JPH07509237A - ｇｐ１２０ＨＩＶエピトープを模倣したペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に関する開発に関する。 発明の背景 ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）のエンベロープ糖タンパク質（ｅｎｖ）は個々 の分離体間で非常に変化しやすく（引用文献１）１．：、（７）変化はＨＩＶ− １とＨＩＶ−２との間ではさらに際立っている（２）。この変化は個々の分離体 間たけてはなく、個々の患者からのウィルスの一連の分離体についても見られる （３．４）。当然ながら、ヒト免疫不全ウィルスおよびサル免疫不全ウィルス（ ＳＩＶ）の間にも類似の連続変化か観察され、また同一種のサルから分離された 場合にもＳＩＶ内に同様の連続変化が見られた（５−７）。 この変化はＨＩＶの他の遺伝子生産物よりエンベロープ糖タンパク質において大 きいたけでなく、この１つのタンパク質内においても、この変化は特定の変化し やすい領域（初期の遺伝子生産物のタンパク分解性成熟によって発生した大半は 表面部分（ｇｐ１２０））に集中し、他の領域はそれほと変化しやすくない（８ ，９）。残念ながら、大半の変化しやすい領域はまたしばしば最も免疫原性てあ り（１０）、その結果ウィルスは部分的に宿主の免疫応答を免れ、永続的な感染 を確実にする。 このように変化しやすいことが特異的な相互作用に基づく診断技術にとって問題 となり、別々のまたは混合された試薬が通常ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２双方に ついてサンプルをテストするために使用される。この変化しゃすいことはまたい かなる考えられるワクチンまたは免疫治療にとっても問題となる。なぜならば、 いがなる適切な薬剤も多くの変異ウィルス株に対するとともに、ＨＩＶ−１およ びＨＩＶ−２に対しても応答しなければならないからである。 この発明は（ＨＩＶ−１ｅｎｖ配列の発明者らの位置決定において）位置１２２ から出発する、ｅｎｖのｇｐ１２０におけるこれまで認識されていなかった高度 に保存されるウンデカペプチドを本発明者らが発見したことに基づく。ウンデカ ペプチドはＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶにも存在する。この配列は、［ 高度に分岐したＪＨＩＶ−２分離体Ｄ１９４および０２０５　（Ｉ　Ｉ）を含む 、双方のタイプのＨＩＶのすへてのリストされた分離体において、Ｌｙｓ−Ｐｒ ｏ−Ｃｙｓ−Ｖａ　］−］Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−ＰｒｏＬｅｕ−Ｃｙｓ−Ｖ ａ　］　（Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、Ｉ、配列Ａとも呼ぶ）として丸ごと保存され、 高度に分岐したアフリカマンドリル分離体（１２）の場合を除いて、ＳＩＶのす へての分離体ではトレオニンおよび第２のバリンにおいて保存的変化か起こるだ けである。高度に分岐したアフリカマンドリル分離体（１２）では、トレオニン および両方のロイシンが突然変異する。 この明細書では、アミノ酸は、そのフルネーム、通常の３文字略号、または表１ に記載される通常の１文字記号のいずれかによって示される。 表２は高度に保存される共通配列と比較した、ＨｒＶ−１、ＨＴＶ−２およびＳ ＩＶの多数の異なった分離体に対するアミノ酸配列データを与える。共通配列は 絶対多数に基づき、個々の分離体に対して、点線は共通配列との一致を示し、そ うでない部分にはアミノ酸が示される。 遺伝子コードの冗長性は少し幅広い変化を可能にするが、このペプチドをコード する遺伝子のヌクレオチド配列の比較においてもまた高度の保存性が見られる。 配列情報はロス・アラモス・データ・ベース（Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｓ　Ｄａｉａ 　Ｂａ５ｅ）から得られたものである。 初期の報告によれば、ｇｐ１２０の免疫支配的な領域は大部分は可変ループ、特 にｖ３にある（たとえば１０）。 ペプチドを用いた限られた研究は我々が説明する保存領域を含んでいた（たとえ ば１３）。これらのペプチドはほとんど免疫原性を示さなかった。これは輸送タ ンパク質への結合においてアミノ酸側鎖を修飾から保護するために何も注意が払 われなかったからであると現在考えられている。 上述の保存配列はプロテウス・バイオテクノロジ・リミテッド（Ｐｒｏｔｅｕｓ 　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ　）のＥＰＯ２９８６３３にお いて、ＨＩＶの少なくとも１つの株に対する免疫を促進するための可能なワクチ ンベースとして言及されている。この配列はＨＩＶエンベロープタンパク質の少 なくとも１つの池の抗原決定基に対する形態学的類似性に基づいて選択されたと 記載されている。しかしながら、Ｈｌｖ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶの異なっ た株間における配列の高度な保存性の評価についてはＥＰＯ２９８６３３には何 も示されていない。 ＥＰＯ２９８６３３はまた、上述の保存配列のＣ末端を、類似の聾様で選択され たさらなる配列に結合することを開示しており、重要でないＣ末端ジペプチドＣ ｙｓ−Ｖａｌはおそらくは省いてもよく、配列の第１のＣｙｓ残基は分子内ジス ルフィド架橋を経て分子の別のＣｙｓ残基に架橋結合され得ることがこの文献に は記載されている。 この発明はさらに、保存配列の正しい提示か免疫応答を引出すために非常に重要 であるという理解に基づく。現在では、その本来の形状において、上述の保存配 列は、分子内ジスルフィド架橋を経て、ＥＰＯ２９８６３３て提案されたものと は異なるｇｐ１２０のさらなる配列に架橋結合されることが知られる。このさら なる配列（配列Ｂ）もまたＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の双方の採肉て高度に保 存され、２つのタイプの間には限られた突然変異しかない。 ＳＩＶ分離体＋１ＨＩ　Ｖ−１（Ｓ　Ｉ　Ｖｃ、、　）またＩ；ｔＨＩＶ−２（ ＳｒＶのすへての他の株）のいずれかに強い類似性を示す（表３）。現在ではさ らに、上述の保存配列の双方のシスティン残基が、本来の配座（１４）でそれぞ れジスルフィド架橋に関与することか理解されており、システィン残基の一方は 重要ではないというＥＰＯ２９８６３３の記載に反して、適切な免疫応答を引出 すためには双方のシスティン残基か必要であると考えられる。この第２のペプチ ドの強い保存性は、それが保存配列とともに必要な構造上の配座を形成すること と十分に適合する。 このことを示すために、本願発明者らは双方のシスティン残基がジスルフィド結 合のほぼ２分の１まで誘導された状悪て、上述の保存配列を使用して研究を行な い、本来の表現形を模倣した。このペプチドに関する最初の免疫原性の研究は、 このペプチドが適切な輸送タンパク質に結合されて提示された場合に免疫原性で あり、結果として生じる抗血清は透過性とされた細胞において本来のｇｐ１２０ と反応することを示す。適切な配向で各配列の双方のシスティン残基からジスル フィド架橋を介してさらなる配列に結合された上述の保存配列を使用して研究か 行なわれた。 発明の概要 １つの局面において、この発明は、アミノ酸配列すシジーブロリンーシステイン ーバリンーリシンーロイシンートレオニンーブロリンーロイシンーシステインー バリン（Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、Ｉ　）ををするペプチドを含む分子であって、各 システィン残基が、さらなるシスティン残基にジスルフィド架橋されているかま たはジスルフィド結合の部分を模倣するように誘導化されている分子、またはＨ ＩＶ　ｅｎｖのｇｐ１２０のエピトープの免疫原的挙動を模倣する、そのような ペプチドの機能的に等価な変形体を提供する。 関連のＳ■Ｖにおいてよく似た保存を伴う、ＨｒＶの表面エンベロープタンパク 質内でのペプチド配列の厳密な保存性は、この発明の基礎である配列がｅｎｖ− タンパク質の機能に極めて重要であり、したがって他の今のところはまだ特徴付 けられていない分離体でもそれ以上変化しそうにないことを示唆する。研究音速 はこの配列がＥＭＢＬデータベースの他のタンパク質には存在しないことを示し ているので、これは免疫不全ウィルスに特異的であるように思われる。したがっ て、この発明は以下に説明する診断薬、免疫原性の薬剤および治療薬の設計に対 して多くの考えられる意味合いを持つ可能な固定配列を提供する。 上に説明したように、分子がｇｐ１２０の対応するの配列の挙動を正確に模倣す るためには、各システィン残基がそれぞれのジスルフィド架橋（実際のまたは適 切な誘導によって模倣されたもの）に寄与していることが重要である。 これはたとえばＳ−アセタミドメチル誘導体のようなシスティン残基の適切な誘 導化によって達成できる。代替的に、これは、システィン残基をさらなるペプチ ド配列のそれぞれのシスティン残基に架橋結合することによって達成でき、この さらなるペプチド配列は、ペプチドの適切なリンカ−または他の特性によっであ るａ■隔て本発明のペプチドにつながっているものであってもよいし、または別 個のペプチドてあってもよい。ｇｐ１２０で発生することが現在知られている実 際の架橋結合に基づく１つの好ましい架橋結合配列は以下のとおりである。 （配列Ａ）　（Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、１　）Ｓ　ＤＳＴ；Ｉ　ＫＥＴ　Ｄ ある） 配列Ａはこの発明が基づくユニークに保存される配列であり、配列ＢはＨＩＶ− １のアミノ酸２１９から２３０およびＨＩＶ−２の２１０から２２１の配列に基 づき、突然変異は頻度の順に下に示される。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対し てさまざまな配列が最適であるかもしれないが、配列Ｂはこのようにかなり保存 性がある（表３）。 所望のペプチド配列は、たとえばＦｍｏｃ法を使用して、通常の態様で容易に合 成できる。代替的に、ペプチド配列は既知の態様て組換えＤＮＡ法によって生産 可能である。 この発明のさらなる局面は、この発明に従うペプチド分子をコードする、好まし くは適切な発現ベクターに組込まれたＤＮＡ分子を提供する。 高度に保存される配列に基づくこの発明の分子は、その分子の機能的に重要な免 疫原性の挙動に著しく影響を及ぼすことなく、さまざまな異なった方法で修飾で きるようである。当該ペプチド配列または各ペプチド配列に対する可能な修飾は 以下のものを含む。 １）　１つ以上の個々のアミノ酸はたとえば以下のような共通の特性を有するア ミノ酸によって置換可能である。 ■を■によって置換 ＴをＳによって置換 ＫをＲによって置換 りを１、■またはＭによって置換 ２）　１つまたはそれ以上の通常のペプチド結合を等配電子装置き換えによって 置換可能である。可能な置き換え結合はペプチド合成の分野の当業者には周知で あり、たとえは引用文献１５て検討することがてきる。アミノ酸のアルファ炭素 が窒素原子によって置換されるアザペプチド結合の使用（つまり−ＮＨ−ＮＲ− Ｃｏ−）　、メチルアミンを与える還元アミド結合（つまり−ＮＨ−ＣＨＲ−Ｃ Ｈ。 −）、’ＣｏをＣＨ２によって、かつＭＨをＳによって置換した千オメチル基（ つまり−３−ＣＨＲ−ＣＭ、＝）、ＮＨおよびＣＯ基双方の不飽和炭素原子によ る置換（つまり＝ｃＨｍｃＨＲ−ｃＨ＝）、またはＭＨ基のメチレンによる置換 （つまり−Ｃｌ−ｌ２−ＣＨＲ−ＣＣ）−）の例か含まれる。 ３）　ジスルフィド架橋されたシスティン残基（つまりノスチン残基）の一方ま たは双方の対は以下のようなシスチン類似体によって置換可能である。 ４）　１つまたはそれ以上のアミノ酸を「逆−倒ＷＣｒｅｌｒｏ−ｉｎＶｅｒｓ ｏ　）　Ｊ　アミノ酸、つまり、ＷＯ９１／ｌ　３９０９て論じられたアミノ酸 に対応する官能基を有する三官能アミンによって置換可能である。 ５）　１つまたはそれ以上の重要でないアミノ酸をけずってもよい。 ６）　機能に著しく影響しない１つまたはそれ以上の付加的なアミノ酸を含むこ とがてきる。 ７）　ペプチドの３次元構造を模倣した構造上の類似体をペプチドの代わりに使 用することができる。 この発明に従う分子は免疫応答を引出すことが可能であることか示された。した かって、この分子の１つの可能な用途はＡＩＤＳおよびＡＩＤＳ関連疾病に対し て可能性のあるワクチンの主成分（ベース）としてのものである。 さらなる局面において、この発明はこの発明に従う分子を含むＡＩＤＳおよびＡ ＩＤ、ｓＩ！Ｊ連疾病に対するワクチンを提供する。 この目的のために、この発明の分子は、あるいは保存配列のアミノ酸の化学基を 介して、またはＣ−もしくはＮ−末端で付加された付加的なアミノ酸を介して、 任意に担体分子に結合され得る。たとえばＴｙｒ残基の側鎖を使用する多くの適 切な結合が知られている。適切な担体は、たとえば、スカンガイのヘモシアニン （ＫＬＨ）、血清アルブミン、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ） 、オボアルブミン、非タンパク質担体および多くの他のものを含む。保存配列の りシン残基はこの発明の分子において非常に重要であると考えられ、この理由の ために、リシン残基のニブシロン−アミノ基は、結合剤の使用の前にその後再生 される基を用いて、担体を結合する反応の間望ましくない反応を防ぐため、既知 の態様で保護することが好ましい。 この発明の分子は、代替的に可能な生ワクチンとして、たとえばポリオまたはワ タシニアなとの遺伝子的に修飾されたウィルスの被覆の一部として与えることが できる。 この発明のワクチンは通常の態様で、たとえば注射、経口なとて投与され、フロ イント完全アジュバントもしくは不完全アジュバントまたは水酸化アルミニウム などの従来のアジュバントを使用してもしなくてもよく、また他の免疫強化剤を 使用してもしなくてもよい。ワクチンを投与するため処方する際に使用するのか 適した希釈剤もまた周知であり、蒸留水、リン酸塩緩衝生理的食塩水、およびク エン酸塩緩衝液なとの緩衝溶液が含まれる。 この発明に従う分子は、ＨＩＶウィルスのヒトまたは動物の細胞への結合を外す ように作用することによって、またはウィルスの３次元組織を乱すことによって 、ＡＩＤＳおよび関連疾病の処置（予防または治療）における用途をさらに見出 し得る。 この発明のさらなる局面はＡＩＤＳまたは関連疾病の予防または治療のための方 法を提供し、効果的な量のこの発明に従う分子を投与するステップを含む。 さらなる局面において、この発明はあるいは１つ以上の製薬的に許容されるアジ ュバント、担体および／または賦形剤とともに、この発明に従う分子を有効成分 として含有する製薬組成物を提供する。 この発明はまたＡＩＤＳまたは関連疾病の治療または予防的処置に対する薬剤の 調製のためのこの発明に従う分子の用途を提供する。 この発明が基づく保存配列に結合する分子、特に抗体、抗体関連分子、およびそ の構造上の類似体もまたＡＩＤＳおよび関連疾病の治療および診断における薬剤 としての使用か可能である。 さらなる局面において、この発明はこの発明のベースである保存配列に結合する 分子、特に抗体、抗体の抗原結合部位、またはその構造上の類似体を提供する。 抗体（モノクローナルおよびポリクロナール）を製造するための技術は当該技術 分野において周知である。 キメラ抗体、人体に適応させた抗体、修飾された抗体、および設計された抗体な どの、（抗原結合部位を含む）抗体の変形物は一般にこの発明の範囲内に含まれ る。このような変形物を生産するための技術もまた当業者には周知である。 ｇｐ１２０の保存配列の３次元構造の知識があれば、この配列に結合する合成分 子を設計しかつ構成することが可能である。この目的に適切な技術はたとえば引 用文献１６および１７に開示されており、これらはレニンに対して可能性のある 抑制剤を設計するためのコンピュータモデルの使用を含む。 この発明か基つく保存配列に結合する抗体および他の分子は以下を含む多くのさ まざまな方法で治療（予防および治療）ならびに診断目的のために使用可能であ る。 １）　抗体、好ましくは人体に適応させた抗体の患者への適切な投与による受動 免疫のため。 ２）　（おそらくは適切な抗体エンジニアリングによって入手される）適切なサ ブクラスまたはアイソタイプの抗体を使用することによって、補体を活性化する かまたは抗体依存細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介して、所望の機能を発揮さ せることかできるようにするため。 ３）　たとえは抗体の結合剤および細胞毒性成分を含む免疫毒素を使用すること によって毒素または他の薬剤の目標とする配達を行ない、ｇｐ１２０の目標とす る保存配列に直接的または間接的に結合するため。 ４）　ＨＩＶ感染細胞の表面に対して高度に免疫原性の物質をねらい通りに配達 し、宿主の体液性または細胞性免疫システムのいずれかによってそのような細胞 の可能な除去をもたらすため。 ５）　たとえばさまざまなイムノアッセイ法を使用してＨＩＶを検出するため。 上のすへてを実行するため技術は当業者に周知である。 別の局面において、この発明は治療または診断目的のためにこの発明の保存する 配列に結合する分子の使用を含む。 この発明はまたこの発明に従う分子を使用して、ＨＩＶ、ＨＩＶに対する抗体、 またはＨＩＶによる感染を検出するための方法およびキットをその範囲内に含む 。 以下の例においてこの発明を例示としてさらに説明する。 第１の例は高度に保存される配列を組込むペプチドに関する免疫学的研究に関す るものであり、これはペプチドが免疫原性であり、かつ抗血清は感染された細胞 において本来のｇｐ１２０と反応することを示す。この例では添付の図面の図１ から４を参照する。 図１は細胞の免疫蛍光を示す一連の写真である。ペプチドての処理の前後におい てウサギから得られた血清で処理する。いくつかはＨＩＶ−１からｇｐ１２０を 発現している。血清はいくつかの場合には細胞への適用の前にペプチドで処理さ れる。 図２は、ＨＩＶ−１の異なる分離体に感染されていない細胞または感染されてい る細胞の免疫蛍光を示す一連の写真である。細胞は、ペプチドでの処理の前後に おいてウサギから得られた血清で処理される。 図３は、感染されていない細胞、または感染された細胞の免疫蛍光を示“す一連 の写真である。細胞は、ペプチドでの処理の前後において２つの異なったウサギ から得られた血清で処理される。 図４は、ＨＩＶ−２に感染されたまたは感染されていない細胞の免疫蛍光を示す 一連の写真である。細胞は、ペプチドでの処理の前後においてウサギから得られ た血清で処理されている。 第２の例は、適度に保存される配列Ｂと逆平行の形態でジスルフィド架橋された 高度に保存される配列Ａを組込むペプチドについての免疫学的研究に関するもの である。このペプチドは示されるように免疫原性であり、かつその感染性を中和 するた゛めに抗血清がＨＩＶ−１と反応することを示す。この例では添付の図面 の図５を参照する。 図５は、組織培養細胞の上方にある上澄み液に存在するウィルスのグラフであり 、’　Ｈ−ｄＴＴＰを組込む際のウィルス逆転写酵素の活性によって測定され、 ＲＰＭＩ／１０％ＦＣ３て１．２０に希釈される示された血清（またはリン酸塩 緩衝生理的食塩水、ＰＢＳ）を用いて、６０分間３７°Ｃで処理されたウィルス （’５０　ＴＣＩ　Ｄｓ。）で意図的に感染させた後さまざまな時間において測 定されたものである。 分析のために用いたＨ　Ｉ　ＶおよびＳＩＶ配列は、ロスアラモスデータベース （’Ｌｏｓ　ＡｌａｍｏＳＤａｔａ　Ｂａ５ｅ）からのものである。配列の比較 は、ニューシーラント、ダニ−ディン（Ｄｕｎｅｄｉｎ　）　、オタゴ大学（Ｏ ｔａｇＯＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）　、ＰＡストックウェル（Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ 　）からのＲＯＭＥＤ、バージョン３．３０を用′いてＶＡＸ８６’００コンピ ュータで行なった。 ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２分離物のエンベロープ糖タンパク質配列の位置決定 は、保存度が異なるいくつかの部位を示した。しかしながら、ＳＩＶ配列に対し ても比較を行なうとこれらのほとんとは保存されておらず、重要なサイズの単一 の領域のみか保存された。これは、第１の超可変（Ｖｌ）ループ（９）の直前に おいてｇｐ＋２０で起こる。保存は表２に示される。ウンデカペプチドはＨＩＶ のすへての分離物において絶対的に保存され、ＳＩＶにおける変化はかなり保存 性かあり、はとんどの分離物ではＴがＳに、かつＶが１に変化するたけである（ 他の点において高度に分岐したアフリカマンドリル分離物ＧＢＩにおいてはＬが ■に、ＴがＮに、およびＬかＹに変化する）。 １１アミノ酸の配列はＨＩＶおよびＳＩＶに独特のよってあり、ＥＭＢＯおよび スイスプロット（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ　）配列データベースのサーチの際に５つ を上回る隣接した残基（またはギャップを許容する６残基）の一致は見出されな い。他の点において高度に可変であるｇｐ１２０のこの部位の制限された配列の 変化は、これかＨＩＶの生存能力に必須であるかもしれず、したがって大きく変 化することはできず、なお感染性の後代ピリオンを維持することを示唆している 。 配列の位置決定はまた、第２の超可変（■２）ループ（９）直後の、第１の独特 に保存された部位（１４）における両方のンステイン残基に対してジスルフィド 架橋した第２の部位の高度の保存を示し、この保存は表３に示される。 保存はジスルフィド架橋を形成するシスティン残基間で最大てあり、各ＨＩＶタ イプは、極めて高い保存性を持ってのみ突然変異し、ＳＩＶ分離物か一方または 他方のＨＩＶタイプに類似する。このことはさらに、逆平行の架橋ペプチドか、 ウィルスの生存能力にとって必須であるｇｐ１２０内の構造を形成することを示 唆している。 例１ この分析に基づいて、本発明の高度に保存される配列に基づく合成ペプチドを用 いて実験を行なった。 すべての化学物質は分析グレードのものであり、言及しない限りさらなる精製を 行なわないで用いた。 ペプチド合成 配列ＫＰＣＶＫＬＴＰＬＣＶＴＬＹ　（Ｓｅｇ、［ｄ、Ｎｏ、４　）を存するペ プチドを自動合成機（Ｌ　Ｋ　Ｂバイオリンクス（Ｂｉｏ１ｙｉ＋ｘ　）　）を 用いてＦｍｏｃ連続フロー固相合成によって合成した。２．３−ジヒドロ−３− ヒドロキシ−４−オキソ−ベンゾトリアジンのエステルか好ましいＴｈｒを除い ては、Ｆｍｏｃアミノ酸ペンタフルオロフェニルエステルをアシル化種として用 いた。キーゼルグールに支持され、ヒドロキシメチルフエノキソ酢酸結合により 機能的にされたポリジメチル−アクリルアミドを、内部標準アミノ酸とされるノ ルロイシンとともに（１８，１９）固相支持体として用いた。 Ｃｙｓの側鎖上の酸に安定なＡｃｍ　（アセタミドメチル）以外は、ｔｅｒｔ− ブチル基側鎖保護基の同時開裂を引起こすトリフルオロ酢酸／フェノールｌ／　 ｌ−リエチルシラン（５００ｍｇのペプチド−樹脂アセンブリに対して２３ｍ１ ／Ｉ　ｇ／１ｍ１）を用いて樹脂からペプチドを分離した。樹脂をろ過によって 除去し、少量のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いて洗浄した。減圧下でのロー タリーエバポレーションによって、合わされたＴＦＡろ液から溶媒を除去した。 油状の残渣はＯ１％ａｑ、（水性）ＴＦＡ（２０ｍｌ）に溶解し、ジエチルエー テル（５Ｘ２０ｍｌ）で抽出し、凍結乾燥によって合わされた水相から溶媒を除 去して、白色の粉末（２０，９ｕｍｏｌ、７６％収率）を生成した。 合成後ＨＰＬＣによってペプチドを分析すると、少な（とも９８％の純度である ことがわかったため、それ以上精製することなくウサギの免疫処置のためＫＬＨ に対する結合に用いた。 抗血清の生産 ペプチドを約３０倍モル過剰で、本質的にはバシリおよびユティガー（Ｂａｓｓ ｉｒｉ　ａｎｄ　Ｕｔｉｇｅｒ）のプロトコル（２０）によって、これをキバー ステイス（に１ｂｅｒｓｔｉｓ　）ら（２１）に従って修飾して、ＫＬＨに結合 させた。我々はできるだけ元のタンパク質に近い条件でペプチドを提供すること に特に関心があるため、Ｃｙｓ残基をＳ−アセタミドメチル誘導体として残し、 これがジスルフィド結合の約半分に対して選択され、Ｌｙｓ残基のイプシロン− アミノ基を、ヒドロキシル基に転換しないように、結合反応の間、結合に先立っ てｐＨ９，０の２．３−ジメチルマレイン酸無水物（１０倍モル過剰）を用いた 修飾によって保護し、その後８時間にわたってｐＨ６，５，２０℃で脱保護した （２２）。 ３匹のニューシーラント・ホワイト・ラビット（Ｐｉｎｇ、ＰｏｎｇおよびＰａ ｎｇとして知られている）（英国ローズミールラビット社（Ｒｏｓｅｍｅａｌ　 Ｒａｂｂｉｔｓ　Ｌｔｄ、　）からの通常通りに繁殖されたもの）を、フロイン ト完全アジュバントにおける０、６ｍｇペプチド当量で、複数回の皮下注射によ って免疫処置し、その後不完全フロインドアジュバント中の０゜３ｍｇペプチド 当量で２回皮下的に刺激を与えた。免疫処置前、および免疫処置後の血液サンプ ルを最終免疫の血液とともに採取し、サンプルを室温で凝固させることによって 血清を調製した。 免疫応答をＥＬＩＳＡによってマイクロタイター・プレートのウェルに結合した ペプチドに対してモニタし、その後これらをウシ血清アルブミンでブロックした 。第２の抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（ＤＡＫ ＯＬｉｄ、　）を用い、基質としてｌ、２−フェニレンジアミン、ジヒドロクロ リド（ＤＡＫＯＬｔｄ、　）を用いた。 ウサギの免疫処置前の血清および免疫処理後の血清のＥＬＩＳＡは、スカシガイ のヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合して与えられると、３匹のウサギすべてが免疫 原としてペプチドに応答を表わしたことを示した（表４）。１：６４００または １　：　３２００の希釈において、最後に採血したものでは数値が高く（免疫処 置前の血清と比較して４倍に等しいか、またはそれを上回る）　、ＫＬＨに対す る抱合体として与えられるとペプチドが免疫原となったことを示唆している。　 。 ＨＩＶ感染細胞に対する抗血清の結合に関する免疫蛍光研ウサギ血清中の抗体の 本来のｇｐ１２０への結合について、共焦点免疫蛍光顕微鏡（２３）であるバイ オラ・ノド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　）　ＭＲＣ６００共焦点顕微鏡を用いてアッセイ を行ない、ウサギの抗体を示す第２の抗体としてフルオレセインイソチオシアネ −１−（ＦＩＴＣ）標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　 Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　）を用いた。本来のｇｐ１２０に対する 正のコントロールであるウサギの抗血清は、ナショナル・インステイチュート（ Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）のロッド・ダニエル（Ｒｏｄ　Ｄａｎ ｉｅｌ）博士からロンドンのメディカル・リサーチ（ＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａ ｒｃｈ）社に贈られたものであった。テスト細胞はヒトＴリンパ芽球細胞株Ｃ８ １６６であり、これはヒトＴ細胞リンパ性ウィルスタイプ−１（２４）により非 生産的に感染される。これはＲＰＭＩ／１０％ウシ胎児血清において成長させ、 ＨＩＶ−Ｉ　ＢＲＵ（２５）、ＨＩＶ−Ｉ　５Ｆ２（２６）て感染させるか、ま たはコントロールとして感染させないようにした。細胞（１５ｕｌにおいて１０ ９をポリーＬ−リシン処理された顕微鏡スライドのウェルに移し、室温で３０分 間結合させ、その後４％グルタルアルデヒドで固定させ、０．１％トリトンＸ１ ００で処理して、プラズマ膜を透過性にした。ＰＢＳ中の適切な希釈の抗血清か 添加され、細胞を洗浄する前に、室温て６０分間結合させた。フルオレセイン標 識第２抗体を（供給業者が推奨する希釈で）添加し、ＰＢＳにおいて洗浄する前 に６０分間結合させた。次にスライドを共焦点顕微鏡で調べ、抗体の結合を検出 し、適当な標本を撮影した。 ＨＩＶ−１１□１８のｇｐ１２０を発現する細胞に対する免疫血清の結合が、免 疫処置前の血清およびコントロールとしての感染されていない細胞の両方を用い て測定された。 １匹のウサギ（Ｐａｎｇ）に対する典型的な視野が図１に示される。この図の上 方のパネルでは、細胞にはｇｐ１２０を発現していないもの（ａ、ｂおよびｆ） と、発現しているもの（その他の写真すべて）があり、免疫処置前の血清（ａお よびｅ）で処理されたものと免疫血清で処理されたもの（その他の写真すべて） がある。この図の下方のパネルでは、すべての細胞がｇｐ１２０を発現し、１匹 のウサギ（ｐａｎｇ）からの免疫血清で、ペプチドなしで処理されたもの（ｉお よびｍ）、ペプチド八を用いたインキュベーションの後処理されたもの（ｊおよ びｎ）、または別のウサギ（Ｐｉｎｇ　）からペプチドなして処理されたもの（ ｋおよび０）、ペプチド八を用いたインキュベーションの後処理されたもの（ｌ およびｐ）かある。 図１は免疫血清とｇ１２０発現細胞との結合のみが大きく、一方非発現細胞と血 清、または感染された細胞と免疫処置前の血清については結合度が低いことを示 している。 ｇｐ１２０発現細胞に対する免疫血清の結合の分布は、発現細胞には結合するが 非発現細胞には結合しない、ｇｐ１２０て免疫処置されたウサギからのコントロ ールの血清について示されるものと非常に類似している。さらに、感染された細 胞に対する免疫血清の結合はペプチドによってブロックされ、つまりこれがｇｐ １２０上の特異的部位に対するものであることを示している。 感染細胞中のＨＩＶ誘導物質に対する免疫血清の結合は、免疫処置前の血清およ びコントロールとしての感染されていない細胞の両方を用いて測定された。ＨＩ Ｖ−ＢＲＵを用いての１匹のウサギ（Ｐｉｎｇ）に対する典型的な視野が図２に 示される。この図において、細胞は感染されていない（ａ、ｂ、ｅおよびｆ）か 、またはＨＩＶ−Ｉ　ＢＲＵで感染されている（Ｃおよびｄ）もしくはＳＦ２で 感染されており（ｇおよびｈ）、一方血清は免疫処置前（ａ、Ｃ。 ｅおよびｇ）のものと免疫（ｂ、　ｄ、ｆおよびｈ）のものかある。バーは２５ ｕｍを表わす。 図２は、免疫血清と感染細胞とのみか大きく結合し、血清と感染されていない細 胞、または免疫処置前の血清と感染細胞とては結合度か低いことを示している。 感染されていない細胞に対する免疫血清の結合の分布は、感染細胞には結合する か感染されていない細胞には結合しない、ｇｐ１２０て免疫処置されたウサギか らのコントロールの血清について示されるものと類似している。ＨＩ’Ｖ−Ｉ　 ＳＦ２て感染された細胞を用いてこれらの実験を繰返すと、非常に類似した結果 （図１のｇおよびｈ）を示し、反応が使用するＨＩＶ株に依存しないことを確か にした。 ＨＩＶ−Ｉ　ＳＦ２および別の２匹のウサギ（ＰｏｎｇおよびＰａｎｇ）からの 血清を用いて行なった同様のテストの結果か図３に示される。図３ａは、どちら も感染された細胞を用いてＰｏｎｇからの免疫処置前の血清（左上）または免疫 血清（残りの写真）を用いた結果を示し、図３ｂは、Ｐａｎｇからの免疫血清を 用いて、感染されていない細胞（左上）または感染された細胞（残りの写真）を 用いた結果を示している。バーは２５ｕｍを表わす。 ウサギＰａｎｇからの血清でも、ＨＩＶ−Ｉ　ＢＲＵまたはＳＦ２で感染された 細胞に対して同じような結合が認められた（図３ａ）。第３のウサギ（Ｐａｎｇ ）もやはり、その高度免疫血清の結合を示したが、この場合には免疫処置前の血 清もＨＩＶ−Ｉ　ＢＲＵで感染された細胞に結合したため、この応答については 結論が得られなかった。しかしなから、ＨＩＶ−Ｉ　ＳＦ　２で感染された細胞 は、免疫処置前の血清および免疫血清（図３ｂ）の両方について、他のウサギと 非常に類似した結果を示し、このウィルス株では、免疫処置前の血清は結合せず 、つまり結合が免疫処置の結果として生じることが示された。 図４は１匹のウサギ（Ｐｏｎｇ）からの血清のＨＩＶ−２で感染された細胞への 結合を示す。細胞は感染されていない（ａおよびｂ）か、またはＨＩｖ−２ＣＡ Ｍ！で感染されており、免疫処置前の血清（ａおよびＣ）または免疫血清（ｂお よびｄ）で処理した。やはり結合は感染細胞に対する免疫血ｉｎのみに見られた 。 これらの結果は、提供された形態、すなわちスカシガイのヘモシアニンに結合し 、ジスルフィド架橋を模した配置におけるシスティン残基およびリシン残基のイ プシロンアミノ基が維持された状態でのｇｐ１２０の高度（こ保存さ第１た配列 が、テストした３匹のウサギにつし１て皇女子な免疫応答を与えたことを示して いる。結果として生じる１几血清（よ、ＨＩＶ−２、およびＨＩＶ−１のし１く つ力１の株力為らの本来のｇｐ＋２０に結合する。 エビｌ−−ブの表面接近が可能であるこの保存（よ、このペプチドか元のタンパ ク質においである機台ヒ０りな役割を有し１ｒＦることを示唆している。可能な 役割の１つ（よ、よく牛！徴付けられたＣＤ４に付加的な受容体への結合であろ う。 五 ｇｐ＋２０における天然由来の架橋配列（こ基づし１て、Ｗｌｌのペプチド（Ｂ ｊＡペプチド）にジスルフィド′架橋した本発明の保存配列を含むペプチド（Ａ 鎖ペプチド°）を用０て、さらに実験を行なった。 Ａ　ｊｌ’ｊペプチドおよびＢ鎖ペプチドの配列（架橋も示す）は以下のとおり である。 （Ｓｅｑ、Ｉｄ、Ｎｏ、５１ 本発明の配列ＡおよびＢに基づいてジスルフィド架橋ペプチドを用いた実験をさ らに行なった。 ペプチド合成 配列ＤＱＳＬＫＰＣＶＫＬＴＰＬＣＶＴＬＹ　（Ａ鎖）（Ｓｅｇ、　ｌｄ、Ｎｏ 、　６　）およびＬ　ＩＮＣＮＲ３ＡＩＫＥＳＣＰＫＶＳＦ　（Ｂ鎖）　（Ｓｅ ｇ、Ｉｄ、Ｎｏ、５　）を有するペプチドを例１て述へたように合成したが、こ こではＡ鎖のシスティン７についてＡｃｍおよびシスティン１４についてトリチ ル、ならびにＢ鎖のシスティン４についてトリチルおよびシスティン１３につい てＡｃｍによりシスティン残基を保護した。トリチル基を各ペプチドからアシド リシス（酸分解）によって除去し、Ａ鎖において結果として生じるシスティンは ２−ジピリジルジスルフィドと反応し、ゲルろ過して過剰な試薬を除去した。活 性化されたペプチドを次に１゜５倍過剰Ｂ鎖と反応させ、単独にジスルフィド架 橋されるペプチドをワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ　）　ＣＭ　５２陽イオン交換 樹脂で精製した。 メタノール中ＩＯ当量の１２との反応によって第２のジスルフィド架橋が特異的 に形成された。最後にペプチドをゲルろ過によって精製した。 抗血清の生産 ジスルフィド架橋ペプチドを、リシン残基に対する同じ保護を用いて、例１て述 へたのと全く同じようにＫ　Ｌ　Ｈに対して結合させた。２匹のウサギ（Ｔｒｉ ｓｔａｎおよびに５ｎｉｇＭａｒｋｅ　）をフロイント完全アジュバントにおけ るＫＬＨ抱合体の皮下注射によって免疫処置し、フロイント不完全アジュバント 中の同じ抱合体で１回刺激を与えた。その後の刺激はフロイント不完全アジュバ ントにおけるペプチドだけで行なった。 マイクロタイター・プレートのストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ）被覆されたウェルに結合した、ビオチニル化ペプチドに対してＥＬＩＳＡによ って免疫応答を分析した。 展開試薬は例１と同しものであった。 ウサギの免疫処置前の血清および免疫処置後の血清のＥＬＩＳＡは、上述のよう に与えられると、双方のウサギとも免疫原としてのペプチドに応答を表わすこと を示した（表５）。最終的に採血したものでは、Ｉ：１６０００の希釈において 数値が高い（免疫処置前の血清と比較して１０倍を上回る）。 抗血清によるウィルス中和の研究 ＨＩＶ−ｉ８．、のサンプル（５０組織培養感染投与量（ＴＣＩＤａｏ）　）を 、３７℃で６０分間、ＨＩＶ　１ｉ＊−からのｇｐ＋２０で免疫処置したウサギ からの血清もしくはコントロールとしてのＰＢＳと、または１匹のウサギ（Ｔｒ ｉｓｔａｎ　）からの免疫処置前の血清もしくは免疫血清の１２０希釈とインキ ュベートした。次に処理されたウィルスをＣ８１６６組織培養細胞を感染させる ために用い、感染の過程は標準的な方法に従い、鋳型としてポリ−Ａを、および プライマーとしてオリゴ−ｄＴを用いての’Ｈ−ｄＴＴＰの組込後に、トリトン Ｘ１００によって放出される逆転写酵素活性によって細胞の上清にあるウィルス を測定する。 図５は、ＰＢＳのコントロールとインキュベートしたウィルスでの感染後では７ 日目から１２２日目間に上演のウィルスが約１０００倍に増える一方で、ｇｐ１ ２０に対する抗血清を用いたウィルスのインキュベーションはいかなる感染の徴 候も妨げることを示している。免疫処置前の血清は感染に影響を及はさなかった が、免疫血清は抗ｇｐ１２０コントロール血清と同様に感染を防ぐ効果があった 。 上述の方法による本発明のジスルフィド架橋ペプチドでの免疫処置は、したがっ てウィルスの感染力を中和する血清中の抗体の生成をもたらした。さらに、免疫 原におけるＢ鎖の配列は、ＨＩＶ−１，。における当量のペプチドと同してはな いが、やはり中和が見出されている。全体のペプチドがＨＩＶ−１またはＨＩＶ −２の変異体と反応する抗体をもたらすことを示唆しているが、上述の各々１つ のペプチド種で特定のＨＩＶタイプとよりよい反応が得られるかもしれない。 アミノ１１Ｇ　し会う Ｔミノ内賃−３文！ｐ略ｂ　（え中自已５／＜’）ン　Ｖａｌ　１７ １区 ３９　ＳＩＶ′　ｓ＋、ｔｕ−ｓ４　Ｅ工　ｌ−４ｓｕＲ０＋木　＋Ｉ＾ＭＲ１ ｉＥ　Ｓｅｑ、；ｄ、ＮＯ，ε１４コＳＩＶムＱｌ講３Ｆ４−５−−ＩＫＬＩＳ すＶＥｌｌＫＭＳ（ＱＳｅｑ、二二、Ｊｉｏ、９１」Ｌユ 引出、を小木： １、　ＲａＬｎｅｒ、Ｌ、Ｇａ１ｌｏ、ＲＣ＆％４ｏｎｇ−５Ｌａａｌ、Ｆ　ｆ ＋９８５１　Ｎａｔｕｒｅ［Ｌｏｎｄ、ｌ　３１３，６３６−６３７゜２、　Ｃ １ａｖｅｌ、Ｆ、　Ｇｕｙａｄｅｒ、　Ｍ、　Ｇｕｅｔａｒｄ、　Ｄｒ　５ａｌ ｌｅ、　ＭＩＭｏｎｔａｑｎｉｅｒ、Ｌ　＆　八１ｉｚｏｎ、Ｍ　ｆ＋９Ｂ６１ 　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ、ｌ　３２４．　６９＋−３、Ｈａｈｎ、Ｂ　Ｈ， Ｓｈａｗ、　Ｇ　ＩＬ　Ｔａｙｌｏｒ、　Ｍ　Ｅ、　Ｒｅｄｆｉｅｌｄ、ＲＲｅ Ｍａｒｋｈａｒｎ、Ｐ　Ｄ、５ａＬａｈｕｄｄｉｎ、Ｓ　Ｚ、Ｗｏｎｇ−５ｔａ ａｌ、Ｆ、Ｇａ１ｌｏ、ＲＣ。 Ｐａｒｋｓ、ＥＳ＆　ＰａｒｋＳＩ　Ｗ　Ｐ　＋１９８６１５ｃｉｅｎｃｅ　＋ Ｗａｓｈ、ｌ　２３２１　＋５４８−＋５５３゜ ４、　Ｓａａｇ、Ｍ　Ｓ、日ａｈｎ、Ｂ　Ｈ，Ｇｉｂｂｏｎｓ、Ｊ、Ｌｉｔ　Ｙ 、Ｐａｒｋｓ、Ｅ　Ｓ。 Ｐａｒｋｓ、　Ｗ　Ｐ　＆　Ｓｈａｗ、　Ｇ　Ｍ　［９８Ｂ１　Ｎａｔｕｒｅ　 （Ｌｏｎｄ、）　３３４．４４０−５．　Ｄａｎｉｅｌ、Ｍ　Ｄ、Ｌｅｔｖｉｎ 、Ｎ　Ｌ、Ｋｉｎｇ、８％４　Ｋａｎｎａｇｉ、５１Ｓｅｈｑａｌ、　Ｐ　Ｋ、 　Ｈｕｎｔ、　ＲＤ、　Ｋａｎｋｉ、　Ｐ　Ｊ、　Ｅｓ５ｅｘ、　Ｍ　＆　Ｄｅ ｓｒｏｇｉｅｒｓ。 Ｃｉ＋９８５１５ｃｉｅｎｃｅ　（Ｗａｓｈ、）　２２Ｂ、＋２０１−１２０４ ゜６　、Ｆ　ｒ　ａ　ｎ　Ｃｈ　１ｎ　Ｌ　ｒ　Ｇ　ｒ　Ｇ　ｕ　ｒ　ｑ　０１ ．　Ｃｒ　Ｇ　ｕ　Ｏ＊　＋（−Ｇ　ｒ　Ｇ　ａ　１１０　＊@ＲＣｔ Ｃｏｌｌａｔｉ、Ｅ＋　Ｆａｒｇｎｏｌｉ、Ｋ　Ａ、■ａｌｌ、Ｌ　Ｆ、Ｗｏｎ ｇ−５ｔａａｌ、Ｆ　＆Ｒｅ１ｔｚ、　Ｍ　Ｓ　Ｊ　Ｎ９８７１　Ｎａｔｕｒｅ 　ｆＬｏｎｄ、１　３２８．５３９−５４３゜７、　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｌ、 Ｌｒ　Ｇｕｙａｄｅｒ、ＭＩ　Ａ１１ｚｏｎ、Ｍｔ　Ｄａｎｚｅｌ、Ｍ　ＤｒＤ ｅＲｏｓｉｅｒｓ、ＲＣ，Ｔｉｏｌｌａｉｓ、Ｐ　＆　５ｏｎｉｑｏ、Ｐ　（１ ９８７１ＮａｔｕｒｅｆＬｏｎｄ、ｌ　３２Ｂ、５４３−５４７゜８、５ｊａｒ ｃｉｃｈ＋　Ｂ　Ｒ，）Ｉａｈｎ、Ｂ　）Ｉ、Ｓｈａｗ、Ｇ　Ｍ、ＭｃＮｅｅｌ ｙ、Ｐ　ＤｒＭｏｄｒｏｗ、Ｓ、　Ｗｏｌｆ、Ｈ，Ｐａｒｋｓ、Ｅ　Ｓ、Ｐａｒ ｋｓ、　Ｗ　Ｐ、　Ｊｏｓｅｐｈｓ、Ｓ　Ｆ。 Ｇａ１ｌｏ、　ＲＣ＆　Ｗｏｎｑ−５ｔａａｌ、Ｆ　Ｎ９８６１　Ｃｅ１ｌ　４ ５．６３７−６４８゜９、　Ｍｏｄｒｏｗ、　Ｓｒ　Ｈａｈｎ＋　Ｂ　Ｈ，Ｓｈ ａｗ、　Ｇ　Ｍ、　Ｇａ１ｌｏ、　ＲＣ，Ｗｏｎｇ　−５ｔａａｌ、Ｆ　ｔ、Ｗ ｏｌｆ、Ｉ（ｆ＋９８７１　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ、６１．　５７０−５７８゜１０、 Ｒ＊５ｃｈｅ、Ｊ　Ｒ，Ｊａｖａｈｅｒｉａｎ、に、ＭｃＤａｎａｌ、ＣＩ　Ｐ ｅｔｒｏｌ　Ｊ。 Ｌｙｎｎｒ　Ｄ　ＬＴ　Ｇｌ’Ｌｍａｌｌａ＋　Ｒｒ　Ｌｉ１ｎ９１０１Ｓ＋　 Ａ、Ｇａ１ｌｏ、ＲＣｒ　Ａｃｏｔｈｕｒ、ＬＯ，Ｆｉｓｃｈｉｎｇｅｒ、Ｐ　 Ｊ、Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ、Ｄ　Ｐ、Ｐｕｔｎｅｙ、Ｓ　Ｄ　＆Ｍａｔｔｈｅｗｓ 、Ｔ　Ｊ　Ｎ９ＢＢ１　Ｐｒｏｃ、Ｎａｐ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪｓＡ　８５ ．　３＋９８−３２０２゜ １１−　Ｋｕｈｎｅｌ、ｏ、ｖｏｎ　ＢｒＬｅＳｅｎｒ　ＨＨＤＬｅｔｒｉＣ１ ’ｌ＋　ｕ、Ａｄａｍｓｋｉ、ＭＩＭｉＸＩ　ＤＩ　Ｂｉｅｓｅｒｔ、ＬＩ　Ｋ ｒｅｕｔｚ、Ｒ，ＩｍｍｅＬｍａｎｎ、Ａ、Ｈｅｎｃｏ、Ｋ。 Ｍｅｉｃｈｓｎｅｒ、Ｃ，Ａｎｄｒｅｅｓｅｎ、Ｒ，Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ、Ｈ ＆　Ｒｕｂｓａｍｅｎ−Ｗａｉｇｍａｎｎ、’　Ｈｆ＋９８９１　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ＳｃＬ、　ＩＪＳＡ　８Ｌ　２３８３−２３８７゜ ＋２．　Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、）Ｉ、）ｌａｓｅｇａｗａ、八、Ｍａｋｉ、Ｎ、 Ｆｕｋａｓａｗａ、Ｍ＋１’１Ｌｕｒａ＋　ＴＴ　５Ｐｅｌｄｅｌ＋　Ｓｒ　Ｃ ｏｏｐｅｒ、ＲＷｔ　Ｍｏｔ’１ｙａｍａｌ　Ｅ　Ｎｔ＋３．　ＤａＶｉＳ、Ｄ 、５ｔｅｐｈｅｎＳＩ　Ｄ　Ｍ、Ｗｉｌｌｅｒｓ、Ｃ−ＬａＣｈｍａｎｎ、Ｐ　 Ｊ［１９９０１Ｊ　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、７１．２８８９−２８９８゜１４、Ｌ ｅｏｎａｒｃＬ　ＣＬ　５ｐｅｌｌｒｎａｎ、Ｍ　Ｗ、Ｒｉｄｄｌｅ＋　ＬＩ　 Ｆｌａｒｒｉｓ、Ｒ、ＬＴｈｏｒｎａｓ、　Ｊ　Ｎ　ａｎｄ　Ｇｒｅｇｏｒｙ、 　Ｔ　Ｊ　（１９９０１，Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６５＋＋０３７ ３−１０：１８２゜ １５、ＤａＶｌｅＳ＋　Ｊ　Ｓ　（１９８４１１ｎ　５ｐｅＣ０Ｐｅｒｘｏｄｉ ｃａｌ　ＲｅｐＳｌ　Ａｍ１ｎＯ−Ａｃ１ｄｓ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎｓ、Ｒａｙ、Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、Ｌｏｎｄｏｎ。 ＋６．　ＢｌｕｎｄｅＬｌ、Ｔ、５ｉｂａｎｄａ、Ｂ　Ｌ　ａｎｄ　Ｐｅａｒｌ 、Ｌ　（１９８３１Ｎａｔｕｒｅ１７、　５ｉｂａｎｄａ＋　Ｂ　Ｌ、　Ｈｅｒ ｎｍｉｎｇｓ、八Ｍ　ａｎｄ　Ｂｌｕｎｄｅｌｌ、　Ｔ　Ｌ　ｆ＋９８５１ｉｎ 　”Ａｓｐａｒｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　Ｔｈｅｉｒ　Ｉｎｈｉｂ、” 、Ｐｒｏｃ　ＦＥＢＳ　Ａｄｖ。 Ｃｏｕｒｓｅ　１９８４．　ｐｐ　３：＋９−３４９．　Ｅｄ、Ｋｏｓｔｋａ、 　Ｖ　Ｐｕｂｌ、ｂｙ　ｄｅＧｒｕｙＬｅｒ、Ｂｅｒｌｉｎ。 １８、Ａｔｈｅｒｔ、ｏｎ、Ｅ　＆　５ｈｅｐｐａｒｄ、ＲＣＮ９Ｅ１９＋　” ５ｏｌｉｄ　ＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ：八ｐｒａｃｔｉ ｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、”　ｆｏｘｆｏｒｄＬｌｎｉｖｅｒｓｉｔ−ｙ　Ｐ ｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄｌ。 ＋９．　Ｄｒｙｌａｎｄ、　Ａ　＆　５ｈｅｐｐａｒｄ、　ＲＣ（１９８８１Ｔ ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　４４Ｊ２０、Ｂａ５ｓｉｒｉ、　ＲＭ　＆　Ｉｊｔｉｇ ｅｒ、　ＲＤ　（１９７２１Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　９０゜７２２−７２ ７゜ ２Ｌ　Ｋｉｂｅｒｓｔｉｓ、Ｐ　Ａ、Ｐｅ５ｓｉ、Ａ、八ｔｈｅｒｅｏｎ、Ｅ、 Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｒ。 ｏｕｎｔｅｒ、Ｔ　＆　Ｚｉｍｍｅｒｎ、Ｄ　（１９８３１ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ 、ｕ；４ｔ　３５５−３６０２２、Ｂｕｔｌｅｒ、ＰＪＧ＆Ｈａｒｔｌｅｙ、Ｂ Ｓ＋１９７２１ｉｎ”Ｍｅ（ｈｏｄｓｉｎＥｚｙｍｏｌｏｑｙ”　ｆｅｄ、　Ｃ Ｗ　）ｆｉｒｓ　ａｎｄ　Ｓ　Ｎ　Ｔｉｍａｓｈｅｆｆｌ、　Ｖｏｌ、　２５＋ 　ＰＰ１９１−１９９　（八ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　 ａｎｄ　Ｌｏｎｄｏｎｌ。 ２３、ＷｈｉＬｅ、Ｊ　Ｇ、Ａｍｏｓ、Ｗ　Ｂ　ｔ、Ｆｏｒｄｈａｍ、Ｍ　Ｎ９ ８７１　Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．　１０５．　４１−４８゜ ２４、　５ａｌａｈｕｄｄｉｎ、Ｓ　Ｚ、Ｍａｒｋｈａｍ、ＰＤ、Ｗｏｎｇ−９ ｔａａｌ、Ｆ。 Ｆｒａｎｃｈｉｎｉ＋　Ｇｒ　Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎ、Ｖ　Ｓ　＆　Ｇａ１ ｌｏ、ＲＣｆ＋９ＥＤＩＶｉｒｏｌｏｑｙ二旦、　５１−６４゜２５、Ｗａｉｎ −Ｈｏｂｓｏｎ、ｓ、５ｏｎｉｑｏ、Ｐｒ　Ｄａｎｏｓ、Ｏ，Ｃｏ１ｅｒ　Ｓ　 ＆Ａ１１ｚｏｎ、Ｍ　Ｎ９Ｅ１５）Ｃｅｌｌ　４０．９−１７゜２６、　５ａｎ ｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｅ、Ｒｒ　ＰＯＷｅｌ’＋　Ｍ　Ｄｒ　Ｂａｒｒ、Ｐ 　Ｊｒ　Ｓｔ−ｅＬｍｅｒｒＫ　Ｓｒ　Ｓｔｅｍｐｌｅｎ、Ｍ　Ｈｒ　Ｂｒｏｗ ｎ−５ｈｉｍｅｒ、５Ｔ−ｒ　Ｇｅｅ、Ｗ　Ｊ　Ｒｅｎａｒｄ＋Ａ、　Ｒａｎｄ ｏｌｐｈ、　Ａ、　Ｌｅｖｙ、　ＪＡｔ　１Ｍｎａ、　Ｄ　＆　Ｌｕｃｉｗ、　 Ｐ　Ａ　ｆ＋９８５１由也り゛）　り入ト （１１１ＪＮＥｎＡＬ　ＩＮＦＯＲＨＡＴＩＯＮ：（ｉｌｌ　ＮＵＭｔｌＥＲＯ ｒ　５ＥＱＵ２ＮＣＥＳ：　１０ｔ２＋　５ｔＱｘ−ｏ　ｙｏ、１＋−ｍＷ３＋ ％４Ｇ−；（１１）伝翻へ勺ベプ　：ペゴ千ト１ （１川イＬｖＬ：　τｔし く１ｉｉｌ　７ン＋しンスー：　５トしくｖ）ブラリ：ｇｙ’ｈ９（ゴ　−　４ ンクーｊＩＶ（ｘｌ）　色び゛（の記載　８□６゜Ｉｎ　Ｎｏ：　１：Ｌｙｓ　 Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　ｅｙｅ　 Ｖａｌ工５１０ （２）江９．１し、Ｎら、２−ｔｚ（＠唱を積重り＝　。 （ｉｌ）ω←−（ブ　・ペア陣Ｆ“ （工１ｉ）（欠ｔｃ　、：ｒあし Ｊｉｉｉ）７’＞今をシス５二　匂ｉノ（ｖ）７う７ス〉ト７ベプ　：　インク −ｊｌＬ／（Ｘｌ）　批判／ｌ　ｔｃ［：　ｓｇｏ　ｓｏ　ＮＯ＋　２；＋２１ 　５ｔｈ、ＩＪ）、ｖｏ、３＋ｓ　ｐ５ｈ＊ｆｌｉＬ　：（ｉｉｌ　／ｆ＋−＋ 　’ｉｌ（プ　；ベプ斗Ｆ゛”’　＜’ｙ−＃　、：　ｒｌし ＋１ｌｉ１７オしン７−！　τＦし くｖ）７う恢斗９（ブ　：（＞ターカレｔｘｉ）　ＭｕＭｌｌＩＩＰｌｔｊｔｘ 　：　５ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　３：Ａｓｐ　！ｌｅｒ　Ｔｈｒ　＾１ａ １２）　、５ＥＱ、　ＩＪ）、υ・、仔Ｃ〕曲り４従：（出）　イ日Ｌ　：ｒｐ し く１ｉｉｌ　ＴＡ’セ、ンス−：　ｒＪ、Ｌ。 （Ｖ１７ラヴにシト２１ブ　＋　ＫＡ−ｊｒｖ＋ｘｉｌ　ｈ？ＪｓＱｔｑ　％こ 奴Ｉ　ＳＥｏ　１０　Ｈｏ白：Ｌｙ＋ｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｃｙａ　Ｌ ａｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｃｙａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　？ｙｒ１５ １゜ 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叶ｆｌ（Ｂ牧） 補正書の写しく翻訳力提出書（特許法第１８４条の７第１１１）、３平成　７年 　１月１３日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸配列、リシン−プロリン−システイン−バリン−リシン−ロイシン −トレオニン−プロリン−ロイシンーシステイン−バリン（Ｓｅｇ．Ｉｄ．Ｎｏ ．１）を有するペプチドを含む分子であって、各システイン残基はさらに別のシ ステイン残基にジスルフィド架橋するか、もしくはジスルフィド結合の部分を刺 激するため誘導化された分子、またはＨＩＶｅｎｖにおけるｇｐ１２０のエピト ープの免疫原的挙動を模する、そのようなペプチドの機能的に等価な変形体。
2. ２．各システイン残基がＳ−アセタミドメチル誘導体として誘導される、請求項 １に記載の分子。
3. ３．さらに別のペプチド配列に架橋される、請求項１に記載の分子。
4. ４．以下のように架橋される、請求項３に記載の分子。 ▲数式、化学式、表等があります▼
5. ５．該ペプチド配列またはそれぞれのペプチド配列が、同等な特性を有するアミ ノ酸で１つまたはそれ以上の個々のアミノ酸を置換することによって変更される 、請求項１ないし４のいずれか１つに記載の分子。
6. ６．該ペプチド配列またはそれぞれのペプチド配列が、１つまたはそれ以上の正 常なペプチド結合を等配電子的置換によって置き換えることにより修飾される、 請求項１ないし５のいずれか１つに記載の分子。
7. ７．該ペプチド配列またはそれぞれのペプチド配列が、ジスルフィド架橋された システイン残基の一方または両方の対をシステイン類似体で置換することによっ て修飾される、請求項１ないし６のいずれか１つに記載の分子。
8. ８．該ペプチド配列またはそれぞれのペプチド配列が、１つまたはそれ以上のア ミノ酸を「逆−倒置（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）」アミノ酸で置換すること によって修飾される、請求項１ないし７のいずれかに１つに記載の分子。
9. ９．該ペプチド配列またはそれぞれのペプチド配列が、１つまたはそれ以上の必 須でないアミノ酸を欠失させることによって装飾される、請求項１ないし８のい ずれかに１つに記載の分子。
10. １０．該ペプチド配列またはそれぞれのペプチド配列が、機能に大きく影響を及 ぼさない１つまたはそれ以上の付加的なアミノ酸を含むことによって修飾される 、請求項１ないし９のいずれか１つに記載の分子。
11. １１．先行する請求項のいずれか１つに記載のペプチド分子をコードするＤＮＡ 分子。
12. １２．適切な発現ベクターに組込まれる、請求項１１に記載の分子。
13. １３．請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の分子を含む、ＡＩＤＳおよび ＡＩＤＳ関連の症状に対するワクチン。
14. １４．請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の分子が担体分子に結合される 、請求項１３に記載のワクチン。
15. １５．請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の分子が生ワクチンとして提供 される、請求項１３に記載のワクチン。
16. １６．請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の分子を効果的な量だけ投与す ることを含む、ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連の症状の予防または治療方法。
17. １７．１つまたはそれ以上の製薬的に許容されるアジュバント、担体および／ま たは賦形剤とともに、請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の分子を有効成 分として含む薬剤組成物。
18. １８．ＡＩＤＳまたはＡＩＤＳ関連の症状の予防的治療または療法に対する薬剤 調製のための、請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の分子の使用。
19. １９．請求項１ないし１０のいずれか１つに記載の分子に結合する、特に抗体、 抗体の抗原結合部位、またはその構造的な類似体である分子。
20. ２０．治療または診断の目的のための、請求項１ないし１０のいずれか１つに記 載の分子に結合する分子の使用。