JPH07508404A

JPH07508404A - ヒト／ブタハイブリッド第ｖｉｉｉ因子

Info

Publication number: JPH07508404A
Application number: JP5517782A
Authority: JP
Inventors: ローラー，ジョン　エス．; ランジ，マーシャル　エス．
Original assignee: Emory University
Current assignee: Emory University
Priority date: 1992-04-07
Filing date: 1993-04-07
Publication date: 1995-09-21
Anticipated expiration: 2018-08-25
Also published as: JP3495365B2; JP3440097B2; EP1359222A3; ATE322544T1; DE69334003D1; JP2003174876A; EP1359222A2; DK0638088T3; PT1359222E; CA2133203C; ES2261866T3; CA2133203A1; US5583209A; DE69333724D1; AU4279993A; EP0638088A1; EP0638088B1; DE69333724T2; HK1058946A1; AU682147B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般的には、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子、および、それらの調製方法および使用に関する。

外傷部位において外傷血管の切れた壁に血小板が付着した時に、血液凝固が始まる。引き続いて、酵素的に制御された反応のカスケードにおいて、可溶性フィブリ／−ゲン分子が、酵素トロンビンによって、血栓中に血小板をともに保持する不溶性フィブリンストランドに変換される。カスケードの各ステップにおいて、タンパク質前駆体は、連続して次のタンパク質前駆体を切断するプロテアーゼに変換される。補因子が、多くのステ・ノブで必要である。その活性形態において、タンパク質第Ｖｌｌ＋因子は、プロテアーゼ活性化された第１Ｘ因子による第Ｘ因子の活性化に必要な補因子である。

１９３０年代に、第Ｖｌｌｌ因子または抗血友病因子が血漿中で注目され、命名された。１９４０年代に、第Ｖｌ１１因子中の欠損が血液凝固疾病である血友病Ａに関連するとされた。第Ｖｌｌｌ因子はＸ染色体に連鎖していることが見いだされ、そして、タンパク質であることが推定された。ウシ、ヒト、およびブタ血漿を包含する研究により、１９８０年代に第Ｖｌｌｌ因子がタンパク質として同定されたが、その決定的な細胞源はまだ不確かであった。

正確には、どのようにして第Ｖｌ１１因子が血液凝固に機能するのか知られていない。第Ｖｌ１１因子が、トロンビンまたは第Ｘａ因子によって、タンパク質分解的に第ＶＩＩＩａ［子に活性化されることが知られている。カルシウムとリン脂質との組み合わせにより、第Ｖｌ１１因子は、未知のメカニズムにより、第Ｘ因子のより有効な活性化因子である第１Ｘａ因子を作る。

第Ｖｌｌｌ因子が欠損している、あるいは、第Ｖｌｌｌ因子で処置されないのに第Ｖｌｌｌ因子に対する抗体を有しているヒトは、関節内の炎症反応から早期死亡までの様々な範囲の症状を起こし得、無制御の内部出血を起こしやすい。アメリカ合衆国内に約１０．０００人いるひどい血友病患者は、充分な回数および濃度で投与された場合、血液の正常な凝固活性を回復し得る第Ｖｌｌｌ因子の輸液を用いて治療され得る。事実、第Ｖｌ１１因子の古典的な定義は、血友病Ａを有する個人由来の血漿中の血液凝固欠陥を矯正する、正常な血漿に存在する物質である。

種々の純度の、ヒト血漿由来第Ｖ１１１囚子のいくつかの調製物が、血友病Ａの治療のために市販されており入手可能である。これらは、ウィルスに対する熱および界面活性剤処理された多数人のドナーのプールされた血液由来の部分精製された第Ｎｉｌ因子を含むか、抗原タンパク質；抗原不純物とウィルス混入とが低レベルである、モノクローナル抗体精製された第１Ｘａ因子；および、臨床試験進捗中の組換えヒト第Ｖｌｌｌ因子を、顕著なレベルで含有する。加えて、部分精製されたブタ第Ｖｌｌｌ因子の調製物が、ヒト第Ｖｌｌｌ因子と結合および中和する循環する抗体分子のような、ヒト第Ｖｌｌｌ因子に対するインヒビター、を有する患者を治療するために入手し得る。

血友病患者は、関節内への再発性出血の後に起こる革具性血友病性関節炎を予防するために、第Ｖｌ１１因子を毎日置換する必要がある。しかしながら、第Ｖｌｌｌ因子の濃縮物の供給は、商業生産および治療上の使用の問題から、血友病患者を適切に治療するためには充分豊富ではない。例えば、通常用いられる血漿由来のものは、単離および精製が困難で、免疫原性があり、そしてエイズおよび肝炎ウィルスの感染の危険を除去する処理が必要である。組換えヒト第Ｖｌｌｌ因子は後者の２つの問題を小さくし得る。ブタ第１／ＩＩ＋因子もまた、代替物を提供し得る。なぜなら、ヒト第Ｖｌｌｌ因子は、ブタ第Ｖｌ１１因子を比較して、生理学的濃度およびｐＨで不安定であり、血液中に極めて低濃度（０，２μｇ／ｍｌ血漿）で存在し、そして、その比血液凝固活性が低いからである。

ヒト第Ｖｌｌｌ因子のインヒビターの多くは、ブタ第Ｖｌｌｌ因子と強固に反応しないので、ブタ第Ｖｌｌｌ因子は、現在、ヒト第Ｖｌｌｌ因子の輸液と反応しない条件下の患者の第Ｖｌｌｌ因子欠損を矯正するのに使用されている。ブタ第Ｖｌ１１因子の限界は、１またはそれより多い輸液後のそれに対する阻害抗体の発達である。

上記一般に使用されており、市販されており入手可能な、そして血漿由来の第Ｖｌｌ＋因子にともなう問題は、より良い第Ｖ１１＋因子生産の開発に対する関心を促進する。より活発な第Ｖ１１＋因子分子に対する要求が存在し、それにはより多くのユニットの血液凝固活性を１分子あたり送達し得、選択されたｐＨおよび生理学的ａ度で安定な第Ｖｌｌ＋因子分子；阻害抗体を産生しにくい第Ｖｌ１１因子分子；および、ヒト第’／ＩＩＩ因子に対する抗体を既に得ている患者において免疫系に検出されない第Ｖ１１＋因子分子がある。

それゆえ、本発明の目的は、第Ｖｌｌ＋因子が欠損しているあるいはヒト第Ｖｌｌ＋因子のインヒビターを有する患者の血友病を矯正する第Ｖｌｌ＋因子を提供することである。

本発明のさらなる目的は、血友病患者の治療方法を提供することである。

本発明の他の目的は、第Ｖｌｌ＋因子の血液凝固アッセイにおいて、増強した効能を有する第Ｖｌｌ＋因子を提供することである。

本発明のさらなる他の目的は、選択したｐＨおよび生理学的濃度で安定な第Ｖｌ１１因子を提供することである。

発明の要旨ヒト／ブタハイブリッド血液凝固性第Ｖｌ１１因子は、ヒトおよびブタ第Ｖｌｌ！因子サブユニットの単離および組換えにより、あるいは、ヒトおよびブタ第Ｖｌ１１因子遺伝子の遺伝子工学により生産される。

好ましい実施態様としては、第Ｖｌｌ＋因子のサブユニットは、ヒトまたはブタ血漿から単離および精製され、そして、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌ１１因子は、ヒトＬ鎖サブユニットとブタＨ鎖サブユニットとの混合、あるいは、ブタＬ鎖サブユニットとヒトＨ鎖サブユニットとの混合のいずれかにより、生産され、それにより、ヒトＬ鎖／ブタＨ鎖、および、ヒトＨ鎖／ブタＬ鎖ハイブリッド分子を生産する。これらのバイブ’Ｊ　ｙド分子は、イオン交換クロマトグラフィーにより単離される。

あるいは、組換えＤＮＡ法が、ヒト第Ｖｌｌ＋因子に対応する要素とブタ第ＶｌｌＩ［子の要素とを交換するのに使用され、その結果としてヒト／ブタハイブリッド第Ｖ１１＋因子分子が得られる。

高純度に精製されたヒト／ブタハイブリ、ド第Ｖｌｌ＋因子を調製する方法は、以下の工程：（ａ）血漿由来のヒト第Ｖｌ１１因子のサブユニ、トおよび血漿由来のブタ第Ｖｌｌ＋因子のサブユニットの単離、続いて、ヒトサブユニ、トとブタサブユニットとの混合による血液凝固活性の再構成、続いて、イオン交換クロマトグラフィーによるヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子の単離；（ｂ）組換えＤＮＡ法による、ブタ第Ｖｌｌ＋因子のドメインの構築、続いて、ブタおよびヒト第Ｖｌｌ＋因子のドメインの交換；あるいは、（Ｃ）ヒト第Ｖｌｌ＋因子の特定のアミノ酸残基と相同なブタ第Ｖｌｌ＋因子のアミノ酸残基との部位特異的変異による置換による、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子の創造、により得られる。

その結果として得られるヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子は、ヒト第Ｖｌｌ＋因子より高い、そして、ブタ第ＶＩＩＫ子に比べて等しいかまたはわずかに高い、比活性を有する。

図面の簡単な説明図１　（従来技術）は、サブユニット（Ｈ鎖およびＬ鎖）ならびにそのドメインを示す第Ｖ１１＋因子の分子の概略図面である。

発明の詳細な説明一定義本明細書において用いる「ヒト／ブタハイグ第Ｖ１１＋因子コ因子コとは、ヒトおよびブタ第Ｖ１１＋因子由来の配列を有する、機能性第Ｖｌ１１因子タンパク質分子である。このヒト／ブタハイブリッド第ｖ１［［因子は、ブタ第ｖ（１１因子に比べて等しいかまたは高い比活性を有し、ヒト第Ｖｌ１１因子アツセイにおける活性を有する。特定の実施態様においては、このヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子は、すべてのヒト第Ｖｌｌｌ因子抗体と交叉反応しない。

本明細書において用いる「比活性」とは、ヒト第Ｖｌｌ＋因子欠損血漿の凝固欠陥を矯正し得る活性を言う。比活性は、正常のヒト血漿の凝固時間とヒト第Ｖｌｌ＋因子欠損血漿の凝固時間と比較する標準アッセイにおいて、第Ｖｌ１１因子全タンパク質１ミリグラムのあたりの凝固活性ユニットで測定する。第Ｖｌｌ＋因子活性１ユニットは、正常ヒト血漿１ミリリツトルに存在する活性である。このアッセイにおいては、凝固形成時間が短いほど、第Ｖ１１＋因子活性は高く測定される。

本明細書において用いられる「ハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子」または「ハイブリッドタンパク質」とは、部分的にヒト起源のおよび部分的にブタ起源に由来するアミノ酸配列を有する第ｖ１１１因子タンパク質である。このハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子は、（１）単離した血漿由来のブタまたはヒトサブユニット（Ｈ鎖またはＬ鎖）と、対応するヒトまたはブタサブユニットとの置換；（２）ヒトまたはブタドメイン（ＡＩ、Ａ２、Ａ３、Ｂ１Ｃ１、およびＣ２）と、対応するヒトまたはブタドメインとの置換；（３）ヒトまたはブタドメインの部分と、ブタまたはヒトドメインの部分の置換；または（４）ヒト第Ｖｌ１１因子中の１またはそれより多いアミノ酸残基の、対応するブタ配列における前記残基への変換により生産し得る。融合タンパク賀とは、ハイブタノド遺伝子の産物であり、この融合タンパク質においては、１つのタンパク質のコード配列が、例えば、この融合タンパク質をコードするハイブリ、ド遺伝子を産生ずる異なる遺伝子由来の第２のタンパク質をコードする配列と上記１つのコード配列と融合することにより、広範囲にわたって改変されている。本明細書においては、融合タンパク質は、本出願に記載されたハイブリ、トタンバク質のサブセットである。

本明細書において用いられる「第Ｖｌ１１因子欠損」は、欠陥第Ｖｌｌ＋因子の生産により、不完全な第Ｖｌｌ＋因子または生産されない第Ｖｌｌ＋因子により、あるいはインヒビターによる第Ｖ＋Ｉ＋因子の部分的または全体的な阻害により起こる血液凝固活性の欠損を含む。血友病Ａは、Ｘ染色体に連鎖した遺伝子中の欠陥、および、それがコードする第Ｖｌ１１因子の不在あるいは欠損から起こる第Ｖｌ１１因子欠損の１タイプである。

本明細書において用いられる、ヒトまたはブタ第Ｖｌｌ＋因子の「サブユニットコとは、そのタンパク質のＨ鎖およびＬ鎖である。第Ｖｌｌ＋因子のＨ鎖には、３つの「ドメインＪＡＬ、Ａ２、およびＢが含まれる。第Ｖｌ１１因子のＬ鎖にも、３つの［ドメインＪＡ３、Ｃ１、およびＣ２が含まれる。

一方法の一般的記載高純度に精製されたヒト第Ｖｌｌ＋因子と比較した時に、標準血液凝固アッセイにおける活性がより高いヒト／ブタハイブリッド第Ｖ目！因子の分子は、以下のようにして構築され得る。

本明細書で開示された、４つのタイプのヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子およびこれらの調製方法：これらは、（１）（ａ）ブタサブユニ、ト（例えばＨ鎖またはＬ鎖）と、対応するヒトサブユニットとの置換により；（ｂ）ブタドメイン（例えば、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ｂ、ＣＩ、およびＣ２）と、対応するヒトドメインとの置換により；（Ｃ）ブタドメインの部分と、対応するヒトドメインのフラグメントとの置換により：および（２）ヒト第Ｖｌ１１因子の１またはそれより多いアミノ酸残基の、対応するブタ配列における残基への変換により、得られる。このハイブリッド分子は、以下により詳細に記載した、多様な領域の起源に依存してブタ配列より多くのパーセンテージのヒト配列を含有し得、またはその逆であり得る。

以下に、ブタＨ鎖／ヒトＬ鎖からなり、上記で列記した第一のタイプのハイブリッドに対応する、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子が、ヒト第Ｖｌｌ＋因子と比べて、標準血液凝固アッセイにおいて、より高い血液凝固比活性を有することを示す。このヒト／ブタハイ第Ｖｌ１１因子ｌ＋因子は、インヒビターを有する患者の治療に有用であり得る。なぜなら、これらのインヒビターは、ヒトまたはブタ第Ｖｌｌ＋因子のいずれと比べても、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子との反応性のほうが低いからである。

上記でグループ（１）として列記した、ヒト／ブタバイブ１月。

ド第Ｖｌｌ＋因子タンパク質は、血漿由来の第Ｖｌｌ＋因子のサブユニットの単離、次いで再構築および精製により作られる。上記でグループ（２）として列ご己したヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩ＋因子タンパク質は、組換えＤＮＡ法により作られる〇単離したヒトおよびブタ第Ｖｌｌｌ囚　サブユニットからのによるヒト　ブタハイブリッド　Ｖｌｌｌ　の　の−：ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌ１１因子の分子は、調製され、単離され、そして、これらの血液凝固促進（Ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）活性が特徴付けられる。１つの方法［この方法は、Ｆａｙ、　Ｐ、　Ｊ。

らにより、２６５　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、６１９７＜１９９０）　（本明細書に参照する）で報告された手順、および、Ｌｏｌ　ｊａｒ、　Ｊ、　Ｓ、らにより、２６３Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１１０４５１（１９８＞　（本明細書に参照する）で報告された手順を改変したもの］においては、ヒトおよびブタ第Ｖ＋ｒ１因子のサブユニット（Ｈ鎖およびＬ鎖）の単離、それに続く、ヒトＨ鎖およびブタＬ鎖の組換え、または、ヒトＬＩＫおよびブタＨ鎖の組換えを含む。

それぞれの種由来の個々のサブユニットの単離は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いたカルシウムのキレート化、そしてそれに続＜　Ｍｏｎｏ　Ｓ　Ｔ″ＨＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）による、Ｌ鎖／Ｈｊｊｌダイマーの解離を含む。ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子の分子は、カルシウムの存在下で単離されたサブユニットから再構築される。ヒトＬ鎖／ブタＨ鎖ハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子またはブタＬ鎖／ヒｌ −Ｈ鎖ハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子は、Ｍｏｎｏ　Ｓ　ＴＭＨＰＬＣを用いて、Ｌｏｌｌａｒ、Ｊ。

Ｓらにより、７１　Ｂｌｏｏｄ　１３７−１４３（１９８８）　（本明細書に参照する）で報告されたブタ第Ｖｌｌ＋因子の単離手順により、未反応性のＨ鎖から単離される。

以下の実施例で詳細に記載するこれらの方法により、ヒト第Ｖｌ１１因子の血液凝固促進活性の６＠より高い前記活性を有するヒトＬ鎖／ブタＨ鎖ハイブリッド分子が得られる。

ヒトおよびブタ第Ｖｌｌｌ囚　サブユニットをコー　ド　る　フ１の、且　え− ユ：ＪｉＪ二工も−る一ヒト　ブタハイブリッド　’／ＩＩ＋因　の　の−製：ヒト第Ｖｌ１１因子遺伝子は、単離され、は乳類細胞において発現された。これは、Ｔｏｏｌｅ、　Ｊ、　Ｊ、ら、３１２　Ｎａｔｕｒｅ　３４２−３４７（１９８４）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）　；　Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ、Ｊ、ら、３１２　Ｎａｔｕｒｅ　３２６−３３００９８４＞（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈン　；　Ｗｏｏｄ、Ｗ、１．　ら、３１２　Ｎａｅｕｒｅ　３３０−３３７（１９８４）　（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）　；　Ｖｅｈａｒ、　Ｇ、Ａ、ら、３１２　Ｎａｔｕｒｅ　３３７−３４２（１９８４）　（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）　（これらはそれぞれ本明細書に参照する）で報告された。そして、アミノ酸配列はｃＤＮＡから推定された。Ｃａｐｏｎらによる米国特許第４．９５５．１９９号は、は乳類宿主細胞において第Ｖｌｌ＋因子を産生ずる組換えＤＮＡ法およびヒト第Ｖｌｌ＋因子の精製法を開示する。Ｃ’ＨＯ（チャイニーズハムスターの卵巣）細胞およびＢＨＫＣ（ベビーハムスターノ腎細胞）における第Ｖｌｌ＋因子の発現が、既に報告されている。

ヒト第Ｖｌｌ＋因子をコードするｃＤＮＡ配列、および、推定されるアミノ酸配列を、以下に示す。

（以下余白）ロ　０　ロ　ロ　ロ　ロ　０　ロ　ロ　ロ　ロ　０　ロ　ロ　ロ　ロ　。　ロ　。

！　ロ　−　ＩＮ　の　寸　ロ　ψ　〜　ω　寸　０　１　ヘ　ロ　！　０　１　〜９　−　−　ψ　φ　さ　ロ　ω　■　ω　ロ　−　−ヘ　ヘ　門　ザ　寸　いマ　！　マ　す　マ　？　？　寸　マ　マ　給　ＩＩ′Ｉ　膿　い　い　い　い　い　い０　０　ロ　ｏ　ｏ　ｏ　ロ　ロ　ロ　ｏ　ｏ　ｏ　Ｏロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ１　ヘ　−　寸　ロ　ＪＮ　ロ　マ　０１１＋Ｎ　ω　マ　ｏ　１　〜　ω　マ１　さ　〉　ω　［Ｆ］　の　ロ　ロ　―　へ　へ　−−寸　ｕ’ ＋ｕ’＋ｔａｓ＋’−１−１１１１さ口さささささささささｉさロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　０　ロ　ロ　ロ　０　ロ　ロ　ロ　ロ　ロロ　ψ　Ｎ　口　寸　ロ　ψ　へ　ａ５？　ロ　１　ヘ　ロ　！　ロ　１　〜ロ　−　■　ロ　ロ　−　−へ　Ｎｌ＋１　す　曽　ｊ　１　１　さ　さ　中さ　さ　さ　ト　ロ　 ω　ω　中　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロトＰｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ｌ１ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｑ　Ａｓ■ Ｇｌｕ＾ｌａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｑ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ１］０　１コ５　１４゜Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ｒｌｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ２２５　２〕ｏ　２コ５　２４゜Ｘａａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｕｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　ＧｌｙＡｓｐ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ八ｌａ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　５ｅｒ　ＡｒｑＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　ＸａａＸａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ７２５　１］０　７］５Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｑ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＭｅ仁　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　工ｉｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　八１ａＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　ＡｒｇＶａｌ　）１．ｉｓ　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｃ凾 ■ ８２０　８２５　８］０Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｉｉｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ８〕５　８４０　８４５Ｐｒｏ　Ｉ’ｒｏ　Ｓｅ仁　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｇｌ■ ８Ｂ５　８９０　Ｂ９５ブタとヒトの両方の第Ｖｌｌ＋因子は、２つのサブユニットのタンパク質として血漿から単離される。図１　（従来技術）に、上記分子のサブユニット構造の概略図面を示す。Ｈ鎖およびＬ鎖として公知の上記サブユニットは、カルシウムまたは他の２価の金属イオンを必要とする非共有結合により、互いに結合している。第Ｖｌｌ＋因子のＨ鎖は、共有結合で結合した３つのドメインＡＩ、Ａ２、およびＢを含有する。第Ｖｌｌ＋因子のし鎖は、Ａ３、ＣＩ、およびＣ２と名付けられた３つのドメインを含有する。Ｂドメインは、既知の機能を有さす、第Ｖｌ１１因子の測定可能な任意のパラメーターにおける顕著な変化をさせずに、タンパク質分解的にまたは組換えＤＮＡ法により、分子から除去され得る。ヒト組換え第Ｖｌｌ＋因子は、は乳類中で発現されないとグリコリル化されないが、血漿由来の第ＶＩ　Ｉ＋因子と同様の構造および機能を有する。

ヒトおよびブタの両方の活性化第Ｖｌｌ＋因子（第Ｖｌ１１因子）は、ＡＩドメインとＡ２ドメインとの間のＨｉｌｌの切断による３つのサブユニットを有する。この構造物はＡｌ／Ａ２／Ａ３−Ｃｌ−Ｃ２と名付けられた。ヒト第Ｖｉｌｌａ因子は、ブタ第Ｖｌ１１因子が安定な条件下では安定ではない。これは、ヒト第Ｖｉｌｌａ因子のＡ２サブユニットの結合か弱いからである。ヒトおよびブタ第Ｖｌ１１因子のＡ２サブユニットの解離は、活性の喪失を伴う。

ブタＢドメインのヌクレオチド配列は既知であるので、ノ＼イブリッドの全長を構築し得る。ブタ第Ｖｌ１１因子ｃＤＮＡの個々のドメインは、クローン化され得、確立された変異法により対応するヒトドメインを置換し得る。これらの第Ｖｌ１１囚子ｃＤＮＡ分子は、活性なヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子のタンパク質分子の最終発現のために発現ベクター中へクローン化され得る。

成熟ヒト第Ｖ１１１因子の残基３７２−７４０位に相同である、完全なブタ第Ｖｌ１１因子のＡ２ドメインが配列決定され、そしてアミノ酸配列が推定された。

これらの配列を以下に示す。

（以下余白） −薬学的組成物ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子を含有する薬学的組成物は、本明細書に参照される手法である、Ｅ、　Ｗ、　ＭａｒｔｉｎによりＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓに記載されたような、既知の方法に基づいて調製される。上記薬学的組成物は、単独、あるいは、適切な薬学的安定化組成物、送達賦形剤、および／またはキャリア賦形剤との組合せである。

好適な一実施態様においては、静脈内輸液に対する好適なキャリアまたは送達賦形剤は、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水である。

好適な他の実施態様においては、好適な安定化化合物、送達賦形剤、およびキナ１ノア賦形剤には、アルブミンのような他のヒトまたはブタタンパク質を含有するが、これに限定されない。

リン脂質賦形剤またはリポソーム懸濁液もまた、薬学的に受容可能なキャリアまたは送達賦形剤として好適である。これらは、当業者に公知の方法に基づいて調製され得、そして、例えば、ホスファチンルセソン／−ホスファチジルコリン、または表面に負電荷をともに与えるリン脂質または界面活性剤である他の組成物を含有し得る。なぜなら、第Ｖｌ１１因子は負帯電したリン脂質膜と結合するからである。リポソームは、適切な脂質（例えば、ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ステアロイルホスファチジルコリン、アラカドイル（ａｒａｃｈａｄｏｙｌ）ボスファチ／ルコリン、およびコレステロール）を、無機溶媒に溶解し、次いでエバボレートし、容器の表面上に乾燥した脂質の薄膜として残すことにより調製され得る。次いで、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌ１１因子の水溶液を、上記容器中に庄く。この容器を、さらに手で渦を巻くように振り、容器の側面から脂質物質をフリーにし、脂質凝集物を分散させ、それによりリポソーム懸濁液を生成する。

ヒト／ブタパイプｌノット第Ｖ１冊因子は、ビタミンに依存性血液凝固因子、組織因子（ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ）、およびフォンビルプラント因子（ｖＷｆ）または第Ｖｌｌ＋因子結合性部位を含むｖＷｆのフラグメント、ならびにンヨ糖などの多糖を含有する、他の適切な安定化化合物、送達賦形剤、および／またはキャリア賦形剤と組合され得る。

ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子は、レトロウィルスベクターのような送達手段を用いた、ヒト第Ｖ１冊因子が送達され得るのと同様の方法で、遺伝子治療により、送達され得る。

この方法は、第Ｖｌｌｌ因子欠陥患者中への直接移植、または、第Ｖｌｌ＋因子の分子には透過性であるが細胞には不透過性である移植可能なデバイス中に置かれる、次いで移植される、第Ｖｌｌ＋囚子ｃＤＮＡのヒト細胞中への導入からなる。好適な方法は、レトロウィルスが介在する遺伝子転移であり得る。この方法においては、外因性遺伝子（例えば第Ｖｌｌ＋因子ｃＤＮＡ）は、改変レトロウィルスのゲノム中にクローン化される。

この遺伝子は、宿主細胞のゲノム中に、細胞により発現され得るウィルス機構によって挿入される。このレトロウィルスベクターは、改変され、ウィルスを産生し得ずに、宿主のウィルス感染を防止する。このタイプの治療の一般的原理は、当業者には公知であり、文献（例えば、Ｋｏｈｎ、　Ｄ、　Ｂ、およびＰ、ＷＫａｎｔｏｆｆ、　２９　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　８１２−８２０．１９８９）に記載されている。

ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子は、ハイブリ、ド分子の半減期および在庫保存期間を増加させるために、ｖＷｆに結合して保存され得る。さらに、第Ｖｌ１１因子の凍結乾燥は、ｖＷｆの存在下における活性化分子の収率を改良し得る。商業供給者が現在用いているヒトおよびブタ第Ｖｌｌ＋因子の保存方法は、ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩ　Ｉ＋因子の保存のために用いられ得る。これらの方法は、以下を含む：（１）部分精製された段階（例えば、さらに精製することなく輸液とされた第Ｖｌｌ＋因子「濃縮物」として）の第Ｖｌｌ＋因子の凍結乾燥；　（２＞Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ法による、第Ｖ１冊因子の免疫アフィニティー精製および第Ｖ１冊因子を安定化するアルブミンの存在下での凍結乾燥；（３）アルブミンの存在下での組換え第Ｖｌｌ＋因子の凍結乾燥。

あるいは、ヒト／ブタハイブリ、ド第Ｖｌｌ＋因子は、０．６ＭＮａｃｌ、２０ｍＭ　ＭＥＳ、および５ｍＭ　ＣａＣｌ２．ｐＨ６，０中、４°Ｃにおいて、無期限に安定であり、これらの緩衝液中で凍結して保存し得、そして活性の最低限の喪失で解凍し得る。

−治療方法ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌ１１因子は、阻害抗体を有するおよび有さない血友病患者ならびに阻害抗体の発達によりもたらされる第Ｖｌｌｌ因子欠損を有する患者における第Ｖ１１＋因子欠損による非制御出血（例えば、関節内の、頭蓋内の、または胃腸管の出血）を治療するために用いられる。この活性物質は、好ましくは静脈内に投与される。

あるいは、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子は、上記のように、ハイブリッドを産生ずるように遺伝的に改変された細胞の移植、または、このような細胞を含有するデバイスの移植により、投与され得る。

好適な実施態様においては、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖ１冊因子単独、あるいは、安定化剤、送達賦形剤、および／またはキャリアとの組合せの薬学的組成物が、ヒトまたはブタ第Ｖｌｌ＋因子の注入に用いられるのと同様の手順に基づいて、患者に静脈注入される。

上記治療を必要とする患者に投与され得るヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子組成物の治療投与量は、第Ｖｌｌｌ因子欠損の程度に依存する。

一般的には、投与量のレヘルを、それぞれの患者の出血現象の程度および持続時間に合わせて、投与回数（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、持続時間、二二、トを調整する。従って、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子は、薬学的に受容可能なキャリア、送達賦形剤、または安定化剤中に、標準血液凝固アッセイで測定した時に出血を止めるための治療学的に有効な量のハイブリッドを患者に送達するのに充分な量で含有される。

通常、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌ１１因子投与により患者において達成される、所望の血漿第Ｖｌ１１因子レベルは正常の３０から１００％までの範囲である。ヒト／ブタノ＼イブリット′第ＶＩＩ＋因子の好適な投与の形態においては、上記組成物（ま、体重１ｋｇあたり約２０ユニツトから５０ユニツトまでの範囲の好適な投与量で、静脈に注入され；投与の間隔は、約８時間力）ら２４時間の範囲であり（重症の血友病患者にお（Ａて）；そして、治療持続日数は、１日から１０日の範囲である力）、また（よ、出血力なくなるまでである。Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ｗ、　Ｊ、らｓ　（１９９０）の石虹叫旦■におけるＲｏｂｅｒ　ｔｓ、　ｔＬ　ＲおよびＭ、　Ｒ，ＪｏｎｅｓのＩＨｅｍｏｐｈｉｌｉａ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　−Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ　ｏｆＰｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ（Ｆａｃｔｏｒ　Ｉｌ、　Ｆａｃｔｏｒ　Ｖ、　ａｎｄ　Ｆａｃｔｏｒｓ　Ｖｌｌ　ｔｏ　Ｘ山Ｊ　Ｃｈ、１５３．１４５３−１４７４．１４６０を参照のこと。インヒビターを有する患者は、ヒト／ブタノ＼イブリッド第Ｖｌｌｌ因子をより多く必要とするか、または、患者は、ヒト／ブタノ−イブ１）ｌド第Ｖｌ１１因子より少なく必要とするかである。ヒト第Ｖｌ１１因子よりも高い比活性であるからである。ヒトまた（ま）゛り第Ｖｌｌ＋因子を用いた治療においては、注入される第Ｖｌｌ＋因子の量（よ、１工程の第Ｖ１１１因子血液凝固アツセイ（こより決定され、そして、選択された例では、インビボでの回収（′！庄人後の、虫者の血漿中の第Ｖｌｌ＋因子を測定することにより決定される。任意の特定の被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に対する特定の投与摂生法（ｒｅｇｉｍｅｎｓ）は、個体の必要性、または組成物の投与を指示また（ま管理する専門医の判断により、常時調整され、し力）も本明細書で提示される濃度範囲は例としてのみであり、そして、８青求項に記載の組成物の範囲または実際に限定されな℃１ことを意図する。

治療は、組成物の単回静脈内投与、あるいは、所望により、拡張された時間の期間にわたる定期的または連続投与の形態を取り得る。あるいは、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌ１１因子は、多様な時間間隔て、単回または数回の投与により、リポソームと共に、皮下あるいは経口投与され得る。

上記に一般的に記載した、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖ１１１因子の分子、ならびに、単離、特徴付け、産生、および使用方法は、以下の限定されない実施例に関連してさらに理解され得る。

（以下余白）実施例　１；ブタ第Ｖｌ１１因子およびヒト／ブタハイブリッド第Ｖ１１１因子のアッセイブタ第Ｖｌ１１因子は、分子の比活性に基づきヒト第Ｖ１１１因子より多い凝固活性を有する。これらの結果を実施例４０表ＩＩに示す。この結果は、ヒトおよびブタ第Ｖｌｌ＋因子を公平に比較し得る適切な標準曲線の使用に基づく。凝固アッセイは、血友病Ａの患者由来の血漿の血液凝固時間を短縮する第Ｖｌｌ＋因子の能力に基つく。２種類のアッセイを行った：すなわち、１工程のアッセイおよび２工程のアッセイである。

１工程のアッセイにおいては、０．１ｍｌの血友病Ａ血漿（Ｇｅ。

ｒｇｅ　Ｋｉｎｇ　Ｂｉｏｍｅｃｌｉｃａｌ、　Ｉｎｃ、）を、０．１ｍｌの活性化された部分トロンボプラスチン試薬（ＡＰＴＴ）（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ）、および０゜０１　ｍｌの試料または標ｒ＄試薬と水浴中で３７℃で５分間インユニベートした。襟章試薬は、希釈クエン酸緩衝化正常ヒト血漿からなる。インキュベーションの後、０．１ｍｌの２０　ｍＭ　ＣａＣｌ２ヲ添加し、そしてフィブリン凝固が生じる時間を視覚による検査により１測定した。

第Ｖｌ１１因子の１単位を、１ｍｌのクエン酸緩衝化した正常ヒト血漿中にある量と定義する。ヒト血漿を標準として、ブタおよびヒト第Ｖｌ１１因子活性を直接比較した。標準血漿または精製タンパク質の希釈を、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０２Ｍ　）ＩＥＰＥＳ（ｐＨ７，４）中で行った。標準曲線を、血漿の３または４の希釈液に基づいて作製し、最大希釈は１１５０であり、そしてｌｏｇｔ　ｏ血液凝固時間をｌｏｇＩ　Ｃ血漿１度に対してプロットすると直線プロットとなる。未知試料中の第Ｖｌｌ＋因子の単位数を、標準曲線から補間法により決定した。

１工程ア、セイは、血友病Ａ血漿中で形成された活性化剤による第Ｖｌｌ＋因子の内因性活性化に依存するが、２工程アツセイは予備活性化第Ｖ］（（因子の血液凝固促進活性（ｐｒｏｅｏａｇｕｌａｎｔ）を測定する。、２工程アツセイにおいて、トロンビンと反応した第Ｖｌｌ＋因子含有試料を、３７°Ｃで５分間ブレインキュベートした活性化された部分トロンボプラスチンおよびヒト血友病人血漿の混合物に添加した。次いで、得られた血液凝固時間を、上述した同じヒト標準曲線に基づいて単位／ｍｌに変換した。２工程アツセイにおける相対活性は、第Ｖｌｌ＋因子を予備活性化したので、１工程アツセイにおけるより高かった。

実施例　２：ヒトとブタ第Ｖｌｌ＋因子との間の機能的な相違の特徴付け。

ブタおよびヒト血漿由来第Ｖｌｌ＋因子およびヒト組換え第Ｖ１１１因子の単離は文献中に記載されている。Ｆｕｌｃｈｅｒ、　Ｃ，Ａ、、およびＴ、Ｓ、　Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、７９　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ｌＪ、ｓ、Ａ。

１６４８−１６５２　＜１９８２）＋　Ｔｏｏｌｅ、　Ｊ、　Ｊ、、ら、　３１２　Ｎａｔｕｒｅ　３４２−３４７（１９８４）　（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）＋　Ｇｔｔｓｃｈｉｅｒ、Ｊ、、ら、３１２　Ｈａｔｕｒｅ　３２６−３３０　（１９８４）　（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）：　Ｗｏｏｄ、Ｗ、［、ら、３１２　Ｎａ１ｕｒｅ　３３０−３３７　（１９８４）　（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；　Ｖｅｈａｒ、Ｇ、Ａ、、ら、　３１２Ｎａｔｕｒｅ　３３７−３４２　（１９８４）　（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；　Ｆａｓｓ、Ｄ、Ｎ、、ら、５９Ｂｌｏｏｄ　５９４　（１９８２）＋　Ｔｏｏｌｅ、Ｊ、Ｊ、、ら、８３　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［１，Ｓ、Ａ、　５９３９−５９４２　（１９８６）。この単離はい（つかの方法で成し遂げられる。上記の調製物の全てはサブユニット組成において類似しているが、一つにはそれらを比較するのに共通の基準を用いていないため、以前は注目されていなかった。本明細書はヒト第Ｖｌｌ＋因子とブタ第Ｖｌｌｌ因子との間の機能的相違の最初の記載である。

ヒト組換え第Ｖｌｌ＋因子とブタ第Ｖｌｌｌ因子を比較するために、高度に精製されたヒト組換え第Ｖｌｌ＋因子（Ｃｕｔｔｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、　ＣＡ）およびブタ第Ｖｌｌｌ因子（Ｆａｓｓ、　Ｄ、　Ｎ、、ら、５９　Ｂｌｏｏｄ　５９４　（１９８２）に記載のように免疫精製した）調製物を、Ｍｏｎｏ　Ｑ”（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）陰イオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ、）上の高圧液体り０７トグラフイー　（ＨＰＬＣ）にかけた。Ｍｏｎｏ　Ｑ”’　ＨＰＬＣ工程の目的は、少量の不純物の除去と共通の緩衝液への交換は、ヒトおよびブタ第Ｖｌｌｌ因子を比較するためである。１０００〜２０００単位の第Ｖｌｌ＋因子を含んでいるバイアルを５ｍｌの８２０で再構築した。次いで、Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７，４で２Ｍ）を添加し最終濃度をＯ，０２Ｍにした。第Ｖｌｌ＋因子を、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０２Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、５　ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ７，４（緩衝液Ａに０，１５Ｍ　ＮａＣ１を添加）で平衡化したＭｏｎｏ　Ｑ”　ＨＲ５１５にかけた；１０ｍ１の緩衝液Ａ　＋　０．１５Ｍ　ＮａＣ１で洗浄し；そして緩衝液Ａ中の０゜１５Ｍ　〜０．９０ＭのＮａＣ１２０ｍｌの直線濃度勾配を用い、流速１ｍ１７分で溶出した。

ヒト第Ｖｌ１１因子（血漿由来およびＭｏｎｏ　Ｑ”　ＨＰＬＣで精製）およびブタ第Ｖｌｌｌ因子を比較するために、免疫アフィニティー精製した血漿由来のブタ第Ｖｌｌｌ因子を、０．０４Ｍ　Ｈｅｐｅｓｓ　５ｎ＋Ｍ　ＣａＣｌ２．０．０１％Ｔｖｅｅｎ−８０（ｐＨ７，４）で１・４に希釈し、そしてヒト第Ｖｌｌ＋因子について前の文節に記載した同じ条件下でＭｏｎｏ　ＱＴＭＨＰＬＣにかけた。ヒトおよびブタ第Ｖｌ１１因子を単離するためのこれらの手順は当業者にとって標準的なものである。

カラム画分を、１工程凝固アツセイにより第Ｖｌｌ＋因子活性についてアッセイし、アッセイ結果の平均を、物質のＡｎ。当たりの活性単位で表して表■に示した。この結果は、１工程アツセイを用いる場合、ブタ第Ｖｌｌｌ因子か、ヒト第Ｖｌ１１因子よりも少なくとも６倍大きい活性を有することを示す。

表　Ｉ　ヒトおよびブタ第Ｖｌｌｌ因子凝固活性の比較活性（Ｕ／Ａ２ａｏ）ブタ　２１．３００ヒト血漿由来　３．６００ヒト組換え　２，４００実施例　３：ヒトおよびブタ第Ｖｉｌｌａ因子の安定性の比較第Ｖｌ１１因子に対する１工程アツセイの結果は、試料中の第Ｖｌｌｌａ因子に対する第Ｖｌｌ＋因子の活性化、およびおそらくは形成された第Ｖｉｌｌａ因子活性の損失を反映する。ヒト第ｖｌｉｌ因子およびブタ第Ｖｌ１１因子の安定性の直接比較を行った。Ｍｏｎｏ　ＱＴＭＨＰＬＣ由来の試料を同じ濃度および同じ緩衝液組成に希釈し、そしてトロンビンと反応させた。様々な時間で、試料を２工程凝固ア、セイするために取り出した。代表的には、ピーク活性（２分後）は、ブタ第Ｖｌｌｌａ因子の方がヒト第Ｖｌｌｌａ因子より１０倍高かった。そしてブタおよびヒト第Ｖｌｌｌａ因子の両方の活性は実質的に減少し、ヒト第Ｖｉｌｌａ因子活性の方がより急速に減少した。

一般的に、安定なヒト第Ｖｌｌｌａ因子を単離する試みは、安定なブタ第Ｖｌｌｌａ因子を生成する条件を用いる場合ですら成功しない。これを示すために、Ｍｏｎｏ　ＱＴＭＨＰＬＣで精製したヒト第ＶＩＩ＋因子をトロンビンで活性化し、そして安定なブタ第Ｖｉｌｌａ因子を生成する条件下で、Ｍｏｎｏ　ＳＴＭ陽イオン交換（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ）ＨＰＬＣにかけた（Ｌｏｌｌａｒ、　Ｊ、　Ｓ、、およびＰａｒｋｅｒ、　Ｃ，Ｇ、。

２８　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　６６６、１９８９、この教示は本明細書中に援用されている）。

全体積１０　ｍｌの、０．２Ｍ　ＮａＣ１，０，ＯＩＭ　Ｈｅｐｅｓ、　２．５　ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ７，４中のヒト第Ｖｌｌ＋囚子４３ａ　ｇ／ｍ１（０，２ｔｔ　Ｍ＞を、トロンビン（０，（１３６μＭ）と１０分間反応させ、反応後、ＦＰＲ−ＣＨ２Ｃｌ　Ｄ−フェニル−プロリル−アルキニル−塩化メチルケトンを０．２μＭのａｉになるように添加しトロンビンを不可逆的に不活性化した。次いで、ａ　合液ヲ、４０　ｍＭ　２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、５ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ６，０で１．１に希釈し、そして５ｍＭ　ＭＥＳ、５ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ６，０（緩衝液Ｂ）　−０，１Ｍ　ＮａＣ１で平衡化したＭｏｎｏ　ＳＴＭＨＲ５１５ＨＰＬＣカラムに２ｍ１／分の流速でかけた。カラムを洗浄せずに、第Ｖｌｌｌａ因子を、２０　ｍｌの緩衝液Ｂ中の０．１ＭＮａｃ１〜０．９Ｍ　ＮａＣ１の濃度勾配で、１　ｍ１７分で溶出した。

２工程アツセイにおける凝固活性の両分を、これらの条件下で単一ピークとして溶出した。ピーク画分の比活性は、約７．５００　Ｕ／Ａ２ａｏであった。Ｍｏｎｏ　ＳＴＭ第Ｖｌｌｌａ因子ピークのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）　した後、タンパク質を銀染色し、第Ｖｌｌ＋因子由来の異型二量誘導体（Ａ３−ＣＩ−Ｃ２／Ａ　Ｉ　）に対応する２本のバンドを生じた。Ａ２フラグメントは濃度が低かったので、これらの条件下で銀染色では同定されず、１２Ｊ［識により微量生成物として同定した。

ヒト第Ｖｌｌ＋因子を用いた結果に対して、同一の条件下でＭ。

ｎｏ　ＳＴＭＨＰＬＣにより単離したブタ第Ｖ１１１ａ因子は、１．６Ｘ１０６Ｕ／Ａ２８０の比活性を有した。ブタ第Ｖｉｌｌａ因子の分析を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより行うと、Ａ１、Ａ２、およびＡ３−Ｃｌ−Ｃ２サブユニットに対応する３つのフラグメントが示され、ブタ第Ｖｉｌｌａ因子が３つのサブユニットを有することが証明された。

ｐＨ６，０におけるヒトトロンビン活性化第Ｖｌｌ＋因子調製物のＭｏｎｏ　Ｓ ”　ＨＰＬＣの結果は、安定なブタ第Ｖｉｌｌａ因子を生じる条件下で、ヒト第Ｖｉｌｌａ因子か不安定であることを示す。しかし、微量のＡ２フラグメントがピーク画分で同定されたが、凝固活性が、少量の異型三量体第Ｖｉｌｌａ因子から生じるのかまたは低い比活性を有する異型二量体から生じるか否かの決定は、この方法だけからは可能ではなかった。

ヒト第Ｖｌｌｌａ因子がＡ２サブユニ、トを失う前にヒト第ＶｌｌＩａ因子を単離する方法がこの疑問を解決するのに好適である。

この目的に、Ｍｏｎｏ　ＳＴＭ緩衝液のｐＨをｐＨ５まで下げること包含する手順で単離を行った。Ｍｏｎｏ　ＱＴＭで精製したヒト第Ｖｌｌｌ因子（０，５ｍｇ）を、Ｈ２Ｏで希釈して、０．２５Ｍ　ＮａＣ１，０，ＯＩＭ　Ｈｅｐｅｓ、　２゜５　ｍＭＣａＣ１２，００５％Ｔｖｅｅｎ−８０、ｐＨ７，４（全体積７．０　ｍｌ）中の０゜２５ｍｇ／ｍｌ（１μＭ）の第Ｖｌｌｌ因子の最終組成物を調製した。トロンビンを最終濃度００７２μＭになるように添加し、そして３分間反応させた。次いで、トロンビンをＦＰＲ−ＣＨ２Ｃ１（０，２μＭ＞”不活性化した。次いで、混合液を、４０　ｍＭ酢酸ナトリウム、５ｍＭ　ＣａＣｌ２．０，０１％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐｏｓ、ｏで１１に希釈し、そして００１Ｍ酢酸ナトリウム、５　ｍＭ　ＣａＣｌ２．００１％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ５゜０　＋０．１Ｍ　ＮａＣ１で平衡化したＭｏｎｏ　ＳＴＭｔ（Ｒ５１５ＨＰＬＣカラムに２　ｍ１７分でかけた。カラムを洗浄せずに、第Ｖｌｌｌ因子を２０　ｍｌの同緩衝液中の０．１Ｍ　ＮａＣ］〜１．ＯＭ　ＮａＣ１の濃度勾配を用いて１ｍｌ／分で溶出した。この結果、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により示されるＡ２フラグメントの検出可能量を含有するピーク中に凝固活性を回収した。

ピーク画分の比活性は、ｐｉ（６，０で回収した活性より１０倍高かった（７５，０００　Ｕ／Ａ２ａｏ対７，５００　Ｕ／Ａ２ａｏ）。

しかし、４°Ｃで長期間安定なｐＨ６，０で単離したブタ第Ｖｌｌｌａ因子に対して、ヒト第Ｖｌ１１因子活性は、Ｍｏｎｏ　Ｓ”から溶出後数時間の期間にわたり絶え間なく減少した。さらに、ｐＨ５，０で精製し、直ちにアッセイした第Ｖｌ１１因子の比活性は、ブタ第Ｖ１１１ａ因子のほんの５％であり、アッセイ前に実質的な解離が生じたことを示す。

これらの結果は、ヒトおよびブタ第Ｖｌ１１因子の両方が、３つノサブユニット（Ａｌ、Ａ２、およびＡ３−Ｃ１−Ｃ２＞で構成されることを示した。Ａ２サブユニ、トの解離は、生理学的イオン強度、ｐＨ１および１度などの特定の条件下で、ヒトおよびブタ第Ｖｌｌｌａ因子の両方の活性の損失に対応する。特定条件下でのブタ第Ｖｌｌｌａ因子の相対的安定性は、Ａ２サブユニットのより強力な結合による。

実施例４：ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子の調製ブタ第Ｖｌ１１因子り鎖および第Ｖｌｌ＋囚子Ｈ鎖を、以下のように単離した。０．５ＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７，４）を、Ｍｏｎｏ　ＱＴＭで精製したブタ第Ｖｌｌｌ因子に添加して最終ａ度を０．０５Ｍとし、そして室温で１８〜２４時間放置した。等量の、緩衝液Ｂ　（１０ｍＭ　ヒスチジン−ＨＣｌ　１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０２％ｖ／ｖ　Ｔｖｅｅｎ　８０、ｐＨ６，０）を添加し、そしてこの溶液を１　ｍ１７分で、緩衝液Ａ　＋　０．２５Ｍ　ＮａＣ１で前もって平衡化したＭｏｎｏ　Ｓ”　ＨＲ５１５カラムにのせた。第Ｖｌ１１因子Ｈ鎖は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより判断されたように、樹脂に結合しなかった。第Ｖｌｌｌ因子り鎖を、２０　ｍｌの緩衝液Ａ中の０１〜０．７ＭＮａＣ１直線濃度勾配を用いて１ｍｌ／分で溶出した。そして第Ｖｌｌｌ因子り鎖ｉ；！５ＤＳ−ＰＡＧＥテ均一であった。第Ｖｌ１１因子Ｉ（鎖を、ｍｏｎｏ　Ｑ”　ＨＰＬＣにより以下の方法で単離した。第Ｖｌｌ＋囚子Ｈ鎖は、第Ｖｌ１１因子り鎖を精製している間、ｍｏｎｏ　ＳＴＭに吸着しなかった。第Ｖｌｌ＋囚子Ｈ鎖を含有する吸着されなかった（ｆｕｌｌ−ｔｈｒｏｕｇｈ）溶出物質に０．５Ｍ　Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，４＞を添加してｐＨ７゜２に調節し、そして０．ＩＭ　ＮａＣ１，０，０２Ｍ　）ｌｅｐｅｓ、　０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０（ｐＨ７，４）で平衡化したｍｏｎｏ　Ｑ”　ＨＲ５１５ＨＰＬＣカラムにのせた。

カラムを１０ｍＬの同緩衝液で洗浄し、そして第Ｖｌ因子Ｈ鎖を、２０ｍＬの同緩衝液中の０．１〜１．ＯＭ　ＮａＣ１ａ度勾配で溶出した。ヒトＬ鎖およびＨ鎖を、同じ方法で単離した。

ヒトおよびブタＬ鎖およびＨ鎖を、以下の工程に従って再Ｉ　築Ｌ　ｔ：、。１００μｇ／ｍ　１１度のヒトまたはブタ第Ｖｌｌｌ因子り鎖の１０μｍを、ＬＭ　ＮａＣ１，０，０２Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、　５ｍＭ　ＣａＣ１４，０，０１％Ｔｖｅｅｎ−８０（ｐＨ７，４）中で、（１）同緩衝液中の２５μｌの異質のＨ鎖６０μｇ／ｍｌ　；　（２）ｌＯμｌの０．０２Ｍ　Ｈｅｐｅｓ、　０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０、ｐＨ７，４；（３）５μｌの０．６Ｍ　ＣａＣｌ２と、室温で１４時間混合した。この混合液を、０．０２Ｍ　ＭＥＳ、００１％Ｔｗｅｅｎ− ８０，５ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ６で１７４に希釈し、Ｏ，ＩＭ　ＮａＣ１，０，０２Ｍ　ＭＥＳ、　０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０，５ｍＭＣａＣ１）、ｐＨ６，０中で平衡化したＭｏｎｏ　ＳＴＭＨｒ５１５にのせた。同緩衝液中で、０．１〜１．０Ｍ　ＮａＣ１２０ｍｌのａ度勾配を１ｍ１７分で行％ｓ。

そして０．５ｍｌずつ画分を集めた。画分の２８０μｍでの吸収を測定し、そして１工程血液１Ｍ固アッセイにより第Ｖｌｌｌ因子（二対する吸収て画分をアッセイした。（Ｈ鎖に結合してし＼な（１）遊離し鎖もまたＭｏｎｏ　Ｓ”に結合するのでＨ鎖が過剰に存在した；過剰のＨ鎖は遊離し鎖が調製物の一部分でないことを確実（こした。Ｍｏｎｏ　Ｓ”　ＨＰＬＣ精製に続いて、鎖の４つの可能な組み合せ全ての再構築実験を行った：この４つの組合せは、ヒトＬ鎖、′ヒトＨ鎖、ヒトＬ鎖／ブタＨ鎖、ブタＬ鎖／フリＨ鎖、ブタＬ鎖／′ヒトＨ鎖である。−表ＩＩは、ヒ）Ｌ鎖／ブタＨ鎖第Ｖｌ１１因子が天然のブタ第Ｖｌ１１因子（表Ｉ）に匹敵する活性を有することを示し、ブタＨ鎖中の構成要素がヒト第Ｖｌｌｌ因子と比較してブタ第Ｖｌｌｌ因子の増加した凝固活性対応していることを示す。

表■■ニ　ヒト／ブタハイブリッド第Ｖ［Ｉ＋因子比活性のヒトおよびブタ第Ｙ［Ｉ！因子との比較活性（Ｕ／Ａ２８０）ブタＬ鎖／ブタＨ鎖　３０．６００ヒトＬ鎖／ブタＨ鎖　４４．１００ブタＬ鎖／ヒトＨ鎖　１．１００ヒ　ト　Ｌ　鎖／　ヒ　ト　Ｈ鎖　１，０００実施例５：ブタ第Ｖｌｌ！因子のＡ２ドメインの単離および配列決定ブタ第Ｖｌｌｌ因子のＢドメインおよびＡ２ドメインの一部分だけが以前に配列決定されている（Ｔｏｏｌｅ、　Ｊ、　Ｊ、、ら、８３　Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔ’１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌＪ、ｓ、Ａ、　５９３９−５９４２　（１９８６））。ブタ第Ｖ１１１因子ＢドメインのゲノムＤＮＡ、およびブタ第Ｖｌｌｌ因子Ａ２ドメイン全体のｃＤＮＡ配列を本明細書に開示する。

ブタ第Ｖｌ１１因子Ａ２ドメインを、ブタ牌臓の全ＲＮＡの逆転写およびＰＣＲ増幅によりクローニングした；既知のヒト第Ｖｌｌ＋囚子ｃＤＮＡ配列に基づく縮重プライマー、およびフリ第Ｖｌ１１因子配列の一部分に基づく正確なブタプライマーを用いた。ｌｋｂのＰＣＲ生成物を単離し、そしてＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ”（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ファージミド（ｐｈａｇｅｎｉｄ）ベクターに挿入することにより増幅した。

ブタＡ２ドメインを、ジデオキシ配列決定法により完全に配列決定した。配列は上述した通りである。

実施例　６：組換えヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子の：Ａ製ヒト第Ｖｌｌ＋因子配列は文献に記載されている（Ｔｏｏｌｅ、　Ｊ、　Ｊ、。

ら、３１２　Ｎａｔｕｒｅ　３４２−３４７　（１９８４）　（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）；　Ｇｉｔｓｃｈｉｅｒ、Ｊ、、ら、３１２　Ｎａｔｕｒｅ　３２６−３３（１（１９８４）　（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）：Ｗｏｏｄ、Ｗ、１．、ら、３１２　Ｎａｔｕｒｅ　３３０−３３７　（１９８４）　（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；　Ｖｅｈａｒ、Ｇ、Ａ、、ら、３１２　Ｎａｔｕｒｅ　３３７−３４２　（１９８４）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））。配列は上述した通りである。

組換えヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子の作成には、ヒト第Ｖｌｌ＋囚子ｃＤＮＡ領域（Ｂｉｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐ、）を除去し、そして相同のブタｃＤＮＡ配列を挿入することが必要である。引き続いて、このハイブリッドｃＤＮＡを適切な発現システムで発現する。これらの実験では、例えば、ヒト第Ｖｌｌ＋因子のＡ２ドメインに対応する全長ｃＤＮＡ配列を、当業者一般に公知の方法であるオリゴヌクレオチド介在突然変異により取り除いた（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　およびＴ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、第１５章、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８９を参照）０この工程は以下の通りである：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＣＪ２３６細胞を、ヒト第Ｖｌｌ＋囚子ｃＤＮＡ挿入物を含むＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭ７　ｙ−ジで形質転換した。−水路のＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭ／ヒト第Ｖｌｌ＋因子環状ＤＮＡを、Ｍｌ　３ＫＯ７ヘルバーフアージを用いて生成し、続いて標準的な方法により精製した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、およびＴ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ、証１　ｅｃ　ｕ　ｌ肛ユ誦田しユニ山ユ旦ユ↓つ且、第４章、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　１９８９）。

突然変異性オリゴヌクレオチドを、Ａ１ドメインの３°末端、およびＡ３ドメインの５°末端に対応して合成した：５’　ＣＣＴＴＣＣＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＡＧＡＴＣＡＡＣＡＧＧＡＡＡＴＴＧＡＣ３′付加的に、このオリゴヌクレオチドは、ブタＡ２ドメインを挿入するのに用いられ得る５ｎａＢ１制限部位を提供する。−水路Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ”／ヒト第ｖ１１１因子にこのオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーションすると、Ａ１とＡ３ドメインとの間の領域、すなわち、Ａ２ドメインが「ルーブアウ）　（ｌｏｏｐｅｄ　ｏｕｔ）する」。得られたヘテロ二本鎖を、Ｔ７ポリメラーゼを用いて環状の２本鎖ＤＮＡに伸ばし、連結（ｌｉｇａｔｅル、そしてＥ。

ｃｏｌｉ　ＸＬＩ−ｂｌｕｅ”（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）細胞を形質転換するのに用いた。

数種のコロニーからファージミドＤＮＡを単離し、Ｘｈｏｌで切断し、そしてファージミドＤＮＡの大きさをアガロースゲル電気永動により調べることにより形質転換体を、スクリーニングした。

ｌｋｂのＡ２ドメインの欠失に対して予想されたように、ヒト第Ｖｌｌ＋因子／　ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭ２すｌｋｂ短い３つのクローンを同定した。この結果は、Ａ１およびＡ３ドメインの境界を横切って配列決定することにより確認した。

ブタＡ２ドメインを、以下の方法によりヒト第Ｖｌｌ＋囚子ｃＤＮＡのＡ１とＡ３との間に挿入した。＜１）ブタＡ２ドメインのＰＣＲ増ｍ　；　（２）ＰＣＲ生成物のゲル精製（エチジウムブロマイド染色により可視化されたバンドを生成するＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気永動、次いでバンドを切り出しＤＮＡを精製してアガロースおよび他の夾雑物を除去）；および（３）Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いるブタＡ　２　ｃＤＮＡの、５ｎａＢ１制限部位を用いることにより直鎖状にしたヒトＡ２ドメイン欠失ｃＤＮＡへの結合。ブタＡ２をＰＣＲ増幅するために使用したプライマーは、以下のものであった：５°プライマー：　５′ｃＴｘｃｃｃｒｒｃｃｃＡＡｃｙｃｃｉｃｃｃｒｍａＡｃｃ　３　ｒ３　プライマーは、ブタ第Ｖｌ１１因子タンパク質記列の７３６〜７４０残基（Ａ２ドメインのＣ末端で）、およびヒト第Ｖｌｌ＋因子配列の１６４９〜１６５６残基（Ａ３ドメインのＮ末端でンに対応するヌクレオチドを含有する。ループアウト手順はＡ３配列残基を除外したのでＡ３配列残基が含まれていた。結合生成物をＸ［，１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換するのに用い、ＰＣＨにより分析されたとき所望のブタＡ２挿入物を含有する数個のコロニーを生成した。

ブタＡ２ドメインのＰＣＲ増幅した結果、生成物は、Ａ　１−Ａ　２結合部で不要のチミンを含んでいた。突然変異性オリゴヌクレオチド（トス）づ弐ｂう５’　ＣＣＴＴＴＡＴＣＣＡＡＡＴＡＣＧＴＡＧＣＧＴＴＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧ　３’を用いることにより、この単一塩基をループアウトし、そして生成物を、ヒ）Ａ２欠失ｃＤＮＡの生成について上述したように（実施例６の第３節に）、正確にクローニングし得る。

ブタＡ１、Ａ３、Ｃ１およびｃ２ドメインのクローニングは、ブタＡ２ドメインのクローニングに用いたのと同じ戦略で実行可能である。これらドメインのフラグメントラ、ループアウト突然変異技術よりクローニングし得る。ヒト第Ｖｌｌ＋因子およびその任意のフラグメントにおける、対応するドメインの切り出しは、単一アミノ酸の除去を含み、上述したようにループアウト突然変異により実行可能である。このアプローチにより、全ての可能なドメインの交換、ドメインのフラグメントの交換、または単一アミノ酸残基の交換が可能である。

組換えヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌｌ因子の生物学的活性を、最初、ｃｏｓ −細胞は乳類一時（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）発現系を用いることにより、評価し得る。ヒト／ブタハイブリッドｃＤＮＡを、ｃ。

Ｓ細胞にトランスフェクトし得、モして上清を、実施例１で記載されたｌ工程、および２工程凝固アツセイを用いることにより、第Ｖｌｌ＋因子活性について分析し得る。さらに、第Ｖｌｌ！因子活性を、さらに高感度で多量の試料を分析し得る色素原基質アッセイを用いることにより測定し得る。このアッセイは公知である（Ｌｏｌｌａｒ、　Ｐ、、　Ｇ、　Ｊ、　Ｋｎｕｔｓｏｎ、およびり、　Ｎ、　Ｆａｓｓ、　２４　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　８０５６−８０６４．１９８５）。第Ｖ［ＩＩ因子活性アソセイにおいては、同様のアッセイが標準的である（Ｗｏｏｄ、　Ｗ。

１１．ら、３１２　Ｎａｔｕｒｅ　３３０−３３７．　１９８４；　Ｔｏｏｌｅ、Ｊ、Ｊ、、ら、３１２Ｎａｔｕｒｅ　３４２−３４７．１９８４）。ＣＯＳ細胞中での組換え第Ｖｌｌ＋因子を発現は標準的な手法である（Ｔｏｏｌｅ、　Ｊ、　Ｊ、、ら、３１２　Ｎａｔｕｒｅ　３４２−３４７．１９Ｂ４；　Ｐｉｔｔｎ＋ａｎ、　Ｄ、　Ｄ、、およびＲ，Ｊ、　Ｋａｕｆｍａｎ、　８５　Ｐｒｏｅ、Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　２４２９−２４３３．１９８８）ｏ本明細書に記載された組換え分子の出発物質として使用されるヒト第ＶＩ１１囚子ｃＤＮＡをＣＯ３細胞中で発現させて、生物学的活性を有する生成物を産生じた。この物質を、ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子分子と比較する標準物として用い得る。ハイブリッド分子を適切に比較するために、アッセイにおける活性を比活性に変換した。このために、細胞により産生された第Ｖｌｌ＋因子量の測定が必要であり、そして標準物として精製されたヒトおよび／またはブタ第Ｖｌ１１因子との免疫アッセイによって測定され得る（例えば、Ｌｏｌｌａｒ、　Ｐ、、ら、７１　Ｂｌｏｏｄ　１３７−１４３゜１９８８を参照）。

ヒトおよびブタ第Ｖｌｌ＋因子の配列は、エピトープ（すなわち、阻害抗体に対する認識部位として）に含まれているようでありＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＩＢＩ　Ｃｏｒｐ、、　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、　ＣＴ）などの市販のを購入した予測コンピュータプログラムを用いて決定し得る。ブタ第Ｖｌ１１因子の配列は、対応する（相同な）抗原性ヒト配列に比べて抗原ではなく、そして置換体が作成され、標準的な組換えＤＮＡ方法に従って、ブタ配列を挿入およびヒト配列を欠失する。

ブタ第Ｖｌｌ＋因子が、ヒト第Ｖｌｌ＋因子はど特定の阻害抗体と反応しないことはすでに公知である；このことは、阻害剤を有する患者に対する本発明の治療の基礎を提供する。組換えハイブリッドの作成後、それらをＢｅｔｈｅｓｄａ阻害剤アッセイを用いて反応性をインビトロで試験する。天然のヒト第Ｖｌｌ＋因子および天然のブタ第Ｖｌｌ＋因子より反応性が低いこれらの構築物は、代替の治療法の候補となる。

（以下余白）（１１）発明の名称：ヒト／ブタハイブリッド第Ｖｌｌ＋因子（ｉｉｉ）配列数二６（２）配列番号２の情報：（１１）配列の種類：タンパク質（ｉｉｉ）ハイボセティカル配列：Ｎ０（１ｖ）アンチセンス＝ＮＯ（Ｖ）フラグメント型：Ｎ末端フラグメント（ｘｌ）配列、配列番号、２：Ｔｙｒ　ＧＬｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＡｌａＡｓｎ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ａｒｑ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＡｓｎＭｅｔ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　ｒｌｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｖａ１（２）配列番号：３の情報・（１１）配列の種類：　ｃＤＮＡ（ｉ百）ハイボセティカル配ＩＱ　：　Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ（Ｖｌフラグメ７ト型：Ｎ末端フラグメノト０００　ロ　ロ　ロ　ロ　０　ロ　ロ　０１　へ　の　マ　ロ　Ｃヘ　ロ　マ　ロ　１−　−　へ　−−マ　！　い　リ　１Ｏロ　０　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ｏ　Ｏｏ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　ロ　０− 　へ　の　？　０　１　へ　ａ５　で　ロ　ψ　〜　口　！　ｏ　Ｑ　へ　の　リｃＤ　＋ＱｍＯｍ　−へ　へ　−寸　寸　い　い　−さ　さ　φ　ω　■−− −ヘ　ヘ　Ｎ　Ｎ　へ　へ　へ　へ　へ　へ　〜　へ　へ　へ　ヘ　ヘ（ｘｌ）配列：配列番号：４・＋１ｉｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｒ■ Ｔｙｒ　ｒｌｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ３８５　］９０　３９５　４００Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　八ｓｎ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＩＩｓ　Ｇ１ｎ５Ｂ０　５Ｂ５　５９０Ｉｒｉｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ＾Ｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ＰｈｅＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＧＩＹ　Ｐｒｏ　ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　＋＋ｔv Ｇ１．ｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎνａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｈａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＧｌｙ　Ｇｉｎ　にｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＬｙｓＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｃ１１ｙ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｐｈ■ Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｍｅセ　ＬｙＳ　Ａｇｎ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｂｒ１２２０　１２２５　１２：１０Ａｒｑ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　八ｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ１２］５　１２４０　１２４５Ｇｌｙ　Ａｇｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｋｒｑ八ｒ９　八ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｈａ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　にｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　ｃｌｕ１３１５　１コ２０　１３２５Ｌｙｓ　Ａｒｑ　Ｉｌｅ　Ｘｌｅ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ１３３０　１１コ５　１３４０Ｌｙｓ　ｌ１ｉｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙ■ １３４５　１：１５０　１：］５５　１３６０Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｒｑ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＧｌｎ　Ｐｈｅ　ｔ、ｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｔ　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ｔｈ■ １７１０　１７］５　１７４０１１ａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　ＧＬｎ１９２５　１９］０　１９］５Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　にｌｙ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅ虹Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　ＧｌｙＴｙｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｉｌｅ　Ｈｌｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｇｉｎ工ｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ペプチド（ｉｉｉ）ハイポセティカル配列−ＮＯ（１ｖ）アンチセノス；Ｎ０（ｖ）フラグメント型：Ｎ末端（ｘｉ）配列：配列番号＝６＝Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　）ｌｉｓ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ＾ｒｑ　Ａｇｎ＾ｒｑ　Ｇｌｙｌ　５　１０　１５Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　ＡＳｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈａ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ｌ１ｉｓ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓ■ ＾ｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｌ、ｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｌ■ １１ｅ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌａｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ八ｌａ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＣｈｉｎ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌ■ 阿ｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　ＩＩｅＳｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ＡｌａＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＡｌａＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　ＡｒｇＶａｌ　Ｈｉｓ　Ａｒｑ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ八ｌａ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ　ＧｌｙＰｒｏ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｇｌｕフロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１４／７５５　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１５１０９７７２９−４ＢＩＣ１２Ｎ　５１００　Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ブタおよびヒトのアミノ酸配列を含有する、精製された血液凝固促進ハイブリッド第ＶＩＩＩ因子の分子。
２．請求項１に記載の分子であって、前記タンパク質が、本質的にヒトＬ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットおよびブタＨ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットからなるタンパク質、および、本質的にブタＬ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットおよびヒトＨ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットからなるタンパク質、からなる群から選択される、分子。
３．請求項１に記載の分子であって、前記タンパク質が、１またはそれより多いブタＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１、またはＣ２ドメインで、相同のヒト第ＶＩＩＩ因子ドメインが置換された、本質的にヒト第ＶＩＩＩ因子からなるタンパク質、および、１またはそれより多いヒトＡ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１、またはＣ２ドメインで、相同のブタ第ＶＩＩＩ因子ドメインが置換された、本質的にブタ第ＶＩＩＩ因子からなるタンパク質、からなる群から選択される、分子。
４．前記タンパク質が、ヒト第ＶＩＩＩ因子に特有の１またはそれより多いアミノ酸で、対応するブタアミノ酸が置換された、本質的に複数のブタ第ＶＩＩＩ因子からなる、請求項１に記載の分子。
５．前記タンパク質が、ブタ第ＶＩＩＩ因子に特有の１またはそれより多いアミノ酸で、対応するヒトアミノ酸が置換された、本質的に複数のヒト第ＶＩＩＩ因子からなる、請求項１に記載の分子。
６．前記タンパク質が、１工程の血液凝固アッセイにおいて標準としてヒト血漿が用いられる時に、水溶液中で２０．０００Ｕ／Ａ２８０より多い比活性を有する、請求項１に記載の分子。
７．前記ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子が、第ＶＩＩＩ因子が欠失したヒト患者の治療に有効である、請求項１に記載の分子。
８．前記ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子が、患者の輸液に好適な薬学的キャリアと結合している、請求項７に記載の分子。
９．前記キャリアが、安定化剤および送達賦形剤からなる群から選択される、請求項８に記載の分子。
１０．前記安定化剤が、タンパク質および多糖類からなる群から選択される、請求項９に記載の分子。
１１．さらにフォンビルプラント因子、ビタミンＫ依存性凝固因子、および組織凝固因子からなる群から選択される凝固因子を含有する、請求項８に記載の分子。
１２．前記送達賦形剤がリボソームである、請求項９に記載の分子。
１３．第ＶＩＩＩ因子が欠失した患者の治療方法であって、ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子の分子を患者に投与する工程を包含する、方法：ここで、該ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子の分子の凝固活性は、ヒト第ＶＩＩＩ因子の抗体により阻害されない。
１４．前記患者がヒト第ＶＩＩＩ因子の抗体の存在により特徴付けられる、請求項１３に記載の方法。
１５．精製されたヒト／ブタハイブリッド凝固第ＶＩＩＩ因子を調製する方法であって、ブタ第ＶＩＩＩ因子由来の一次アミノ酸配列とヒト第ＶＩＩＩ因子由来の一次アミノ酸配列とを結合させ、血液凝固性ハイブリッド第ＶＩＩＩ因子の分子を形成する工程を包含する、方法。
１６．請求項１５に記載の方法であって、前記ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子の分子が、ヒト第ＶＩＩＩ因子およびブタ第ＶＩＩＩ因子のＨ鎖サブユニットおよびＬ鎖サブユニットを単離し精製し、そして、該ヒトおよびプタサブユニットを混合してヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子を形成することによって、形成される、方法。
１７．前記ヒトおよびプタ第ＶＩＩＩ因子サブユニットをヒトおよびブタ血漿から単離する、請求項１６に記載の方法。
１８．前記ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子が、ヒト第ＶＩＩＩ因子およびブタ第ＶＩＩＩ因子のＨ鎖サブユニットおよびＬ鎖サブユニットのドメインをコードする組換えＤＮＡの発現により形成される、請求項１５に記載の方法であって、さらに、ヒトおよびプタ第ＶＩＩＩ因子のドメインを置換する工程を包含する、方法。
１９．前記ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子の分子が、ヒトＬ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットとブタＨ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットとを混合することにより形成される、請求項１６に記載の方法。
２０．前記ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子の分子が、ブタＬ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットとヒトＨ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットとを混合することにより形成される、請求項１６に記載の方法。
２１．前記ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子の分子が、ヒト第ＶＩＩＩ因子の特定のアミノ酸残基と相同のブタ第ＶＩＩＩ因子の特定のアミノ酸残基とのコードする核酸の部位特異的変異による置換により調製される、請求項１５に記載の方法。
２２．血液凝固性ヒト／ブタハイブリッド第ＶＩＩＩ因子の分子をコードする、単離された核酸配列であって、ヒトアミノ酸配列およびブタアミノ酸配列を含有する、核酸配列。
２３．前記タンパク質が、本質的に、ヒトＬ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットおよびブタＨ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットからなる、請求項２２に記載の核酸配列。
２４．前記タンパク質が、本質的に、ブタＬ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットおよびヒトＨ鎖第ＶＩＩＩ因子サブユニットからなる、請求項２２に記載の核酸配列。
２５．前記タンパク質が、１工程の血液凝固アッセイにおいて標準としてヒト血漿が用いられる時に、２０．０００Ｕ／Ａ２８０より多い比活性を有する、請求項２２に記載の核酸配列。
２６．第ＶＩＩＩ因子が欠失したヒト患者の治療に有効なタンパク質をコードする、請求項２２に記載の核酸配列。
２７．前記タンパク質が、Ａ１、Ａ２、Ｂ、Ａ３、Ｃ１、またはＣ２を含み、相同のヒト第ＶＩＩＩ因子ドメインで置換された複数のブタ第ＶＩＩＩ因子ドメインからなる、請求項２６に記載の核酸配列。
２８．前記タンパク質が、第ＶＩＩＩ因子阻害抗体との反応性が低い、請求項２６に記載の核酸配列。
２９．ブタ第ＶＩＩＩ因子Ａ２ドメインをコードする、単離された核酸配列。