JPH07509308A - ヘリコバクターピロリのｉｎｖｉｔｒｏ試験 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘリコバフタ−ピロリのｉｎ　ｖＨｒａ試験本発明は、哺乳動物におけるへりコ バフタ−ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｌｃ＋　ｐｙｌｏｒｉ）の感染をｉｎ　ｖ ｉｓａで迅速に検出することができる方法およびキットに関するものである。さ らに詳しくは、本発明は、粘液分泌物中のヘリコバフタ−ピロリ（１１，ｐｙｌ ｏ「ｉ）に対するＩｇＧ抗体の検出方法を包含するものであり、したがって、哺 乳動物において微生物による感染がその時点て存在する（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａ ｒｙ　１ｎｌｅｃ目Ｏｎ）かを検査する手段を提供するものである。

哺乳動物、特にヒトの腸内感染は、一般的な粘膜の免疫システムの活性化を通し て、唾液等の粘液分泌物における免疫反応を刺激する。この反応は、通常ＩｇＡ 抗体の存在によって特徴付けられるが、初期の段階では血清中の抗体反応に対応 することか多い。しかしながら、唾液等の分泌物中の免疫反応は、抗原（例えば 、細菌またはウィルス）が体内から除去された後に迅速に消失する。したがって 、粘液分泌物中に抗体か存在するということは、現行の感染（ｃｕｒｒｅｎｊ’ １ｎｆｅＣｆｉｏｎ）　、つまりその時点で１盛染している（Ｃｏｎｌｅｍｐｏ ｒａＢ　１ｎｆｅＣ１ｉｏｎ）ことを示している。例えば、微生物の感染の場合 には、粘液分泌物中に抗体（以降、分泌抗体（＋ｅｃ＋ｅｔｉｏｕｉ　ａｎｔｉ ｂｏｄｙ）　と称する）あるということは、腸内等の微生物その時点でコロニー を形成しているという状態を意味しており、このためその時点で感染しているか を検査するのに有用である。これに対して、血清抗体は、微生物か体内から除去 された後一定期間持続する。したがって、血清抗体試験が陽性であるということ は、過去および現在の両方で抗原に対して存在していることを示すため、臨床医 にとっては余り有用ではない。これに対して、分泌抗体試験が陽性であるという ことは、微生物による感染が存在することまたは微生物による感染がその時点に 存在すること（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）を示すもので ある。

哺乳動物の腸におけるヘリコバフタ−ピロリ（ｌｌｅｌｉｃｏｂａｃｌｅｒ　ｐ ｙｌｏｒｉ）　（カンピロバクタ−ピロリ（Ｃａｍｐ７１ｏｂａｃｆｅｔ　ｐｙ ｌｏｒｉ）としても知られている）の感染に関する調査の後、本発明が得られた 。ヘリコバフタ−ピロリ（Ｈ，ｐｙｌ。

ｒｉ）の感染の診断は、顕微鏡検査、胃粘膜の生検における微生物の培養若しく はウレアーゼの検出、尿素呼吸試験（Ｕｔｅａ　ｂｒｅａｔｈ　ｆｅａｔ）によ ってまたは血清ＥＬ　Ｉ　ＳＡにおける特異的な抗体の存在によってなされる。

ヘリコバフタ−ピロリ（Ｈ，ｐｙｌｏｒｉ）の感染は、胃粘膜の感染であり、胃 の分泌物中のＩｇＡ抗体反応を誘導すると考えられていた。

しかしながら、本発明以前の研究で、胃の分泌物中のへりコバフタ−ピロリに特 異的な抗体はＩｇＧクラスのものであり、考えられていたようなＩｇＡクラスの ものではないことか発見された。検出されても、非常に微量なＩｇＡ抗体しか検 出されない。したがって、ＡＵ−Ａ−９０６７６７６号は、へりコバフタ−ピロ リ抗原に特異的な粘液分泌物中のＩｇＧの検出に関するものであり、このため、 哺乳動物の」二足微生物による現行の感染、つまりその時点における感染を検査 する手段を提供するものである。相当する文献は、ウィツト（Ｗｉｌｌ）ら、フ ロンティアーズ　インムコサル　イムノロジー（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ　ｉｎ　Ｍ ｕｃｏｓａｌ　Ｉｍｍｕｎ。

１ｏｇｙｌ　、１巻、ページ６９３〜６９６　（１９９１年）である。

カンピロバクタ−ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｊｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ）が陽性 である患者の唾液におけるＩｇＧ抗体の存在は、アニュアル　ミーテインダス　 オブ　ザ　アメリカン　ガストロエンテｏロジカル　アソシエーション（Ａｎｎ ｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇｓ　。

ｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｇａｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓ ５ｏｃｉａｔｉｏｎ）において幾らか注目を浴びた。１９８９年の会報において 上記したような抗体の存在がチン（Ｃｚｉｎｎ）　らによって開示された後、ラ ーセンら（Ｌａｒｓｅｎ）らは、１９９１年５月の会報において唾液のＴｇＧｆ ｆｌは抗体による治療中の治療による応答（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｒｅｓｐ ｏｎｓｅ）の実用的な非侵襲マーカーとなる（ＬａｎｄｅｓＪらは、先の観察を 確認し、へりコバフタ−ピロリに対する唾液のＩｇＧの測定はヘリコバフタ−ピ ロリが陽性である患者、特に他の試験が使えない多くのまたは小児の人々を検出 するための簡単な、非侵襲試験であると考えた。

へりコバフタ−ピロリに関する唾液のＩｇＧを基礎とした診断試験か広く興味を もたれ、臨床上潜在力を有することは」二足より明らかである。何様にして、こ のような試験が信頼性がありかつ簡便でなければならないことも明白である。侵 襲を伴う技術は既知であり（例えば、ＵＳ−Ａ−４８８２２７１号、シャバーｆ ｓｃｈａｂｅｒｌ　ら、ジエー　クリン　マイクロパイオル（Ｊ、　ｃｌ　ｉｎ 、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　）　、２７（２）、ページ３２７〜３３０　（１９ ８９年）、ロッフエルド（Ｌｏｌｌｅｌｄ）　ら、ザ　ランセット（Ｔｈｅ　Ｌ ａｎｃｅｔ）、１９８９年５月２７０、ページ１１８２〜１１８５および工ヴア ンス（ＥｖａｎｓＪ　ら、ガストロエンテロロジ−（Ｇａｔｒｏｅｎｌｅｒｏｌ 。

ｇｙｌ、９６、ページ１００４〜１００８　（１９８９年））、確立されている （例えば、ウェスタン　オーストラリア、ペルス（Ｐｅｒｊｈ、　Ｗｅｓｔｅｒ ｎ　Ａｕｒｌｒａｌｉａ）のデルタ　ウェストリミテッド（Ｄｅｌｔａ　Ｗｅｓ ｔ　Ｌｔｄ）より市販されており、生検サンプルにおけるウレアーゼの存在を検 出するシーエルオーＭ テスト（商標）キット（ＣＬＯｋｉｔ）　）。非侵襲試験は、ＥＳＴ 許容され、使用されてきている侵襲試験の信頼性に匹敵するものでなければなら ない。

本発明は、へりコバフタ−ピロリに関する唾液を基礎とした（および池の粘液を 基礎とした）ＩｇＧ試験の信頼性を向上させることに関するものである。試験方 法の免疫特異性か、ヘリコバフタ−ピロリのある種の抗原を用いて、他の抗原は 用いずに粘液のＩｇＧを検出することによって向上できることが発見された。

本発明の第一の概念によると、抗原調製物が約２６５ｋＤａのへりコバフタ−ピ ロリ由来の成分からなり、約４４ＱｋＤａのヘリコバフタ−ピロリ由来の成分を 実質的に含まないことを特徴とする、抗原成分に特異的な粘液分泌物中のＩｇＧ 抗体が複合体を形成するのに十分な時間および条件下で哺乳動物の粘液分泌物を へりコバフタ−ピロりの抗原調製物と接帥させ、複合体に複合体を検出するため の検出手段を施すことからなる方法である、哺乳動物におけるヘリコバフタ−ピ ロリによるその時点に存在する感染（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ　１ｎｆｅｃｔ ｉｏｎ）の検出方法を提供するものである。

したがって、本発明は、粘液分泌物中のＩｇＧ抗体をスクリーニングすることに よるへりコバフタ−ピロリの感染に関する効果的なｉｎ　ｖｉｔｒｏ検定法を提 供するものである。

約４４ＱｋＤａの成分が存在すると、患者によっては偽陽性が出てしまうことが あることは知られている。約２６５ｋＤａの抗原が存在しないと、偽陰性が生じ てしまう。

さらに、へりコバフタ−ピロリ由来の約３４ＱｋＤａの抗原が存在しないと、患 者によっては偽陰性が出てしまうことかある；したがって、約３４０ｋＤａの抗 原は存在することが非常に好ましい。必ずしも存在しなければならないことはな いが、存在する他のへりコバフタ−ピロリの抗原成分としては、約１６０ｋＤａ および約７０ｋＤａの分子量を有するものが挙げられる。

抗原成分は、ウェスタンブロッティング分析によって検出できる際には、本発明 の目的を達成するために存在する。

これに対して、上記手段によって検出できない場合には、抗原成分は存在しない 。ウェスタンブロッティング分析の一般的に使用される感度は２０μｇ　／　ｍ 　１のオーダーである。

本発明において用いられる抗原成分の分子量は、一般的な分子量測定方法が限ら れているため、必然的におおよその数値である。具体的に引用される分子量は、 ファストゲル（商標）　（ＰＩＩＡＳＴＧＥＬ”）の勾配８〜２５を用いたファ ストゲル（商標）　（ＰＩ（ＡＳＴＧＥＬＴＭ）及びファストシステム（商標） 　（ＰＦＩＡＳＴＳＹＳＴＥＭ”’）の商標名でファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）から販売されているネイティブな（ｎａＮＶｅ）ポリアクリルアミドゲル 電気泳動（ＰＡＧＥ）によって得られたものである。このシステムは、球状タン パク質に関して５０，０００から７５０，０００までの分子量範囲ではタンパク 質の移動距離と分子量の対数との間に直線的な関係がある。

ファルマンアｆＰｈａ　ｒｍａｃ　ｉａｌ　は、電気泳動用の計算キ・ノドにお いて高分子量用マーカーセットを販売している；このマーカーセットを本明細書 において用いられるゲルの計算に用いた。異なる人が行うことによってまたは同 じ人でも別の時に行うことによって若干異なる結果が得られることは当業者には 既知である。このため、本明細書において引用されるおおよその分子量値は±５ ％または±１０％の誤差で考えられなければならない。上記理由により、約２６ ５に、　Ｄ　ａの抗原は２５５〜２７５ｋＤａの抗原となる場合がある。

「抗原」という表現は最も広義で使用されており、全ヘリコハクター　ピロリ細 胞またはヘリコハクター　ピロリの均一の、均一に近い若しくは不均一の抽出物 を含むものであり、これらはすべて粘液分泌物中の特異的な抗体に結合すること が可能である。ただし、この際、約２６５ｋＤａ　（および好ましくは約３４０ ｋＤａ）のへりコバフタ−ピロリ由来の抗原が存在しており、約４４０１（Ｄ　 ａのヘリコハクター　ピロリ由来の抗原は実質的に存在していなし１８本発明に よる抗原成分としては、タンパク質、多糖若しくは脂質またはこれらの組合わせ か挙げられる。これらのうち、抗原は、タンパク質、リポ多糖または例えば、超 音波処理、加圧処理による破壊（ｐｒｅｓｓｕｒｅ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉ ｏｎ）、デタージエントを用いた抽出または分画によって調製されたヘリコハク ター　ピロリの細胞抽出物であることが好ましい。

多くの不要な成分は除去したまま、確実に必要な抗原を存在させるのに最もａ効 なｈ゛法の−っとしては、ヘリコハクター　ピロリ細胞の未精製抽出物（超音波 処理物等）にクロマトグラフィーを使用することがある。例えば、スーパーロー ズ（商標）　（ＳｔｌＰＥＲＯ５Ｅ　Ｔ町の６サイズの排除限界を６するカラム （６５ｉｘｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｏｌｕｍｎ）を用いた１タンパク質高速 液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）は、イオン交換クロマトグラフィーにかけ られた細胞の未精製超音波処理物を用いる際に特に有効である。他の方法は、当 業者が可能であると考えられる範囲内で使用できる。

相応して、望ましくない約４４０ｋＤａの抗原を確実に含ませない最も効果的な 方法の一つとしては、特にＦＰＬＣ等のクロマトグラフィーによる精製した後の 、へりコバフタ−ピロリ細胞の抽出物に凍結乾燥を使用することがある。凍結乾 燥は上記目的のために適当ないずれかの装置で行われる。実際に使用される設備 および条件は調製物の量によって変化する。凍結乾燥プロセスは使用される設備 の範囲内で実質的に最後まで行われることが好ましい。

本発明は、自然に生じた形態の抗原の使用およびこれらの合成（組換体等）の形 態及び免疫学的に活性を有する誘導体、類似体及び関連体をも含むものである。

したがって、本発明において用いられるａ効な抗原セットが、へりコバフタ−ピ ロリ細胞の調製物から選択的に得られた（ｓｊｒｉｐｄｏｗｎ）ものであっても または個々の成分若しくは成分の混合物から構築したもののいずれであってもよ いことは明らかである。

本発明の方法において、抗体は粘液分泌物中で検出される。「粘液分泌物」とは 、外気と連通ずる管、腔及び路、特に鼻、喉、気道、目、生殖路、尿路及び消化 器系の系統の細胞等の粘液を分泌する上皮細胞（つまり粘膜）からの分泌物を意 味する。好ましい実施態様においては、粘液分泌物は鼻の分泌物、痰または唾液 であり、特に唾液が好ましい。

唾液または池の粘液分泌物は、希釈されずにまたは適当な希釈剤（蒸留水等）で 希釈されて検査される。感受性が高いほど、希釈することが好ましい（採集器具 を用いる際には特に好ましい）。

抗原調製物は、簡便であるため、固体支持体に結合していることが好ましい。使 用される支持体としては、ニトロセルロース膜、カラスおよび重合体が挙げられ る。上記を目的として最も一般的に使用される重合体は、セルロース、ポリアク リルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンで あるが、本発明はこれらに制限されない。固体支持体は、ストリップ状、チュー ブ状、ヒ゛−ス状、ディスク状若しくはマイクロプレート状である、または免疫 検定を行うにあたって好ましい他の表面の形態を白°する。

本発明において使用されるへりコバフタ−ピロリの抗原成分は固体表面に凡打結 合または非凡Ｇ結合（「受動的に」）のいずれかで結合する。適当な結合方法は 既知であり、通常、架橋、共り結合または抗原の固体支持体への物理的吸収から 構成される。

感染は、粘液ザンプルにおけるＩｇＧ抗体とヘリコハクター　ピロリ抗原との複 合体の形成を検出することによる本発明の手段によって診断される。したがって 、検出手段の形態によっては、抗体−抗原複合体の存在（または、必要であれば 、量）を同定する必要がある。

検出手段は、リポータ−分子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）と複合体 を形成しくｃｏｎｊｕｇａｔｅ）　、さらに分泌物中に見られるへりコバフタ− ピロリに特異的な抗体のクラスの少なくとも一部分に特異的である、第２抗体で ある；この際、上記したように、この抗体はＩｇＧである。

［リポータ−分子（ｒｅｐｏｒｔｅｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）　Ｊとは、その化学 的性質によって、分析によって同定できる特性を有するまたは抗原が結合した抗 体の検出が可能であるような分析によって同定されるシグナルを備えた分子また は基である。

検出は定性または定量のいずれかである。上記タイプの検定における最も一般的 に用いられるリポータ−分子は、酵素、発蛍光団または放射性核種を含む分子（ すなわち、放射性同位元素）のいずれかである。酵素免疫検定（エンザイムイム ノアッセイ）の場合には、酵素は、通常グルタルアルデヒド若しくは過ヨウ素酸 によって、第２抗体と複合体を形成するする。しかしながら、容易に認識される ように、当業者が容易に使用できる複合体形成技術としては非常に？、１々な異 なる技術が存在している。一般的に使用される酵素としては、他の酵素のうち、 西洋ワサビのペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダー ゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。特殊な酵素と共に使用される基 質は、通常、相当する酵素による加水分解によって検出可能な色の変化を生じる ようなものが選択される。基質は、目的とする使用形態によって、可溶性または 不溶性となりうる。例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／ ニトロブルーテトラゾリウム（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄ ｏｌｙｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ／ｎｉ！ｒｏｂｌｕｅ　ｌｅｔｒａｘｏｌｉｕｍ ）はアルカリホスファターゼ複合体（ｃｏｎｉｕｇａ＋ｅ）と共に使用する際に 好ましい；ペルオキシダーゼ複合体では、１，２−フェニレンジアミン−５−ア ミノサリチル酸（１，２−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅづ−ａｍｉｎｏｓ ａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄ）、３．３゜５．５−テトラメチルベンジジン（３ ，３，５，５−１ｅｆｒａｍｅｌｈ７１ｂｅｎ５−１ｅｆｒａ、トリジンまたは ジアニンジンが一般的に使用される。」−記したような色素形成基質ではなく、 蛍光物質を生じる蛍光形成基質を使用してもよい。蛍光形成基質の例としては、 フルオレセインやローダミンが挙げられる。特殊な波長の光の照射によって活性 化される際には、蛍光色素で標識された抗体が光エネルギーを吸収し、分子内の 励起状態を誘導した後、光学顕微鏡で一般的に肉眼で検出可能である特徴のある 色の光を発光する。免疫蛍光技術およびＥＩＡ技術は両方とも当該分野において 確立されており、本方法では特に好ましい。しかしながら、放射性同位元素、化 学発光分子、及び生物発光分子および／または染料及び他の色素形成物質等の、 他のリポータ−分子を使用することも可能である。

特殊なリポータ−分子と複合体を形成した抗体の選択は、はとんどの場合、本発 明の目的とする使用および使用者によって決定される。さらに、試験はへりコハ クター　ピロリの感染が疑われるすべての哺乳動物に好ましいが、ヒトにおける ヘリコハクター　ピロリの感染を検査することが最も好ましく、有用である。

したがって、好ましい実施態様においては、本発明は、以下よりなるヒトにおけ るへりコハクター　ピロリによる感染を同時に（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ　１ ｎｆｅｃｔｉｏｎ）検出する方法を提供するものである： （ａ）抗原調製物における抗原に特異的な粘液分泌物中のＩｇＧ抗体が複合体を 形成するのに十分な時間および条件下で固体支持体上に固定されたへりコハクタ ー　ピロリの抗原調製物とヒトの粘液分泌物を接触させる段階であって、該抗原 調製物が約２６５ｋＤａ及び約３４０ｋＤａのヘリコハクター　ピロリ由来の成 分からなり、約４４０ｋＤａのへりコハクター　ピロリ由来の成分を実質的に含 まない段階： （ｂ）複合体をリポータ−分子て標識されへりコハクター　ピロリに特異的なＩ ｇＧ抗体に特異的である有効量の第２抗体と接触させる段階；および （Ｃ）リポータ−分子によって」二足ＩｇＧ抗体への第２抗体の結合を検出する 段階。

医療従事者、臨床医、看護婦゛またはさらには患者さえもが、凍結乾燥されＦＰ ＬＣで分画された可溶性超音波処理物等の、固定されたへりコハクター　ピロリ 抗原を有するニトロセルロースまたは他の適当な固相支持体膜のストリップを用 いてもよい。さらに、このストリップを、唾液中のＩｇＧクラスの強力なへりコ ハクター　ピロリに特異的な抗体か固定された抗原に結合できるのに十分な時間 および条件下で粘液分泌物と接触させる。唾液の代わりに、粘液分泌物の源は鼻 腔の分泌物または痰であってもよい。

次に、この試験ストリップを、粘液分泌物に接触させた直後、第２抗体が第１抗 体に結合するのに十分な時間および条件下でリポータ−分子と複合体形成した第 ２抗体と接触させるようにする。好ましくは、リポータ−分子は、アルカリホス ファターゼ等の酵素である。さらに、試験ストリップを洗浄し、リポータ−分子 用の基質（リポータ−分子かアルカリホスファターゼの場合には、５−ブロモ− ４＝クロロ−３−インドリルリン酸／ニトロブルーテトラゾリウム）をストリッ プと接触させる。基質をリポータ−分子と反応させることによって、検出可能な 変化を生じさせる。例えは、アルカリホスファターゼで５−ブロモ−４−クロロ −３−インドリルリン酸を加水分解することによって、紫色の生成物が生じる。

この全処理は、医療従事者の外科や医局で行われる。

臨床実験室等で、より定量的な酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ） が必要である際には、マイクロタイタートレー（ｍ　ｉ　ｃ　ｒ　ｏ目Ｉｒｅ　 ｔｒａｙ）のウェル中に固定されたヘリコハクター　ピロリ抗原を有するマイク ロタイタートレーを使用してもよい。この場合、唾液等の粘液分泌物のサンプル をウェルに加え、強力なへりコハクター　ピロリに特異的なＩｇＧ抗体を固定さ れている抗原に結合させる。

過剰な分泌物を洗浄除去し、リポータ−分子と複合体を形成したＩｇＧに特異的 な第２抗体を加え、抗原−抗体−複合体形成した抗体複合体を形成させる。この 複合体を上記したようにリポータ−分子に基質を添加し、例えば、可視シグナル を得ることによって検出され、さらに分光光度的にまたは他の手段によって定量 してもよい。

本発明は、代わりにイムノプロットシステム（ｉｍｍｕｎｏｂｌ。

Ｉ　ｔｙｓｌｅｍ）において用いられるものであってもまたはさらに上記システ ムにおいて用いられるものであってよい。このイムノプロットシステムは（例え ば、焦束の色の濃さおよび／またはクロマトグラフィーのストリ・ノブの移動距 離を測定することによって）定量化できるものである。

本発明は、特にニトロセルロースストリップの形態を有する際には、ヘリコハク ター　ピロリの現在市販されている検定法に比べて多くの利点を有する。粘液分 泌物、特に唾液をへりコハクター　ピロリ抗体の検定に使用することによって、 現行の感染（ｃｕｒｒｅｎｔ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）　またはその時点に存在す る感染（ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ）の診断が可能になり 、したがって、医療従事者が以下のことを行なうことが可能となる： ａ）腸の症状からへりコハクター　ピロリの感染を疑うことによって、さらなる 検査（侵襲法を含む）および／または治療（例えば、特異的な抗ヘリコバクター 　ピロリ物質の使用）に関する決定が可能となる。後者は、ヘリコハクター　ピ ロリに関連した非潰瘍性消化不良、胃炎、十二指腸潰瘍、胃潰瘍および関連した 及び他の症状に関して特に小便であると考えられる。

ｂ）医局、診療室または病院において簡便な非侵襲試験が初めて行えることによ って、消化性潰瘍を一度経験した患者の再発を早い段階で追跡できる。試験が陽 性であることによって再発性消化性潰瘍の初期の診断および予防または早目の治 療が可能となる。また、試験が陰性であることは、消化不良への診断アプローチ の分析において互恵的にｒ１用である。

さらに、本発明による試験によって、簡単な是非の答えがて、採血等を必要とし ない。数分で分かり、臨床医による検体の特殊な調製を伴わずに現像できる。粘 １１に分泌物（唾液等）をへりコハクター　ピロリに特異的な抗体に関する試験 に使用することが本発明の特徴的な長所である。

本発明の第二の概念によると、以下よりなる試験キットである、哺乳動物の粘液 分泌物におけるへりコハクターピロリを検出するための試験キットを提供する： （ａ）抗原調製物が約２６５ｋＤａ及び約３４０ｋＤａのへりコハクター　ピロ リ由来の成分からなり、約４４０ｋＤａのヘリコハクター　ピロリ由来の成分を 実質的に含まないものであることを特徴とする、固定されたへりコハクター　ピ ロリの抗原調製物を有する固体支持体；および（ｂ）該粘液分泌物中のＩｇＧが １つまたはそれ以上の抗原調製物の成分に結合するかどうかを検出するのに使用 する検出手段。

検出手段は、検出可能なシグナルを生成するまたは該シグナルが生じることが可 能であるリポータ−分子と複合体を形成する抗体である；この際、抗体は、感染 の疑いのある哺乳動物のＩｇＧ抗体に対して特異的である。好ましい実施態様に おいては、リポータ−分子は、生成物が反応体とは異なる検出形態を示す反応を 触媒することが可能な酵素である。このような場合においては、例えば酵素の生 成物とは色度特性の異なる、酵素に対する基質もまた一般的にキット中に存在す る。

したがって、好ましい実施態様においては、本発明は、隔室に分かれており、以 下よりなる試験キットである、ヒト等の哺乳動物の粘液分泌物におけるヘリコハ クター　ピロりに特異的なＩｇＧ抗体を検出するためのキットをも包念するもの である： （ａ）抗原調製物が約２６５ｋＤａ及び約３４０ｋＤａのへりコハクター　ピロ リ由来の成分からなり、約４４０ｋＤａのヘリコハクター　ピロリ由来の成分を 実質的に含まないものであることを特徴とする、固定されたヘリコハクター　ピ ロリの抗原調製物を有する固体支持体を含むように用いられる第一の隔室； （ｂ）抗体がＩｇＧ抗体に対して特異的である、シグナルを生成することができ るリポータ−分子と複合体を形成する抗体を含む第二の隔室：および （ｃ）リポータ−分子が酵素である際には、該酵素に対する基質をＳむ第三の隔 室。

このようなキットは、適当な粘液物質および／または１つまたはそれ以上の希釈 剤および／または緩衝液を入れるため等のさらなる隔室をも有するものであって もよい。また、キットは、適当な形態で販売するために梱包されていてもよい。

約−４４０ｋ　Ｄ　ａのへりコハクター　ピロリの抗原を含まない約２６５ｋＤ ａ及び約３４０ｋＤａの抗原の組み合わせは、本発明の第一の概念の方法を行う にあたって、さらには、本発明の第二の概念によるキットの調製をするにあたっ てｆ１用である。したがって、本発明の第三の概念によると、約２６５ｋＤａ及 び約３４０ｋＤａのへりコハクター　ピロリ由来の成分からなり、約４４０ｋＤ ａのヘリコ・・フタ−ピロリ由来の成分を実質的に自まないヘリコノくフタ−ピ ロリの抗原調製物を提供するものである。

このような抗原調製物は、前記したように、へりコハクター　ピロリ細胞の抽出 物を凍結乾燥し約４４０ｋＤａの抗原を除去することによって調製できる。した がって、本発明の第四の概念によると、ヘリコハクター　ピロリ細胞の抽出物を 凍結乾燥することからなる方法である、上記抗原調製物の調製方法を提供するも のである。凍結乾燥される抽出物は、未精製のへりコハクター　ピロリ抽出物の 大きさによる排除限界クロマトグラフィー（ｓｉｘｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎｃｈ ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）によって得られる約６７ｋＤａから約４４　Ｑ　ｋ 　Ｄ　ａの分画であることが好ましい。

本発明の各概念の他の好ましい態様は、他の概念と同様、必要により変更が加え られてもよい。

本発明を以下の実施例を参照にして詳細に説明するが、これらの実施例によって 本発明の概念が制限されることはない。

実施例１ 本実施例において、へりコハクター　ピロリの未精製超音波処理物を調製し、Ｆ ＰＬＣ分画を行い、凍結乾燥した。

ウェスタンブロッティング分析によって、約２６５及び３４０ｋＤａのタンパク 質が本発明の検定の免疫学的特異性において反応性のある因子であることか示さ れた。これらのクンバク質は、４４０ｋＤａのタンパク質が非常に混入している ものとは異なり、真に陽性なものにのみ反応性を示す。このタンパク質は凍結乾 燥によって除去されることから、感受性があると考えられる。

へりコバフタ−ピロリ抗原の調製 陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、遠心された超音波処理物 ｉ）へりコバフタ−ピロリの培養物をＰＢＳ中にチョコレート寒天平板培地（ｃ ｈｏｃｏｌａｔｅ　ａｇａｒ　ｐｌａｔｅ）より集める。

この細菌は、［トララブｆＴ＋ａｕｂ）　Ｊと称する野生株およびＮＣＴＣ１１ ６３７株の、２つの異なる培養物として成長する。

ｉｉ）細菌を１０，０００Ｘｇで５分間遠心することによってＰＢＳで３回洗浄 する。

１ｉｉ）洗浄された細菌を２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、ＣＦＵを４０５ｎｍにお ける分光光度計で読むことによって測定する。

ｉｖ）この懸濁液を５回超音波処理する（１処理は、６μで３０秒間処理した後 、６０秒間休むことにより構成される）。

■）超音波処理された１１機体を１０．ｏｏｏｘｇで１０分間遠心する。

Ｖｌ）」−清を回収し、０．４５μｍのフィルターで瀘過した後、０．２２μｎ １のフィルターで瀘過し、残留した細胞片を除去する。

ｖｉｉ）濾過後、タンパク質ｒａ度の４１り定（ｐｒｏｌｅｉｎ　ｅｓｌｉｍａ ｔｉｏｎ）を行う。

注意：超音波処理物をすぐに処理することができない時には、この方法が継続し て行えるときまでこの時点で一７０℃で凍結しておいてもよい。

ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）モノＱ（商標）　（Ｍｏｎｏ　Ｑ　ＴＭ）の陰イオン交換カラ ムは、５００．ｃｚｌの注入量に対して２０〜５０ｍｇタンパク質（つまり、超 音波処理物が１　ｍ　１当たり４０〜１００ｍｇのタンパク質までの量となる） を処理できる。

ｉｘ）その際、超音波処理物は、一般的に、全超音波処理物の処理に必要な注入 回数を減らすために、さらに、タンパク質濃度を許容濃度まで上昇させるために 濃縮する必要がある。４°Ｃで、それぞれ２５０Ｏｒｐｍで２０分間回転（ｓ　 ｐ　ｉ　ｎ）させることによって、セントリサート（商標）　（ＣＥＮＴＲＩＳ ＡＲＴ　１Ｍ）の濃縮チューブを用いて濃縮を行う。超音波処理物は、一般的に 、５００μｍを２から３回の注入になるように濃縮される。

Ｘ）濃縮後、調製物を５００μｌの注入量でモノＱ　（Ｍｏｎ。

Ｑ）カラムにのせる。各注入に対してリードアウトを行い、すべてのパラメータ ーを記録する。

ｘｉ）ａ製物がモノＱ　（Ｍｏｎｏ　Ｑ）カラムを通過した直後の分画について ウレアーゼのピークをチェックする。

ｘｉｉ）ウレアーゼ試験から得られた値を、ＦＰＬＣより得られたタンパク質プ ロフィル（以下を参照）」二にプロットする。次に、目的とする分画を溜め、タ ンパク質濃度の測定を行う。このようにして得られたタンパク質／ｌｌ麿を用い て、約１ｍｌまで貯蔵物を濃縮するのに必要な回転数を決定する。この調製物を セントリサート（ＣＥＮＴＲｌ５ＡＲＴＩの濃縮チューブを用いて濃縮する。

ＦＰＬＣによる抗原分画 ｉ）超音波処理物を、スーパーローズ（商標）　（ＳｔｌＰＥＲＯ５ＥＴＭ、の ６サイスの排除限界を有するカラム（６ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｏｌ ｕｍｎ）のタンパク質高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製する。

１１）カラムを０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ　（ｐＨ ７，６〜７．７）で平衡化する。

ｉ　ｉ　ｉ）　２００１ｔ　］の超音波処理物をこのカラムにのせ、０．５ｍｌ の分画を収集する。

ｉｖ）分画を集め、ウレアーゼ試験を行い、ウレアーゼピークを測定する。これ らの値をＦＰＬＣにより得られたリードアウト上にプロットする。目的とする分 画を集める。

■）少量のアリコートをとり、ネイティブなＰＡＧＥ分析（ｎａｔｉｖｅ　ＰＡ ＧＥ　ａｎａｌｙｓｉｓ）を行い、結合のコンシスチンシー（ｃｏｎｓｉｓｔｅ ｎｃｙ）を測定する。これらの分画はウレアーゼピークは含まないか、４’４０ ｋＤａから６７ｋＤａの間の分子−量を６するより小さいタンパク質の群を示す ピーク部分に相当する。

ｖｉ）残りを一２０°Ｃで貯蔵し、さらに、他の同様の調製物と共にプールし、 バッチを形成する。

凍結乾燥 上記バッチの抗原を、以下よりなるエフニスイー凍結乾燥機（ＦＳＥ　Ｆｒｅｅ ｚｅ　ＤｒｉｅｒＪ中で凍結乾燥する：（ａ）レイボルド（Ｌｅｙｂｏｌｄ）　 （アメリカ合衆国）製、トリヴアック（商＃Ｍ）　ｆＴＲＩＶＡｃ　”）　＝Ｈ ンフ、モテル番号　Ｄ４Ａ。

（ｂ）ジェネラル　エレクトリック（Ｇｅｎｅｒａｌ　ＥｌｅｃｔｒｉＣ）　（ アメリカ合衆国）製、２４０ボルトＡＣモーター；（ｃ）　ラフ−ティ：Ｚ、　 （商ｔ？）　（ＶＩＲＴＩＳ　ＴＭ）　真空チ＋　ンハー（ヴアーティス　コー ポレーション　インク（Ｖｉｒｔｉｓ　Ｃｏ、Ｉｎｃ、）　、ニューヨーク、ア メリカ合衆国）製；および （ｄ）凍結乾燥機のキャビネットに組み込まれた冷却ユニット。

表面積を大きくするために５ｃｍの直径の５０ｍ１の試料ジャー中で一定の角度 で凍結した、３０ｍ１の抗原を含何した液体を真空チャンバー内に入れ、システ ムを作動させた。使用するシステム内の温度を常に一５５°Ｃに設定した。使用 するシステム内の真空圧は、８０〜１００ｍＴ。

ｒｒ（約０．００１気圧）に維持した；範囲値は凍結された液体の初期容積及び その表面積、さらにこれ故にチャンバー内の蒸気の量に依存する。試料を完全に 乾燥するまで凍結乾燥したところ、１６〜１８時間かかった。

ファルマンア製のファストンステム（商標）を用いたネイ凍結乾燥前後の、」− 記分画の抗原を、直線的な勾配アクリルアミドケル（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉ ｅｎｔ　ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ）を用いたネイティブなＰＡＧＥにかけ る。タンパク質プロフィルを以下のような急速銀染色によって目視化する。

ｉ）バッファーストリップ（ｂｕｆｆｅｒ　５ｔｒｉｐ）は、そのままの状態（ Ｆ）９ンパク質を分離するファストゲル（商標）　（ＰＨＡＳＴＧＥＬＴＭ）の ネイティブなバッファーストリップであった。

１１）ゲルは、ファストゲル（商標）のグラジェント８〜２５　（ＰＨＡＳＴＧ ＥＬ　ＴＭＧｒａｄｉｅｎｔ　８−２５）であった。このシステムは、球状タン パク質に関して５０ｋＤａがら７５０ｋＤａまての分子量の範囲ではタンパク質 の移動距離と分子量の対数との間に直線的な関１系がある。

１ｉｉ）使用したマーカーは、ファルマシア（Ｐｈａ＋ｍａｃｉａ）製の高分子 −量の測定用電気泳動計算キットであった。１バイアル（カタログ番号（Ｃａｔ 、　Ｎｏ、）１７−０４４５−０１）の凍結乾燥されたマーカーを１００μｌの 蒸留水に溶解した。再構築されたマーカーをゲルの銀染色のために１０倍に希釈 した。１μｌのマーカーを２連で泳動した。

ｉｖ）抗原試料について、ＩＩｔｌの各スーパーローズ（商標）６サイスの排除 限界を有するカラムのＦＰＬＣで精製したｆｓＬＩＰＥＲＯ５Ｅ　”’　６　Ｆ ＰＬＣ−ｐｕｒｉｆｉｅｄ）抽出物を２連で泳動し　ｊこ。

■）分離条件：試料を、ファストシステム（商標）のセパレーション　テクニッ ク　ファイル番号１２０　（ＰＨＡＳＴＳＹＳＴＥＭ”λ’　５ｅｐａｒａｔｉ ｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　Ｆｉｌｅ　Ｎｏ、　１２０）のネイティブなＰＡＧ Ｅの最適化された方法を用いて泳動した。泳動長さは１２０ボルト・時間であっ た。

ｖｉ）現像条件ニゲルを、ファストシステム（商標）のデベロップメント　テク ニック　ファイル番号２１０　（ＰＨＡＳＴＳＹＳＴＥＭ”’　Ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　Ｆｉｌｅ　Ｎｏ、　２１０）　（ｒネイティブ なＰＡＧＥに対して最適化された銀染色法（ＳｉｌｖｅｒＳｔａｉｎｉｎｇ　Ｍ ｅｔｈｏｄ　Ｏｐｔｉｍｉｓｅｄ篩ｒ　Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）　Ｊ　）の表 ３の方法に従って、銀染色した。

ｖｉｉ）分子量の測定は、ゲル上の抗原と共に泳動する高分子量用マーカーを用 いて行った。標準曲線は、Ｒｆ値に対する分子量対数をプロットすることによっ て測定される。

凍結乾燥前後の抗原の比較 上記のネイティブなＰＡＧＥ法を用いて、以下の結果が得られた。値は、平均値 ±１標準偏差として示される。

（ｎ）はゲルから作製された測定数を示す。

抗原のさらなる特性付け ｉ）比較用の分子量を、チログロブリン、フェリチン、カタラーゼ、乳酸脱水素 酵素及びアルブミンを含む標準物を用いて／１１ｊ定する。

ｉｉ）ウェスタンブロッティング法によって、ヘリコバフタ−ピロリに陽性であ る血清を用いて目的とするタンパク質のバンドを検出する。

ｉ　ｉ　１）ＦＰＬＣによる分画によって、へりコバフタ−ピロリに陰性な血清 に反応性をＨするより小さい分子量のバンドを除去する。

ｉｖ）抗原調製物に対する凍結乾燥の効果は、偽陽性な血清に反応性を打する大 きな分子量（約４４０ｋＤａ）のユニットの存在を消失させることであると考え られる。この４４０ｋＤａのバンドが含まれないということは、陽性、偽陽性お よび陰性な血清を見分ける上で重要である。

この精製法の効果は、２５５〜２７５　ｋ　Ｄ　ａの分子量範囲における、特に 約２６５ｋＤａのタンパク質および陽性な血清には反応性を有するが陰性な血清 には反応性を有さない約３４０ｋＤａの分子量を有するタンパク質を同定するこ とである。

実施例２ 酵素結合イｌ、ノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）１、抗１１λによるＥＬＩＳＡ 用プレートの被覆ｌ）ポリスチレン製ＥＬ　Ｉ　ＳＡ用プレートを用いる（ポリ ソルブ（Ｐ（＋１ｙｓｏｒｂ）、ヌンクｆＮｕｎｃ）製、タンマーク）。

ｉｉ）実施例１て得られた凍結乾燥された抗原調製物を被覆用緩衝液（以下の２ （ｉｉｉ）を参照）中で最適に希釈する（希釈を最大にすることよって抗体陰性 な唾液の反応性を上昇させることなく抗体陽性な唾液の感受性を最大にてきる） 。

１ｉｉ）１００μｍの希釈された抗原のアリコートを、ＥＬＩＳＡ用プレートの 「抗原」ウェルに加え、１００μｍの被覆用緩衝液（抗原を含まず）を「緩衝液 」ウェルに添加する。

ｉｖ）プレートを４６Ｃの温度で一晩インキユベートする。

■）インキュベートされたプレートをからにし、１００μｌの５％（Ｗ／Ｖ）乾 燥スキンミルク粉／被覆用緩衝液（以下の２　（ｉ　ｉ　ｉ）を参照）のアリコ ートを３０分間かけて加え、内容物を軽く払うことによってすばやくからにｉ） リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）：　ｐＨを７．２に調節された、１リツトルの脱イオ ン水に０．１４Ｍ　塩化ナトリウム、０．００３Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，０，００ ＩＮ　ＮａＨＰｏ　・２Ｈ２０を溶解した溶液。

１ｉ）基質用緩衝液：ｐＨを５．０に調節された、１リットルの脱イオン水に１ ０．１ｇ　クエン酸、１４．２ｇオルｌ−リン酸酸水素ナナトリウム、Ｎ　ａ　 、ＨＰ　Ｏ４）　、１５０　ｕ　］　Ｈ２０２（３０％（ｗ／ｖ））を溶解した 溶液。

１ｉｉ）被覆用緩衝酸二ｐＨを７．５に調節された、１リツトルの脱イオン水に ２．４２ｇ）リス（ＴＲＩＳ）　［トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン］、 ５８．４４ｇ　塩化ナトリウムを溶解した溶液。

３、抗原被覆後のプレートの処理 抗原を被覆したプレートを長期間（６力月）保存するために、プレートを被覆、 ブロッキングした後乾燥し、乾燥剤と其に４℃で保存する。この処理は、抗原を 被覆したプレートを長期間保存するために必要である。

ｉ）０．０５％（ｗ　／　ｖ　）乾燥スキンミルク粉／ＰＢＳＴ（ＰＢｓＴＭ） で２倍に希釈した１００μｌの唾液またはＰＢＳＴＭで２倍に希釈した１００μ ｌの唾液のアリコートを、ＥＬＩＳＡ用プレートの抗原ウェルおよび緩衝液ウェ ルに加える。

ｉｉ）プレートを周囲温度で９０分までインキュベートする。

１ｉｉ）プレートをＰＢＳＴに浸漬することによって５回洗浄する。

ｉｖ）ＰＢＳＴＭで最適に希釈された（希釈を最大にすることよって抗体陰性な 唾液の反応性を−上昇させることなく抗体陽性な唾液の感受性を最大にできる） １００μｍの西洋ワサビのペルオキシダーゼ抗ヒトＩｇＧのアリコートを抗原及 び緩衝液ウェルに加える。

■）プレートを周囲温度で９０分までインキュベートする。

ｖｉ）７’レートをＰＢＳＴに浸漬することによって５回洗浄する。

ｖｉｉ）１００μｌの西洋ワサビのペルオキシダーゼ基質（製品名　Ｔ　−２８ ８５（Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｔ−２８８５）、シグマ（Ｓｉｇｍｉ）製、アメリカ合 衆国）を含む基質用緩衝液のアリコートを抗原及び緩衝液ウェルに加える。

ｖｉｉｉ）プレートを周囲温度で３０分までインキュベートする。

１ｘ）１００μｍのＩＭ　Ｈ，ＳＯ２を抗原及び緩衝液ウェルに加える。

Ｘ）各血清または唾液試料に対して、緩衝液ウェルの吸光度（Ａ）を抗原ウェル のＡから引いて、このようにして得られたＡを、標準曲線（標準抗体陽性血清の ２倍希釈がら作製される）を用いてＥＬ　Ｉ　ＳＡの単位に換算する。

ｘｉｉ）生検によって感染している（または感染していない）ことが確認された 患者からの１００個の唾液検体の調査を用いて、感染に相当するＥＬ　Ｉ　ＳＡ の単位数を測定する。

実施例３ イムノブロツティンクアッセイ用のヘリコハクター　ピロり抗原の調製方法は、 実施例１における方法と同様である。

２、抗原による膜の被覆 ｉ）ニトロセルロース膜の使用する。ナイロンを基礎とした膜を使用してもよい 。

ｉｉ）プロッテインク乾燥後、膜を最適に希釈した抗原液（抗原を最大に希釈す ることによって抗体陰性な試料では陽性の反応を生じさせずに抗体陽性な試料に よる感受性を最大にする）中に５分間浸漬する。

１ｉｉ）次に、膜を５％（Ｗ／Ｖ）スキンミルク粉／ＴＢＳ中で３０分間インキ ュベートする。

ｉｖ）膜を０，０５％（ｗ／　ｖ　）ポリオキシエチレンソルビタンモノラウＬ 、−１−／ＴＢＳ　（ＴＢＳＴ）　で５分間２度洗浄する。さらに、長期間（１ ８力月まで）保存するために、膜を乾燥し、乾燥剤と共に４°Ｃで保存する。

ｖ）ＩＦ’を、試験ボトル内のまたは舌の下の希釈していない試験唾液中で５分 まで浸漬する。

ｖｉ）膜を水道水を流しながら３０秒間洗浄する。

ｖｉｉ）ｌＩ’Ｋを、５分間までＰＢＳＴＭて最適に希釈された（抗体陽性な唾 ｌｆｋと抗体陰性な唾液との区別が可能なように）アルカリホスファターゼ−！ （合体形成抗ヒトＩｇＧ（ａｔｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｌａｓｅ−ｃｏｎｊ ｕｇａｔｅｄ　ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ１中に浸漬する。

ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）膜を水道水を流しながら３０秒間洗浄する。

ｉｘ）膜を基質（０，３ｍｇ　ニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉ＋ｒｏｂｌｕ ｅ　ｔｅｔｒａｘｏｌｉｕｍ）　、０．　１５ｍｇ　５−ブロモ−４−クロロ− ３−インドリルリン酸（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙ ｌ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を１　ｍ　Ｉ　Ｏ、Ｉ　Ｍ　Ｎ　ａ　ＨＣＯ３，１， ０ｍＭ　ＭｇＣｌ２に溶解したもの、ｐＨ９，８）中に５分間浸漬する。

Ｘ）抗体陽性な試料は膜の抗原領域においてふじ色の色の変化を生じるが、抗体 が陰性な試料は抗原領域において膜の色を変化させない。

実施例４ 上背部−腸の症状（ｕｐｐｅｒ　ｇａｓｆｒｏ−ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｓｙｍ ｐｔｏｍ）の検査を目的として、ロイヤル　ノース　ショア　ホスピタル（Ｒｏ ｙａｌ　Ｎｏｒｔｈ　５ｈＯｔｅ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌｌ、エヌエスダブル（ＮＳ Ｗ）の胃腸病材（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　ＤｅｐａＮｍｅｎｌ）に 照会された患者について研究した。胃の生検による微生物の培養、ヘリコハクタ ー　ピロリの検出を目的とする顕微鏡検査、ウレアーゼ試験及び組織学およびＥ Ｌ　Ｉ　ＳＡを可能な限りすべての患者について行った。

へりコバフタ−ピロリに関する唾液抗体と生検との相関前の生検の組織学と唾液 のＥＬＩＳＡの結果との間の関係を、ヘリコハクター　ピロリの感染に関する他 の試験と共に、以下の表に示す。

血／ｉ’ｆＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａは、へりコバフタ−ピロリの感染を険出するとい う点で生検試験よりより感度が高くかつより特異的であることが知られており、 ヘリコバフタ−ピロリの感染を検出するための［金の（ｇｏｌｄ）Ｊ標準物質と して一般的に受け入れられてきている。以下の表における結果から、唾液の検定 システムは血清と同様の結果が得られることが分かる。炎症が存在しないまたは 慢性炎症が存在する場合には、ウレアーゼ、培養及び組織学等の、すべての一般 的に用いられる試験は比較的同様の結果が得られる。しかしながら、活性化した 炎症（ａｃｔｉｖｅ　ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）を患う患者は、他のシステム によるのに比べて血清及び唾液のＥＬＩＳＡによる方がへりコバフタ−ピロリに 感染していることが多いことが示される。上記が起こる理由は、生検はまったく 無作為にサンプリングする方法であり、ヘリコバフタ−ピロリが感染する領域を 逃すことがあるためである。上述したように、唾液のＥＬ　Ｉ　ＳＡによる結果 は血清のＥＬ　Ｉ　ＳＡによる結果と良好な相関を有する。

ＥＬＩＳＡと胃の組織学による生検試験との関係当業者によって、本発明が本明 細書に記載された事項以外の変形および修飾が可能であることは理解される。ま た、本発明はこのような変形および修飾をすべて含むものであることも理解され る。本発明はまた、本明細書において引用されたまたは記載されたすべてのステ ップ、態様、組成物および化合物を、個々にまたは集合的に、含むものであり、 さらに、２つ若しくはそれ以上の上記ステップまたは態様のいずれかのおよびす べての組み合わせをも含むものである。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＺ。

Ｆｌ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＫＺ、ＬＫ、ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　 ＮＯ，ＮＺ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＶＮ （７２）発明者　ウィツト、キャンベルオーストラリア国、ウェスタン　オース トラリア　６１５７．　ビクトン、ブレストンポイント　ロード　２２５ （７２）発明者　クランシー、ロバート　レーウェリンオーストラリア国、ニュ ー　サウス　ウェールズ　２３００．ニューキャッスル、ハイ　゛ストリート　 １１ （７２）発明者　スティール、ダニエルオーストラリア国、ニュー　サウス　ウ ェールズ　２０７０．イースト　リントフィールド、アランビー　アヴエニュー 　２４

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．抗原調製物が約２６５ｋＤａおよび約３４０ｋＤａのヘリコバクターピロリ 由来の成分からなり、約４４０ｋＤａのヘリコバクターピロリ由来の成分を実質 的に含まないことを特徴とする、抗原成分に特異的な粘液分泌物中のＩｇＧ抗体 が複合体を形成するのに十分な時間および条件下で哺乳動物の粘液分泌物をヘリ コバクターピロリの抗原調製物と接触させ、複合体に複合体を検出するための検 出手段を施すことからなる方法である、哺乳動物におけるヘリコバクターピロリ によるその時点に存在する感染の検出方法。
2. ２．該抗原調製物がさらに約１６０ｋＤａおよび／または約７０ｋＤａの分子最 を有するヘリコバクターピロリ由来の抗原を含む、請求の範囲第１項に記載の方 法。
3. ３．抗原調製物がヘリコバクターピロリ細胞の凍結乾燥された抽出物からなるこ とを特徴とする、抗原成分に特異的な粘液分泌物中のＩｇＧ抗体が複合体を形成 するのに十分な時間および条件下で哺乳動物の粘液分泌物をヘリコバクターピロ リの抗原調製物と接触させ、複合体に複合体を検出するための検出手段を施すこ とからなる方法である、哺乳動物におけるヘリコバクターピロリによるその時点 に存在する感染の検出方法。
4. ４．該粘液分泌物が唾液である、請求の範囲第１、２または３項に記載の方法。
5. ５．該抗原調製物が固体支持体に結合する、請求の範囲第１から４項のいずれか に記載の方法。
6. ６．該固体支持体がニトロセルロースストリップである、請求の範囲第５項に記 載の方法。
7. ７．該検出手段が、リポーター分子と複合体を形成し、さらに分泌物中に見られ るヘリコバクターピロリに特異的な抗体のクラスの少なくとも一部分に特異的で ある、第２抗体である、請求の範囲第１から６項のいずれかに記載の方法。
8. ８．該リポーター分子が酵素または発蛍光団である、請求の範囲第７項に記載の 方法。
9. ９．該リポーター分子が酵素であり、かつ該酵素がアルカリホスファターゼであ る、請求の範囲第８項に記載の方法。
10. １０．該哺乳動物がヒトである、請求の範囲第１から９項のいずれかに記載の方 法。
11. １１．以下よりなるヒトにおけるへリコバクターピロリによるその時点に存在す る感染を検出する方法：（ａ）抗原調製物における抗原に特異的な粘液分泌物中 のＩｇＧ抗体が複合体を形成するのに十分な時間および条件下で固体支持体上に 固定されたへリコバクターピロリの抗原調製物とヒトの粘液分泌物を接触させる 段階であって、該抗原調製物が約２６５ｋＤａ及び約３４０ｋＤａのヘリコバク ターピロリ由来の成分からなり、約４４０ｋＤａのヘリコバクターピロリ由来の 成分を実質的に含まないことを特徴とする段階； （ｂ）複合体をリポーター分子で標識されヘリコバクターピロリに特異的なＩｇ Ｇ抗体に特異的である有効最の第２抗体と接触させる段階；および （ｃ）リポーター分子によって該１ｇＧ抗体への第２抗体の結合を検出する段階 。
12. １２．以下よりなる試験キットである、哺乳動物の粘液分泌物におけるヘリニコ バクターピロリを検出するための試験キット： （ａ）抗原調製物が約２６５ｋＤａ及び約３４０ｋＤａのヘリコバクターピロリ 由来の成分からなり、約４４０ｋＤａのヘリコバクターピロリ由来の成分を実質 的に含まないことを特徴とする、固定されたへリコバクターピロリの抗原調製物 を有する固体支持体；および（ｂ）該粘液分泌物中のＩｇＧが１つまたはそれ以 上の抗原調製物の成分に結合するかどうかを検出するのに使用する検出手段。
13. １３．該抗原調製物がさらに約１６０ｋＤａおよび／または約７０ｋＤａの分子 量を有するヘリコバクターピロリ由来の抗原を含む、請求の範囲第１２項に記載 のキット。
14. １４．以下よりなる試験キットである、哺乳動物の粘液分泌物におけるヘリコバ クターピロリを検出するための試験キット： （ａ）抗原調製物がヘリコバクターピロリ細胞の凍結乾燥された抽出物からなる ことを特徴とする、固定されたヘリコバクターピロリの抗原調製物を有する固体 支持体；および （ｂ）該粘液分泌物中のＩｇＧが１つまたはそれ以上の抗原調製物の成分に結合 するかどうかを検出するのに使用する検出手段。
15. １５．該粘液分泌物が唾液である、請求の範囲第１２、１３または１４項に記載 のキット。
16. １６．該抗原調製物が固体支持体に結合する、請求の範囲第１２から１５項のい ずれかに記載のキット。
17. １７．該固体支持体がニトロセルロースストリップである、請求の範囲第１６項 に記載のキット。
18. １８．該検出手段が、リポーター分子と複合体を形成し、さらに分泌物中に見ら れるヘリコバクターピロリに特異的な抗体のクラスの少なくとも一部分に特異的 である、第２抗体である、請求の範囲第１２から１７項のいずれかに記載のキッ ト。
19. １９．該リポーター分子が酵素または発蛍光団である、請求の範囲第１８項に記 載のキット。
20. ２０．該リポーター分子が酵素であり、かつ該酵素がアルカリホスファターゼで ある、請求の範囲第１９項に記載のキット。
21. ２１．隔室に分かれており、以下よりなる試験キットである、ヒト等の哺乳動物 の粘液分泌物におけるヘリコバクターピロリに特異的なＩｇＧ抗体を検出するた めのキット：（ａ）抗原調製物が約２６５ｋＤａ及び約３４０ｋＤａのヘリコバ クターピロリ由来の成分からなり、約４４０ｋＤａのヘリコバクターピロリ由来 の成分を実質的に含まないものであることを特徴とする、固定されたへリコバク ターピロリの抗原調製物を有する固体支持体を含むように用いられる第一の隔室 ； （ｂ）抗体がＩｇＧ抗体に対して特異的である、シグナルを生成することができ るリポーター分子と複合体を形成する抗体を含む第二の隔室；および （ｃ）リポーター分子が酵素である際には、該酵素に対する基質を含む第三の隔 室。
22. ２２．適当な粘液物質および／または１つまたはそれ以上の希釈剤および／また は緩衝液を入れるために用いられるさらなる隔室をも脊する、請求の範囲第２１ 項に記載のキット。
23. ２３．約２６５ｋＤａ及び約３４０ｋＤａのヘリコバクターピロリ由来の成分か らなり、約４４０ｋＤａのヘリコバクターピロリ由来の成分を実質的に含まない ヘリコバクターピロリの抗原調製物。
24. ２４．ヘリコバクターピロリ細胞の抽出物を凍結乾燥することからなる方法であ る、請求の範田第２３項に記載の抗原調製物の調製方法。
25. ２５．凍結乾燥される抽出物が、未精製のヘリコバクターピロリ抽出物の大きさ による排除限界クロマトグラフィーによって得られる約６７ｋＤａから約４４０ ｋＤａの分画である、請求の範囲第２４項に記載の方法。
26. ２６．ヘリコバクターピロリ細胞の凍結乾燥された抽出物。