ過流出物が、抗原被覆されたチップと裸のＣＭ５センサチップ表面 の両方にかけられた。空の部分からの吸着は抗原チップ上において見られず、裸 のＣＭ５表面上でも物質は吸着されなかった。しかしながら、ペプチドおよび他 の着色された物質か、特定の検出およびコントロールの両方（こおいて分離の後 半で屈折率に変化をもたらした。これらの結果は図６ａおよび６ｂにグラフで示 される。図６ａは時間（秒）に対する共鳴単位のグラフである。 図６ｂは時間（秒）に対する共鳴信号の変化速度（１秒当たりのＲＵ）のグラフ である。 図６ａは、Ｂ［Ａｃｏｒｅ装置によって検出されたｐｈＯＸ−ＢＳＡ被覆表面へ の抗ｐｈＯＸ　（Ｂ２）ｓｃＦｖ　（太い記録線）および抗ｐｈＯＸ　ＮＱ１０ Ｆａｂフラグメント（細い記録線）のオンライン特異的結合を示す。増殖培地に おける抗体の両方がスーパーデックスフ５において分離された。グラフの下部に ある点線は、被覆されていないＣＭ５センサチップ表面にかけられた増殖培地中 のＮＱＩＯによって与えられるものである。 ＮＱｌｏＦａｂおよびＢ２の二量体が同じ位置で溶出され、５ｃＦｖ　Ｂ２の単 量体がセンサによる記録において別のピークとして認められる。抗原表面からの Ｆａｂ　ＮＱＩＯの解離は、ピークの位置から、培地からの小さなペプチドおよ び他の栄養分が溶出する（Ｔ＝２０００−２５００の時点）まで、対数的減少の 形状を呈する。これは、単量体５ｃＦｖの速い減少（その可逆的結合特性による ）と約１５００ｓから見られるゆっくりとした解離とが混在しているＢ２の解離 プロファイルとは対照的である。これは、２つの結合部位によりハブテン化され たＢＳＡへ結合するＢ２二量体の安定化の結果であるかもしれない。 図６ｂは、図６ａにおいて５ｃＦｖ　Ｂ２　（実線）およびＮＱｌｏＦａｂ（破 線）について示される信号の導関数（ｄＲ／ｄｔ）を示す。最大結合速度は、二 量体Ｂ２およびＮＱｌｏＦａｂの両方について同じ溶出位置に見られ、もう１つ のピークは単量体Ｂ２の溶出に対応する（アルブミン、オボアルブミンおよびリ ゾチームスタンダードでのキャリブレーションに基づく）。５ｃＦｖ単量体の迅 速な解離は大きな負の値として見られる。 ００ｏ口０　Ｃ）　Ｃ１口０ロ ００００００口ｏ。 かのｒ＋すｕ＋Ｉ譬ｎ〜− （ｎＨ）”ｄｓＪ８°ｌａｄ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．サンプル中において関心のある分析対象物の溶液における存在を検出するた めの装置であって、固体支持体および可逆的結合受容体を含む固定化された結合 パートナーを含み、前記可逆的結合受容体は関心のある分析対象物に結合するこ とができ、それによって固定化された結合パートナーの特性に測定可能な変化を 起こすものであり、さらに前記測定可能な変化を検出するための検出手段を含む 、装置。
2. ２．前記可逆的結合受容体が抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求 項１に記載の装置。
3. ３．前記可逆的結合受容体が、受容体／抗原複合体の解離の正味の速度が低減さ れる方法によって選択される、請求項１または２に記載の装置。
4. ４．前記可逆的受容体が、Ｖ遺伝子レバートリから得られるヌクレオチド配列に よってコードされるポリペプチド配列を含む抗体またはその抗原結合フラグメン トである、先行する請求項のいずれか１つに記載の装置。
5. ５．前記受容体がファージ表示方法を用いるライブラリから選択によって得られ た抗体またはその抗原結合フラグメントである、先行請求項のいずれか１つに記 載の装置。
6. ６．前記受容体が１本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦＶ）を含む、先行する請 求項のいずれかに１つに記載の装置。
7. ７．前記固定化された結合パートナーの光学特性が測定可能な変化を受ける、先 行する請求項のいずれか１つに記載の装置。
8. ８．前記固定化された結合パートナーの表面屈折率が測定可能な変化を受ける、 先行する請求項のいずれか１つに記載の装置。
9. ９．前記検出手段が、前記固定化された結合パートナーの表面プラスモン共鳴（ ＳＰＲ）を測定することを含む、先行する請求項のいずれか１つに記載の装置。
10. １０．前記装置が、１０−２００ｎＭの濃度範囲にある分析対象物を定量的に検 出することができる、先行する請求項のいずれか１つに記載の装置。
11. １１．前記可逆的結合受容体が、ポリペプチド抗原に対して向けられる抗体また はそのフラグメントである、先行する請求項のいずれか１つに記載の装置。
12. １２．５分よりも顕著に短い可逆的応答時間を有する、先行する請求項のいずれ か１つに記載の装置。
13. １３．関心のある分析対象物のオンライン定性的または定量的検出のために用い られる、先行する請求項のいずれか１つに記載の装置。
14. １４．サンプル中の関心のある分析対象物の存在を検出する方法であって、サン プルを請求項１−１３のいずれか１つに従う装置と接触させるステップと、前記 結合パートナーへの分析対象物の結合に応答する、前記結合パートナーの特性に おける測定可能な変化を検出するステップとを含む、方法。
15. １５．関心のある分析対象物のオンライン定性的または定量的検出を含む、請求 項１４に記載の方法。