JPH0354679B2 - - Google Patents
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- JPH0354679B2 JPH0354679B2 JP58137893A JP13789383A JPH0354679B2 JP H0354679 B2 JPH0354679 B2 JP H0354679B2 JP 58137893 A JP58137893 A JP 58137893A JP 13789383 A JP13789383 A JP 13789383A JP H0354679 B2 JPH0354679 B2 JP H0354679B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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Description
本発明は、新規な蛋白質（PP17）、ヒトの胎盤
抽出液からのその富化および取得方法ならびにそ
の利用に関する。 ヒトの胎盤抽出液中には、その組織に由来する
一連の可溶性蛋白質の存在が証明されている〔F.
G.Lehmann氏編「Carcino−Embryonic
Proteins」第１巻中H.Bohn氏「Placental and
Pregnarcy Proteins」（Biomedical Press社
1979年刊行）〕。 本発明は、PP17と命名された新規な可溶性胎
盤蛋白質の単離および特性化に関する。 よく洗浄されたヒトの胎盤（600ｇ）から生理
的食塩水を用いてこの蛋白質の平均2.5mgが抽出
される。 ヒトの他の器官（例えば心臓、肺、皮膚、胃、
腎臓、子宮、肝臓、脾臓、副腎、結腸および膀
胱）からの抽出液はこの蛋白質を含まないかまた
はごく微量のみ含有する。ヒトの他の体液の血清
中にはこの蛋白質は通常存在しないかまたは痕跡
量程度（＜１mg／）である。 本発明の対象は蛋白質PP17であり、それは下
記すなわち (a) 電気泳動的易動度がβ1−およびα2−グロブリ
ンの中間範囲内にあること、 (b) 等電点が5.25±0.20であること、 (c) 沈降係数S0 20,wが2.7±0.1Sであること、 (d) ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリル
アミド（PAA）ゲルにより測定された分子量
が38000±2000であること、 (e) 吸光係数Ｅ１％ 1cm（280nｍ）が8.5±0.4である
こと、 (f) 炭水化物部分が2.1±0.9％（マンノース0.3±
0.2％ガラクトース0.4±0.2％、キシロース0.2
±0.1％、Ｎ−アセチルグルコサミン1.0±0.3
％、Ｎ−アセチルノイラミン酸0.2±0.1％）で
あること により特徴づけられる。 PP17のアミノ酸組成は下記の表に示されるよ
うである。
抽出液からのその富化および取得方法ならびにそ
の利用に関する。 ヒトの胎盤抽出液中には、その組織に由来する
一連の可溶性蛋白質の存在が証明されている〔F.
G.Lehmann氏編「Carcino−Embryonic
Proteins」第１巻中H.Bohn氏「Placental and
Pregnarcy Proteins」（Biomedical Press社
1979年刊行）〕。 本発明は、PP17と命名された新規な可溶性胎
盤蛋白質の単離および特性化に関する。 よく洗浄されたヒトの胎盤（600ｇ）から生理
的食塩水を用いてこの蛋白質の平均2.5mgが抽出
される。 ヒトの他の器官（例えば心臓、肺、皮膚、胃、
腎臓、子宮、肝臓、脾臓、副腎、結腸および膀
胱）からの抽出液はこの蛋白質を含まないかまた
はごく微量のみ含有する。ヒトの他の体液の血清
中にはこの蛋白質は通常存在しないかまたは痕跡
量程度（＜１mg／）である。 本発明の対象は蛋白質PP17であり、それは下
記すなわち (a) 電気泳動的易動度がβ1−およびα2−グロブリ
ンの中間範囲内にあること、 (b) 等電点が5.25±0.20であること、 (c) 沈降係数S0 20,wが2.7±0.1Sであること、 (d) ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリル
アミド（PAA）ゲルにより測定された分子量
が38000±2000であること、 (e) 吸光係数Ｅ１％ 1cm（280nｍ）が8.5±0.4である
こと、 (f) 炭水化物部分が2.1±0.9％（マンノース0.3±
0.2％ガラクトース0.4±0.2％、キシロース0.2
±0.1％、Ｎ−アセチルグルコサミン1.0±0.3
％、Ｎ−アセチルノイラミン酸0.2±0.1％）で
あること により特徴づけられる。 PP17のアミノ酸組成は下記の表に示されるよ
うである。
【表】
組織蛋白質の諸特性の詳細は下記の通りであつ
た。 電気泳動的易動度は、微量化改変されたベツク
マン・インスツルメント社製マイクロゾーン
（Microzone）R200型にセルロースアセテートス
トリツプ（ザルトリウス社製品）を用い、PH8.6
のジエチルバルビツール酸ナトリウム緩衝液で調
べた。 等電点の測定は、LKB社製のカラム（440ml）
を用いて行なつた。いわゆるアンホリン
（Ampholin ）混合液は、糖蛋白質（グリコプ
ロテイン）の研究においてPH4.0〜6.0の範囲を有
した。 沈降係数は、ベツクマン社製分析用超遠心装置
（スピンコＥ型）により280nｍにおける紫外線ス
キヤナー法を用い二重選別セル中で毎分60000回
転により測定した。溶媒にはNaCl0.2モル／を
含有するPH6.8の0.05モル濃度燐酸塩緩衝液を用
いた。蛋白質濃度は光学濃度（OD）約３に設定
した。沈降係数は20℃における水を基礎として算
定した。 SDS−PAAゲルによる分子量の測定には、ド
デシル硫酸ナトリウム（SDS）0.1％を含有する
7.5％のポリアクリルアミドゲルを用いた。比較
物質としては、ヒトの胎盤ラクトゲン（HPL）
およびヒトのアルブミンならびにその凝集物を用
いた。 吸光係数の測定には、その物質を炭酸水素アン
モニウムを加えてPH7.0に調整した蒸留水に0.10
％（0.10ｇ／100ml）に溶解した。 炭水化物の分析は下記の通りに実施した。すな
わちグリコシド結合を加水分解した後に、遊離さ
れた中性の糖を硼酸塩複合体としてアニオン交換
カラムにより〔Y.C.Lee氏その他「Anal.
Biochem.」第27巻第567頁（1969年）〕分離し、
溶離液にビシンコニン酸第１鋼試薬〔K.Mopper
およびM.Gindler両氏「Anal.Biochem.」第56巻
第440頁（1973年）〕を加えることにより発色さ
せ、ラムノースを内部標準物質として定量的に測
定した。アミノ糖はニンヒドリンとの反応により
検出し定量した。ノイラミン酸の含有量は
Warren氏の方法〔「Methods in Enzymology」
第６巻第463〜465頁（1963年）〕により測定され
る。 アミノ酸分析は、S.Moore氏その他の方法
〔「Anal.Chem.」第30巻第1185頁（1958年）〕に従
い、ベツクマン社製品マルチクロムＢ型（商品
名）液体クロマトグラフ装置により実施した。1/
２シスチンは過蟻酸を用いる蛋白質の酸化〔S.
Moore氏その他「Anal.Chem.」第30巻第1185頁
（1958年）〕およびそれに続くクロマトグラフイー
〔S.Moore氏「J.Biol.Chem.」第238巻第235頁
（1963年）〕によりシステイン酸として定量した。
トリプトフアン含有量はH.Edelhof氏の方法
〔「Biochemistry」第６巻第1948頁（1967年）〕に
従い直接的フオトメーター測定法により定量し
た。 PP17は下記の通りの諸特性を有し、そしてそ
れらは該当する方法を採用することによつて単離
操作に用いられた。 (1) 硫酸アンモニウムによりPH５〜８そして30〜
50％の飽和において水溶液から塩析される。 (2) 水溶性のアクリジン塩基（例えば２−エトキ
シ−６，９−ジアミノアクリジンラクテート）
によりPH７〜９および塩基濃度0.4〜0.8ｇ／
100mlにおいて沈殿するが、しかし塩基濃度0.4
mg／100mlまたはそれ以下であるとPH6.0では全
然かまたはほとんど沈殿しない。 (3) エタノールによる沈殿操作に際して、希薄塩
溶液（例えば１〜２％NaCl溶液）中ではPH７
においてアルコール濃度20％（容量）まででは
主として上清中にとどまる。 (4) 電気泳動による分離においてPP17はβ1−お
よびα2−グロブリンの中間に位置する易動度を
示す。 (5) 等電点フオーカスの決定に際してはPH5.1〜
5.4の範囲において5.2〜5.3の間に極大を示す。 (6) PP17は0.5モル濃度のグリシン−HCl緩衝液
に対する透析に際して安定であり、免疫化学的
に変化しないが、これと反対に他の数種の胎盤
蛋白質（例えばPP9）はこれらの条件下で免疫
化学的反応性を失なう。 (7) セフアデツクス によるゲル過において
PP17は分子量20000〜60000の範囲に現われる。 (8) PP17は弱塩基性のイオン交換剤（例えば
DEAE−セルロースまたはDEAE−セフアデツ
クス）に低い伝導度（約０〜２ｍＳ）および中
性または弱塩基性PH（約７〜９）において吸着
され、高濃度の強電解性塩類濃度〔０〜0.2％
（ｇ／100ml）〕のNaCl溶液によりイオン交換剤
から再び溶離される。 (9) PP17はその水溶液から免疫吸着法により富
化されそして単離され得る。 本発明の対象は、ヒトの胎盤抽出物を上記の諸
特性を利用して分画することを特徴とするPP17
の取得方法である。 当業者には明らかなように、硫酸アンモニウム
と同様に生化学的調製法において通常用いられる
中性塩類もまたPP17の塩析に用いられる。アク
リジン塩基と同様にキノリン塩基の水溶性誘導体
もまた蛋白質分画法において知られる通り、本発
明による方法の範囲内において用いられ得る。そ
の電気泳動的挙動ならびに分子量に対応して、上
記の諸特性を有する蛋白質を他の蛋白質から分離
することに適当な他の手段がこの蛋白質の単離に
用いられ得る。このために、ゲル過、ゲルクロ
マトグラフイー、限外過の諸方法ならびに
PP17が希薄な緩衝溶液から弱塩基性のイオン交
換剤に結合され、そこから高濃度の強電解性塩類
溶液により再び溶離され得るという特性もまた利
用され得る。 PP17の富化またはこの蛋白質の他の蛋白質か
らの分離に有効な各種の手段の合理的な組合わせ
によりPP17が単離され得る。 PP17の富化のための本発明の個々の操作段階
を対象として以下に記述し、また富化操作の組合
わせにより達成されたPP17の精製のための操作
法を示す。 実施例は、免疫吸着法の応用によるPP17の単
離を記述する。ヒトの胎盤からの水抽出液を直接
に免疫吸着法にかけることができる。抽出液中の
PP17濃度は比較的に低いので、最初にPP17を抽
出液の予備分画操作により特異的に富化すること
が目的に適合する。 従つて、大量の蛋白質の分画操作に適する各種
の方法例えば中性塩、有機カチオンまたはアルコ
ールによる分画的沈殿あるいはゲル過またはイ
オン交換クロマトグラフイーによる分離等を参考
にして基礎に採用することができる。 胎盤蛋白質の単離に際して、水溶性アクリジン
塩基および硫酸アンモニウムによる複合分画操作
が多くの場合に目的に適合することが知られてい
る。これはPP17の単離にも応用され、実施例Ａ
にも記述される。 それ以上の富化のためには、随伴蛋白質の一部
分がアルコールを用いる沈殿操作により更に分離
除去される。 しかしながら実施例中に示される富化のための
各操作段階は強制的ではなく、またそこに記述さ
れる系列順序通りに行なわねばならないことはな
い。 免疫吸着操作の段階もまた、例えばPH２〜４好
ましくはPH2.5の0.5モル濃度グリシン−HCl緩衝
液に対する透析を応用した後の例えば調製電気泳
動および等電点フオーカス測定等の他の分離法を
もつて代替することができる。 PP17の高度精製のためには、セフアデツクス
Ｇ−100によるゲル過、DEAE−セフアデツク
スによるイオン交換クロマトグラフイーおよび反
転免疫吸着を使用できることが知られた。PP17
は抗原性を有するので、PP17の検出には分離操
作による分画において得られる変数値のほかに免
疫化学的方法もまた有用である。動物をこの蛋白
質で免疫処置すると特異的な抗体が産生される。 この目的のために使用可能な抗血清は、下記の
ようにして得られる。 ２−エトキシ−６，９−ジアミノアクリジンラ
クテートおよび硫酸アンモニウムを用いる胎盤抽
出液の分画〔「Arch.Gyna¨kol.」第210巻第440頁
（1971年）〕において、PP17は主として胎盤分画
に入る。この分画を0.5モル濃度のグリシン−
HCl緩衝液（PH2.5）に対して14時間透析し、そ
れを中和した後生理的食塩水に対して透析する。
この分画で家兎を免疫処置することにより１種の
多価抗血清が得られ、そしてそれを用いてPP17
が検出され得る。この抗血清は正常なヒト血清お
よびPP17を含有しない胎盤分画で吸収すること
により抗原PP17に対してさらに高度に特異的に
され得る。この特異的抗血清は一方ではPP17の
免疫学的検出に、また他方ではPP17の富化およ
び単離に用い得る免疫吸着剤の調製に役立つ。 本発明に従つて得られる高度精製PP17を用い
て、既知方法により動物を免疫処置して、それに
より直接に単一特異性の抗血清が調製される。電
場において寒天を含むゲル中で分離後のPP17と
家兎の特異的抗血清との免疫学的反応を第１ａ図
に示す。これとの対比において第１ｂ図はヒトの
血清（HS）に対する家兎の抗血清の免疫学的反
応により可視化された蛋白質の分離を示す。 PP17の免疫学的検出のためには、Ouchterlony
氏によるゲル拡散法〔SchultzeおよびHeremans
両氏編「Molecular Biology of Human Pro−
teins」第１巻第134頁参照〕または放射免疫測定
法および酵素免疫測定法のようなさらに高感度の
方法を用い得る。 PP17は多少なりとも胎盤「特異的」蛋白質で
ある。このような蛋白質の検出および定量は診断
法的意義を有する。すなわち一方では妊娠経過の
監視に、他方では栄養膜に特異的な腫瘍ならびに
非栄養膜性の腫瘍の検出および病状経過の監視な
らびにこのような疾患における治療の調整に関し
てである。 PP17はまた、PP17を検出および定量するため
の抗血清の調製に用いられ得る。 本発明は下記の実施例中に明示される。 実施例 (A) 胎盤よりの抽出ならびにリバノールおよび硫
酸アンモニウムを用いる抽出液の分画 冷凍保存したヒト胎盤1000Kgを切断ミキサー
中で細断し0.4％（ｇ／100ml）の食塩溶液1000
で抽出した。組織残渣を遠心により分離除去
の後に、抽出液を20％酢酸でPH6.0に調整し、
そこへ２−エトキシ−６，９−ジアミノアクリ
ジンラクテート（ヘキスト社製品リバノール
）の３％（ｇ／100ml）溶液200を撹拌しつ
つ混入した。沈殿物を遠心分離して投棄した。
上清に１％（ｇ／100ml）量のベントナイトＡ
（エルブスレー社製品）を混入し、２規定
NaOH液を加えてPH7.0に調整しそして過し
た。液に30％（ｇ／100ml）量の硫酸アンモ
ニウムを撹拌しつつ徐々に加えた。これにより
PP17は他の蛋白質と共に沈降した。沈降物を
過分離して約12Kg湿潤なペーストが得られ、
これを以下「Ａ分画」と称する。Ａ分画におけ
るPP17の純度は１％より小さく、収量は500mg
であつた。 (B) エタノールによる分画 Ａ分画500ｇを水400mlに溶解し、４℃におい
て生理的食塩水に対して透析した。透析の後に
５％（ｇ／100ml）のNaCl溶液を加えることに
より伝導度を15ｍＳに調整した。しかる後溶液
を０℃に冷却し、96％のエタノールを撹拌しつ
つ徐々にアルコール最終濃度が20％（ｇ／100
ml）に達するまで混入した。沈殿物を遠心除去
した。しかる後上清を水に対し、そして次に１
モル／のNaClおよび0.1％（ｇ／100ml）の
NaN3を含む0.1モル濃度のトリス−HCl緩衝液
（PH8.0、緩衝液と称する）に対して透析し
た。終局的に蛋白質は38％（ｇ／100ml）の固
体状硫酸アンモニウムを加えることにより沈降
せしめられた。沈降物を水に溶解し、それを前
記の緩衝液に対して透析した。これにより、
PP17の平均35mgを含有する溶液（Ｂ分画）約
850mlが得られた。Ｂ分画におけるPP17の純度
は２％であり、収量は35mgであつた。 (C) 免疫吸着法によるPP17の富化 １ 免疫吸着剤の調製 家兎の抗PP17血清400mlを0.02モル濃度の
燐酸塩緩衝液（PH7.0）に対して透析し、免
疫グロブリンの分離のためにDEAE−セルロ
ースクロマトグラフイーにかけた。免疫グロ
ブリン分画（蛋白質量5.95ｇ）に、予め臭化
シアン74.4ｇで活性化された特別精製の顆粒
状アガロース（フアルマシア社製品セフアロ
ース ）595ｇを混合して担体に共有結合さ
せた。この調製操作は、R.Axen氏その他
〔「Nature」第214巻第1302頁（1967年）〕に
より記述されている。このようにして調製さ
れた免疫吸着剤を用いて胎盤蛋白質PP17を
その溶液特にPP17を富化された胎盤分画か
ら単離し得た。 ２ 免疫吸着操作の実施 免疫吸着剤を緩衝液（NaCl1.0モル／
およびNaN30.1％を含有する0.1モル濃度の
トリス−HCl緩衝液、PH8.0）中に懸濁し、
しかる後クロマトグラフカラム（5.0×21cm）
に充填し、緩衝液をさらに注加した。次に
Ｂ分画の半量をカラムに装入し、これにより
PP17は免疫吸着的に結合された。しかる後
緩衝液をカラムに注加し、終局的には吸着
された蛋白質を３モル濃度のチオシアン化カ
リウム溶液により溶離した。PP17を含有す
る溶離液を緩衝液に対して透析し、限外
過により約15mlに濃縮した。 吸着操作１回当りの収量はPP176mgであつ
た。 カラム中の免疫吸着剤はPP17の溶離後直
ちに緩衝液で中和し、徹底的に洗浄し、そ
れをPP17の免疫吸着的結合のために更新し
て用いた。Ｃ分画におけるPP17の純度は70
％であり、収量は12mgであつた。 (D) PP17の高度精製 免疫吸着操作により得られた蛋白質は、まだ
しばしば非特異的に結合された血清蛋白質およ
び他の胎盤蛋白質により不純化された。血清随
伴蛋白質の主要部分の分離除去は、セフアデツ
クスＧ−100を用いるゲル過により達成され
た。残余の随伴蛋白質は、次に反転あるいはネ
ガテイブ免疫吸着すなわち担体に結合された抗
不純蛋白質抗体を用いる方法により除去され
た。これは本質的にヒトの胎盤ラクトゲン
（HPL）および免疫グロブリンに関する。 PP17標品中に時々なお微量に存在した赤血
球蛋白質は、終局的にはDEAE−セフアデツク
スクロマトグラフイーにより除去し得た。
PP17をそこで0.01モル濃度のトリス−HCl緩衝
液中（PH7.0）でカラムに装入して吸着させ、
しかる後NaCl0〜２％（ｇ／100ml）の直線的
塩濃度勾配により溶離した。赤血球蛋白質はそ
の時イオン交換剤に一層強く吸着されており、
PP17の後でようやくカラムから溶離された。
Ｄ分画におけるPP17純度は99％より高く、収
量は５mgであつた。
た。 電気泳動的易動度は、微量化改変されたベツク
マン・インスツルメント社製マイクロゾーン
（Microzone）R200型にセルロースアセテートス
トリツプ（ザルトリウス社製品）を用い、PH8.6
のジエチルバルビツール酸ナトリウム緩衝液で調
べた。 等電点の測定は、LKB社製のカラム（440ml）
を用いて行なつた。いわゆるアンホリン
（Ampholin ）混合液は、糖蛋白質（グリコプ
ロテイン）の研究においてPH4.0〜6.0の範囲を有
した。 沈降係数は、ベツクマン社製分析用超遠心装置
（スピンコＥ型）により280nｍにおける紫外線ス
キヤナー法を用い二重選別セル中で毎分60000回
転により測定した。溶媒にはNaCl0.2モル／を
含有するPH6.8の0.05モル濃度燐酸塩緩衝液を用
いた。蛋白質濃度は光学濃度（OD）約３に設定
した。沈降係数は20℃における水を基礎として算
定した。 SDS−PAAゲルによる分子量の測定には、ド
デシル硫酸ナトリウム（SDS）0.1％を含有する
7.5％のポリアクリルアミドゲルを用いた。比較
物質としては、ヒトの胎盤ラクトゲン（HPL）
およびヒトのアルブミンならびにその凝集物を用
いた。 吸光係数の測定には、その物質を炭酸水素アン
モニウムを加えてPH7.0に調整した蒸留水に0.10
％（0.10ｇ／100ml）に溶解した。 炭水化物の分析は下記の通りに実施した。すな
わちグリコシド結合を加水分解した後に、遊離さ
れた中性の糖を硼酸塩複合体としてアニオン交換
カラムにより〔Y.C.Lee氏その他「Anal.
Biochem.」第27巻第567頁（1969年）〕分離し、
溶離液にビシンコニン酸第１鋼試薬〔K.Mopper
およびM.Gindler両氏「Anal.Biochem.」第56巻
第440頁（1973年）〕を加えることにより発色さ
せ、ラムノースを内部標準物質として定量的に測
定した。アミノ糖はニンヒドリンとの反応により
検出し定量した。ノイラミン酸の含有量は
Warren氏の方法〔「Methods in Enzymology」
第６巻第463〜465頁（1963年）〕により測定され
る。 アミノ酸分析は、S.Moore氏その他の方法
〔「Anal.Chem.」第30巻第1185頁（1958年）〕に従
い、ベツクマン社製品マルチクロムＢ型（商品
名）液体クロマトグラフ装置により実施した。1/
２シスチンは過蟻酸を用いる蛋白質の酸化〔S.
Moore氏その他「Anal.Chem.」第30巻第1185頁
（1958年）〕およびそれに続くクロマトグラフイー
〔S.Moore氏「J.Biol.Chem.」第238巻第235頁
（1963年）〕によりシステイン酸として定量した。
トリプトフアン含有量はH.Edelhof氏の方法
〔「Biochemistry」第６巻第1948頁（1967年）〕に
従い直接的フオトメーター測定法により定量し
た。 PP17は下記の通りの諸特性を有し、そしてそ
れらは該当する方法を採用することによつて単離
操作に用いられた。 (1) 硫酸アンモニウムによりPH５〜８そして30〜
50％の飽和において水溶液から塩析される。 (2) 水溶性のアクリジン塩基（例えば２−エトキ
シ−６，９−ジアミノアクリジンラクテート）
によりPH７〜９および塩基濃度0.4〜0.8ｇ／
100mlにおいて沈殿するが、しかし塩基濃度0.4
mg／100mlまたはそれ以下であるとPH6.0では全
然かまたはほとんど沈殿しない。 (3) エタノールによる沈殿操作に際して、希薄塩
溶液（例えば１〜２％NaCl溶液）中ではPH７
においてアルコール濃度20％（容量）まででは
主として上清中にとどまる。 (4) 電気泳動による分離においてPP17はβ1−お
よびα2−グロブリンの中間に位置する易動度を
示す。 (5) 等電点フオーカスの決定に際してはPH5.1〜
5.4の範囲において5.2〜5.3の間に極大を示す。 (6) PP17は0.5モル濃度のグリシン−HCl緩衝液
に対する透析に際して安定であり、免疫化学的
に変化しないが、これと反対に他の数種の胎盤
蛋白質（例えばPP9）はこれらの条件下で免疫
化学的反応性を失なう。 (7) セフアデツクス によるゲル過において
PP17は分子量20000〜60000の範囲に現われる。 (8) PP17は弱塩基性のイオン交換剤（例えば
DEAE−セルロースまたはDEAE−セフアデツ
クス）に低い伝導度（約０〜２ｍＳ）および中
性または弱塩基性PH（約７〜９）において吸着
され、高濃度の強電解性塩類濃度〔０〜0.2％
（ｇ／100ml）〕のNaCl溶液によりイオン交換剤
から再び溶離される。 (9) PP17はその水溶液から免疫吸着法により富
化されそして単離され得る。 本発明の対象は、ヒトの胎盤抽出物を上記の諸
特性を利用して分画することを特徴とするPP17
の取得方法である。 当業者には明らかなように、硫酸アンモニウム
と同様に生化学的調製法において通常用いられる
中性塩類もまたPP17の塩析に用いられる。アク
リジン塩基と同様にキノリン塩基の水溶性誘導体
もまた蛋白質分画法において知られる通り、本発
明による方法の範囲内において用いられ得る。そ
の電気泳動的挙動ならびに分子量に対応して、上
記の諸特性を有する蛋白質を他の蛋白質から分離
することに適当な他の手段がこの蛋白質の単離に
用いられ得る。このために、ゲル過、ゲルクロ
マトグラフイー、限外過の諸方法ならびに
PP17が希薄な緩衝溶液から弱塩基性のイオン交
換剤に結合され、そこから高濃度の強電解性塩類
溶液により再び溶離され得るという特性もまた利
用され得る。 PP17の富化またはこの蛋白質の他の蛋白質か
らの分離に有効な各種の手段の合理的な組合わせ
によりPP17が単離され得る。 PP17の富化のための本発明の個々の操作段階
を対象として以下に記述し、また富化操作の組合
わせにより達成されたPP17の精製のための操作
法を示す。 実施例は、免疫吸着法の応用によるPP17の単
離を記述する。ヒトの胎盤からの水抽出液を直接
に免疫吸着法にかけることができる。抽出液中の
PP17濃度は比較的に低いので、最初にPP17を抽
出液の予備分画操作により特異的に富化すること
が目的に適合する。 従つて、大量の蛋白質の分画操作に適する各種
の方法例えば中性塩、有機カチオンまたはアルコ
ールによる分画的沈殿あるいはゲル過またはイ
オン交換クロマトグラフイーによる分離等を参考
にして基礎に採用することができる。 胎盤蛋白質の単離に際して、水溶性アクリジン
塩基および硫酸アンモニウムによる複合分画操作
が多くの場合に目的に適合することが知られてい
る。これはPP17の単離にも応用され、実施例Ａ
にも記述される。 それ以上の富化のためには、随伴蛋白質の一部
分がアルコールを用いる沈殿操作により更に分離
除去される。 しかしながら実施例中に示される富化のための
各操作段階は強制的ではなく、またそこに記述さ
れる系列順序通りに行なわねばならないことはな
い。 免疫吸着操作の段階もまた、例えばPH２〜４好
ましくはPH2.5の0.5モル濃度グリシン−HCl緩衝
液に対する透析を応用した後の例えば調製電気泳
動および等電点フオーカス測定等の他の分離法を
もつて代替することができる。 PP17の高度精製のためには、セフアデツクス
Ｇ−100によるゲル過、DEAE−セフアデツク
スによるイオン交換クロマトグラフイーおよび反
転免疫吸着を使用できることが知られた。PP17
は抗原性を有するので、PP17の検出には分離操
作による分画において得られる変数値のほかに免
疫化学的方法もまた有用である。動物をこの蛋白
質で免疫処置すると特異的な抗体が産生される。 この目的のために使用可能な抗血清は、下記の
ようにして得られる。 ２−エトキシ−６，９−ジアミノアクリジンラ
クテートおよび硫酸アンモニウムを用いる胎盤抽
出液の分画〔「Arch.Gyna¨kol.」第210巻第440頁
（1971年）〕において、PP17は主として胎盤分画
に入る。この分画を0.5モル濃度のグリシン−
HCl緩衝液（PH2.5）に対して14時間透析し、そ
れを中和した後生理的食塩水に対して透析する。
この分画で家兎を免疫処置することにより１種の
多価抗血清が得られ、そしてそれを用いてPP17
が検出され得る。この抗血清は正常なヒト血清お
よびPP17を含有しない胎盤分画で吸収すること
により抗原PP17に対してさらに高度に特異的に
され得る。この特異的抗血清は一方ではPP17の
免疫学的検出に、また他方ではPP17の富化およ
び単離に用い得る免疫吸着剤の調製に役立つ。 本発明に従つて得られる高度精製PP17を用い
て、既知方法により動物を免疫処置して、それに
より直接に単一特異性の抗血清が調製される。電
場において寒天を含むゲル中で分離後のPP17と
家兎の特異的抗血清との免疫学的反応を第１ａ図
に示す。これとの対比において第１ｂ図はヒトの
血清（HS）に対する家兎の抗血清の免疫学的反
応により可視化された蛋白質の分離を示す。 PP17の免疫学的検出のためには、Ouchterlony
氏によるゲル拡散法〔SchultzeおよびHeremans
両氏編「Molecular Biology of Human Pro−
teins」第１巻第134頁参照〕または放射免疫測定
法および酵素免疫測定法のようなさらに高感度の
方法を用い得る。 PP17は多少なりとも胎盤「特異的」蛋白質で
ある。このような蛋白質の検出および定量は診断
法的意義を有する。すなわち一方では妊娠経過の
監視に、他方では栄養膜に特異的な腫瘍ならびに
非栄養膜性の腫瘍の検出および病状経過の監視な
らびにこのような疾患における治療の調整に関し
てである。 PP17はまた、PP17を検出および定量するため
の抗血清の調製に用いられ得る。 本発明は下記の実施例中に明示される。 実施例 (A) 胎盤よりの抽出ならびにリバノールおよび硫
酸アンモニウムを用いる抽出液の分画 冷凍保存したヒト胎盤1000Kgを切断ミキサー
中で細断し0.4％（ｇ／100ml）の食塩溶液1000
で抽出した。組織残渣を遠心により分離除去
の後に、抽出液を20％酢酸でPH6.0に調整し、
そこへ２−エトキシ−６，９−ジアミノアクリ
ジンラクテート（ヘキスト社製品リバノール
）の３％（ｇ／100ml）溶液200を撹拌しつ
つ混入した。沈殿物を遠心分離して投棄した。
上清に１％（ｇ／100ml）量のベントナイトＡ
（エルブスレー社製品）を混入し、２規定
NaOH液を加えてPH7.0に調整しそして過し
た。液に30％（ｇ／100ml）量の硫酸アンモ
ニウムを撹拌しつつ徐々に加えた。これにより
PP17は他の蛋白質と共に沈降した。沈降物を
過分離して約12Kg湿潤なペーストが得られ、
これを以下「Ａ分画」と称する。Ａ分画におけ
るPP17の純度は１％より小さく、収量は500mg
であつた。 (B) エタノールによる分画 Ａ分画500ｇを水400mlに溶解し、４℃におい
て生理的食塩水に対して透析した。透析の後に
５％（ｇ／100ml）のNaCl溶液を加えることに
より伝導度を15ｍＳに調整した。しかる後溶液
を０℃に冷却し、96％のエタノールを撹拌しつ
つ徐々にアルコール最終濃度が20％（ｇ／100
ml）に達するまで混入した。沈殿物を遠心除去
した。しかる後上清を水に対し、そして次に１
モル／のNaClおよび0.1％（ｇ／100ml）の
NaN3を含む0.1モル濃度のトリス−HCl緩衝液
（PH8.0、緩衝液と称する）に対して透析し
た。終局的に蛋白質は38％（ｇ／100ml）の固
体状硫酸アンモニウムを加えることにより沈降
せしめられた。沈降物を水に溶解し、それを前
記の緩衝液に対して透析した。これにより、
PP17の平均35mgを含有する溶液（Ｂ分画）約
850mlが得られた。Ｂ分画におけるPP17の純度
は２％であり、収量は35mgであつた。 (C) 免疫吸着法によるPP17の富化 １ 免疫吸着剤の調製 家兎の抗PP17血清400mlを0.02モル濃度の
燐酸塩緩衝液（PH7.0）に対して透析し、免
疫グロブリンの分離のためにDEAE−セルロ
ースクロマトグラフイーにかけた。免疫グロ
ブリン分画（蛋白質量5.95ｇ）に、予め臭化
シアン74.4ｇで活性化された特別精製の顆粒
状アガロース（フアルマシア社製品セフアロ
ース ）595ｇを混合して担体に共有結合さ
せた。この調製操作は、R.Axen氏その他
〔「Nature」第214巻第1302頁（1967年）〕に
より記述されている。このようにして調製さ
れた免疫吸着剤を用いて胎盤蛋白質PP17を
その溶液特にPP17を富化された胎盤分画か
ら単離し得た。 ２ 免疫吸着操作の実施 免疫吸着剤を緩衝液（NaCl1.0モル／
およびNaN30.1％を含有する0.1モル濃度の
トリス−HCl緩衝液、PH8.0）中に懸濁し、
しかる後クロマトグラフカラム（5.0×21cm）
に充填し、緩衝液をさらに注加した。次に
Ｂ分画の半量をカラムに装入し、これにより
PP17は免疫吸着的に結合された。しかる後
緩衝液をカラムに注加し、終局的には吸着
された蛋白質を３モル濃度のチオシアン化カ
リウム溶液により溶離した。PP17を含有す
る溶離液を緩衝液に対して透析し、限外
過により約15mlに濃縮した。 吸着操作１回当りの収量はPP176mgであつ
た。 カラム中の免疫吸着剤はPP17の溶離後直
ちに緩衝液で中和し、徹底的に洗浄し、そ
れをPP17の免疫吸着的結合のために更新し
て用いた。Ｃ分画におけるPP17の純度は70
％であり、収量は12mgであつた。 (D) PP17の高度精製 免疫吸着操作により得られた蛋白質は、まだ
しばしば非特異的に結合された血清蛋白質およ
び他の胎盤蛋白質により不純化された。血清随
伴蛋白質の主要部分の分離除去は、セフアデツ
クスＧ−100を用いるゲル過により達成され
た。残余の随伴蛋白質は、次に反転あるいはネ
ガテイブ免疫吸着すなわち担体に結合された抗
不純蛋白質抗体を用いる方法により除去され
た。これは本質的にヒトの胎盤ラクトゲン
（HPL）および免疫グロブリンに関する。 PP17標品中に時々なお微量に存在した赤血
球蛋白質は、終局的にはDEAE−セフアデツク
スクロマトグラフイーにより除去し得た。
PP17をそこで0.01モル濃度のトリス−HCl緩衝
液中（PH7.0）でカラムに装入して吸着させ、
しかる後NaCl0〜２％（ｇ／100ml）の直線的
塩濃度勾配により溶離した。赤血球蛋白質はそ
の時イオン交換剤に一層強く吸着されており、
PP17の後でようやくカラムから溶離された。
Ｄ分画におけるPP17純度は99％より高く、収
量は５mgであつた。
第１ａ図は電場において寒天を含むゲル中で分
離後のPP17と家兎の特異的抗血清との免疫学的
反応を示す。第１ｂ図はヒトの血清（HS）に対
する家兎の抗血清の免疫学的反応により可視化さ
れた蛋白質の分離を示す。
離後のPP17と家兎の特異的抗血清との免疫学的
反応を示す。第１ｂ図はヒトの血清（HS）に対
する家兎の抗血清の免疫学的反応により可視化さ
れた蛋白質の分離を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記特性すなわち (a) 電気泳動的易動度がβ1−およびα2−グロブリ
ンの中間の範囲にあること、 (b) 等電点が5.25±0.20であること、 (c) 沈降係数S0 20,wが2.7±0.1Sであること、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する
ポリアクリルアミドゲル中において測定された
分子量が38000±2000であること、 (e) 吸光係数Ｅ１％ 1cm（280nｍ）が8.5±0.4である
こと、 (f) 2.1±0.9％の炭水化物部分中にマンノース0.3
±0.2％、ガラクトース0.4±0.2％、キシロース
0.2±0.1％、Ｎ−アセチルグルコサミン1.0±
0.3％およびＮ−アセチルノイラミン酸0.2±0.1
％を含有することを特徴とする蛋白質PP17。 ２ ヒト胎盤よりの抽出物を少なくとも下記の処
理方法すなわち (1) PH５〜８の範囲および30〜50％飽和における
硫酸アンモニウムでの沈降、 (2) PH7.0および20％（容量）までのアルコール
濃度における希薄な塩溶液中の随伴蛋白質の沈
降、 (3) 分子量20000〜60000の蛋白質を取得するため
のゲル過、 (4) 蛋白質の弱塩基性イオン交換剤への吸着およ
び溶離、 (5) 免疫吸着操作 に付しそしてPP17を富化した分画を取得するこ
とからなる、下記特性 (a) 電気泳動的易動度がβ1−およびα2−グロブリ
ンの中間の範囲にあること、 (b) 等電点が5.25±0.20であること、 (c) 沈降係数S0 20,wが2.7±0.1Sであること、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する
ポリアクリルアミドゲル中において測定された
分子量が38000±2000であること、 (e) 吸光係数Ｅ１％ 1cm（280nｍ）が8.5±0.4である
こと、 (f) 2.1±0.9％の炭水化物部分中にマンノース0.3
±0.2％、ガラクトース0.4±0.2％、キシロース
0.2±0.1％、Ｎ−アセチルグルコサミン1.0±
0.3％およびＮ−アセチルノイラミン酸0.2±0.1
％を含有すること を有する蛋白質PP17の調製方法。 ３ 蛋白質PP17の検出および定量用の抗血清の
調製に用いるための、下記特性 (a) 電気泳動的易動度がβ1−およびα2−グロブリ
ンの中間の範囲にあること、 (b) 等電点が5.25±0.20であること、 (c) 沈降係数S0 20,wが2.7±0.1Sであること、 (d) ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含有する
ポリアクリルアミドゲル中において測定された
分子量が38000±2000であること、 (e) 吸光係数Ｅ１％ 1cm（280nｍ）が8.5±0.4である
こと、 (f) 2.1±0.9％の炭水化物部分中にマンノース0.3
±0.2％、ガラクトース0.4±0.2％、キシロース
0.2±0.1％、Ｎ−アセチルグルコサミン1.0±
0.3％およびＮ−アセチルノイラミン酸0.2±0.1
％を含有すること を有する蛋白質PP17を含有する抗原。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE19823228503 DE3228503A1 (de) | 1982-07-30 | 1982-07-30 | Neues protein (pp(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)7(pfeil abwaerts)), verfahren zu seiner anreicherung und gewinnung sowie seine verwendung |
| DE3228503.5 | 1982-07-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5944321A JPS5944321A (ja) | 1984-03-12 |
| JPH0354679B2 true JPH0354679B2 (ja) | 1991-08-20 |
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| EP (1) | EP0100522B1 (ja) |
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| DE3338480A1 (de) * | 1983-10-22 | 1985-05-02 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Neues protein pp(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)0(pfeil abwaerts), verfahren zu seiner gewinnung sowie seine verwendung |
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