JPH07508352A - 腫瘍マーカー対照 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 腫瘍マーカ一対照 発明の分野 本発明は、一般的には、ｉｎ　ＶｉｔｒＯ診断アッセイにおいて使用するための 、ヒトの血清に基づく安定な対照に関し、より具体的には、腫瘍マーカーについ てのｉｎ　ｖｉｔｒｏ診断アッセイの精度をモニターする際に使用するためのヒ トの血清に基づく安定な対照に関する。

発明の背景 腫瘍マーカーは、腫瘍細胞によって血流中へ放出される物質である。腫瘍マーカ ーは、血清その他の体液中において検出することができ、種々の感性腫瘍を臨床 的にモニターするために作用である。

腫瘍マーカーという語は、癌遺伝子又は異常に発現されたタンパク質、例えば腫 瘍のタイプに関係しそれを同定する助けとなる酵素、ホルモン、及びレセプター 等のような、細胞又は組織の特徴を含むまでに拡張されてきた。

臨床腫瘍学者は、患者の状態の診断並びに予後の推定及び治療のモニタリングの 助けとするために、体液中のこれらのマーカーの存在及び／又は量を測定する。

腫瘍マーカーの血清アッセイが市販されている。これらの血清アッセイは、ラジ オイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイその他の臨 床分析技術のようなアッセイ系を用いて実施される。

これらのアッセイ系の正確さ、精密さ、及び信頼性を管理し及びモニタリングす ることは、患者が正しい治療を受けていること及びアッセイ結果が医療上適切で あることを保証するために、極めて重要である。

現在、幾つかのヒトの血清に基づく対照が市販されている。対照は、一般には、 例えば高い、低い及び／又は正常範囲のような、特定の範囲を表すレベル内にあ る。これらの市販の腫瘍対照製品には、ＰＯＬＹλＩＥＤｃＯからのＣａｎｃｅ ｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌｓ　、　ＮＭＳ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ ｃａｌｓ、Ｉｎｃ、からのＴ−八ＩＡＲＫＥＲｓ　ＱｔＪＡＬ［ＴＹ　Ｃ０ＮＴ Ｒ０Ｌ　ＳＥＲＵＭ　、及び８１０−ＲＡＤからのＬＹＰＩ（ＯＣＨＥＫ■Ｔｕ ｍｏｒ　Ｍａｒｋｅｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌが含まれる。現在市販されている対照は 、しかしながら、臨床腫瘍学者によって必要とされている腫瘍マーカーの多くを 欠いている。更には、現在入手できる市販の対照は、限られた透明性、限られた 凍結乾燥安定性及び限られた復元後安定性を有している。更に、市販の対照のう ちには、僅か２つのレベルの対照（すなわち「高」及び「低」）てしかないもの がある。加えて、市販の対照の成分の濃度のうちには、完全に有用であるには余 りに高過ぎるか又は余りに低すぎるものがある。

腫瘍マーカーのいくつかを精製するための方法が発表されてきたが、これらの方 法の多くは、手間がかかり数段階を要する。各追加の段階が、腫瘍マーカーの収 率の低下をもたらす。対照として使用するためには、腫瘍マーカーは、これらの 精製法のあるものによって得られるような高い純度を必ずしも要しない。

こうして、一層広範な腫瘍マーカーを有し、それらのマーカーの個別の有用範囲 を有しそして高められた光学的透明性と安定性とを有する、腫瘍マーカ一対照に 対する需要がある。また、この意図した用途にとっては十分である高い収率と純 度とをもたらす、これら腫瘍マーカーのうちのあるものの一層簡単な精製方法に 対する需要もある。

発明の要約 本発明の、ヒトに基づく血清又は血漿対照は、好ましくは、患者の診断のために 臨床腫瘍学者によって利用される腫瘍マーカーの多くを含有する。本発明の、ヒ トに基づく血清又は血漿対照は、高められた凍結乾燥及び復元後安定性を有し、 且つ復元後の光学的透明性が高められている。

発明の詳細な記述 本発明のヒトに基づく血清又は血漿対照は、ヒト男性の脱脂血漿又は血清よりな るベースと腫瘍マーカーとを含む。該腫瘍マーカーには、副腎皮質刺激ホルモン （ＡＣＴＨ）　、アルドステロン、αフェトプロティン（ＡＦＰ）、β２−ミク ログロブリン（８２Ｍ）、ＣＡ　１５−３■ＣＡ１２５■、ＣＡ　１９−９０、 ＣＡ　１９−９０（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ　Ｉｎｃ。

の一部門であるＣｅｎｔｏｃｏｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓの登録商標）　、Ｃ Ａ３４９　、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）　、フェリチン、ガストリン、ヒト絨毛性 ゴナドトロピン（ｈＣＧ）　、β−ｈＣＧ、γ−エノラーゼ（ＮＳＥ）、プロラ クチン、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）　、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ） 　、組織ポリペプチド抗原（ＴＰＡ）　、カルシトニン及びＬＤ−１が含まれて よい。該対照には保存剤系も含有される必要がある。該保存剤系としては、凍結 乾燥前及び凍結乾燥後の双方において安定である保存剤を含有しなければならな い。

ある種のマーカー、特に、微生物によって産生されるプロテアーゼに非常に感受 性の高い酵素の復元後安定性を保証するためには、保存剤系が必要である。組み 合わせた保存剤が添加される。好ましい保存剤系は、硫酸ゲンタマイシン、シク ロヘキシミド及びブロクリン（Ｐｒｏｃｌｉｎ）　３００　（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ 　Ｈａａｓ）の組み合わせである。ブロクリン３００は、しかしながら、凍結乾 燥後には効果がなく、製造工程に際して微生物の増殖を制御するのに有用である 。硫酸ゲンタマイシン及びシクロヘキシミドは、復元後に微生物の増殖を制御す るのに使用される。主としてアジドの爆発性という有害性のために、アジ化ナト リウムは使用されない。

凍結乾燥対照の安定性は、少なくとも約１年は必要であり、好ましくは少なくと も約３年である。大半の成分の復元後安定性は、少なくとも７日必要であり、好 ましくは少なくとも約１４日である。

ヒトの血清又は血漿よりなるベースは、ＰＡＰマーカーの安定性を保存するため に、実質上全て、男性供与者からのものでなければならない。実質上全て男性の 血清又は血漿の存在下においては、ＰＡＰは非常に安定である。女性の血清及び 血漿は、この酵素マーカーに対する抗体を含有するかも知れない。該抗体がある と、対照溶液からＰＡＰが効果的に排除されてしまうであろう。もしも女性の血 清又は血漿からそれらの抗体がうまく除去されるかそれらの作用が除去されるな らば、得られる血清又は血漿は、ベース材料として利用できよう。

ヒトの血清又は血漿中の脂質の量は、減少させなければならない。脂質含量は、 血清又は血漿をシリカ微粒子又は硫酸デキストランで処理するか又は他の既知の 方法で減少させることができる。脂質を減少させるために用いられる方法は、ヒ トの血清又は血漿中のコレステロール及びトリグリセリドの含量が、処理後それ ぞれ２０ｒｎ　ｇ／ｄＬ未満であることを保証しなければならない。脂質含量を 減少させるべき理由は少なくとも３つある。

第１に、変性又は酸化され易い添加された腫瘍マーカーの安定性は、脂質含量が 減少されると増大する。これは、脂質が分解するとき、マーカーのうちのあるも のの安定性を害し得る酸化副生成物を生じるためである。更には、脂質の分解は 溶液の濁りをもたらす。

第２に、脂質の減少は、復元過程の助けとなる。凍結乾燥対照は、脂質が除去さ れていると、液体を添加したとき直ちに復元される。

もしも通常量の脂質を含有する血清又は血漿を用いると、凍結乾燥対照の復元時 間は約１５乃至３０分だけ遅れる。

第３に、高レベルの脂質は、腫瘍マーカーうちののあるものの測定の妨害の原因 となる。こうして、脂質のレベルの減少は、より正確なアッセイ結果をもたらす 。

該対照のためのベースとして利用される血清又は血漿は、腫瘍マーカーの添加の 前に、添加されるべき該腫瘍マーカーについてアッセイしなければならない。

表１は、該ベース材料に添加される種々のタイプの腫瘍マーカーの分類である。

表■は、腫瘍マーカーと、該マーカーに通常関連している癌のタイプを掲げてい る。表■は、数種類の腫瘍マーカー源を掲げている。

該ベース材料に添加される腫瘍マーカーは、比較的純粋でなければ、すなわち他 のマーカーと交差汚染されていない又は妨害物質によって汚染されていないもの でなければならない。天然のヒト形感である腫瘍マーカー源を用いるのが最善で あるが、しかし、多くのヒト起源の腫瘍が１種より多くのマーカーを産生ずるこ とが判明している。ベース材料へのこの原料の添加は、各腫瘍マーカーの正確な 量を有する対照を処方することを困難にする。ある場合には、腫瘍マーカーが、 低い又は正常の対照のレベルのために用いるには結局高すぎる量に加えられるこ とになり得る。従って、この問題を回避するためには、多くの腫瘍マーカーは交 差汚染を除去するために精製されなければならない。加えて、ベース材料に添加 されるべき腫瘍マーカーは、交差汚染及び既知の妨害物質の存在について測定す るためにアッセイされなければならない。

８２Ｍは、腎臓障害のある患者から収集された尿から精製することかできる。粒 子を除去し尿を適当な緩衝液中へ適当な濃度に透析濾過しそして濃縮する。８２ Ｍ（タンパク質である）は、約１１．０００ダルトンのおよその分子量を有する 。従って、それはゲル濾過クロマトグラフィーのようなサイズ排除クロマトグラ フィーを用いて精製できる。好ましいゲル祠料としては、Ｕｌｔｒａｇｅｌ　Ａ ＣＡ　５４又はそれと同等の物がある。２８Ｍを含有する両分をプールし、好ま しくは少なくとも約１ｇ／ｄＬｌニー濃縮し、次いて精製物を、電気泳動のよう な既知の方法を用いて定量することができる。加えて、８２Ｍは、市販のイムノ アッセイによって試験される。８２Ｍは、約２〜８°Ｃて又は−２０°Ｃより低 い温度に凍結して貯蔵するとき、安定である。得られる８２Ｍは、８２Ｍの有用 性に影響を及はすことなく約７０％のまでのイムノグロブリンよりなる不純物を 含有することができる。

ＣＡ１２５は卵巣癌に特異的なマーカーである。このマーカーは、卵巣癌を有す る患者から採られた腹水中に見いだすことができる。

該腹水は、２つのマーカーＣＡｌ２５及びＴＰＡを含む。ＴＰＡによる汚染のレ ベルは非常に高く、従って、各ＣＡ１２５及びＴＰＡの正確な量を添加するため には、それらのマーカーを分離しなければならない。これらのマーカーの双方と も、腫瘍の増殖に際して血清中に漏れ出し、これらのマーカーの類似性のために それらの分離は困難である。ＴＰ’Ａは、およその生理学的ｐＨのリン酸緩衝液 中において、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体であるフェニルセファロー ス（Ｐａｒｍａｃｉａ社）に結合することが見出された。　約５０ｍ　Ｍのリン 酸塩よりなるｐＨ約７．２のリン酸緩衝液が好ましい。該腹水は、フェニルセフ ァロースのカラムにかけられる。大部分のＣＡ１２５は、フェニルセファロース に結合せず、カラムを素通りして流れ、回収される。次いてカラムを、約２．５ Ｍの尿素を添加したリン酸緩衝液で洗浄する。この緩衝液は、残っているＣＡ１ ２５を溶出する。次いて該カラムを、約６Ｍの尿素を添加したリン酸緩衝液で洗 浄する。ＴＰＡは、この緩衝液で溶出し、回収される。

通常、フェニルセファロースを用いたクロマトグラフィーは、結合を起こさせる ために高い塩類濃度を必要とする。しかしながら、驚くべきことに、ＴＰＡは高 い塩類濃度なしでも結合する。このように、この分離が疎水性相互作用によるも のでないことから、この分離が起こることは凡くべきことである。分離されたタ ンパク質は、尿素を除去するために緩衝液交換され、そして、好ましくは約１ｇ 　／　ｄ　Ｌより高いタンパク質レベルにまで濃縮される。タンパク質の分離は 、分離されたタンパク質を市販のイムノアッセイ法を用いてアッセイすることに よって確認される。

ＣＥＡ、ＣＡ１９−９及びＴＰＡは、しばしば同じ源から得られる。

従って、それらを互いに分離しなければならない。ＣＥＡは、約２゜ｏ、　ｏｏ ｏダルトンの大型の糖タンパク質であり、結腸癌の患者の血清中に高いレベルで 見出される。ＣＥＡは、子宮内生活中に発現され誕生後は消失する、癌胎児性抗 原の一つである。癌胎児性抗原は、妊娠中に出現していた器官における修復又は 新生物の増殖の状態において、再び出現する。肺癌、胃癌、乳癌、及び膵臓癌の 患者において、高レベルであることが判明している。ＣＡ　１９−９は、腫瘍ム チン抗原である。腫瘍ムチンは、約２００．０００ダルトンから１０００　ｋ　 Ｄ　Ａの高分子量の糖タンパク質であり、約２５％乃至８０％の炭水化物を含む 。腫瘍マーカーとして、ＣＡ　１９−９は、膵臓癌及び胃腸癌を有する患者にお いて上昇している。

ＣＥＡ、ＣＡ１９−９及びＴＰＡＯ源の一つは、５Ｗ１１１６として規定された 細胞系である。５Ｗ１１１６は、結腸直腸癌から得られたヒトの細胞系である。

この癌細胞は、細胞増殖培地中に抗原を分泌する。

それが産生されているとき細胞増殖培地を集めて凍結する。細胞上澄を解凍し、 約２０倍に濃縮する。濃縮された上澄を、生理学的ｐＨのリン酸緩衝液のような 緩衝液へと緩衝液交換する。好ましい緩衝液は、ｐＨ７，２の５０ｍＭリン酸緩 衝液である。

ＣＥＡ、ＣＡ１９−９及びＴＰＡは、幾分異なってはいるが、それらはいずれも 糖タンパク質であり、典型的なりロマトグラフィーによっては分離するのが非常 に困難である。ＣＥＡを沈殿させるための過塩素酸処理を用いる沈殿法が、提案 されているが、その方法ではｆｆｔ製マーカー収率は低い。

こうして、これら３ｆｆｆｉのマーカーを精製する方法が開発された。

該濃縮された、緩衝液交換された上澄がフェニルセファロースカラムにかけられ る。８２Ｍの精製について記述したように、ＴＰＡは、高濃度の塩類の存在なし にクロマトグラフィー媒体に結合する。

次いてカラムをリン酸緩衝液で洗浄し、溶出液を各画分に回収する。イムノアッ セイによって決定されるように、これらの画分は、殆どＣＡ　１９−９を含有す るが、特定の両分はＣＥＡを含有する。

ＣＥＡ／ＣＡｌ９−９画分は、当該分野において知られた方法を用いてアフィニ ティークロマトグラフィーによって分離でき更に精製できるａ　Ｆｏｒｄ、　Ｃ ，Ｈ，Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、Ｉｍｍｕｎｏａｄｓｏｒｂｅｎｔ　Ｐｕｒｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ　ｕｓ Ｉｎｇ　Ａ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ：　Ａ　Ｄｊｒｅｃｔ　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　Ｍｅｔｈｏ ｄ、Ｔｕｍｏｒ　Ｂｉｏｌ、Ｖｏｌ、８：ｐ、　２４１−２５０　（１９８７） に開示された方法においては、ＣＥＡに特異的な抗体を取りつけたクロマトグラ フィー媒体を含んだカラムが調製される。このカラムはＣＥＡ除去することがで き、ＣＡ　１９−９はカラムを通過する。ＣＥＡはカラムから除去されることが できる。しかしながら、市販のＣＥＡの別の源がある。従って、この方法を用い る必要はない。

ＣＥＡはこの方法で得る必要がないから、フェニルセファロースカラムからの各 画分を合わせ、次いで、フェニルセファロースカラムを、如何なる追加のＣＡ　 １９−９をも除去するために２乃至３Ｍの尿素を含んだリン酸緩衝液（好ましく はｐＨ７，２の５０ｍ　Ｍリン酸塩）で洗浄するのが好ましい。溶出液を集める 。ＣＡ　１９−９を、及びＣＡ１９−９とＣＥＡとを含有する全ての両分を合わ せる。カラムを次に、６Ｍの尿素を含んだ同じ緩衝液で溶出する。ＴＰＡが溶出 し、集められる。

該ＣＡｌ９−９／ＣＥＡ含有プールを緩衝液交換して尿素を除き、少なくとも約 １　ｇ／ｄ　Ｌにまで濃縮する。該濃縮液を凍結する。ＣＡ１９−９の長期の凍 結はＣＥＡの活性低下をもたらすが、しかし、ＣＡ１９−９の活性は保存される 。従って、精製方法全体が単純化できる。

凍結時間の長さは、イムノアッセイ法にょっＣＥＡの存在について該濃縮液の一 部分を試験することによって決定できる。およその回収率は１００％に達し得る 。

代わりとして、ＣＥＡ／ＣＡｌ９−９を含有する両分を捨てることもてきる。次 いで、ＣＡ　１９−９を含有する画分のみがプールされ濃縮される。

ＴＰＡもまた、緩衝液交換され、上述のように濃縮される。ＴＰＡの回収率もま た約１００％に達する。交差汚染は、イムノアッセイ法を用いて測定される。

ＣＥＡは、モノクローナル抗体法を用いて得られるが、又は他の市販の源から得 ることができる。ＣＥＡは、対照において使用する前に、イムノアッセイ法を用 いて交差汚染について試験する必要がある。汚染が検出されたならば、そのＣＥ Ａは当該分野で知られた方法の一つ、好ましくは上述のアフィニティー法を用い て精製しなければならない。

ＮＳＥは新鮮な又は凍結されたばかりのヒト脳から得られる。精製されたＮＳＥ は、市販のものを入手できる。好ましい精製方法は、脳のホモジネートを調製し 、該ホモジネートを遠心しそして上澄を収集することによって達成される。次に 、４０％の硫酸ナトリウムを用いて上澄をペレット化する。ペレットを、１０ｍ Ｍのトリスリン酸緩衝液中に再懸濁させ、該緩衝液に対して透析し、次いて濃縮 する。濃縮液を、Ｄ　Ｅ−５２上でクロマトグラフィーにかけ、０．１５Ｍ〜０ 、３５Ｍの塩化ナトリウム勾配を用いて溶出させる。ＭＳＥを含有するピークを 透析し、凍結乾燥しそしてセファデックスＧＩ５０その他によって分画する。ポ リバッファー（Ｐｏｌｙｂｕｆｆｅｒ）置換クロマトフオーカシングが、ＮＳＥ を集中させるために使用される。ＮＳＥを次いて溶出させ、モしてＧ−１５０（ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ）によって最終的にに分画する。

最後に、ＡＦＰを精製しなければならない。ＡＦＰは、ＣＥＡ同様癌胎児性抗原 の−っである。ＡＦＰは、胎児の肝臓及び消化管中に発現される糖タンパク質で ある。成人においては、血清中におけるこの抗原のレベルの上昇は、悪性の肝癌 と関連しており、ある場合には、卵巣癌及び呆丸癌と関係している。この抗原の 最も優れた源は、出産時に収集されるヒトの調帯血清である。この血清は、高レ ベルのＡＦＰ　（約６０．０ＯＯｎ　ｇ／ｍ　Ｌ）を含み、そして汚染する腫瘍 マーカーを一つしか（プロラクチン）含まない。

当該分野において記述されているＡＦＰの精製方法がある。例えば、Ｃｈｕｄｙ 　Ｄ、　ａｎｄ　Ｚｉｚｋｏｓｋｙ　Ｖ、、　Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｒａ ｐｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒｔｈｅ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ 　ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｈｕｍａｎ　ｃｏｒｄ　ｓ ｅｒｕｍ、　Ｎｅｏｐｌａｓｍａ　３４（４）、　ｐｐ、４９１−４９６　（１ ９８７）は、そのような手順の一つを記述している。本発明の目的のためには、 プロラクチンからのＡＦＰの単離の好ましい方法は、イオン交換クロマトグラフ ィーを用いて達成される。

ｐＨ８，５の２０ｍＭトリス緩衝液を用いて、調帯血清を陽イオン交換樹脂に適 用する。このｐＨ及び緩衝液強度においては、ＡＦＰはカラムに結合するが、大 部分のプロラクチンはカラムには結合しない。こうして、血清がカラムに加えら れ、プロラクチンがカラムを通して洗い流される。プロラクチンは、回収するこ とができる。次いて、ＡＦＰを、緩衝剤を含んだ約０．２乃至０．３Ｍの塩化ナ トリウムを用いてカラムから溶出することができる。

単離されたＡＦＰを、次いで、約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮する。この仕方によるこ のＡＦＰの回収は約１００％であることができる。この仕方で精製したＡＦＰは 、大量のアルブミンを含有し得る。しかしながら、この夾雑物は、問題とならな い。それは、前記血清又は血漿に基づく材料がアルブミンを含有しているからで ある。精製されたＡＦＰは、イムノアッセイ法を用いて試験できる。

ＡＣＴＨ、アルドステロン、ｈＣＧ、β−ｈＣＧ、ＣＡｌ５−３、ＣＡ３４９　 、カルシトニン、フェリチン、ガストリン、ＰＡＰ、ＰＳＡ、プロラクチン及び ＬＤ−１のような他の腫瘍マーカーは、数通りの源から商業的に入手できる。こ れら他のマーカーは、精製されたものを得ることができ又は、当該分野で周知の 手順によって精製することができる。各腫瘍マーカーについて、イムノアッセイ 法を用いて交差汚染を評価することができる。ＬＤＨ中に存在するＬＤ−１の量 を測定することによって、ＬＤ−１が、ＬＤＨの一成分として加えられる。

対照のだめの溶液は、血漿又は血清、及び該血漿又は血清にスパイクするのに用 いられる全ての特異的な腫瘍マーカーを、最初にアッセイすることによって、処 方される。表■は、調製された３通りのレベルの対照の各々の該特異的な腫瘍マ ーカーについての標的値を示す。計算は、血清又は血漿中の各マーカーの濃度を 表■の平均標的値から引き、次いで各マーカーの適当量をそれら３通りのレベル の対照の各々に加えることによって実施される。

腫瘍マーカーが、各マーカーの安定性に応して血清又は血漿に加えられる。血清 又は血漿の温度が約２乃至１０’Ｃの範囲内に制御されている限り、Ｂ２ＭＳＡ ＦＰ、プロラクチン、ｈＣＧ、β−ｈＣＴＧ、　ＣＡｌ５−３、ＣＡ　１９−９ 、ＣＡ３４９　、ＣＡ１２５　、ＣＥＡ、フェリチン、ＴＰＡ、及びＬＤ−１（ ＬＤＨとして加えられる）のようなマーカーを加え、凍結乾燥の数日以内に添加 調製することができる。

もしも全ての材料が約２乃至１０″Ｃの範囲に維持されるなら、ＡＣＴＨ１ガス トリン、γ−エノラーゼ、及びカルシトニン（短期の液中安定性を有するマーカ ーである）を、凍結乾燥の約６時間前に加えてよい。好ましくは、これらのマー カーは、凍結乾燥の直前に加えられ、そして添加及び調整は低温、すなわち２乃 至ｌＯｏＣにて行われる。

これら３通りのレベルの液体対照の各々は、標準の方法を用いて凍結乾燥される 。凍結乾燥された対照を含んだ瓶は、真空下にシールされ、次いで約４°Ｃに貯 蔵される。該対照は、水又は緩衝液のような他の適当な液体によって、復元され る。

ＡＣＴＨについては、凍結乾燥工程に際したＡＣＴＨ活性の損失を定量するため に、凍結乾燥研究が必要である。該工程による活性損失を測定するためにはイム ノアッセイ法が用いられる。その結果は、特定の凍結乾燥後レベルを保持するの に必要なＡＣＴＨの凍結乾燥前レベルを決定するために用いることができる。

凍結乾燥された対照中の全てのマーカーの安定性は、過酷な温度３７°Ｃにて４ 過であると測定された。表■を参照のこと。これは２乃至８”Ｃに貯蔵したとき の約３年に相当する。ＡＣＴＨ，ガストリン及びカルシトニンを除く全てのマー カーについて、少なくとも２週の復元後安定性が見出された。表■を参照のこと 。Ａ　ＣＴ　Ｈ、ガストリン及びカルシトニンは、液体で復元した後は速やかに 使用しなければならない。復元後の安定性は、ＮＳＥ、ガストリン及びカルシト ニン以外の全ての分析対象については、復元後の材料の各部分量を一２０°Ｃに 凍結することによって、３０日間延ばすことができることも判明した。表■を参 照のこと。ガストリンとカルシトニンの安定性は、復元後の材料の各部分量を一 ２０’Ｃに凍結することによって、７日間延はすことができる。表■を参照のこ と。ＮＳＥの安定性は、復元後の材料の各部分量を一２０°Ｃに凍結することに よって、２４時間延ばすことができる。表■を参照のこと。

次の実施例は、本発明の説明のために与えられたものである。

実施例ｌ ８２Ｍの精製 腎臓疾患の患者から尿を集めることによって尿濃縮液を調製した。政派をプール し、保存剤としてアジ化ナトリウムを０．０２％に加えた。粒子及び微生物を除 去するため、政派を０．３μｍ未満の膜を通して濾過した。次いて、政派をｐＨ ８，０の７倍量の５０ｍＭ）リス緩衝液に対して透析濾過し、そして元の１００ 倍に濃縮した。例えは、＋００　ＬをＩＬに濃縮した。濃縮した尿を、上記緩衝 液を用いて、総タンパク質量か約９．０ｇ／ｄＬの濃度になるよう調整した。

尿素濃縮液の約５０ｍ　ＬをＵｌｔｒａｇｅｌ　ＡＣＡ　５４カラムにかけた。

サンプルサイズは、カラムサイズに依存しており、媒体の総体積の２．５％に等 しい。タンパク質の効果的な分離のためには、カラムの長さは、約１００ｃｍな ければならない。８２Ｍを含有する画分を合わせ、プールし、そして約１ｇ／ｄ Ｌｉ：濃縮した。

［ｈ製はまた５ｕｐｅｒｄｅｘ　７５　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によっても達成 された。しつ１しながら、この適用のためには、Ｌｌｌｔｒａｇｅｌ　ＡＣＡ　 ５４による精製の方が優れている。

ＣＡ　１９−９及びＴＰＡの精製 細胞系５Ｗ１１１６、からの上澄（上澄はＷｈｉ　ｔａｋｅｒより入手可能）の 約５０ｍ　Ｌのサンプルを元の液量の半分まで濃縮した。ｐＨ約７．２の５０ｍ 　Ｍのリン酸カリウムの約５（１ｍ　Ｌによってサンプルを３回緩衝液交換した 。サンプルの最終液量は、約３５ｍ　Ｌであった。約２０ｍ　Ｌのサンプルを、 フェニルセファロースカラムにかけた。該カラムは、該緩衝液で洗浄し、両分を 収集した。これらの画分を、ＣＥＡ及びＣＡ　１９−９活性について、イムノア ッセイを用いて評価した。ＣＥＡ含有画分をプールして濃縮し、また、ＣＡ　１ ９−９含有画分をプールし濃縮した。尿素量の漸増する約５０ｍ　Ｍのリン酸塩 を含有するｐＨ７゜２の緩衝液を該カラムにかけた。ＴＰＡは、約６Ｍの尿素に よって溶出された。該ＴＰＡ含有画分をプールし、濃縮し、次いてこの６Ｍの尿 素を除去するために透析濾過した。

ＣＡ　１９−９を汚染している如何なるＣＥＡの活性をも除去するために、該Ｃ Ａ　１９−９画分を長期貯蔵に付した。

実施例２ 対照の調製 男性からの脱脂血清を次のフィルター列を通して濾過した。すなわち、１．２μ ｍのプレフィルタ−１０，８μｍフィルター、０．４５μｍフィルター及び０． ２２μｍフィルターである。濾過した血清を冷蔵した。Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａ ａｓからのブロクリン３００を血清ＩＬ当たりＩｒｎＬの濃度に添加した。該血 清を１．９２Ｌ／プールの２つのプールに分割し、プール１及びプール２と名付 けた。

この血清を、ＡＣＴＨ、アルドステロン、８２Ｍ、ｈＣＧ、β−ｈ’ＣＧ５ＣＡ １５−３、ＣＡ　１９−９、ＣＡｌ２５　、ＣＡ３４９　、カルシトニン、ＣＥ Ａ、フェリチン、ガストリン、ＮＳＥ、ＰＡＰ、ＰＳＡ、プロラクチン、ＴＰＡ 、及びＬＤ−１の量について、イムノアッセイ技術を用いてアッセイした。

これらのマーカーの各々は、ここに記述したようにして精製したて得たか、又は 商業的に入手した。各マーカーの量を測定した。表■のレベルＩ範囲に与えられ ている値に到達させるために必要な各マーカーの量を、ブールｌに加えた。表■ のレベル■範囲に与えられている値に到達させるための各マーカーの量をブール ２に加えた。マーカーの該をアッセイし、如何なる調整も、追加量のマーカーの 添加によって行った。

ブール１　（レベルＩ）からの３ｍＬの各部分量を、フリーザー中で約１時間冷 やしておいたバイアルに充填し、ブール２（レベル３）からの３ｍＬの各部分量 を、フリーザー中で約１時間冷やしておいたバイアルに充填した。バイアルを凍 結乾燥に付し、真空下にシールし、そして約４°Ｃにて貯蔵した。

実施例３ 腫瘍マーカ一対照に基づく血清のアッセイ実施例２において調製した対照を収容 したバイアルを、３ｍＬの蒸留水によって復元し、穏やかに逆さにして混合した 。該レベルｌ及びレベル３の対照中に含有されているマーカーを、種々のイムノ アッセイ法を用いてアッセイした。結果は表ＩＸに与えられている。

表１ 腫瘍マーカーの分類 １、癌胎児性抗原ＡＦＰ、ＣＥＡ 胎児の発育の際に産生され成人におい ては低レベル。腫瘍はこれらのタンパ ク質の再発現を引き起こす。

２、腫瘍関連抗原 腫瘍細胞によって分泌されるＣＡ１９−９、ＣＡ３４９　、ＣＡ１５−３、ムチ ン（炭水化物リッチ糖タンパク質）。高分子量 ＞２００ｋｄａ、２５〜８５％の炭水化物３、ホルモン ｈＣＧ、ＡＣＴＨ，カルシトニン、プ ロラクチン、アルドステロン、ガスト リン ４　血清タンパク質　β２−ミクログロブリン、フェリチン５、酵素　ＰＡＰ、 ＮＳＥ、ＬＤ　１ 表１１ 腫瘍マーカ一対照 臨床マーカー 腫瘍マーカー　部位 副腎皮質刺激ホルモン　肺 （ＡＣＴＨ） αフェトプロティン（ＡＦＰ）　要丸、肝臓アルドステロン　腎臓 β２−ミクログロブリン　骨髄 βヒト絨毛性ゴナドトロピン　婦人科、前立腺ＣＡ　１５−３／　ＣＡ　５４９ 　乳房ＣＡ　１９−９　膵臓、結腸直腸、胃 ＣＡｌ２５　卵巣 癌胎児性抗原（ＣＥＡ）　結腸直腸、乳房、肺、胃、膵臓 表１１（つづき） 腫瘍マーカ一対照 臨床マーカー 腫瘍マーカー　部位 フェリチン　肝臓 γエノラーゼ　肺、脳 ガストリン　膵臓 ヒト絨毛性ゴナドトロピン　塞丸 （ｈＣＧ） 乳酸デヒドロゲナーゼ　脳 イソ酵素（ＬＤ−１） プロラクチン　脳下垂体 前立腺酸性ホスファターゼ　前立腺 （ＰＡＰ） 前立腺特異性抗原　前立腺 （ＰＳＡ） 組織ポリペプチド抗原　膀胱、前立腺、婦人科、肺（Ｔ　Ｐ　Ａ） 表Ｉ１１ 腫瘍マーカ一対照 真水 ＣＡ１２５　リ■巣癌ｌｌ！７ｋ、０匈７に−７し癌し 表ｖＩ ＡＦＰ　１０．２　１０．６　２９３　２９４アルドステロン　７９　８１　８ ０４　８５０８２Ｍ　１．＋　１．０　４．２　４．４ＣＡ１９−９　３５　３ ３　２４９　２４１フエリチン　３１　２８　６９３　６７１ＰＡＰ　２．１　 ２．０　１６．９　１６．４プロラクチン　６．８　６．３　＋７１　１７０Ｐ 　Ｓ　Ａ　３．０　２．６　３７　３２Ｔ　Ｐ　Ａ　４８　４６　９５３　９５ ７ＣＡ　５４９　Ｂ、　９　８．９　２７　３０ＣΔ１５−３　４１　４３　＋ ６５　１５８βｈ　ＣＧ　２．７　２．６　４７５　４４６ｈＣＧ　、２．７　 ２．７　４２２　４１４ＣＡＩ２５　＋８　２０　３５６　３６０ＣＥＡ　２． ９　２．６　、　５７　５６ＬＤＩ　４７．７　４９．８　５１　５１表■１ アルドステロン　７６　７８　８４０　８３４ＡＦＰ　１１　１１　３００　２ ９７ Ｐ２Ｍ　Ｏ，９８０，９７４，７４，８ＡＣＴＨ１５１７４０８４１８ フエリチン　３１　２８　７２６　６８６Ｐ　Ａ　Ｐ　２．２　２．　Ｉ　２０ 　２０Ｐ　Ｓ　Ａ　２．６　２．６　３３　３３プロラクチン　４．２　４．４ 　１２５　１３３Ｔ　Ｐ　Ａ　５６　５４　７７９　８５４ＣＡ５４９　９．１ 　９．９　３６　３５ＣＡ１５−３　２３　２３　１００　１０２βｈ　ＣＧ　 ２．６　２．６　４２６　４３８ＣＡ１２５　２５　２５　４４８　４７４ＣＥ Ａ　２．６　２．６　６０　６Ｉ ＣＡ１９−９　５５　５５　２７６　２７７Ｌ　Ｄ　Ｈ２５２２４７７５６７６ ４ ＬＤ−１４８％　４８％　５１％　５１％表■ ガストリン　１０１　９８　３２２　３１３カルシトニン　１２３　１１０　３ ４２　３５３ＮＳＥ　１０　１０　５４　５４ 表１× 装置／方法比較 分析対象　方法　単位　レベル１　レベル３ＡＣＴＨＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製 品　ｐｇ／ｍＬ　３３　４６１［ｎｃｓｔａｒ　ＲＩＡ　ｐｇ／ｍＬ　１４　４ ６６Ｎｉｃｈｏｌｓ　Ａｌｅｇｒｏ　ＲＩＡ　ｐｍｏｌ／Ｌ　１４　６９Ｃ１ｉ ｎｉｃａｌ　Ａｓ５ａｙｓ　ｐｇ／ｍＩ、　２０　４６６アルドステロン Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓの製品　ｐｇ／ｍＬ　７９　８７５β２−ミクログロブ リン ＣＡ１２５°　Ｃｅｎｔｏｃｏｒ　Ｕ／ｍＬ　２２　３７７ＣＡ３４９　）ＩＹ ｂｒｉｔｅｃｈ　Ｔａｎｄｅｍ−ＲＵ／ｍＬ　１０　３０表ＩＸ（つづき） 装置／方法比較 ガストリン　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｓ５ａｙｓ　ｐｇ／ｍＬ　１７２　４６゜Ｄ ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓの製品　ｐｇ／ｍＬ　５６　３４７表ＩＸ（つづき） 装置／方法比較 Ｔ　Ｐ　Ａ　ＢＹｋ−５ａｎｇｔｅｃ　ｎｇ／ｍＬ　５４　９７８カルシトニン 　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓの製品　ｐｇ／ｍＬ　６１　１７３１ｎｃｓｔａｒ、 Ｉ［ＲＩＡ　ｐｇ／ｍＬ　１２９　３６７＊ＣＡ１５−３、ＣＡ　１９−９、Ｃ Ａ１２５は、ｃｅｎｔｏｃｏｒの一部門Ｃｅｎｔｏｃｏｒ　ＤＪａｇｎｏｓｔｒ ｃｓの登録商標である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．腫瘍マーカーの測定のための対照であって、（ａ）脂質を減少させたヒトの 血清又は血漿を含むベースであって該血清又は血漿がＰＡＰに対する抗体を本質 的に含まないものであるベースと、 （ｂ）複数の腫瘍マーカーと、 の混合物を含む対照
2. ２．凍結乾燥されているものである、請求項１の対照。