JPH07509369A - 内皮細胞産物を製造するために脂肪組織を処理する装置及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 内皮細胞産物を製造するために脂肪組織を処理する装置及び方法関連出願に対す る記載 本願は、１９８５年６月６日付は出願の出願番号第７４２，０８６号であって１ ９８９年４月１１日付は発行の米国特許第４．８２０，６２６号［合成あるいは 天然に得られる微小血管内皮細胞を備える表面の処理方法及び処理された表面そ のものＪ　（−Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｔｒｅａｔｉｎｇ　ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉ ｃ　ｏｒ　Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　５浮窒■≠■ ｅ　ｗｉｔｈ　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ ｌｓ、　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｔｒｅａｔｅｄ　５ｕｒｆａｃｅ@Ｉｔｓｅｌｆつ の分割出願である１９８８年９月１２日付は出願の出願番号第２４４．４９６号 「合成あるいは天然に得られる微小血管内皮細胞を備える表面の処理方法及び処 理された表面そのもの」（Ａ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｔｒｅａｔｉｎｇ　ａ　５ ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｏｒ　Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｑｃｃｕｒｒｉｎｇ　５ｕｒｆ ａｃｅ　ｗｉｔｈ　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃ ｅ１ｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｔｒ■≠唐狽■п@５ｕ ｒｆａｃｅ　Ｉｔｓｅｌｆ”）の一部継続出願である１９８９年５月２４日付は 出願の出願番号第３５６．４３１号「内皮細胞獲得及び堆積キットＪ　（”Ｅｎ ｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｄｅｐｏｓ ｉｔｉｏｎ　Ｋｉｔ”）の一部継続出願である１９９０年２月９日付は出願の出 願番号第４７７．７３３号「内皮細胞産物を製造するために脂肪組織を処理する 装置Ｊ　（”Ｄｅｖｉｃｅ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｆａｔ　Ｔｉ５ｓ ｕｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｄｕｃｅ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ戟@Ｃ ｅ１ｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔ”）の一部継続出願であり、これらの出願内容は本願に 参照として取り込まれている。また前記出願のそれぞれは、本願のＢｅｃｔｏｎ 　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃ。

ｍｐａｎｙとの共同譲受人であるＴｈｏｍａｓ　Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　Ｕｎｉｖ ｅｒｓｉｔｙに対して、全体あるいは部分的に譲渡されている。

さらに、本願は、１９９１年５月３日付は出願の出願番号第６９５，４７４号「 脂肪組織を採集し処理して、微小血管内皮細胞を獲得するための装置及び方法」 （Ｄｅｖｉｃｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ＣＣｏ１１ｅｃｔｉｎ　ａｎ ｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｆａｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ@Ｐｒｏｃｕｒｉｎ ｇ　Ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ−）の一部 継続出願でもある。

本願は、１９８６年１１月６日付は出願の出願番号第９２７，７４５号「補綴物 表面の内皮細胞の適用範囲を決定する方法Ｊ　（Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｄｅｔｅ ｒｍｉｎｉｎｇ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｏｖｅｒａｇｅ　ｏｆ 　ａ　Ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ　５ｕｒｆａｃｅ″）：　１９８６年４月４日付は 出願の出願番号第８４８．４５３号「微小血管内皮細胞成長を支持するために、 コラーゲン積層物を備える合成あるいは天然に得られる表面を処理する方法及び 表面そのもの」（＋＾Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｔｒｅａｔｉｎｇ　ａ　５ｙｎｔｈ ｅｔｉｃ　ｏｒ　Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　５浮窒■ ａｃｅ　ｗｉｔｈ　ＣｏｌＣｏ１１ａ　Ｌａｍ１ｎａｔｅ　ｔｏ　５ｕｐｐｏｒ ｔ　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ@Ｃｅ１ｌ　Ｇｒ。

ｖｔｈ　ａｎｄ　ｔｈｅ　５ｕｒｆａｃｅ　Ｉｔｓｅｌｆ″）；　１９８７年１ ０月２８日付は出願の出願番号第１１４．２４２号「血管内張りを再度内皮化す る方法Ｊ　（Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｒｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚｉｎｇ　Ｖ ａｓｃｕａｌｒ　Ｌｉｎｉｎｇ”）に関係する。これらすべては、１９８５年６ 月６日付は出願の出願番号第７４２，０８６号であって１９８９年４月１１日付 は発行の米国特許第４，８２０，６２６号の一部継続出願である。上記出願のそ れぞれは、Ｔｈｏｆｆｌａｓ　Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに対 して譲渡されており、本願に参照として組み込まれている。

発明の背景 自系の静脈は、移植片（グラフト）の選択の余地を残すけれども、進行した血管 疾病及び従来の外科的な介入は自己移植片の入手可能性を制限する。したがって 、他に方法がない場合には、局所貧血領域に対して血液流を回復するための手段 として、合成移植片が用いられている。過去３０年間、動脈硬化的な血管疾病の 結果としての局所貧血領域に対する血液流の迅速な回復を提供するために、人工 移植片が用いられている。加えて、慢性腎臓不全を患う患者の血液透析及び動脈 瘤の治療のための血液透析に対する血管へのアクセスを提供するために、人工移 植片が用いられている。

局所貧血組織に対して液体の出し入れを回復させることは、当初は成功するが、 これらの移植片に対する長期にわたる予後は、奨励されていない。商業的に入手 可能な移植片は、それらに固有のトロンボゲン形成性（血栓症を引き起こす）ゆ えに、理想とはかけ離れている。長期にわたると、４ｌ未満の径を有する移植片 は、フィブリン沈殿及び細胞接着を介して閉塞するようになるので、該移植片は 開放性を喪失することになる。この過程は、副次的に且つ埋め込まれた補綴物の 裸のつまり内皮化されていない表面の血栓性に起因して、現れる。”Ｈｅａｌｉ ｎｇ　ｏｆＡｒｔｅｒｉａｌ　Ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ　ｉｎ　Ｍａｎ；　Ｉｔｓ 　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ″、＾ｎｎ、　Ｓｕｒｇ、　１７５：P１８− ２７（１ ９７２）参照。

よって、現在行われている研究のほとんどは、自然のヒト血管に存在するような 非血栓性内皮細胞を製造するために、ヒト内皮細胞を備える内張り補綴物に焦点 が向けられている。イヌにおいて、小径及び大径の移植片上への内皮細胞の植え 込みは、１〜４力月にわたり、完全な内皮細胞内張りを結果的に生じることが見 出されている。血管内皮は、独特の非血栓性表面を再現すると言われており、内 皮細胞は、「小径の血管移植片を内張すするための第１の論理的な選択」である と、報告されている。血管移植片の表面上への機能的な内皮細胞内張りの移植は 、開放率を増加し且つ動物モデルにおける流動表面上の血栓形成を減少すること が証明されている。

過去及び現在の研究は、静脈部分からの大きな血管内皮細胞の分離及び引き続い て行われる移植片内腔表面上のこれらの細胞の植え付けに焦点を合わせている。

さらに組織培養の進歩は、血管補綴物上に可能な限り高密度に植え付けるための 内皮細胞の多数の世代を作り出している。これらの技術は、臨床的な植え込みに 当たって、大きな障害を有する。低密度植え込み技術が適用される場合には、内 皮化は低速度で起こる。培養された内皮細胞を用いる高密度植え付けは、臨床的 な植え付けには容易に適用することができない不確定の培地の使用を要求する。

ヒト微小血管内皮細胞すなわち毛細管、動脈及び静脈から派生する細胞は、自然 組織における大きな血管内皮細胞及び微小血管内皮細胞の間の形態学上及び機能 上の相違点にもかかわらず、大きな血管細胞に適当に置き換わる機能を発揮する であろうことは認められている。微小血管内皮細胞は、体組織、特に顕著には脂 肪組織に、豊富に供給された状態で存在しており、移植に先立つ埋込の合流（ｉ ｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）の程度、すなわちほとんどの インブラントの予後を劇的に改良する少なくとも５０°、を確立するために用い られるであろう。さらなる記載の目的のために、好例の微小血管内皮細胞源とし て脂肪組織を示すが、同様に他の組織由来の内皮細胞を使うこともできる。

補綴移植片上に大きな血管内皮細胞を植え付けることに関する問題を解決するた めに、微小血管内皮細胞を自体の脂肪の多い組織から分離し、その後、血管補綴 物を高密度に植え付ける方法が開発された。

微小血管内皮細胞は、血液接触表面を内皮化できることが見出されているが、施 術室内で、これらの細胞を獲得し堆積させる方法には、特別の考慮が払われる。

同一の連続した外科施術の初期に得られる血管移植片あるいは他のインブラント は、脂肪から分離された微小血管内皮細胞を用いる合流（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ ）とすべく処理される。脂肪組織は、無菌状態が確立された後、患者から除去さ れる。次いで、脂肪領域内にある微小血管内皮細胞は、酵素消化及び遠心分離に より、関連する組織から速やかに分離されて、同一の手術の後半段階で患者に埋 め込まれる表面を処理するために用いられる。この施術は、患者自身の新鮮な内 皮細胞との合流（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達するまであるいは合流（ｃｏｎｆ ｌｕｅｎｃｅ）上で処理された移植片を患者が受け入れることを可能とする。

微小血管が多い組織が得られるのは、腎周囲の脂肪、皮下脂肪、網（ｏｍｅｎｔ ｕ厘）、あるいは胸腔又は腹膜腔に関連する脂肪である。次いで、この組織は、 カゼアナーゼ（ｃａｓｅａｎａｓｅ）及びトリプシンを含むコラゲナーゼ等のタ ンパク質分解酵素を用いて、消化される。該タンパク質分解酵素は、組織塊が分 散して組織消化物が産出されるまで、組織と共に保温培養される。次いで、微小 血管内皮細胞は、低速の遠心分離により消化物から分離されて、内皮細胞が豊富 なペレットとする。

該ペレットは、バッファ塩溶液で洗浄される。

次いで、結果として得られる微小血管内皮細胞は、好ましくは約１％の血しよう タンパク質を含有するバッファ塩溶液中に懸濁されることが好ましい。容積基準 で、溶液に対して、１．５〜１：１５、好ましくは約１：１０の割合でペレット を含むこの懸濁液は、次いで、少な（とも５０°の合流（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ ）を与える微小血管内皮細胞の前記（患者に埋め込まれる）表面に対する十分な 接着が得られるまで、該表面と共に細胞を保温培養することにより、該表面を処 理するために用いられる。結果として、融合性を有するか、あるいは埋込に続い て非常に速やかに（１個の固体群内で倍増する）合流（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ） に到達するような、内皮化された表面を有する改良された移植片インブラントが 与えられる。

かような内皮細胞内張りを産出するために処理可能なインブラントとしては、例 えば、人工血管補綴物、人工心臓及び心臓弁等の血管内装置を挙げることができ るが、これらに限定されるものではない。この発明の表面を内皮化するためのキ ット及び方法は、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）等の 公知の合成材料、あるいは腰帯静脈、伏在静脈及びウシ動脈等の天然に得られる 材料からなる表面のために用いることができる。

現在用いられている方法は、ビーカー、フラスコ、遠心管、シェーカーバス、ピ ペット、シリンジ及び無菌フード等の標準的なラボ設備を使用する。一つの方法 において、寄贈された組織は、好ましくはバッファ剤がリン酸塩である、すなわ ちリン酸バッファ溶液（ＰＢＳ）である冷バッファ塩（ｐＨ７，４）に速やかに 移されて凍結される。該組織は、鋭い挟みで細かく刻まれ、バッファを静かに注 ぎ込む。カゼアナーゼ及びトリプシンを含むタンパク質分解酵素コラゲナーゼが 該組織に添加され、組織塊が分散するまで３７℃にて保温培養される。消化は、 ３０分以内、一般には２０分未満で起こる。消化物は、無菌試験管に移され、テ ーブルトップ遠心分離機内で、低速（７００Ｘｇ）にて、室温で５分間、遠心分 離される。

こうして形成された細胞のペレットは、９５％を超過する内皮細胞を含む。これ らの内皮細胞は、すべて微小血管である小動脈、毛細管及び小静脈から派生する ので、本願においては微小血管内皮細胞（ＭＢＣ）として記載する。ＭＢＣペレ ットは、好ましくはＰＢＳであるバッファ塩を用いる遠心分離により、１回洗浄 される。次いで、ＭＢＣ懸濁液は、遠心分離（２００Ｘｇ）によりペレット化さ れ、該ペレットはバッファ溶液を含むタンパク質と再度懸濁することが好ましい 。この再度の懸濁は、バッファ溶液に対してバックされた微小血管内皮細胞の容 積の割合、はぼ１：５〜１：１５あるいは約１＝１０にて行われる。細胞懸濁液 は、管状移植片及び締め付けられた端部、すなわち処理されるべき表面上に積層 する細胞に加えられる。

細胞間相互作用に対する最適な期間は、補綴物の材料、受は入れるであろう前処 理の性質、及び補綴物の表面がＭＢＣの受容能を改良するために改変されている か否か、に依存して変わる。内皮細胞の補綴物表面との接着を可能とするために 十分な期間の保温培養に続いて、該表面はバッファを含むタンパク質で洗浄され る。

米国特許第４，８２０，６２６号明細書及び関連する出願において、内皮細胞と 共に移植片表面を処理する方法が、開示されている。これらの方法に従って、皮 下脂肪組織は、カニユーレを介して吸引され且つ粘液トラップ内に真空吸引によ り移される。次いで、該トラップは、滅菌ビーカー内に置かれた漏斗内側の篩に 移される。次いで、リンス液が該組織全体に注がれて、赤血球細胞及び溶解した 脂肪を除去する。該組織は、コラゲナーゼ溶液を含有する滅菌Ｅｒｌｅｎｍｅｙ ｅｒフラスコ内に手動で注がれて、３７℃にて２０分間震盪される。コラゲナー ゼスラリーは、滅菌コニカル遠心管内に手動で注がれて、７００Ｘｇにて７分間 、回転させられる。移植片は、ｍａｌｅ　１ｕｅｒ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎに結ば れ、管内に固着される。細胞は、血清タンパク賀培地内に再度懸濁され、ニード ル及びシリンジを用いるシリンジ内に引かれる。細胞は、移植片の内腔内に強制 的に入れられる。該移植片は、手動で２時間回転させられる。

これらの利点にもかかわらず、施術室設備にて移植片上に内皮細胞コーティング を製造するための簡易で信頼性のある方法の必要性はいまだ存在し、本発明はか ような必要性に答えるものである。本発明は、施術室内で容易に行うことができ る多量の内皮細胞の容易な分離を提供する。脳、肺、網膜、副腎、肝臓及び筋肉 等の脂肪以外の組織から内皮細胞を分離することができるが、脂肪組織の多量性 及び入手可能性、また脂肪組織の除去は治療中の患者に逆効果を与えるものでは ないという事実から、細胞源として脂肪組織を使用することが好ましい。また、 あまり好ましくはないけれども、心臓は鼓動しているが脳死状態の死体ドナーか ら、あるいはドナーの手術以外のドナーから、ヒトの腎周囲の脂肪を得ることも 可能である。次いで、分離された内皮細胞は、植え込み用の移植片の上に堆積さ せられる。

発明の概要 内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理する装置は、組織をリンスし、 排出し、消化し及び分離するための容器を備える。該容器は、処理中に、組織を 含有するためのリンス及び消化チャンバを有する。脂肪吸引手段と流体連通状態 にて連結するための入り口は、リンス及び消化チャンバ内にある。ドレインチャ ンバすなわち排水チャンバは、容器内に設けられて、該リンス及び消化チャンバ と流体連通する状態にあることが好ましい。該排水チャンバは、真空源と流体連 通状態に連結している。リンス及び消化チャンバを排水チャンバから分離するた めのスクリーンが容器内にあり、リンス液をリンス及び消化チャンバから排水チ ャンバへ濾過しながら移動させることができる。

分離チャンバは、リンス及び消化チャンバを備える容器内にあり、別のスクリー ンによってリンス及び消化チャンバから分離されている。一対のポートが、アン プルを形成するチャンネルにより分離されていることが好ましい。ポートのそれ ぞれは、弁手段により、アンプルと流体連通状態に選択的に取り付けられてもよ い。リンスされ、消化され、及び処理された無菌状態で製造された組織は、内皮 細胞産物として、アンプル内に採集されてもよい。容器は、一般に、円錐台形端 部を有する円筒状であり、分離チャンバを収容する。

内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理する好ましい方法は、内皮細胞 産物を製造するため組織を処理するための採収容器を準備する工程を備え、該容 器はリンス及び消化チャンバ、排水チャンバ及び分離チャンバを有する。別の工 程は、処理されるべき組織をリンス及び消化チャンバ内に導入する工程である。

別の工程は、リンス及び消化チャンバ内にリンス液を導入する工程である。さら なる工程は、排水チャンバ内に通されるリンス液から、リンス及び消化チャンバ 内で処理されるべき組織を仕切るように、容器を方向づける工程とすることもで きる。追加の工程は、酵素をリンス及び消化チャンバ内に導入する工程である。

この工程に続いて、リンス及び消化チャンバを震盪しながら、組織を酵素で消化 するために十分な一定時間及び一定温度で処理されるべき組織及び酵素を加熱す る工程を備える。容器を遠心分離することで、細胞をリンス及び消化チャンバか ら分離チャンバに移す。さらなる工程として、微小血管内皮細胞のペレットを弁 手段の選択的な作用により分離する。

図面の簡単な説明 図１は、内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理するための装置の斜視 図である。

図２は、図１の線２−２に沿った図１の装置の一部断面図であり、遠心分離中に 、第１の位置にある弁ハンドルを示す。

図２Ａは、遠心分離中に、弁及びポートを通る流路の該略図である。

図３は、図２と同様の図１の装置の一部断面図であるが、遠心分離後、第２の位 置にある弁ハンドルを示す。

図３Ａは、遠心分離後、弁及びポートを通る可能な流路の該略図である。

図４は、図１〜３の装置と同じ装置であるが、本発明を説明する改変されたフィ ルター装置を備えた装置を示す側面立面一部断面図である。

図５は、図４の装置の改良を示す側面立面一部断面図であり、本発明をさらに説 明する。

図６は、内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理する方法の工程を説明 するフローダイアグラムである。

図７は、本発明が有用な装置の実施例の該略図である。

図８は、採集し処理する装置の別の実施例の拡大縦断面図である。

図９は、採集し処理する装置の別の実施例の拡大縦断面図である。

発明の詳細な説明 本発明に有用な好ましい方法にしたがって、改良された脂肪吸引技術を用いて皮 下脂肪は患者から除去されて、自己内蔵閉鎖型装置に移され、必要になるまで無 菌状態下で保存される。脂肪は、消化装置に滅菌状態で移され、まず赤血球細胞 及び他の有機堆積物を除去するために洗浄され、続いて約３７℃にて約２０分間 、制限コラゲナーゼで消化される。次いで、脂肪スラリーは、再度、無菌状態で 、内皮細胞が分離装置に沈殿する内皮細胞分離装置に移され、分離された内皮細 胞の自動回復を可能とする。次いで、細胞懸濁液は、無菌状態下で移植片表面上 に細胞が速やかに濾過される処理ユニットに無菌状態で移される。内皮細微分離 処理及び堆積処理は、ここに記載された装置を用いて、終了までに約４０分間を 要するだけである。保温培養期間に続いて、移植片は患者への埋込用に準備され る。本発明と従来行われていた方法との比較において、分離された内皮細胞の数 と、該細胞の移植片表面への接着数とは、等価であり再現性が観察されている。

システムは、連続高密度植え付は及び移植片表面への接着を数的に許容できる、 例えば、５０ｃｃの脂肪から約５．１４Ｘ１０’〜４．２４Ｘ１０７個の範囲で 、内皮細胞産物を産する。本発明の装置は、移植片の全長及び直径に沿って、堅 実に、分散分析により比較した場合に細胞濃度に顕著な差がないように、細胞を 堆積させる。本発明を適用することによる顕著な技術上の利点は：１）閉鎖され 、滅菌された流路；２）最小のユーザーのインプット；３）施術室設備との互換 性；及び４）患者から患者への高度な再生処理に対する条件の最適化である。

一般に、本発明が有用であるシステムは、５つの主なサブシステムを備える：１ ）脂肪採集ユニット；２）消化ユニット：３）内皮細胞分離ユニット；４）血管 移植片処理ユニット；５）内皮細胞堆積ユニット。脂肪採集ユニットは、患者か ら皮下脂肪組織サンプルを採集する。移植片を受け入れる患者から微小血管内皮 細胞を含有する脂肪を採集するために用いられる脂肪採集ユニットの概略は、図 ７に示されている。ここで、脂肪は最終的に脂肪採集装置に採集される。構成要 素として、流入管１１２、脂肪採集装置１１４、真空管１１５、吸引カニユーレ １１０及び吸引ポンプ１１８を含む。吸引ポンプ１１８は、患者から、カニユー レ１１０及び流入管１１２を通して、脂肪採集装置１１４内に、連続的に脂肪組 織を吸引するために用いられる。

さて、図１を参照すれば、本発明の内皮細胞産物を製造するために組織を採集し 処理する装置１０の一実施例が示されている。本発明のある特徴によれば、上述 の脂肪採集及び処理機能は、図示された単一ユニット内で行われる。容器１１は 、装置１０用の組織をリンスし、排出し、消化し、及び分離するために用いられ る。図２〜５の側面立面図に図示されているように、容器１１は２つのポート１ ２．１３を備える。要求されている訳ではないけれども、容器１１は、形状化す ることが容易で且つ内皮細胞を処理中に取り扱われるであろう物質に対して耐性 がある低コストのポリマーから作られることが最も好ましい。好ましい実施例に おいて、上部部分１２は逆さのカップ１４であり、下部部分１３は頂部縁部１６ を備える円錐台形ファンネル１５である。該頂部縁部１６は、逆さのカップ１４ の開放底部１７と結合し、容器１１内に囲包体１８を形成する。リンス及び消化 チャンバ１９は、この囲包体１８内に規定される。リンス及び消化チャンバ１９ は、容器１１の逆さのカップ１４内に含まれているので、処理中、組織を適当に 取り扱うことができる。リンス及び消化チャンバ１９内に微小血管内皮細胞を有 する組織を導入するための入り口２０は、図７に示されるカニユーレ１１０等の 外部脂肪吸引手段と流体連通状態で連結するために、リンス及び消化チャンバ１ ９の側部２１に設けられる。

図２に示されるように、ドレインチャンバすなわち排水チャンバ２２は、容器１ １の逆さのカップ１４の上部内側部分２３内に配設され、リンス及び消化チャン バ１９と流体連通状態にある。図４において、別のドレインすなわち排水チャン バ２４が示されており、該チャンバ２４は囲包体１８内に中心的に配設される。

両方の排水チャンバ２２．２４は、逆さのカップ１４の頂部２６を通過するよう に配設され、真空源と流体連通可能とする連結部２５を有する。図５において、 図２〜４の装置と同様であるが、連結部２０及び２５が置き換えられている装置 が示されている。特に、図５における入り口は２５゛　であり、出口連結部は２ ０゛である。よって、排水チャンバは１９゛　でありリンス及び消化チャンバは ２４°である。リンス及び消化チャンバ２４゛　は、囲包体１８内に中心的に配 設される。

図２において、容器１１内で逆さのカップ１４内部に配設された上部スクリーン ２７は、リンス及び消化チャンバ１９を排水チャンバ２２から分離し、リンス及 び消化チャンバ１９から排水チャンバ２２へ、リンス液を濾過しながら移すこと ができる。スクリーン２７は種々の形状とすることができるが、図２に示すよう に平坦であることが好ましい。結果として、排水チャンバ２２は、逆さのカップ １４の上部内側部分２３に隣接しており、リンス及び消化チャンバ１９は、すぐ 真下にある。図４において、スクリーン２８は円筒形状で示され、その軸Ａに沿 って、逆さのカップ１４の中心に、排水チャンバ２４を規定する。リンス及び消 化チャンバ１９は、仕切られた排水チャンバ２４を取り囲む態様にて、外接する かあるいは適合する。

下部部分１３は、頂部縁部１６を有し、内部チャンバ２９を備える円錐台形ファ ンネル１５を規定する。該頂部縁部１６は、逆さのカップ１４の開放底部１７に 連結して、組み合わされた囲包体１８．２９を形成する。図２〜４の実施例を参 照すれば、それぞれ、ファンネル１５の頂部縁部１６に隣接して位置付けられて いる平坦な横断スクリーン３ｏを有することが好ましい。図５の実施例は、かよ うなスクリーン３０を含んでいないことに注意されたい。チューブ３１は、ファ ンネル１５の頂点３２に連結する。チューブ３１は、垂直チャンネルに連結され た一対の離隔したポート３４．３５を備える。該垂直チャンネルは、チューブ３ １内に中心的に位置付けられたアンプル３６を形成する。ポート３４．３５は、 図４に示すように、それぞれ弁３７．４５により、アンプル３６に選択的に連通 するためのものである。弁３７．４５は、医療用アクセサリ−に一般に見られる ような簡易なストップコックでもよい。この選択的な連通を達成するために、弁 ３７を矢印４６で示されるように回転させ、弁４５を矢印４７で示されるように 回転させる。矢印４８．４９は、ポート３４．３５を通る２つの流れ方向を示す 。

弁３７．４５を用いることで、リンスされ、消化され、処理された組織を無菌状 態下で、アンプル３６内で、微小血管内皮細胞ベレットとして、分離することが 可能となる。該ベレットを除去するために、弁３７．４５を調節して、ポート３ ４．３５の一方を通してペレットを引き抜くことができる。

図２Ａは、遠心分離中に、弁３７．４５を通る流路の概略図を示す。この流路は 、図２Ａに示されるように、アンプル３６の底部のトラップ３８内に赤血球細胞 をトラップする。赤血球細胞は微小血管内皮細胞よりも濃いので、遠心分離中に トラップ３８には赤血球細胞が採集される。遠心分離後、弁３７．４５は、概略 的に図３Ａに示されるように調節される。示されるように、真空吸引すなわちポ ート３４．３５のいずれかに負荷された圧力により、分離された細胞をアンプル ３６及びトラップ３８から除去することができるように、２つの流路が可能とな る。

本発明の別の特徴において、内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理す る方法が開示される。この方法の好ましい実施例での種々の工程は、図６の概略 ダイアグラムに示されている。該方法を行うために、本願に記載されたような内 皮細胞産物を製造するために組織を処理するための容器１１が準備される。容器 １１は、リンス及び消化チャンバ１９、排水チャンバ２２．２４及び分離チャン バ２９を有することが好ましい。

処理されるべき組織をリンス及び消化チャンバ１４内に導入することは、処理方 法の最初の工程である。組織は脂肪吸引処理により得ることができる。容器を方 向づけることで、組織からの不必要な液体を真空及び重力により、スクリーン３ ０を通して濾過除去することが可能となる。該スクリーン３０は、排水チャンバ ２２．２４内に通されるリンス液から、処理されるべき組織を分離する。続いて 、酵素をリンス及び消化チャンバ１９内に導入し、酵素の存在下で、組織を消化 するために十分な時間及び温度で、処理されるべき組織を加熱する。消化は、組 織及び酵素を含有するリンス及び消化チャンバ１９を農機する工程により、補助 される。

逆さのカップ１４の頂部２６について、容器を遠心分離することにより、分離チ ャンバ２９内のリンス及び消化チャンバ１９からの消化された組織から細胞を採 集する。リンスされ消化された組織内の赤血球細胞は、上述のように、赤血球細 胞は微小血管内皮細胞よりも濃くかつ重いので、アンプル３６の底部でトラップ ３８内に採集されるであろう。さらに、該方法は、上述のように、弁３７．４５ の選択的な適用により、消化された組織を微小血管内皮細胞のペレット状態で分 離する工程をさらに含むことが好ましい。

本発明によれば、脂肪採集及び処理機能は、図８に示すような単一の装置による 別の実施例によっても行うことができる。図１〜５に示されている実施例に当て はまるように、この実施例は、研究、診断あるいは治療目的のために、例えば、 補綴物あるいは天然の表面の内皮化のために、脂肪組織を採集し、リンスし及び 消化し、次いで微小血管内皮細胞を分離するための処理容器として設計されてい る。該装置は、次の３つのチャンバを有する。すなわち、消化チャンバ１９、排 水チャンバ２２及び分離チャンバ２９である。該消化チャンバ１９は、通常は閉 鎖されている逆止弁２２０を含むプレート２８により排水チャンバ２２から分離 されている。浮遊しているポール逆止弁２２４を含む排出管２２２は、排水チャ ンバ２２から分離チャンバ２９内に延びる。消化チャンバ１９は、−列のポート ２０．２２９．２３０により外部と連通ずる。／Ｆｌ化チャンバ１９は、スクリ ーン３０により分離チャンバ２９から分離されている。分離チャンバ２９は、２ つのポート３４．３５を所有し、該ポートのそれぞれは、弁３７．４５を含む。

それぞれの弁３７．４５が第１の位置にあるとき、両者の間に形成されるアンプ ル３６の中間部での連通が可能となる。弁３７．４５が第２の位置にあるとき、 アンプル３６とポート３４．３５の外部との連通が可能となる。本願に記載され ている方法を実施する際には、両方のアンプル弁３７．４５を最初、第１の位置 におき、図８に示されている装置を、消化チャンバ１９に連結する２つのポート ２０゜１３０と連結される脂肪吸引ラインに整列するキャッチ−トラップとして 用いることが好ましい。脂肪を採集後、脂肪吸引ラインは外され、ポート２０， ２３０はキャップされる。リンス溶液（例えば、１９９Ｅ培地、ハンクス液、食 塩、ＰＢＳあるいは他の生理用バッファ溶液）が、別のポート２２９を通して導 入される。脂肪は、シェーカーテーブル上での農機、手動による農機等の外部手 段により、リンス溶液中で農機される。次いで、装置は、アンプル側を上にして 遠心分離機内に置かれ、通常は閉鎖されている逆止弁２２０が開放し、リンス溶 液が排水チャンバ２２内に排水されるまで、回転させられる。この遠心分離工程 の間、排出管２２２内のボール逆止弁２２４は開放して、リンス溶液によって置 換された空気を排水チャンバ２２から排出可能とする。次いで、コラゲナーゼ、 ジスパーゼ、トリプシンあるいは他の組織消化酵素等の消化酵素溶液は、リンス 溶液として同じポート２２９を通して導入され、再度農機される。消化が完了す ると、アンプル側を下にして、装置は再び遠心分離にかけられる。アンプル３６ 内に分離されている内皮細胞を分離するために、両方の弁３７．４５を第２の位 置に転位させる。次いで、内皮細胞「ペレット」は、アンプルボート２３４．２ ３６の一方へ圧力ラインを取り付けることにより、流し出される。

図９に示す別の実施例において、４つのチャンバ、すなわち消化チャンバ１９、 排水チャンバ２２、酵素チャンバ２１３及び分離チャンバ２９を有する容器を備 える装置が提供される。該消化チャンバ１９は、通常は閉鎖されている逆止弁２ ２０を含むプレート２１８により、排水チャンバ２２から分離されている。スク リーン２１６は、逆止弁２２０の入り口をカバーする。浮遊しているポール逆止 弁２２４を含む排出管２２２は、排水チャンバ２２から分離チャンバ２９内に延 びる。該排水チャンバは、プレート２１７により、酵素チャンバから分離されて いる。消化チャンバ１９は、通常は閉鎖されている逆止弁２２１を含むプレート ２１８により、酵素チャンバ２１３から分離されている。浮遊しているボール逆 上弁２２５を含む排水管２２３は、消化チャンバ１９から酵素チャンバ２１３の 頂部に延びる。酵素チャンバ２１３は、ポート２２６により、外部と連通ずる。

消化チャンバ１９は、−列のポート２０．２２９．２３０により、外部と連通す る。消化チャンバ１９は、スクリーン３０により、分離チャンバ２９から分離さ れている。分離チャンバ２９は、２つのポート３４．３５を所有し、該ポートの それぞれは、弁３７．４５を含む。該弁３７．４５は、第１の位置にあるとき、 アンプル３６の中間部、上部、底部間の連通を可能とする。第２の位置にあると き、アンプル３６の中間部とポート３４．３５の外部とを連通ずる。

最初に、両方の弁３７．４５は、第１の位置にある。装置は、２つのポート２０ ．２３０に連結する脂肪吸引ラインと整列するキャッチ−トラップとして用いら れる。脂肪が採集された後、脂肪吸引ラインは外され、ポート２２８及び２３０ はキャップされる。リンス溶液（例えば、１９９Ｅ培地、ハンクス液、食塩、Ｐ ＢＳあるいは他の生理用バッファ溶液）が、ポート２２９を通して導入され、消 化酵素溶液（例えば、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、トリプシンあるいは他の組織 消化酵素）が、ポート２２６を通して導入される。脂肪は、リンス溶液内で、シ ェークする等外部の手段により、農機される。次いで、装置は、アンプル側を上 にして、遠心分離機内に置かれ、通常は閉鎖されている逆止弁２２０が解放し、 リンス溶液を排水チャンバ２２内に排水するまで、回転させられる。この遠心分 離の間、排出管２２２内のボール弁２２４は解放しており、排水チャンバ２２か らリンス溶液により置換された空気の排出を可能とする。次いで、装置は、アン プル側を下にして、遠心分離機内に置かれ、通常は閉鎖されている逆止弁２２１ が解放して酵素溶液を消化チャンバ１９内に排水するまで、回転させられる。こ の遠心分離工程の間、排出管２２３内のボール弁２２５は解放しており、消化チ ャンバ１９から酵素溶液により置換された空気の排出を可能とする。次いで、脂 肪は、消化を促進するために酵素溶液中で農機される。消化が完了すると、装置 は、アンプル側を下にして、再度、遠心分離にかけられる。アンプル３６内に分 離されている内皮細胞を分離するために、両方の弁３７．４５は、第２の位置に 転位される。ついで、内皮細胞ペレットは、アンプルポート２３４．２３６の一 方に圧力ラインを取り付けることにより、流し出される。

本願に記載されている装置及び方法の形態は、本発明の好ましい実施例によるも のであるが、本発明はこれらの好ましい装置及び方法の形態に限定されるもので はなく、添付の請求の範囲から派生する範囲内での変更がなされてもよいことは 、理解されるであろう。例えば、分離能を高めるために、種々のスクリーン多孔 性形状が開発されてもよい。さらに、遠心力制御及び農機の強度は、微小細胞ペ レットの産出量及び品質を高めるために、変更することもできる。加えて、主消 化チャンバは横断面が円筒状で示されているが、特定の施術室に適合するように 四角形としてもよい。したがって、添付された請求の範囲に対して、本発明の真 の範囲を確かめるために、参照とされるべきものである。

μ・−Δ −１へへ　本 ＦＩＧ、３Ａ 捕止書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 特１τ′「序長官　高　島　章　殿 １、特π′［出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳＱ３１０７２１６ ２、発明の名称 内皮１１１胞産物を製造するために脂肪組織を処理する装置及び方法３、特３′ ［出願人 ｒＩ　所　アメリカ合衆国ペンシルバニア州１９１０７゜フィラデルフィア、イ レブンス・アンド・ウオールナツト・ストリーラ（番地ない 名称ｔ−−マス・ジェファーソン・ユニバーシティ　（外１名）４、代理人 住　所　東ｉ；（部下代Ｉｌ１区人手町二丁目２番１号新人下町ビル　２０６区 電話　３２７０−６６４１〜６６４６ ５、補ＩＩ書の提出「１ 補正された請求の範囲 ［１９９３年１２月２１日に国際事務局に受理された：当初の請求項２〜５及び ９は削除した二当初の請求項１．６〜８．１０．１１．１３及び１７は補正した ：新しい請求項２〜５及び９が加えられた；他の請求項は変えていない］１、内 皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理するための装置において、組織を 受け入れるためのリンス及び消化チャンバ；該リンス及び消化チャンバを取り囲 んでおり、排出流体が第１のスクリーンを通して流れた後に、該リンス及び消化 チャンバからの排出流体を受け入れるための独立の排水チャンバ； 該リンス及び消化チャンバからの内皮細胞産物を受け入れるための独立の分離チ ャンバであって、ここで該第１のスクリーンが、該リンス及び消化チャンバを該 排水チャンバ及び分離チャンバから分離する単一のスクリーン構造を備え、該リ ンス及び消化チャンバは第２のスクリーンによって分離チャンバから分離される ことを特徴とする独立の分離チャンバ：該排水チャンバ及び真空源の間の連結部 ；該リンス及び消化チャンバと脂肪源とを連結する入りロポート；及び該排出流 体を選択的に引き抜くための該排水チャンバ内の出口ポートを備える単一の容器 を具備し、 該排水チャンバ及び分離チャンバは、内皮細胞産物を製造するために、無菌状態 下、該容器内で、組織のリンス、消化及び処理を可能とする、ことを特徴とする 装置。

６、前記分離チャンバは、アンプルを形成するチャンネルにより連結されている 一対のポートを用いる出口により分離チャンバと選択的に連結されており、各ポ ートを通してアンプルへの流れ及びアンプルからの流れを制御するために、該ア ンプルと一対のポートのそれぞれとの間を選択的に流体連通状態とするための弁 手段を備えることを特徴とする請求項１の装置。

７、内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理するための装置において、 組織をリンスし、排出し、消化し及び分離するための単一の容器が、該組織を採 集し処理するための容器内のリンス及び消化チャンバ：リンス溶液を受け入れ、 且つ対象から組織を引き抜くための脂肪吸引手段からの組織を受け入れるために 、該リンス及び消化チャンバに連結されている入り０該リンス及び消化チャンバ と流体連通状態にあり、さらに真空源と流体連通するための連結部を備える排水 チャンバ；該リンス及び消化チャンバを該排水チャンバから分離する第１のスク リーンであって、リンス溶液を含む排出流体が該リンス及び消化チャンバから該 第１のスクリーンを通して該排水チャンバまで流れるような第１のスクリーン； 該リンス及び消化チャンバと流体連通状態にあり且つ第２のスクリーンによって 該リンス及び消化チャンバから分離されていて、無菌状態下でリンスされ消化さ れ処理されて製造された組織から細胞を分離可能とする分離チャンバ；該分離チ ャンバと連結されており且つ該分離チャンバと選択的な流体連通状態にあるアン プル； 該分離チャンバと該アンプルとの間の選択的な連結を与える一対のポート；及び 該ポートのそれぞれと作動的に結合しており、各ポート、アンプル及び分離チャ ンバの間の流体連通状態を選択的に制御する弁手段を備え、こうして、アンプル 内で堆積した内皮細胞を該弁手段の選択的な作動により分離する、ことを特徴と する装置。

８、内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理するための装置において、 消化チャンバ；独立の排水チャンバ：独立の分離チャンバ、の３つのチャンバを 備える単一の容器を具備し、 ここで、該排水チャンバ及び分離チャンバは該消化チャンバと流体連通状態にあ り、 該分離チャンバは、内皮細胞産物を受け入れるためのアンプルに弁により選択的 に連結されており、 該消化チャンバは、消化チャンバ及び排水チャンバを連結する弁であって、通常 は閉鎖されている逆上弁の作動により、選択的且つ択一的に該排水チャンバ及び 該分離チャンバとの流体連通状態におかれ、こうして、該装置は、該排水チャン バに該消化チャンバを連結することで組織の消化を可能とし、該消化チャンバを 該分離チャンバに連結することにより組織の処理を可能とし、無菌状態下、単一 の容器内で、内皮細胞産物を製造することを可能とする、ことを特徴とする装置 。

１０、さらに、前記排水チャンバから前記分離チャンバに延びており、逆止弁を 通る流れを可能とするための内部排出管と、該排出管は該排水チャンバ及び該分 離チャンバの間の流体流れを調節する弁と、を備えるをことを特徴とする請求項 ８の装置。

１１、さらに、第１の弁及び第２の弁を備え、該弁のそれぞれは少なくとも２つ の位置を有しており、第１の位置において、第１の弁は分離チャンバ及びアンプ ルの間の連通を可能とし、第２の弁はアンプル及び出口ボートの間の連通を可能 とし、第２の位置において、両方の弁はアンプル内で内皮細胞産物を分離するこ とを特徴とする請求項８の装置。

１２、さらに、採集された脂肪、リンス溶液及び酵素溶液を消化チャンバ内に導 入するために、消化チャンバと連通状態にて前記容器に添付された少なくとも１ つの入りロポートを備えることを特徴とする請求項８の装置。

１３、内皮細胞産物を製造するために組織を消化し処理するための装置において 、（ａ）酵素貯蔵チャンバ；　（ｂ）独立の排水チャンバ：Ｃ）該排水チャンバ 及び酵素チャンバに択−的且つ選択的に連結される独立の消化チャンバ；及び（ ｄ）該消化チャンバに選択的に連結される独立の分離チャンバ、の４つのチャン バを備える単一の容器を具備し、 ここで、該分離チャンバは、第１の弁により、該内皮細胞産物を受け入れるため のアンプルに選択的に連結され、 こうして該装置は、消化チャンバを酵素貯蔵チャンバ及び排水チャンバに連結す ることで組織の消化を可能とし、消化チャンバを分離チャンバに連結することで 組織の処理を可能とし、無菌状態下で、単一の容器内で、内皮細胞産物を製造す る、ことを特徴とする装置。

１４、前記酵素貯蔵チャンバは、弁を通して前記消化チャンバと選択的に連通し 、且つポートを通して外部環境と連通することを特徴とする請求項１３の装置。

１５、前記酵素貯蔵チャンバ及び前記消化チャンバの間の弁が、通常は閉鎖され ている逆止弁であり、前記装置を遠心分離にかけることで前記酵素貯蔵チャンノ （内部の圧力が増加する場合に開放する弁であることを特徴とする請求項１４の 装置。

１６、前記消化チャンバは、さらに、消化されるべき組織を該消化チャンバ内に 導入するための手段と、該組織をリンスするためのリンス流体を該消化チャンノ く内に導入する手段と、を備えることを特徴とする請求項１３の装置。

１７、内皮細胞産物を製造するために組織を消化し分離するための装置において 、組織を入れるための第１の入りロボートと、酵素を入れるための第２の入りロ ポートと、リンス溶液を入れるための第３の入りロボートと、該組織を農機する ために該シールされた消化装置にガスを入れるための第４の入りロポートと、消 化された組織を選択的に噴出し且つ消化されていない組織を保留するための出口 ポートと、を含む組織を保持するためのチャンバ：及び第１の端部にて、該消化 チャンバの出口ポートに選択的に連結され、且つ第２の端部にて、弁によって内 皮細胞産物を分離するためのアンプルに選択的に連結される分離チャンバ、を備 えるシールされた消化チャンバを具備することを特徴とする装置。

補正書の翻訳文提出書 （特５′「法第１８４条の８） 平°成　７年　１月３１日１ 特にγ庁長官　高　島　章　殿 １、特シ′１出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９３１０７２１６ ２、発明の名称 内皮細胞産物を製造するために脂肪組織を処理する装置及び方法３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国ペンシルバニア州１９１０７゜フィラデルフィア、イレ ブンス・アンド・ウオールナツト・ストリーラ（番地なし） 名称トーツス・ジェファーソン・ユニバーシティ　（外１名）４、代理人 住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区 電話　３２７０−６６４１〜６６４６ ５　補１Ｙ書の提出日 明細書 内皮細胞産物を製造するために脂肪組織を処理する装置及び方法関連出願に対す る記載 本願は、１９８５年６月６日付は出願の出願番号第７４２．０８６号であって１ ９８９年４月１１日付は発行の米国特許第４，８２０，６２６号「合成あるいは 天然に得られる微小血管内皮細胞を備える表面の処理方法及び処理された表面そ のものＪ　（”Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｔｒｅａｔｉｎｇ　ａ　５ｙｎｔｈｅｔｉ ｃ　ｏｒ　Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　５浮窒■≠■ ｅ　ｗｉｔｈ　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ ｌｓ、　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｔｒｅａｔｅｄ　５ｕｒｆａｃｅ@Ｉｔｓｅｌｆつ の分割出願である１９８８年９月１２日付は出願の出願番号第２４４．４９６号 「合成あるいは天然に得られる微小血管内皮細胞を備える表面の処理方法及び処 理された表面そのもの」（“＾Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｔｒｅａｔｉｎｇ　ａ　５ ｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｏｒ　Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　５ｕｒｆ ａｃｅ　ｗｉｔｈ　Ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃ ｅ１ｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｔｒ■≠唐狽■п@５ｕ ｒｆａｃｅ　Ｉｔｓｅｌｆ”）の一部継続出願である１９８９年５月２４日付は 出願の出願番号第３５６，４３１号であって１９９１年６月３０日付は発行の米 国特許第５．０３５．７０８号「内皮細胞獲得及び堆積キットＪ　（”Ｅｎｄｏ ｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｒｏｃｕｒｅｉｅｎｔ　ａｎｄ　Ｄｅｐｏｓｉｔ ｉｏｎ　Ｋｉｔ”）の一部継続出願である１９９０年２月９日付は出願の出願番 号第４７７．７３３号「内皮細胞産物を製造するために脂肪組織を処理する装置 Ｊ　（”Ｄｅｖｉｃｅ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｆａｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ 　ｔｏ　Ｐｒｏｄｕｃｅ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　bｅ１ｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ“）の一部継続出願であり、これらの出願内容は本願に参照とし て取り込まれている。また前記出願のそれぞれは、本願のＢｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃ ｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙとの共同譲受人であるＴｈｏｍａｓ　Ｊ ｅｆｆｅｒｓｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに対して、全体あるいは部分的に壌渡 されている。

さらに、本願は、１９９１年５月３日付は出願の出願番号第６９５．４７４号で あって、取り下げられた「脂肪組織を採集し処理して、微小血管内皮細胞を獲得 するための装！及び方法Ｊ　（Ｄｅｖｉｃｅ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　 ＣＣｏ１１ｅｃｔｉｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｆａｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ 　ａｎｄ　Ｐｒｏｃｕｒｉｎｇ　Ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉ ａｌ　Ｃｅ１ｌｓ”）の一部継■o 願でもある。

本願は、１９８６年１１月６日付は出願の出願番号第９２７．７４５号「補綴物 表面の内皮細胞の適用範囲を決定する方法Ｊ　（Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｄｅｔｅ ｒ＋ａｉｎｉｎｇ　Ｅｎｄｏｔｈｅ照すれば、それぞれ、ファンネル１５の頂部 縁部１６に隣接して位置付けられている平坦な横断スクリーン３０を有すること が好ましい。図５の実施例は、かようなスクリーン３０を含んでいないことに注 意されたい。チューブ３１は、ファンネル１５の頂点３２に連結する。チューブ ３１は、垂直チャンネルに連結された一対の離隔したポート３４．３５を備える 。該垂直チャンネルは、チューブ３１内に中心的に位置付けられたアンプル３６ を形成する。ポート３４．３５は、図４に示すように、それぞれ弁３７．４５に より、アンプル３６に選択的に連通ずるためのものである。弁３７．４５は、医 療用アクセサリ−に一般に見られるような簡易なストップコックでもよい。この 選択的な連通を達成するために、弁３７を矢印４６で示されるように回転させ、 弁４５を矢印４７で示されるように回転させる。矢印４８．４９は、ポート３４ ．３５を通る２つの流れ方向を示す。

弁３７．４５を用いることで、リンスされ、消化され、処理された組織を無菌状 態下で、アンプル３６内で、微小血管内皮細胞ペレットとして、分離することが 可能となる。該ペレットを除去するために、弁３７．４５を調節して、ポート３ ４．３５の一方を通してペレットを引き抜（ことができる。

図２Ａは、遠心分離中に、弁３７．４５を通る流路の概略図を示す。この流路は 、図２Ａに示されるように、アンプル３６の底部のトラップ３８内に赤血球細胞 をトラップする。赤血球細胞は微小血管内皮細胞よりも濃いので、遠心分離中に トラップ３８には赤血球細胞が採集される。遠心分離後、弁３７．４５は、概略 的に図３Ａに示されるように調節される。示されるように、真空吸引すなわちポ ート３４．３５のいずれかに負荷された圧力により、分離された細胞をアンプル ３６及びトラップ３８から除去することができるように、２つの流路が可能とな る。

本発明の別の特徴において、内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理す る方法が開示される。この方法の好ましい実施例での種々の工程は、図６の概略 ダイアグラムに示されている。該方法を行うために、本願に記載されたような内 皮細胞産物を製造するために組織を処理するための容器１１が準備される。容器 １１は、リンス及び消化チャンバ１９、排水チャンバ２２．２４及び分離チャン バ２９を有することが好ましい。

ぞれの弁３７．４５が第１の位置にあるとき、両者の間に形成されるアンプル３ ６の中間部での連通が可能となる。弁３７．４５が第２の位置にあるとき、アン プル３６とポート３４．３５の外部との連通が可能となる。本願に記載されてい る方法を実施する際には、両方のアンプル弁３７．４５を最初、第１の位置にお き、図８に示されている装置を、消化チャンバ１９に連結する２つのポート２０ ．１３０と連結される脂肪吸引ラインに整列するキャッチ−トラップとして用い ることが好ましい。脂肪を採集後、脂肪吸引ラインは外され、ポート２０．２３ ０はキャップされる。リンス溶液（例えば、１９９Ｅ培地、ハンクス液、食塩、 ＰＢＳあるいは他の生理用バッファ溶液）が、別のポート２２９を通して導入さ れる。脂肪は、シェーカーテーブル上での震盪、手動による震盪等の外部手段に より、リンス溶液中で震盪される。震盪は、入りロボート２３０あるいは同様の ポートを用いて、組織を震盪するためにシールされた消化チャンバ１９にガスを 入れて、行われてもよい。次いで、装置は、アンプル側を上にして遠心分離機内 に置かれ、通常は閉鎖されている逆止弁２２０が開放し、リンス溶液が排水チャ ンバ２２内に排水されるまで、回転させられる。この遠心分離工程の間、排出管 ２２２内のポール逆上弁２２４は開放して、リンス溶液によって置換された空気 を排水チャンバ２２から排出可能とする。次いで、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、 トリプシンあるいは他の組織消化酵素等の消化酵素溶液は、リンス溶液として同 じポート２２９を通して導入され、再度農機される。消化が完了すると、アンプ ル側を下にして、装置は再び遠心分離にかけられる。アンプル３６内に分離され ている内皮細胞を分離するために、両方の弁３７．４５を第２の位置に転位させ る。

次いで、内皮細胞「ペレット」は、アンプルボート３４．３５の一方へ圧力ライ ンを取り付けることにより、流し出される。

図９に示す別の実施例において、４つのチャンバ、すなわち消化チャンバ１９、 排水チャンバ２２、酵素チャンバ２１３及び分離チャンバ２９を有する容器を備 える装置が提供される。該消化チャンバ１９は、通常は閉鎖されている逆止弁２ ２０を含むプレート２１８により、排水チャンバ２２から分離されている。スク リーン２１６は、逆止弁２２０の入り口をカバーする。浮遊しているボール逆止 弁２２４を含む排出管２２２は、排水チャンバ２２から分離チャンバ２９内に延 びる。該排水チャンバは、プレート２１７により、酵素チャンバから分離されて いる。消化チャンバ１９は、通常は閉鎖されている逆止弁２２１を含むプレート ２１８により、酵素チャンバ２１３から分離されている。浮遊しているボール逆 止弁２２５を含む排水管２２３は、消化チャンバ１９から酵素チャンバ２１３の 頂部に延びる。酵素チャンバ２１３は、ポート２２６により、外部と連通ずる。

消化チャンバ１９は、−列のポート２０．２２９．２３０により、外部と連通ず る。消化チャンバ１９は、スクリーン３０により、分離チャンバ２９から分離さ れている。分離チャンバ２９は、２つのポート３４．３５を所有し、該ポートの それぞれは、弁３７．４５を含む。該弁３７．４５は、第１の位置にあるとき、 アンプル３６の中間部、上部、底部間の連通を可能とする。第２の位置にあると き、アンプル３６の中間部とポート３４．３５の外部とを連通する。

最初に、両方の弁３７．４５は、第１の位置にある。装置は、２つのポート２０ ．２３０に連結する脂肪吸引ラインと整列するキャッチ−トラップとして用いら れる。脂肪が採集された後、脂肪吸引ラインは外され、ポート２０及び２３０は キャップされる。リンス溶液（例えば、１９９Ｅ培地、ハンクス液、食塩、ＰＢ Ｓあるいは池の生理用バッファ溶液）が、ポート２２９を通して導入され、消化 酵素溶液（例えば、コラゲナーゼ、ジスパーゼ、トリプシンあるいは他の組織消 化酵素）が、ポート２２６を通して導入される。脂肪は、リンス溶液内で、シェ ークする等外部の手段により、震盪される。次いで、装置は、アンプル側を上に して、遠心分離機内に置かれ、通常は閉鎖されている逆上弁２２０が解放し、リ ンス溶液を排水チャンバ２２内に排水するまで、回転させられる。この遠心分離 の間、排出管２２２内のボール弁２２４は解放しており、排水チャンバ２２から リンス溶液により置換された空気の排出を可能とする。次いで、装置は、アンプ ル側を下にして、遠心分離機内に置かれ、通常は閉鎖されている逆上弁２２１が 解放して酵素溶液を消化チャンバ１９内に排水するまで、回転させられる。この 遠心分離工程の間、排出管２２３内のボール弁２２５は解放しており、消化チャ ンバ１９から酵素溶液により置換された空気の排出を可能とする。次いで、脂肪 は、消化を促進するために酵素溶液中で震盪される。消化が完了すると、装置は 、アンプル側を下にして、再度、遠心分離にかけられる。アンプル３６内に分離 されている内皮細胞を分離するために、両方の弁３７．４５は、第２の位置に転 位される。ついで、内皮細胞ペレットは、アンプルボート３４．３５の一方に補 正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　７年　１月３１日　１ 特５′［庁長官　高　島　章　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９３１０７２１６ ２、発明の名称 内皮細胞産物を製造するために脂肪組織を処理する装置及び方法３、特許出願人 ４、代理人 ５、捕１Ｆ古の提出口 請求の範囲 １、内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理するための装置において、 囲包体（１８）内にあって、組織を受け入れるためのリンス及び消化チャンバ該 リンス及び消化チャンバと同一の囲包体（１８）内にあって、該リンス及び消化 チャンバからの排出流体が第１のスクリーンを通して流れた後に、該排出流体を 受け入れるための独立の排水チャンバ；該リンス及び消化チャンバからの内皮細 胞産物を受け入れるための独立の分離チャンバであって、ここで該第１のスクリ ーンが、該リンス及び消化チャンバを該排水チャンバ及び分離チャンバから分離 する単一のスクリーン構造を備え、該リンス及び消化チャンバは第２のスクリー ンによって分離チャンバから分離されることを特徴とする独立の分離チャンバ； 該排水チャンバと連結される真空源； 該リンス及び消化チャンバと脂肪源とを連結する入りロボート；及び該排出流体 を選択的に引き抜くための該排水チャンバ内の出口ポートを備える単一の容器を 具備し、 該排水チャンバ及び分離チャンバは、内皮細胞産物を製造するために、無菌状態 下、該容器内で、組織のリンス、消化及び処理を可能とする、ことを特徴とする 装置。

６　前記分離チャンバは、アンプルを形成するチャンネルにより連結されている 一対のポートを用いる出口によりリンス及び消化チャンバに連結されており、各 ポートを通してアンプルへの流れ及びアンプルからの流れを制御するために、該 アンプルと一対のポートのそれぞれとの間を選択的に流体連通状態とするための 弁手段、を備えることを特徴とする請求項１の装置。

７、内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理するための装置において、 組織をリンスし、排出し、消化し及び分離するための単一の容器が、該組織を採 集し処理するための容器内のリンス及び消化チャンバ：リンス溶液を受け入れ、 且つ対象から組織を引き抜くための脂肪吸引手段がらの組織を受け入れるために 、該リンス及び消化チャンバに連結されている入り０該リンス及び消化チャンバ と流体連通状態にあり、さらに真空源と流体連通するための連結部を備える排水 チャンバ；該リンス及び消化チャンバを該排水チャンバから分離する第１のスク リーンであって、リンス溶液を含む排出流体が該リンス及び消化チャンバから該 第１のスクリーンを通して該排水チャンバまで流れるような第１のスクリーン； 該リンス及び消化チャンバと流体連通状態にあり且つ第２のスクリーンによって 該リンス及び消化チャンバから分離されていて、無菌状態下でリンスされ消化さ れ処理されて製造された組織から細胞を分離可能とする分離チャンバ；該分離チ ャンバと連結されており且つ該分離チャンバと選択的な流体連通状態にあるアン プル： 該アンプルに連結されている一対のアンプルポートであって、一方のアンプルポ ートは該分離チャンバ及び該アンプルの間の選択的な連結を与え、他方のアンプ ルポートは該アンプル及び外部環境の間の選択的な連結を与える一対のアンプル ポート：及び 該アンプルポートのそれぞれと作動的に結合しており、該各アンプルポート、該 アンプル及び該分離チャンバの間の流体連通状態を選択的に制御するアンプル弁 手段を備え、 こうして、アンプル内で堆積した内皮細胞を該アンプル弁手段の選択的な作動に より分離する、ことを特徴とする装置。

８、内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理するための装置において、 消化チャンバ： 独立の排水チャンバ：及び 独立の分離チャンバ、の３つのチャンバを備える単一の容器を具備し、ここで、 該排水チャンバ及び該分離チャンバは、該消化チャンバと流体連通状態にあり、 該分離チャンバは、内皮細胞産物を受け入れるためのアンプルに第１の弁により 選択的に連結されており、 該消化チャンバは、消化チャンバ及び排水チャンバを連結する弁であって、通常 は閉鎖されている逆上弁の作動により、選択的且つ択一的に該排水チャンバ及び 該分離チャンバとの流体連通状態におかれ、こうして、該排水チャンバに該消化 チャンバを連結することで組織を消化し、該消化チャンバを該分離チャンバに連 結することにより組織を処理し、無菌状態下、単一の容器内で、内皮細胞産物を 製造する、ことを特徴とする装置。

１０、さらに、前記排水チャンバから前記分離チャンバに延びており、逆止弁を 通る流れを可能とするための内部排出管と、該排出管は該排水チャンバ及び該分 離チャンバの間の流体流れを調節する弁と、を備えるをことを特徴とする請求項 ８の装置。

１１、さらに、第２の弁を備え、前記第１の弁及び該第２の弁のそれぞれは少な くとも２つの位置を有しており、第１の位置において、第１の弁は分離チャンバ 及びアンプルの間の連通を可能とし、第２の弁はアンプル及び出口ポートの間の 連通を可能とし、第２の位置において、両方の弁はアンプル内で内皮細胞産物を 分離することを特徴とする請求項８の装置。

１２、さらに、採集された脂肪、リンス溶液及び酵素溶液を消化チャンバ内に導 入するために、消化チャンバと連通状態にて前記容器に添付された少なくとも１ つの入りロポートを備えることを特徴とする請求項８の装置。

１３、内皮細胞産物を製造するために組織を消化し処理するための装置において 、（ａ）酵素貯蔵チャンバ；　（ｂ）独立の排水チャンバ：ｃ）該排水チャンバ 及び酵素チャンバに択−的且つ選択的に連結される独立の消化チャンバ；及び（ ｄ）該消化チャンバに選択的に連結される独立の分離チャンバ、の４つのチャン バを備える単一の容器を具備し、 ここで、該分離チャンバは、第１の弁により、該内皮細胞産物を受け入れるため のアンプルに選択的に連結され、 こうして該装置は、消化チャンバを酵素貯蔵チャンバ及び排水チャンバに連結す ることで組織の消化を可能とし、消化チャンバを分離チャンバに連結することで 組織の処理を可能とし、無菌状態下で、単一の容器内で、内皮細胞産物を製造１ ４、前記酵素貯蔵チャンバは、弁を通して前記消化チャンバと選択的に連通し、 且つポートを通して外部環境と連通することを特徴とする請求項１３の装置。

１５、前記酵素貯蔵チャンバ及び前記消化チャンバの間の弁が、通常は閉鎖され ている逆上弁であり、前記装置を遠心分離にかけることで前記酵素貯蔵チャンバ 内部の圧力が増加する場合に開放する弁であることを特徴とする請求項１４の装 置。

１６、前記消化チャンバは、さらに、消化されるべき組織を該消化チャンバ内に 導入するための手段と、該組織をリンスするためのリンス流体を該消化チャンバ 内に導入する手段と、を備えることを特徴とする請求項１３の装置。

フロントページの続き （７２）発明者　アルチャス、ポール・ジー・アメリカ合衆国ニューシャーシー 州０７４７０゜ウェイン、ポンズ・サークル　２９ （７２）発明者　プライス、アルフレッド・ダブリューアメリカ合衆国ニューシ ャーシー州０７４２１゜ヘウィット、アウォスティング・ロード（７２）発明者 　ジャーレル、ブルース・イーアメリカ合衆国アリシナ用８５７１８．　トゥー ソン、ノース・ヴイア・エレナ　５７００（７２）発明者　ウィリアムス、スチ ュアート・ケイアメリカ合衆国アリシナ用８５７１８．　トゥーソン、ノース・ サーク口・ソブリオ　５１３１（７２）発明者　ディピサ、ジョセフ・エイ、ジ ュニア−アメリカ合衆国ニューシャーシー州０７４８１゜ワイコフ、メアリーア シ・レーン　８４

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理するための装置であって： リンス及び消化チャンバ、ドレインチャンバ及び分離チャンバを有する容器を備 え、これらのチャンバは、該容器内で、無菌状態下で、内皮細胞産物を製造する ために、組織をリンスし、消化し及び処理可能とする、ことを特徴とする装置。
2. ２．前記リンス及び消化チャンバは、スクリーンにより前記排水チャンバから分 離されていることを特徴とする請求項１の装置。
3. ３．前記リンス及び消化チャンバは、スクリーンにより前記分離チャンバから分 離されていることを特徴とする請求項２の装置。
4. ４．前記スクリーンは、前記リン及び消化チャンバを前記排水チャンバ及び前記 分離チャンバから分離し、前記排水チャンバは前記リンス及び消化チャンバを取 り囲み、前記排水チャンバは真空源との連結部を有することを特徴とする請求項 ２の装置。
5. ５．前記リンス及び消化チャンバは、脂肪源と流体連通するための入り口を含む ことを特徴とする請求項４の装置。
6. ６．前記分離チャンバは、アンプルを形成するチャンネルにより連結される一対 のポート、及び該アンプルと該一対のポートのそれぞれとの間を選択的に流体連 通させ、該ポートのそれぞれを通して該アンプルヘの流れ及び該アンプルからの 流れを制御するための弁手段を備えることを特徴とする請求項１の装置。
7. ７．組織をリンスし、排水し、消化し及び分離するための容器を備える内皮細胞 産物を製造するために組織を採集し処理するための装置であって：組織を採集し 処理するための該容器内のリンス及び消化チャンバ；リンス溶液及び脂肪吸引手 段を流体連通させるための該リンス及び消化チャンバ内の入り口； 該リンス及び消化チャンバと流体連通し、且つ真空源と流体連通するための連結 部を有する排水チャンバ； 該リンス及び消化チャンバを該排水チャンバから分離して、該リンス及び消化チ ャンバから該排水チャンバへリンス溶液を濾過しながら移すことを可能とする第 １のスクリーン； 該リンス及び消化チャンバと流体連通し且つ第２のスクリーンにより分離されて おり、無菌状態下で、リンスされ消化され及び処理されて製造された組織から細 胞を分離することを可能とする分離チャンバ；該分離チャンバと流体連通するア ンプル；該アンプルと流体連通する一対のポート；及び該ポートのそれぞれと作 動的に結合しており、該ポートのそれぞれと該アンプルと該分離チャンバとの間 の流体連通を選択的に制御する弁手段を備え、該アンプル内に堆積した内皮細胞 を該弁手段の選択的な作用により分離することを特徴とする備える。
8. ８．内皮細胞産物を製造するために組織を採集し処理する装置であって：消化チ ャンバ；独立の排水チャンバ；及び該排水チャンバと選択的に流体連通状態にあ る独立の分離チャンバの３つのチャンバを備える単一の容器を具備し、ここで、 該分離チャンバは、該内皮細胞産物を受け入れるためのアンプルに弁により選択 的に連結され、該消化チャンバは選択的に且つ択一的に、該排水チャンバ及び分 離チャンバと流体連通状態にあり、こうして、該装置は、消化チャンバを排水チ ャンバに連結することにより組織の消化を可能とし、また消化チャンバを分離チ ャンバに連結することにより組織の処理を可能として、無菌状態下で、単一の容 器内で、内皮細胞産物を製造することを特徴とする装置。
9. ９．さらに、前記消化チャンバ及び分離チャンバに連結する、通常は閉鎖されて いる逆止弁を備えることを特徴とする請求項８の装置。
10. １０．さらに、前記排水チャンバから前記分離チャンバ内へ延びており、且つ前 記逆止弁を通る流れを可能とするための内部排出管を備えることを特徴とする請 求項９の装置。
11. １１．さらに、それぞれ少なくとも２つの位置を有する第１及び第２の弁を備え 、第１の位置において、該第１の弁は、消化チャンバとアンプルとの連通を可能 とし、第２の弁は、アンプルと出口ポートとの連通を可能とし、第２の位置にお いて、両方の弁は、アンプル内で内皮細胞を分離する、ことを特徴とする請求項 ８の装置。
12. １２．さらに、採集された脂肪、リンス及び酵素溶液を消化チャンバ内に導入す るために、消化チャンバと連通状態にて前記容器に添付された少なくとも１つの 入り口ポートを備えることを特徴とする請求項８の装置。
13. １３．内皮細胞産物を製造するために組織を消化し処理するための装置であって ： （ａ）酵素貯蔵チャンバ；（ｂ）独立の排水チャンバ；（ｃ）該排水チャンバ及 び該酵素貯蔵チャンバに択一的にまた選択的に連結されている独立の消化チャン バ；及び（ｄ）消化チャンバに選択的に連結されている独立の分離チャンバの４ つのチャンバを備える単一の容器を具備し、ここで、該分離チャンバは、第１の 弁により、該内皮細胞産物を受け入れるためのアンプルに選択的に連結されてお り、こうして、消化チャンバを酵素貯蔵チャンバ及び排水チャンバに連結するこ とにより該組織の消化を可能とし、また消化チャンバを分離チャンバに連結する ことにより該組織の処理を可能とし、無菌状態下、単一の容器内で、内皮細胞を 製造することを特徴とする装置。
14. １４．前記酵素貯蔵チャンバは、弁を通して前記消化チャンバと選択的に連通し 、且つポートを通して外部環境と連通することを特徴とする請求項１３の装置。
15. １５．前記酵素貯蔵チャンバ及び前記消化チャンバの間の前記弁が、通常は閉鎖 されている逆止弁であり、前記装置を遠心分離にかけることより前記酵素貯蔵チ ャンバ内部の圧力が増加する場合に開放する弁であることを特徴とする請求項１ ４の装置。
16. １６．前記消化チャンバは、さらに、消化されるべき組織を該消化チャンバ内に 導入する手段と、該組織をリンスするためのリンス流体を該消化チャンバに導入 する手段と、を備えることを特徴とする請求項１３の装置。
17. １７．内皮細胞産物を製造するために組織を消化し分離するための装置であって ： 組織を入れるための第１の入り口ポートと、酵素を入れるための第２の入り口ポ ートと、リンス溶液を入れるための第３の入り口ポートと、組織を震盪するため にシールされた消化装置にガスを入れるための第４の入り口ポートと、消化され た組織を選択的に噴出し且つ消化されていない組織を保留するための出口ポート と、を含む組織を保持するためのチャンバを備えるシールされた消化チャンバ： 及び 該消化装置に選択的に連結されており、さらに内皮細胞産物を分離するためのア ンプルに弁により選択的に連結されている分離チャンバを備えることを特徴とす る装置。
18. １８．以下の工程を備えることを特徴とする内皮細胞産物を製造するために組織 を採集し、処理する方法： 内皮細胞産物を製造するために、組織を処理するための採集容器であって、独立 の排水チャンバ及び分離チャンバと流体連通するリンス及び消化チャンバを有す る容器を準備する工程； 該リンス及び消化チャンバ内に処理されるべき組織を導入する工程；該リンス及 び消化チャンバ内にリンス溶液を導入する工程；該排水チャンバ内に通過したリ ンス溶液の処理されるべき組織をスクリーンするべく該容器を方向づける工程； 該リンス及び消化チャンバ内に酵素を導入する工程；該組織を該酵素で消化すべ くリンス及び消化チャンバを震盪しながら、十分な時間及び温度で、該組織及び 該酵素を加熱する工程；消化された組織からの細胞をリンス及び消化チャンバか ら分離チャンバ内に移すために、該容器を遠心分離する工程；及び該細胞を徴小 血管内皮細胞のペレットとして分離する工程。
19. １９．さらに、弁手段の適用により、微小血管内皮細胞のペレットとして、アン プル内で、前記消化された組織からの細胞を分離する工程を備えることを特徴と する請求項１８の方法。