JPH07509059A - 色素複合体化された酵素接合体を用いてのイムノアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 色素複合体化された酵素接合体を用いてのイムノアッセイ発明の背景 １、発明の分野 本発明は一般的に組成物及びそれらの調製方法並びに生物学的アッセイシステム への使用に関する。より特定には、本発明は、特定の結合物質、酵素及びそれに 複合体化される色素分子を含んで成る標的−特異的ラベリング複合体に関する。

生物学的アッセイ方法において“ラベノじとしての色原体及び螢光色素の使用は 知られている。典型的なアッセイ方法は生物学的サンプルにおける分析物又は分 析物類似体への色素ラベルの直接的又は間接的結合を必要とし、ここでアッセイ の特定の段階での色素の存在又は不在が可視的に決定され、そしてサンプルにお いて初期に存在する分析物の量に関連している。広範囲の種類の特定アッセイ方 法が存在する。

本発明に特に興味あることは、アッセイがラベルとして天然において着色された 又は染色された粒子を利用することであり、ここで前記粒子は抗体又は他の特定 の結合物質に結合される。示唆された粒子は、着色されたラテックスビーズ、着 色されたリポソーム、赤血球、金属ゾル及び同様のものを包含する。そのような 複合体における着色された粒子は可視マーカーとして作用し、ここで粒子の分離 、捕獲又は凝集が抗体又は他の特定の結合物質の結合を通して介入される。特定 のアッセイ段階において分離されたラベルの量がサンプルに初期に存在する分析 物の量に関連する。

そのような抗体−粒子組成物を調製するための種々の方法が提案されて来た。そ のような方法は一般的に、典型的にはラテックスビーズ、リポソーム又は同様の ものを着色することによって着色された粒子を生成し、そして続いて、着色され た粒子を抗体に、典型的には受動的吸着又は共有結合により結合することに依存 する。

一般的に有用ではあるが、そのような抗体−粒子組成物を調製するための方法は 比較的複雑であり、通常粒子の調製、粒子の着色、粒子の抗体への結合及びイム ノアッセイへの使用のためへの粒子のブロッキングを包含する複数段階の操作を 要する。さらに、抗体結合能力の損失はしばしば、粒子結合に起因する。時々、 それらの粒子は特定の用途のために選択された抗体と適合できない。

いづれかの抗体の用途のためへの使用を可能にする改良されたラベリング組成物 及びそれらの調製方法を提供することが所望される。

その組成物は、低背て比較的容易に調製されるべきであり、そして均一の特徴を 有すべきである。特に、組成物は抗体活性を有意な程度、保持すべきである。し かしながら、本発明の方法及び組成物は個々の又はいづれかのそれらの観点にお いて従来技術よりも卓越する必要はないが、しかしむしろ、それらは、本発明が ある従来技術の方法及び生成物に対して提供できる一般的な利点であることが好 ましい。

２、背景技術の記載 アメリカ特許第４．８６３．８７５号は、色素上のイソシアネート基を通して抗 体に共有結合される少なくとも１０種の色素分子又はモノマーを含んで成る組成 物を記載する。アメリカ特許第４．４５２．８８６号は、タンパク質、たとえば 抗体及び抗原に光吸収又は放出ポリマーの共有結合を記載する。アメリカ特許第 ４．３７３．９３２号は、疎水性色素又は色材の水性分散液又はそのような色素 又は顔料により被覆されたポリマー咳によるリガンドのラベリングと記載する。

アメリカ特許第４．７０３．０１７号は、固体支持体上でのりガント−ラベル接 合体の特異的結合に依存する固相アッセイ装置を記載し、ここで前記ラベルは、 粒状物、たとえばサック、赤血球、赤血球ゴースト、リポソーム又はポリマーマ イクロカプセルとして開示されている。アメリカ特許第４．９４３．５２２号は 、ラベルとして赤血球を用いての固相側方流アッセイを記載する。アメリカ特許 第４．８６１．７１１号は吸着パッドに別々に保持される、酵素抗体接合体及び 支持体を用いての固相側方流アッセイを記載する。また、Ｕ、　Ｋ、特許第２． ２０４．３９８号；ＥＰ特許第３０６、７２２号；及びＥＰ特許第２７６、１５ ２号も参照のこと。標的成分に結合される酵素と支持体との反応により着色され た色素を生成する酵素アッセイ及び免疫組織化学染色技法か知られている。

発明の要約 本発明は生物学的アッセイ、たとえばこの後に記載される側方流アッセイに使用 するための改良された標的−特異的ラベリング複合体を提供す。その標的−特異 的複合体は特異的結合物質成分、たとえは抗体又は抗原に結合される酵素成分、 及び複合体に可視的に識別できる色彩を付与するのに十分な量で酵素及び／又は 特異的結合物質に複合体化された色素分子を含んで成る。前記複合体は、酵素成 分への色素の共有又は非共有結合のいづれか又は両者に起因する。

複合体化された色素分子は特異的結合物質上の活性部位を有意にブロックせず、 従って、生物学的アッセイにおいて分析物又は他の標的分子に結合するために利 用できるように存続する。通常、酵素は、生来の酵素活性か本発明のラベリング 複合体として使用する前に、除去されるように不活性化されるであろう。好都合 には、複合体化された色素分子は凍結乾燥され、そしてこの後に記載されるよう に、水性反ＬＬテ媒体に導入される場合でさえ、そこなわれないまま存続する。

複合体化された色素分子又は成分の数は、複合体当たり１０個はどから複合体当 たり１０’個はどであり、そしてそれが使用される生物学的アッセイにおいて粒 子を可視化するために十分な色素が存在する主な必要条件が存在する。通常、個 々の複合体は１０”〜１０’個の色素分子又は成分を含んで成り、そして個々の 成分の個々の分子量は１００〜１０００ドルトンである（但し、その分子量は１ ０”ドルトンはとの高さでもあり得る）。複合体の凝集体サイズは通常、１０” 〜１０１１ドルトン、より通常には１０＠〜１０１０ドルトンであろう。

本発明の方法によれば、標的−特異的ラベリング複合体は、酵素及び特異的結合 物質成分と酵素基質とを反応せしめることによって水性媒体において形成され、 ここで前記酵素が基質を色素に転化する。水性媒体中でそのようにして形成され た色素は接合体に複合体化し、そして酵素反応は、ラベリング複合体の色彩がこ の後に記載されるようなアッセイで使用される場合に容易に観察できるように十 分に濃い時点て停止される。便利には、前記反応は、基質の消耗により及び／又 は反応条件を変えることにより停止され得る。その方法はさらに、酵素を不活性 化し、そして／又は所望する色彩強度が付与された後、複合体を凍結乾燥するこ とを含んで成る。

本発明のもう１つの観点においては、試験製品は、支持マトリックス、通常、好 ましくはマトリックスにおいて単一の方向に液体の流れを誘導できる非吸収性の 強い又は吸収性の強い固体マトリックスにおいて、凍結乾燥により含浸される標 的−特異的ラベリング複合体を含んで成る。この方法においては、液体サンプル が固体マトリックスに適用され、そして含浸されたラベリング複合体が“下流” 位置への液体流れにより輸送され得るようにマトリックスを通して流れる。好都 合には、本発明のラベリング複合体は、下記のように流体流により輸送される場 合、損なわないまま存続することが見出された。

典型的には、アッセイは、特異的結合物質により介入されるラベリング複合体の 捕獲に基づく試験製品を用いて実施され得る。通常、試験製品の領域は、ラベリ ング複合体を直接的又は間接的に結合できる固定された捕獲試薬を組込むであろ う。次に、アッセイ結果は、この捕獲域内でのラベルの出現に依存するであろう 。

他方、ラベリング複合体は、分析物に対して特異的な抗体又は他の結合物質によ り、“捕獲域“内で捕獲試薬に最初に結合され得る。

次に、支持体マトリックスにサンプルを適用することによって、捕競争結合の結 果としてラベリング複合体を移動せしめるであろう。

従って、捕獲域に初めに存在する色彩が、サンプルに存在する分析物の量に比例 して消えるであろう。

本発明のさらにもう１つの観点においては、液体サンプルにおける分析物の存在 を検出するためのアッセイ装置は、サンプル受領域、場合によってはラベリング 域、捕獲域及び吸着域を含んで成る。サンプルは前記受領域に適用され、そして 装置に流れ、ここでそれはラベリング域内でラベリング複合体と組合い、又は前 記捕獲域からラベリング複合体を移動せしめる。第１の場合、ラベリング複合体 はサンプルにおける分析物に結合するか又はそれと競争し、そしてラベルはサン プルに最初から存在する分析物の量に依存して捕獲域内で結合される。第２の場 合、ラベリング域は必要ではなく、そしてサンプル中の分析物は吸着域中にラベ リング複合体を移動せしめる。両者の場合、吸着域は、液体サンプルが装置内の 前の域を通して流れるにつれてその液体サンプルを受けるように作用する。

図面の説明 第１図は、本発明の原理を組込むアッセイ装置を例示し、その特定の例は次の実 験セクションに詳細に記載される。

特定態様の説明 本発明は、組成物、そのような組成物の調製方法、試験製品及び生物学的アッセ イ、特にイムノアッセイの実施への使用のための試験装置を提供する。前記組成 物は、視覚的に区別できる、典型的には着色されており、そしてこの後に詳細に 記載されるように、捕獲域に凝集され、又は蓄積される場合、容易に見える色彩 シグナルを提供できる標的−特異的ラベリング複合体を含んで成る。さらに組成 物は、捕獲域内でそのような捕獲を仲介する特異的結合物質を含んで成り、そし て組成物は広範囲の種類の特定のアッセイ型及び手段に利用できる。組成物は特 に側方流アッセイ手段への使用のために価値あると同時に、それらは同様に広範 囲の種類の他のアッセイ型へも使用されるであろう。

本発明の組成物は酵素成分及び特異的結合物質成分を含む接合体から成り、ここ て前記酵素成分は接合体が水性媒体において生成されるにつれて、その接合体に 複合体化するてあろう色素物質への適切な基質の転換を付与するように選択され る。適切な色素は複合体のために高い結合活性を有すべきてあり、そして共有結 合する色素か好ましい。共有結合しない色素は、特に複合体のタンパク質成分に 対しての強い結合をもたらす疎水性、イオン性及び他の非−共有機構を通して複 合体と相互作用すべきである。特定の色素を生成するためへの特定の酵素及び基 質システムの選択は、特定の用途、所望する色彩及び同様のものに依存するであ ろう。

代表的な酵素−基質システムは下記表へに示される。

表Ａ 特異的結合物質は、特に他の化合物への結合を可能にする空間及び／又は極性特 徴を有する化合物であろう。本発明に有用な特異的結合物質は、特定の組成物、 たとえば分析物、抗−分析物物質及び結合か生物学的アッセイ方法の一部として 部会長〈実施され得る他の標的物質に特異的に結合するように選択され又は調製 されるであろう。天然の特異的結合対は、抗原及び抗体、レクチン及び炭水化物 、ホルモン及びホルモンレセプター、酵素及び酵素基質、ビオチン及びアヒジン 、ビタミン及びビタミン結合タンパク質、相補的ポリヌクレオチド配列、薬物及 びレセプター、酵素及びインヒビター、アポタンパク質及び補因子、増殖因子及 びレセプター、及び同様のものを包含する。ビオチン及びアビジン誘導体、たと えばビオチン類似体／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン及びビオチン類 似体／ストレプトアビジンがまた使用され得る。天然の特異的結合物質が存在し ない場合、それは調製され得る。抗原性及びパブテン標的物質に関しては、抗体 は良く知られた技法により調製され得る。

ポリヌクレオチドに関しては、相補的ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントがまた、良 く知られた合成技法により調製され得る。

好ましい特異的結合物質は抗体、抗原及びハプテンであり、そして残る論議は主 にそれらの物質に向けられるであろう。しかしながら、予備方法は上記のように して他の特異的結合物質を用いて組成物を供給するために容易に適合され得る。

さらに、本発明の試験製品及び試験装置は抗体及び抗原以外の特異的結合物質を 有する標的−特異的複合体を用いるように容易に改良され得、そして本発明のア ッセイ方法もまた改良され得る。

酵素はオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ジアホラーゼ、ガラ クトシダーゼ、溶解酵素又はオキシドレダクターセであり、そして代表的な酵素 は上記表へに示される。酵素は通常、特異的結合物質に共有結合されるが、しか し間接的結合、たとえばピオチン−アビジン結合を通して結合され、又は特異的 結合対の他の同種メンバーも使用され得る。特異的結合物質がポリペプチド又は タンパク質、たとえば抗体である場合、酵素は、種々の成分、たとえばジスルフ ィド、ヒドロキシフェニル、アミノ、カルボキシル、インドール、又は他の官能 基を通して、科学及び特許文献に記載されるような従来の接合化学を用いて共有 結合され得る。結合は、特異的結合物質上の活性部位がブロックされず、そして 所望する標的物質への結合のために利用できるような手段でもたらされるへきで ある。抗体の場合、結合は、好ましくは、相補性を決定する領域が所望する物質 への結合のために利用できるようにもたらされるであろう。酵素への結合のため に抗体を誘導体化するための特定の技法は、　Ｔｉｊｓｓｅｎ、　”Ｐｒａｃｔ ｉｃｅ　ａｎｄ　Ｔｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ”。

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、１５．　Ｂｕｒｄｏｎ　ａｎｄ　ｖａｎ　Ｋｎｉｐｐｏｎｂｅｒｇ、ｅ ｄｓ、ｌ９８５．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ。

Ａｍｓ　ｔｅｒｄａｍに記載されており、これは引用により本明細書に組込まれ る。

特異的結合物質−酵素接合体か形成された後すぐに、それらは適切な酵素基質（ 表Ａを参照のこと）と、水性媒体において、着色された色素生成物に基質を転換 するのに十分な条件下で反応せしめられるであろう。前記反応条件はさらに、酵 素転換により生成される色素分子か接合体と複合体を形成し、そして十分な色素 か視覚的に区別できる色彩を付与するように複合体中に組込まれるように選択さ れる。

複合体化をもたらすのに必要な反応条件は、特定の用途のために選択される酵素 及び基質の性質に依存する。個々の酵素は色素生成物の最適なターンオーバー及 び生成のために特有である反応条件を有する。理想的な候補体酵素、色素原基質 及び反応条件（たとえば、ｐｉ、イオン強度、温度、補因子及び同様のもの）は 、“Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ａｎｄＴｈｅｏｒｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎ ｏａｓｓａｙｓ、”前記のチャプター１７に記載される、酵素−抗体分送組織化 学的染色のために使用されるものである。

酵素転換及び複合体化反応は、十分な色素が生成され、そして接合体に複合体化 され、その結果、得られる複合体が、この後に記載されるように、捕獲域内で凝 集し又は結合される場合、視覚的に検出てきる十分に濃い色彩を有するまで実施 されるであろう。反応及び複合体化は種々のアプローチにより停止され得る。便 利には、反応される基質の量は、その基質が、複合体色彩濃度が十分である場合 、消耗されるように限定され得る。他方、基質の色素生成物への酵素転換は、色 素生成を停止するように選択された時点で反応条件を変え又は酵素インヒビター を添加することによって停止され得る。

第２の選択として、反応を停止し、モして／又は可溶性色素を除去するために、 たとえばゲル透過クロマトグラフィーを用いることによって、反応媒体において 基質から粒子を単純に除去し又は分離することが可能である。

通常、但し、必要ではないが、酵素活性は、複合体化が完結した後、酵素インヒ ビターへの暴露、変性条件（この選択された条件は特異的結合物質を変性せず又 は不活性化すべきではない）への暴露、酵素補因子の消耗又は同様の手段のいづ れかにより阻害されるであろう。本発明の標的特異的ラベリング複合体の能力は 、基質をターンオーバーする酵素の能力に由来するのではなく、複合体化された 色素分子により付与される色彩に由来する。

未反応基質は好ましくは、反応か停止された後、典型的にはクロマトグラフィー 分離技法、たとえばゲル透過によりラベリング複合体から除去されるであろう。

酵素が不活性化される場合、実質的にすへての基質が続くアッセイ工程における 追加の色素生成を紡ぐために分離されることが不可欠である。しかしなから、通 常、酵素は、意図しない色素生成の可能性をさらに回避するために不活性化され るであろう。

好ましい技法においては、本発明の標的特異的ラベリング複合体は固相マトリッ クスに適用され、より好ましくは、マトリックス内で凍結乾燥される。固相マト リックスは吸収性が強く又は非吸収性であり（継続出願に０７／６３９．９６７ に記載される）、そして一般的には、それを通して流体の流れを導びくことがで き、その結果、液体は含浸されたラベリング複合体と相互作用することができる 。

そのようなマトリックスは、一般的に多孔性膜、吸収性パッド、及び同様のもの の調製のためにイムノアッセイ業界において使用されるタイプの種々の材料から 成る。特に好ましいものは、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、レー ヨン、ガラス繊維、セルロース及びそれらのブレンドから構成される織物である 。特定の態様においては、一般的に継続出願Ｎ１１０７／６３９．９６７に記載 されるように、織物を非吸収性にするためにブロッキング剤によりそのような織 物を処理することか所望されるであろう。

固相マトリックスにおけるもう１つの含浸としては、本発明のラヘリ）グ複合体 粒子は粉末形に乾燥され、そして凍結乾燥され得る。

次に、そのような凍結乾燥されたラベリング複合体は一般的に当業界において知 られているような了ツセイ手段への使用に利用できる。

第１図に関しては、本発明の原理に従って構成された典型的な試験装置ｌＯか記 載されるであろう。試験装置ＩＯは、継続出願Ｎα０７／６３９、９６７に記載 されるように非吸収性サンプル及び試薬流領域を用いろてあろう。しかしながら 、強い吸収性のサンプル及び試薬流領域、又は非吸収性及び強い吸収性の領域の 組合せを用いる他の試験装置は、本発明の標的特異的ラベリング複合体による使 用のために構成され得ることか適切であろう。

試験装置ｌＯは、サンプル受領域１２、ラベル域１４、捕獲域１６及び吸着域１ ８を包含する。サンプル受領域に、ラベル域１４及び捕獲域１６は、液体サンプ ル及び他の液体試薬を受けることができ、そして横方向に、すなわち受領域１２ から吸着域１８の方にそのようなサンプル及び池の液体試薬を輸送できる材料か ら成るであろう。吸着域１８は同じ液体サンプル及び試薬を受領でき、そして吸 収できる材料から成るであろう。この場合、サンプル域１２に初めに適用される 液体サンプル又は他の液体試薬は、サンプル受領域Ｉ２から横方向に、ラベル域 １４中に及びそれを通して、捕獲域１６中に及びそれを通して、及び最終的に吸 上作用又は沈下作用（ｗｉｃｋ　ｏｒ　５ｉｎｋ）を有する吸着域１８中に流れ ることができ、その結果、全サンプル又は試薬体積がアッセイを正しく完結する ために前記載１２．１４及び１６を通して流れる。

非吸収性アッセイ装置ｌＯの好ましい場合、サンプル受領域１２及びラベル域１ ４の両者は液体の流れを可能にする非吸収性材料から成り、ここで液体の溶解さ れた又は分散された成分のすべては実質的に等しい速度で及び比較的弱められて いない流れを伴って運ばれる（この後に論ぜられるような捕獲試薬への特異的結 合の不在下で）。適切な非吸収性材料は、本質的に非吸収性材料、たとえば多孔 性ポリエチレン又は本質的に吸収性材料、たとえば紙、ニトロセルロース、ポリ エステル、アクリロニトリル、コポリマー、レーヨン及びそれらのブレンドを包 含し、それらはブロッキング剤、たとえば界面活性剤及び材料の吸収性性質に寄 与する分子力を阻害するタンパク質の適用により、非吸収性流れ特徴を示すよう に転換される。

サンプル受領域１２は典型的には２０μＩ！〜２００μｌの範囲で小量のサンプ ルを受けるように作用し、そしてラベル域１４への横方流を開始せしめるように 作用する。ラベル域１４は典型的には、そこて含浸され又は固定される本発明の 標的特異的ラベリング複合体を包含するであろう。通常、ラベリング複合体は試 験製品の調製に関して上記のように凍結乾燥されるであろう。サンプル又は他の 試薬の流れはラベリング複合体を移動せしめ（溶解し）、そして捕獲域１６の方 に及びその中に複合体を輸送するであろう。

ラベリング複合体と捕獲域１６内のラベリング複合体の結合を仲介する、サンプ ル内の分析物との間に相互作用が存在することが適切であろう。そのような相互 作用は種々の形を取ることがてき、典型的には、′サンドイッチ”ラベリング（ ここで、ラベリング複合体は分析物に結合する抗−分析物を含み、そして捕獲域 は、次に分析物を通してラベリング複合体を捕獲できる固定された抗−分析物を 含む）又は“競争”ラベリング（ここで、ラベリング複合体は分析物又は分析物 類似体を含み、そして捕獲域１６内の抗−分析物へのラベルの結合は元のサンプ ルにおける分析物の量に反比例する）である。基本的サンドイッチ及び競争アッ セイ型に対する種々の修飾は当業界において知られており、そしてここに例示さ れる試験装置ｌＯに同一か又は類似する試験装置への使用のために適合され得る 。

捕獲域１６はまた強い吸収性又は非吸収性材料から調製され得、そして非吸収性 材か好ましい。捕獲域のための特に適切な材料は、サンプル及び他の試薬との強 い吸収性の相互作用を紡ぐためにブロックされているニトロセルロースである。

使用する場合、捕獲域１６内ての本発明の標的特異的ラベリング複合体の結合は 、アッセイ結果を表わす可視シグナル又は徴候を提供するであろう。捕獲域１６ における定義された位置内でのラベリング複合体の十分な量の結合は、捕獲域１ ６における結果を視覚的に使用者が読み取ることを可能にするであろう。

次の例は例示的であって、本発明を制限するものではない。

実験 次の例は、抗体−酵素接合体、適切な酵素基質系、及び酵素インヒビター及び／ 又は安定剤の任意の使用から、体液におけるヒトコリオゴナｌ”　）ロピン（ｈ ＣＧ）の検出のためにプレー色素化された複合体の調製を示す。

モノクローナル抗−ｈＣＧ腹水流体を、５０％塩飽和でナトリウムデキストラン スルフェート及び塩化カルシウム、続いて硫酸アンモニウム処理による膜脂質化 により０〜４°Ｃで分別し、そして０２５カラム上で１０ｍＭのトリス緩衝液（ ｐＨ８，０）により脱塩化した。抗体をさらに、同じ緩衝液中、０〜０．３Ｍの 塩化ナトリウムの塩グラジェントを用いてＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ＠　ＦＦ樹脂 上で精製した。分別を２８０μｍてモニターし、そしてタンパク質のピークを集 め、そして０２５カラム上で０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）により緩 衝液−交換した。得られた抗−ｈＣＧ抗体を限外濾過により５■／　ｍｌに濃縮 した。

マレイミド基を、一般的にＥｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、　Ｉｓｈ ｉｋａｗａ　ｅｔａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ｔｇａｋｕｓｈｏｉｎ、　Ｔｏｋｙｏ −Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８１に記載されるようにして、マレイミドベンゾイ ル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを１００μｇ　／　ｍｌの最終濃度に添加し 、その反応混合物を２５°Ｃて４５分間インキュベートし、モしてＧ２５カラム 上で０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６，０）により緩衝液交換することによ って、抗−ｈＣＧ抗体中に抗体−酵素接合体を調製するために、次の酵素を用い た：グルコースオキシグーゼ（ＧＯ）　、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ ＨＲＰ）、ジアホラーゼＩ　（ＤＩＡ）　、及びウシ腸アルカリホスファターゼ （ＡＬＰ）。

ＳＨ基を導入するために、酵素を０．５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む Ｏ，ＩＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８，０）において５　ｍｇ　／ｍｌ　（ＧＯ 。

ＤＩＡ又はＡＬＰ）又は１０ｍｇ／　ｍｔ’（ＨＲＰ）で調製し、１．２８ｍｇ ／ｍｊ’の最終濃度で２−イミノチオランと共に２５°Ｃで４５分間インキュベ ートし、その後、０２５カラム上で０．１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７，３） により緩衝液−交換した。

マレイミド含有モノクローナル抗−ｈＣＧ抗体（上記セクション１．１）及びＳ Ｈ−誘導体化酵素を２５°Ｃで２時間反応せしめ、続いて５ｅｐｈａｃｒｙｌＯ ３３００ＨＲ樹脂上への酵素抗体接合体の結合を伴った。

０、１９６　（ｗ／　ｖ）ＮａＮｉ、０．０３％（ｗ／ｖ）　ＭｇＣｊ７　！　 ・６ＨｚＯ１０，００３９６（ｗ／ｖ）ＺｎＳＯ４・７）＋２０及び０．００５ ％（ｗ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ＠を含む０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７，０）から成る、濾過された接合体溶出緩衝液０．４５μｍを、前記分別に使 用した。前記分別を２８０μｍでモニターし、そして抗体−酵素接合体画分をプ ールした。続いて、抗体−酵素接合体（抗−ｈＣＧ　／ＡＬＰ接合体を除く）を 、５０Ｍｇのゲンタマイシン／　ｍｌにより補充された次の緩衝液中に０２５カ ラム上て緩衝液−交換した：（ｉ）ｔ（ＲＰ接合体：０．０５Ｍのトリス／ＨＣ １緩衝液（ｐＨ７，５）　；（ｉｉ）ＧＯ接合体：０．ＩＭのＨＥＰＥＳ緩衝液 （ｐｉ（８，Ｏ）　；及び（ｉｉｉ）ＤＩＡ接合体：Ｏ，ＩＭのリン酸ナトリウ ム（ｐＨ８，０）。゛側方流非吸収性アッセイ試験ストリップを、継続出願Ｎα ０７／６３９、９６７に包含される方法に従って構成した。試験装置（第１図） は、３つの活性域、及び活性域からのサンプルの流れを受けるように吸上作用又 は沈下作用を有する第四の吸着域を包含する。活性域は、下記のように、サンプ ル受領域に、中間域１４及び捕獲域１６を含んで成る。

“湿式”アッセイは、例示されていないが、試験管に調製された色素−ラベル− 複合体を用い、これにサンプルが添加される。得られた混合物は次に、試験スト リップに適用された。試験ストリップは次のようにして構成された： １．２゜ｌ　サンプル受領及び中間域の調製サンプル受領域及び中間域を、５ｏ ｎｔａｒａ＠　０−１００　ＤｕＰｏｎｔ　０ｒｌｏｎ＠５ｐｕｎｌａｃ織物か ら調製した。織物をメチル化されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により飽和す ることによって非吸収性にした。非吸収性材料への転換は、ＢＳＡの！０■／ｍ ｅ０■／よる３８μｌ／ａｌでの５分間の室温での処理より達成された。次に、 ５ｏｎｔａｒａＯのパッドを一７０℃で少なくとも１時間凍結した。次に、５ｏ ｎｔａｒａｏをＶｉｒｔｉｓＦｒｅｅｚｅｍｏｂｉ　Ｉｅ上で一晩凍結乾燥した 。サンプル受領パッド及び中間域パッドをＩＯＸ４ｍｍの長方形に切断し、ここ で前記５ｐｕｎｌａｃｅ織物は個々のパッドの長い方の側に平行である。

１、　２．　２　捕獲域膜の調製 非吸収性捕獲域を調製するために、ヤギ抗−ｈＣＧ血清を、５０％塩飽和でナト リウムデキストランスルフェート及び塩化カルシウム、続いて硫酸アンモニウム 処理による膜脂質化により０〜４°Ｃて分別し、そしてＧ２５カラム上でリン酸 緩衝液（ｐＨ７，２；　ＰＢＳ）により脱塩化した。抗−ｈＣＧ抗体をさらに、 溶出媒体としてＯ，ＩＭのグリシン緩衝液（ｐｌ＋２．３）を用いてｈＣＧ−３ ｅｐｈａｒｏｓｅＯ親和性樹脂上で精製した。

分別を２８０μｍてモニターし、単−特異性抗−ｈＣＧタンパク質のピークを集 め、そしてＧ２５カラム上でＰＢＳにより緩衝液−交換した。最後に、得られた 抗体を限外濾過により２■／　ｍ１以上に濃縮した。

８μｍの孔サイズを存するニトロセルロースを、Ｘ−Ｙチャートレコーダーに固 定し、モしてｈＣＧ捕獲バンドを、手動モードで作動する製図用ペンを用いて２ ■／ｍｅのヤギ抗−ｈＣＧ抗体により２ｃｍ間隔ての平行な線として形成した。

それらの線は、サンプルに含まれるｈＣＧと反応性であった。室温での１０分間 の空気乾燥の後、ニトロセルロース膜を室温で１５分間、ブロッキング緩衝液（ 上記トリス緩衝液中、ｌＯ■／　ｍｌのＢＳＡ）を含むトレー中に置いた。上記 膜を取り出し、プロットし、空気乾燥し、そして続いて、装置のアセンブリーま て、室温でデシケータ−に貯蔵した。

１、　２．　３　装置のアセンブリー 捕獲酸膜の２０Ｘ４ｍｍストリップを接着性透明ストリップ上の中央部に固定し た。その透明ストリップは７０Ｘ４ｍのオーバーヘッドプロジェクト透明フィル ムのストリップであり、それは両面接着テープにより接着性にされた。次に、中 間域を、捕獲域パットの次に１順のオーバーラツプを伴って固定した。次に、サ ンプル受領パッドを中間パッドの次に１ｍｍのオーバーラツプを伴って置いた。

次に、装置に吸着剤バットを装備し、そのパッドは、１順のオーバーラツプを伴 って捕獲酸膜の末端に固定される２０Ｘ４ｍｍの長方形のセルロース紙であった 。

抗−ｈＣＧモノクローナル抗体−ＧＯ接合体を含む、阻害されていない予備色素 化されたラベル複合体を、化学的中間体としてフェナジンメトスルフェート及び 電子レセプター（“ＧＯ基質”）として無色の親水性テトラゾリウム塩を用いて 、ＰＡＤ−仲介電子トランスファーにより形成した。この反応は、体液サンプル における分析物のために適切な色素化された酵素−抗体接合体をもたらす。

１．０ｍｌのインキュベーション反応を、５０℃ｇのゲンタマイシンを含む０． １ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０）　５００μｌに次の成分の連続した添加 により２５°Ｃて行なった＝　（ａ）脱イオン水中、５０％（Ｖ／Ｖ）のジメチ ルホルムアミド（ＤＭＦ）　１　ｍｅ当たり８■のＭＴＴテトラゾリウム塩の溶 液１００μ１（ｂ）同じ１（ＥＰＥＳ緩衝液中、０．５ＭのＤ−（＋）−グルコ ース５０μｉ？；（ｃ）脱イオン水ｌｒｄ当たり０．５■のＰＭＳ溶液５０μｌ ；及び最後に、複合体の形成を開始するために（ｄ）同じ１（ＥＰＥＳ緩衝液中 、１．７〜５０℃ｇ／艷の最終濃度での抗−ｈＣＧ抗体−Ｇｏ接合体３００μ１ ０ 第１表に特定された時間の間隔で、１５μｌの複数のアリコートを抜き取り、ｈ ＣＧ標準（それぞれ、Ｏ又は５００ｍ１ＵのｈＣＧ　／−のいづれかの最終ｈｃ ｃ濃度を得るために、０又は８００ｍ１Ｕ／ｒＲ１で０．５％（ｗ／ｖ）のウシ 血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液において調製された）のサンプル ２５μｌと共に混合し、そしてすぐに、セクション１．２に記載されているよう にして調製された、４Ｍの幅の側方流アッセイストリップに適用した。５分後、 捕獲域における視覚的に区別できる陽性シグナルの出現に基づく結果が第１表に 報告されている。

３０−＋ １：＋　＝捕獲域における色彩の明確に区別できる出現：＋／−＝捕獲域におけ る色彩の不確かな出現；及び−二捕獲域における色彩の明確な出現の不在。

抗−ｈＣＧモノクローナル抗体−ＡＬＰ接合体を含む、阻害されていない予備色 素化されたラベル複合体を、着色されたフェノール生成物（”ＡＬＰ生成物”） への無色の有機ホスフェート（“ＡＬＰ基質”）の酵素−触媒された加水分解に より形成した。５５０μｌのインキュベーション反応を次の成分を、０．１％（ ｗ／ｖ）のＮａＮｔを含む０．１ＭのＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１， ３−プロパンジオール）緩衝液（ｐＨｉｏ、　５）２５０μｌに連続的に添加す ることによって２５℃で行なった　（ａ）１−ナフトールに組合された同じ緩衝 液Ｉｎｌ当たり５■のＢＧＰ　（Ｆａｓｔ　Ｂｏｒｄｅａｕｘ　Ｇジアゾニウム 塩）溶液２００μｍ及び（ｂ）接合体溶出緩衝液４５μ！及び最後に、複合体の 形成を形成するために、（Ｃ）２．７５μｇ又は５μｇ　／　ｍｌの混合物にお ける最終濃度での接合体溶出緩衝液における抗−ｈＣＧ−ＡＬＰ接合体５５μｍ 、５分間のインキュベーションの後、５μ！又は３０μｌの複数のアリコートを 抜き取り、それぞれ０又は５５０ｍ１Ｕ／ｍｌのｈＣＧの最終濃度を得るために 、ｈＣＧ標準の２５μｌ又はｌＯμ！アリコートと共に混合し、そしてすぐに、 上記セクション！、２に記載されているようにして“湿式”アッセイのために調 製された４市の幅の側方流アッセイストリップに適用した。１５分後、捕獲域に おける視覚的に区別てきる陽性シグナルの出現に基づく結果か第２表にｆａ告さ れている。

第　２　表 ＡＬＰ　−Ａｂ　標準におけるｈＣＧ濃度１１：＋＝捕獲域における色彩の明確 に区別てきる出現：及び−＝捕獲域における色彩の明確な出現の不在。

抗体−ＡＬＰ接合体を含む、阻害されていない予備色素化されたラベル複合体を また、インジゴ形成／テトラゾリウム塩技法により調製した。６００μｌのイン キュベーション反応を、０．１％（Ｗ／Ｖ）のＮａＮ５を含むＯ，１ＭのＡＭＰ Ｄ緩衝液（１１Ｈ１０，５）２５０μｌ　ヘの次の成分の連続的添加により２５ °Ｃで行なった：　（ａ）０．１％（ｗ／ｖ）のＮａＮｔを含む、０．１ＭのＡ ＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール）緩衝液（ｐｕｔｏ、　１５ ）　１−当たり２．１６ｍｐのＩＰ（３−インドキシルホスフエート二ナトリウ ム塩）の溶液２４０μＡ’；（ｂ）脱イオン水中、５０％（Ｖ／ｖ）ＤＭＦ　１ 　ｍｅ当たり５■のＭＴＴ溶液１０μｌ及び最終的に、複合体形成を開始するた めに、（Ｃ）０．２５μｇ　／　ｍｅ〜４．５８μｇ　／　ｍｅの最終濃度で接 合体溶出緩衝液における抗−ｈＣＧ抗体−ＡＬＰ接合体１００μ１０１分間のイ ンキュベーションの後、１５μ！又は３０μｌの複数のアリコートを抜き取り、 ０又は５００＋ｎ　［Ｕ／　ｍｅのｈＣＧの最終濃度を得るために、それぞれ、 ２５μｌ又はｌＯμｌアリコートのサンプルと共に混合し、そしてすぐに、上記 セクション１．２において記載されているような“湿式”アッセイのために調製 された、４ｍの幅の側方流アッセイストリップに適用した。１５分後、捕獲域に おける視覚的に区別できる陽性シグナルの出現に基づく結果か第３表に示される 。

第　３　表 ＡＬＰ　−Ａｂ　標準におけるｈＣＧ濃度１１：＋＝捕獲域における色彩の明確 に区別できる出現；及び−一捕獲域における色彩の明確な出現の不在。

抗−ｈＣＧ　％ツクローナル抗体−Ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ（ＤＩＡ）接合体を含 む、阻害されていない予備色素化されたラベル複合体を、可視領域において比較 できる吸収スペクトルを示す生成物への適切な有機水素アクセプター基質のＮＡ ＤＨ補因子を包含する酵素触媒された還元により形成した。

１６７７、５μｌのインキュベーションを、５０Ｍｇのゲンタマイシン／ｍｌを 含むＯ，１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）　４４５μｌへの次の成 分の連続的添加により２５°Ｃで行なった＝　（ａ）脱イオン水中、１５％（ｖ ／ｖ）ＤＭＦにおける４、１■のＭＴＴ溶液６７．５μｌ；　（ｂ）　ｌ０ｍｇ のＢＳＡ（同じ緩衝液ｌ−当たりのウシ血清アルブミン）６７．５μｌ；　（ｃ ）同じ緩衝液における１０ｍＭのＮＡＤＩ＋６４．５μｌ及び最後に、複合体形 成を開始するために、（ｄ）同し緩衝液中、５０Ｍｇの抗−ｈＣＧモノクローナ ル抗体−〇ＩＡ接合体３０μｍ、３分間のインキュベーションの後、１５μｆ（ ７）複数（７）７リコートを抜き取り、０．１５０又は５００ｍ１ＬＩノｈＣＧ ／ｍｅの最終ｈｃｃ　ａ度を得るためにｈＣＧ標準のサンプル２５μｌと共に混 合し、そしてすぐに、上記セクション１．２に記載されるような“湿式”アッセ イのために調製された４０１１１１の幅の側方流アッセイストリップに適用した 。３分後、捕獲域における視覚的に区別できる陽性シグナルの出現に基づく結果 が下記第４表に示される。

１５０ｍ１Ｕ／　ｍｌ　＋ ５００ｍ１Ｕ／ｍ１十 １、＋＝捕獲域における色彩の明確に区別できる出現：及び−二捕獲域における 色彩の明確な出現の不在。

抗−ｈＣＧモノクローナル抗体−ＨＲＰ接合体を含む、阻害されていない予備色 素化されたラベル複合体を、無色の電子ドナ一種の着色された生成物へのペルオ キシド−仲介の酵素的転換により形成した。

２０１６μｌのインキュベーション反応を、１ｍｌのメタノール当たり３■の４ −クロロ−１−ナフトールの溶液３６０μ、１への次の成分の連続的添加により ２５°Ｃて行なった：（ａ）５０Ｍｇのゲンタマイシン／ｍｌを踏む０．０５Ｍ のトリス／ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）５４μｆ　；　（ｂ）　０．０２７．５ ）１５４８μｌ；及び最終的に、複合体形成を開始するために、（Ｃ）５０Ｍｇ のゲンタマイシン／−を含む０．０５Ｍのトリス／ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５） における０、２７■の抗−ｈＣＧ抗体／）ＩＲＰ接合体溶液５４μ！０１５分後 、次の試薬（４°Ｃに急冷された）を添加した：（ａ）５０Ｍｇのゲンタマイシ ン／ｍｌを含む０．０５Ｍのトリス／ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，５）１２６μｌ　 ：　（ｂ）０．０２９６（Ｖ／Ｖ）の■２０２．０．１ｍＭのＥＤＴＡ及び５０ Ｍｇのゲンタマイシン／　ｍｌを含む０．０５Ｍのトリス／ＩＩ（Ｊ’緩衝液（ ｐｉ−１７，５）＋２６μｆ；及び（ｃ）０．０５Ｍのトリス／ＨｔＪ’緩衝液 （ｐＨ８，０）中、１００■のＢＳＡ／＋ｎ／の溶液２５２μ１０複数の１５μ ｌアリコートを抜き取り、０．１５０及び５００ｍ１Ｕ　ｈＣＧ／ｍｌの最終濃 度を得るためにｈＣＧ標準の２５μｌサンプルと共に混合し、そしてすぐに、上 記セクション１．２に記載されるような“湿式”アッセイのために調製された、 ４Ｍの幅の側方流アッセイストリップに適用した。３分後、捕獲域における視覚 的に区別できる陽性シグナルの出現に基づく結果が下記第５表に示される。

０ｍ１Ｕ／ｍ＋１− １５１−１５Ｏ／ｍｌ＋ ５００ｍ　１０／　ｍｌ　＋ １：＋＝捕獲域における色彩の明確に区別できる出現；及び−＝捕獲域における 色彩の明確な出現の不在。

抗体−ＨＲＰ接合体を含む、阻害されていない予備色素化された複合体をまた、 製電子カルバゾール誘導体との反応により調製した。

＋１ＲＰ基質を、ジメチルホルムアミドに溶解された３−アミノ−９−エチル力 ルバゾールの０，４０％（Ｖ／　Ｖ）溶液５０μｌと５０ｍＭの酢酸ナトリウム 緩衝液（ｐＨ５，０）　９４０μｌとを混合し、続いて、同じ緩衝液中、０、３ ９６　（ｖ／ｗ）の過酸化水素１０μｌを添加することによって調製した。

上記このセクションに記載されるようにして調製された抗−ｈＣＧ抗体、／ＨＲ Ｐ接合体（０，３４ｍｇ／　ｍｌ”）の５μｌアリコートを、１（ＲＰ基質溶液 ２２８μｐに添加した。２５°Ｃての４時間のインキュベーション後、ｌＯμｆ のアリコートを抜き取り、そしてすぐに、上記セクション１２に記載されるよう な“湿式”アッセイのためにアセンブルされた４ｍｍの幅の側方流アッセイスト リップに適用した。プールされた雄の尿において調製されたｈＣＧサンプル２０ μｌを、サンプル受領ストリップパッド上に適用し、０．１００又は４００ｍ１ Ｕ　ｈＣＧ／ｙ＋＋１の最終標準濃度を得た。最終的に、スパイクされていない （ｕｎｓｐｉｋｅｄ）、明らかに負の雄の尿ブールｌＯμｍ部分をサンプル受領 域に適用し、試験を結論づけた。８分後、捕獲域における視覚的に区別できる陽 性シグナルの出現に基づく結果が下記第６表に示される。

′１００ｍ１Ｕ／−＋ ４００ｍ　［Ｕ／　ｍｌ　＋ １、＋＝捕獲域における色彩の明確に区別できる出現；及び−二捕獲域における 色彩の明確な出現の不在。

体液におけるｈＣＧの検出のための阻害された予備色素化ラベル複合体を、その 複合体が、予備色素化された抗−ｈＣＧ複合体がいったん形成された後、サンプ ルにおけるｈＣＧの検出のために酵素的活性を有する必要かないことを示すため に構成した。阻害された予備色素化複合体は、初期抗体−酵素接合体における酵 素の活性が、予備色素化ラベル複合体を形成するために、適切な酵素基質と共に 抗体−酵素接合体をインキュベーションにした後、阻害されている複合体である 。

抗−ｈＣＧ抗体／ＨＲＰ接合体を含む、阻害された予備色素化複合体を次の通り にして調製した。２０１６μｌのインキュベーション反応を、メタノールＩｎ当 たり４−クロロ−Ｉ−ナフトール３■の溶液３６０μｌへの次の成分の連続的添 加により２５°Ｃて行なった：（ａ）５０Ｍｇのゲンタマイシン／−を含む０． ０５Ｍのトリス／ＨＣＩ緩衝液（ｐ１１７．５）５４μｌ　；　（ｂ）　０．０ ２％（ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ１，０，１ｍＭのＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸 ）及び５０Ｍｇのゲンタマイシン／ｒｄを含む０．０５Ｍのトリス／１ｃｊｌ’ 緩衝液（ｐＨ７，５）　１５４８μｌ；及び最終的に、複合体形成を開始するた めに、（Ｃ）５０Ｍｇのゲンタマイシン／−を含む０．０５Ｍのトリス／ＨＣ１ 緩衝液（ｐＨ７，５）中、０．２７■の抗−ｈＣＧ抗体／ＨＲＰ接合体の溶液５ ４μｍ、１５分のインキュベーションの後、次の試薬（４°Ｃに急冷された）を 添加した：（ａ）５０Ｍｇのゲンタマイシン／ｍｅを含む０．０５Ｍのトリス／ ＩＣ！！緩衝液（ｐＨ７，５）中、２ＭのＮａＮｚの溶液１２５μｍ　；　（ｂ ）　０．０２％（ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ２、Ｏ，ＩｍＭのＥＤＴＡ及び５０１１　ｇ のゲンタマイシン／　ｍｌを含む０．０５Ｍのトリス／ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７， ５）中、ｌ０９１ｗ／ｖ）ｃ７）ＰＶＰ　（７）溶液１２６μｉ’；及び０．０ ５Ｍ（７）トリス／ＨＣ！！緩衝液（ｐＨ８，０）中、１００ｍｇのＢＳＡ／ｍ ｊ’の溶液２５２μ１．続いて、１５μｆ（７）複数（７）７１Ｊ：Ｔ−トを抜 き取り、０．１５０及び５００ｍ１Ｕ　ｈＣＧ／ｍ１の最終濃度を得るためにｈ ＣＧ標準のサンプル２５μｌと共に混合し；そしてすぐに、上記のような“湿式 ”アッセイのために調製された４市の幅の側方流アッセイストリップに適用した 。３分及び６０分後、捕獲域における視覚的に区別できる陽性シグナルの出現に 基づく結果か下記第７表に示されている。

１００ｍ１Ｕ／　ｍ１＋　＋ ５００ｍ　１０／　ｍｅ　＋　＋ １・＋＝捕獲域における色彩の明確に区別できる出現；及び−二捕獲域における 色彩の明確な出現の不在。

“一段階”アッセイのための装置を、後者の中間域を次のようにして調製された 予備色素化ラベルパッドにより置換することによって、“湿式”二段階アッセイ について上記のようにして調製した。

抗体−１（ＲＰ接合体を含む予備色素化されたラベル複合体を、メタノール１ｍ ｌ当たり３■の４−クロロ−１−ナフトールの溶液３６０μｌへの次の成分の連 続的添加により２５°Ｃての２０１６μｌのインキュベーション反応で調製した ：（ａ）５０Ｍｇのゲンタマイシン／ｒｄを含む０、０５Ｍのトリス／ＨＣＩ！ 緩衝液（ｐＨ７，５）５４μｌ　；　（ｂ）　０．０２％（ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ２ ，０，ＩｍＭのＥＤＴＡ及び５０Ｍｇのゲンタマイシン／ｒｎｌを含む０．０５ Ｍのトリス／ＨＣｆ！緩衝液（ｐＨ７，５）　１５４８μｌ；及び最終的に、複 合体形成を開始するために、（ｃ）５０Ｍｇのゲンタマイシン／　ｍｌを含む０ 、０５Ｍのトリス／ＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，５）中、０．２７■の抗−ｈＣＧ抗 体／Ｆ（ＲＰ接合体の溶液５４μｆ、１５分間のインキュベーションの後、次の 試薬（４°Ｃに急冷された）を添加した：（ａ）５０Ｍｇのゲンタマイシン／　 ｍｌを含む０．０５Ｍのトリス／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，５）　１２５μ！！　 ；（ｂ　）　０．０２９６　（ｖ／　ｖ）のＨ６０１，０，ＩｍＭのＥＤＴＡ及 び５０Ｍｇのゲンタマイシン／　ｍｌを含む０．０５Ｍのトリス／１Ｉｃｊ７緩 衝液（ｐＨ７，５）　１２６μｍ　；及び（ｃ）０．０５Ｍのトリス／ＨＣＩ緩 衝液（ｐＨ８，Ｏ）中、　１００ｍｇのｍＢＳＡ／ｍｌの溶液２５２μ１０ 混合物を３８ｕｌ／ａｌで５ｏｎｔａｒａ　５ｐｕｎｌａｃｅ織物上に注いだ。

マトリックスを室温で２０分間維持し、そして少なくとも１時間、凍結乾燥フラ ッシュを伴って、突然−７０°Ｃて凍結せしめた。得られる組成物をＶｉｒｔｉ ｓ　Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ上で一晩凍結乾燥し、そして中間の予備色素化さ れたラベリングパッドをＩＯＸ４ｍの長方形に切断し、ここて５ｐｕｎｌａｃｅ 織物はバットの長い方の側に平行である。次にパッドを、“湿式”二段階アッセ イストリップについての上記の態様に類似する態様で“一段階”装置に中間域と して集成した。

アッセイを、ストリップに０．１５０又は５００ｍ１Ｕ　ｈＣＧ／ｍｌの添加に より行なった。３分及び６０分後、捕獲域における視覚的に区別できる陽性シグ ナルの出現に基づく結果が下記第８表に示される。

１００ｍ１Ｕ／＋＋＋１＋　＋ ５００ｍ１Ｕ／ｍｌ’　＋　＋ １：＋＝捕獲域における色彩の明確に区別できる出現；及び−一捕獲域における 色彩の明確な出現の不在。

前述の発明は明確に理解するために、例示的及び倒曲に詳細に記載されて来たが 、変更及び修飾が本発明の範囲内で実施され得ることは明白てす。

ＩＧ　１ フロントページの続き （７２）発明者　プロノボスト、アラン　ディー。

アメリカ合衆国、カリフォルニア　９２１２９゜サンディエゴ、サーモン　リバ ー　ロード

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．特異的結合物質に結合される酵素；及び標的分子への結合のために利用でき る特異的結合物質の活性部位を残しながら、複合体に視覚的に区別できる色彩を 付与するのに十分な量で、接合体に複合体化された色素分子を含んで成る標的特 異的ラベリング複合体であって、ここで前記色素分子が基質の水性相においての 前記特異的結合物質に待合される酵素との反応により形成されることを特徴とす る複合体。 ２．前記特異的結合物質が抗体である請求の範囲第１項記載のラベリング複合体 。 ３．前記酵素が前記抗体に共有結合される請求の範囲第２項記載のラベリング複 合体。 ４．前記酸素が、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ジアホラ ーゼ、ガラクトシダーゼ及びオキシドレダクターゼから成る群から選択される請 求の範囲第１項記載のラベリング酵素。 ５．前記酵素が不活性化される請求の範囲第１項記載のラベリング複合体。 ６．前記複合体が１０〜１０７の色素分子を含む請求の範囲第１項記載のラベリ ング複合体。 ７．前記複合体が凍結乾燥される請求の範囲第１項記載のラベリング複合体。 ８．支持マトリックス：及び 前記支持マトリックス内に含浸される標的特異的ラベリング複合体を含んで成る 試験製品であって、ここで前記複合体が：（ｉ）酵素及び特異的結合物質の接合 体；及び（ｉｉ）標的分子への結合のために利用できる特異的結合物質の活性部 位を残しながら、複合体に視覚的に区別できる色彩を付与するのに十分な量で、 前記接合体に複合体化される色素分子を含んで成ることを特徴とする試験製品。 ９．前記標的特異的ラベリング複合体が支持マトリックス内に凍結乾燥されてい る請求の範囲第８項記載の試験製品。 １０．前記支持マトリックスが液体サンプルの非吸収性流れを誘導する固体マト リックスである請求の範囲第８項記載の試験製品。 １１．前記支持マトリックスが液体サンプルの強い吸収性流れを誘導する固体マ トリックスである請求の範囲第８項記載の試験製品。 １２．前記支持マトリックスが、ポリエステル、アクリロニトリルコポリマー、 レーヨン、ガラス繊維、セルロース及びそれらのブレンドから成る織物である請 求の範囲第８項記載の試験製品。 Ｉ３．前記織物がそれを非吸収性にするためにブロッキング剤により処理されて いる請求の範囲第１２項記載の試験製品。 １４．前記特異的結合物質が抗体である請求の範囲第８項記載の試験製品。 １５．前記酵素が前記抗体に共有結合される請求の範囲第１４項記載の試験製品 。 １６．前記酵素が、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ジアホ ラーゼ、ガラクトシダーゼ、溶解性酵素及びオキシドレダクターゼから成る群か ら選択される請求の範囲第８項記載の試験製品。 １７．前記酵素が不活性化される請求の範囲第８項記載の試験製品。 １８．前記複合体が１０〜１０７の色素分子を含む請求の範囲第８項記載の試験 製品。 １９．前記複合体が凍結乾燥される請求の範囲第８項記載の試験製２０．標的特 異的ラベリング複合体を調製するための方法であって、酵素及び特異的結合物質 の接合体を供給し、ここで前記酵素は基質を着色された色素生成物に転換するこ とができ、そして前記特異的結合物質は標的分子に結合することができ；そして 前記接合体と前記基質とを、前記接合体と前記着色された色素生成物との複合体 化をもたらす条件下で水性媒体において反応せしめることを含んで成る方法。 ２１．前記反応条件が前記酵素による前記基質のターンオーバーを促進するよう に選択される請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２．前記接合体と基質との間の反応が、前記複合体が所望する色彩強度を得た 後に停止される請求の範囲第２０項記載の方法。 ２３．前記反応が基質の消耗により停止される請求の範囲第２０項記載の方法。 ２４．前記反応が、前記反応条件を変えることによって停止される請求の範囲第 ２０項記載の方法。 ２５．前記反応が、前記酵素を不活性化することによって停止される請求の範囲 第２０項記載の方法。 ２６．前記特異的結合物質が抗体である請求の範囲第２０項記載の方法。 ２７．前記酵素が前記抗体に共有結合される請求の範囲第２６項記載の方法。 ２８．前記酵素が、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ジアホ ラーゼ、ガラクトシダーゼ溶解性酵素及びオキシドレダクターゼから成る群から 選択される請求の範囲第２０項記載の方法。 ２９．液体サンプルにおける分析物の存在を検出するための装置であって： （ａ）液体サンプルの側方流を誘導する固体支持マトリックスを含んて成るサン プル受領域、それと接触して、（ｂ）分析物に特異的に結合するか又はそれと競 争する少なくとも１つのアッセイラベル及び液体サンプルの側方流を誘導する固 体支持マトリックスを含んで成るラベリング域、それと接触して、（ｃ）側方流 を誘導する固体支持マトリックス及びその少なくとも一部における、前記アッセ イラベル又は分析物を結合できる少なくとも１つの捕獲試薬を含んで成る捕獲域 、それに隣接して、（ｄ）吸着域を含んで成り；さらに 酵素及び特異的結合物質の接合体：及び標的分子への結合のために利用できる特 異的結合物質の活性部位を残しながら、複合体に視覚的に区別できる色彩を付与 するのに十分な量で、前記接合体に複合体化される色素分子を含んで成るアッセ イラベルを含んで成ることを特徴とする装置。 ３０．前記特異的結合物質が抗体である請求の範囲第２９項記載の装置。 ３１．前記酵素が前記抗体に共有結合される請求の範囲第３０項記載の装置。 ３２．前記酵素が、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ジアホ ラーゼ、ガラクトシダーゼ溶解性酵素及びオキシドレダクターゼから成る群から 選択される請求の範囲第２９項記載の装置。 ３３．前記酵素が不活性化される請求の範囲第２９項記載の装置。 ３４．前記複合体が１０〜１０７の色素分子を含む請求の範囲第２９項記載の装 置。 ３５．前記複合体が凍結乾燥される請求の範囲第２９項記載の装置。