JPH07509732A - 脂質と結合し且つ輸送する糸状菌タンパク質と，それらの調製方法と，それらの利用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 脂質と結合し且つ輸送する糸状菌タンパク質と、それらの調製方法と、それらの 利用 本発明は、一群の脂質結合・輸送タンパク質（ｌｉｐｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａ ｎｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）と、それらのタンパク 質の菌類からの調製方法と、それらのタンパク質の美容術、農業／食品工業及び 薬剤分野への利用に関するものである。

本発明は、また、上記のタンパク質を含む粗製（ｃｒｕｄｅ　）の画伯出物と、 それらの抽出物の薬剤、美容術及び農業／食品分野での利用とに関する。

リン脂質転移タンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒ ｏｔｅｉｎｓ、ＰＬＴＰ）が、炭素源としてグルコースを用いた合成培地で培養 されたムコル・ムセド（Ｍｕｃｏｒｍｕｃｅｄｏ、　ケカビ）、アスペルギルス ・オクラセウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｃｈｒａｃｅｕｓ　。

コウジカビ）若しくはネウロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａ ｓｓａ　、アオパンカヒ）等の菌類から分離されている（Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｊ、 　Ｂｉｏｃｈｅａ、　＋９９０．２２．１．９３−９８；　Ｄｅｖｅｌｐ、　Ｐ ｌａｎｔ　Ｂｉｏｌ、、　１９８４．９．３０３−３０６；　ＢＢＡ、　１９９ ２．　＋１２６．３．２８６−２X０　） 。しかし、上記の合成培地で培養された菌類から得られるＰＬＴＰの量は僅かに 過ぎず（収率か極めて低い）、そのために、上記の培養方法は工業的に利用する ことか困難である。

脂質の膜間輸送を行う性質を有する脂質結合・輸送タンパク質や、ある種のリン 脂質〔ホスファチジルグリセロール（ＰＣ）、ホスファチジルイノシトール（Ｐ Ｉ））の選択的輸送を行うタンパク質を大量に調製する方法に対しては、極めて 高い要求がある。それらのタンパク質は、特に、薬物分野と美容術の両方で広い 利用範囲を有するリポソームの作用性能の改善に有効であり、また、一般に、修 正生体膜（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ　）の生産に有用であ る。

本発明の目的は、糸状菌から大量に生産され得て、脂質（リン脂質及びステロー ル）及び有効成分の選択的膜間輸送を行う性質を存するリン脂質転移タンパク質 （ＰＬＴＰ）であって、実際の使用上の諸要件に一層適し、特に、膜の生物学的 作用及び表面活性作用の改善を可能にするものを提供することである。

実際に、膜は、生物体の発生過程における多くの機能の基礎であり（細胞認識と 交換、呼吸、分泌等）、それはまた修正され類い障壁である。生体膜工学は、膜 の組成と組織の両方の修正を扱う。

本発明の主題は、非毒性糸状菌（ｎｏｎ−ｔｏｘｉｃ　ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ 　ｆｕｎｇｉ　）からリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）を調製する方法であ って、粗抽出物の調製と、その抽出物からの前記タンパク質の分離と、そのタン パク質の精製とを含み、前記菌か富リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ｒｉ ｃｈ　）培地において培養されることを特徴とする方法を提供することである。

本方法の有利な態様によれば、前記富リン脂質培地は、３〜２０ｇ／ｆのリン脂 質を含んでいる。

本方法の他の有利な態様によれば、 （１）（ａ）前記菌を前記富リン脂質培地において充分な量の菌糸体（ｍｙｃｅ ｌ　ｉｕｍ）か得られるまで培養し、 （ｂ）その得られた菌糸体を、中性ｐＨの抽出用緩衝剤中において破砕（ｇｒｉ ｎｄ）Ｌ、 （Ｃ）その得られた破砕物から、 ・　その破砕物を約２０，０００ｇを越える速度で遠心分離（第１回遠心分ｌｌ １１＋）シて得られる上澄みＳｌを回収し、・　回収した上澄みＳｌを、酸によ り沈殿（ａｃｉｄ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させた後に、約２０，０００ ｇを越える速度で遠心分離（第２回遠心分離）して得られる上澄みＳ２を回収す る ことにより、脂質結合・転移タンパク質を含む粗抽出物（ｌｉｐｉｄ　ｂｉｎｄ ｉｎｇａｎｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　）を分離し、（ｄ）上澄 みＳ２から得られた脂質結合・転移タンパク質を含む粗抽出物を略中性ｐＨに緩 衝させる ことにより、略中性ｐＨの粗抽出物を調製し、（２）前記タンパク質を限外濾過 によって濃縮し、（３）脂質結合・転移活性を有する分画をゲルを用いて分離し 、その活性分画を脂質結合・転移活性を測定することによって１Ｍ過、選択し、 （４）選択された種々の分画のタンパク質を一連のクロマトグラフィ工程におい て精製すること を含み、その精製されたタンパク質は、活性成分と組み合わされることにより若 しくは組み合わされることなく、脂質の膜間結合（ｉｎｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ 　ｂｉｎｄｉｎｇ　）、輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　）　、及び／又は、再配列 （ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ　）を行う性質を有し、疎水性て且っ酸性であり 、５０ｋＤａより低い分子量を存している。

本方法の池の有利な態様によれば、前記糸状菌が、アスペルギルス・カンジダス （Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｃａｎｄｉｄｕｓ）　、アスペルギルス・フラヴイ ペス（Ａ、　ｆｌａｖｉｐｅｓ　）、アスペルギルス・フミガタス（Ａ、　ｆｕ ｍｉｇａｔｕｓ）　、アスペルギルス・ギガンテウス（Ａ、　ｇｉｇａｎｔｅｕ ｓ）　、アスペルギルス才りラセウス，アスペルギルス・オリゼ（Ａ．　ｏｒｙ ｚａｅ　）　、アスペルギルス・テレウス（Ａ．　ｔｅｒｒｅｕｓ）　、アスペ ルギルス・ヴエルシコロル（Ａ．　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ　）　、アスペルギル ス・ウエンティイ（Ａ．　ｗｅｎｔｉｉ　）　、ペニシリウム・ロクエフォルテ ィイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｉ　）及びエラロチイウ ム・ケヴアリエリ（Ｅｕｒｏｔｉｕｍｃｈｅｖａｌｉｅｒｉ　）から選択される 子嚢菌類と、ムコル・ムセド及びリゾプス・ストテ・クリソスポリウム（Ｐｈａ ｎｃｒｏｃｈａｃｔｃ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ　）種から選択される担子 菌類とを含む群から選択される。

本発明の目的においては、上記の種々の群には、母系（、ｍｏｔｈｅｒ　ｓｔｒ ａｉｎｓ）とそれら母系の変株（ｖａｒｉａｎｔｓ）若しくは突然変異株（ｍｕ ｔａｎｔｓ　）の両方が含まれ得る。。

上記した種々の株は、それらに対して雨らの限定も意図するものではないが、特 に・以下の表に掲げる７レクシ・ン（ｃｏｌｌ．ｅｃｔｉｏｎｓ　）に寄託され たものを利用することができる。

株　株Ｎｏ．　と寄託コレクション アスペルギルス・カンジダス　Ｎｏ．２．１２　’　ＬＭＴＣアスペルギルス・ フラヴイペス　Ｎｏ．’２．６’　ＬＭＴＣアスペルギルス・フミガタス　Ｎ＋ ｏ’．９７８　ＭＵＣＬアスペルギルス・ギガンテウス　Ｎｏ、２．　８　ＬＭ ＴＣアスペルギルス・ニゲル　Ｎｏ、２．　７　ＬＭＴＣアスペルギルス・オク ラセウス　Ｎｏ、１４２０７　ＭＵＣＬアスペルギルス・オリ七　Ｎｏ、２．１ ４　ＬＭＴＣアスペルギルス・テレウス　Ｎｏ、２１９３２　ＭＵＣＬアスペル ギルス・ヴエルシコロル　Ｎｏ、２．　ｌ　ＬＭＴＣアスペルギルス・ウエンテ ィイ　Ｎｏ、１０４３　ＭＵＣＬベニツリウム・ロクエフォルティイ　Ｎｏ、２ ９０８３　ＭＵＣＬエウロティウム・ケヴアリエリ　Ｎｏ、２．ｌＯＬＭＴＣム コル・ムセド　Ｎｏ、１８５５２　ＭＵＣＬリゾプス・ストロニフエル　Ｎｏ、 ５．４　ＬＭＴＣファネロカエテ・クリソスポリウム　Ｎｏ、Ｆ１７−６７　Ｌ ＢＣＦ上記の種々の株は、その種類により、ナンド（Ｎａｎｔｅｓ）にあるザ・ ＩＮＲＡ・ラボラトリ・オブ・セリアル・マイクロバイオロジー・アンド・テク ノロジー（ｔｈｅ　ＩＮＲＡ　Ｌａｂｏｒａｊｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｅｒｅａｌ　Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　、ＬＭＴＣj、 ヘルギーにあるす・ファンガス・カルチャー・コレクション・オブ・ザ・カトリ ソク・ユニヴアーシティ’オプ・ルーパン（ｔｈｅ　Ｆｕｎｇｕｓ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　Ｃａｔｈｏｌｉｃ　Ｕｎｉｖｅｒｓ ｉｔｙ　ｏｆ　Ｌｏｕｖａｉｎ　、　ＭＵＣＬ）　、及び、マルセイユ（Ｍａｒ ｓｅｉｌｌｅ　）にあるす・ｒＮＲＡ・ラボラトリ・オブ・フィラメンタスファ ンガス・バイオテクノロジー（ｔｈｅ　ＩＮＲＡ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ 　Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　Ｆｕｎｇｕｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＬＢ ＣＦ）において入手することかできる。

本方法の他の有利な態様によれば、前記（ａ）の工程が、更に、＊前記菌を胞子 形成培地において培養し、＊充分な量の胞子か得られるまで２〜１３日間インキ ュベートし、＊得られた胞子を前記富リン脂質培地において培養し、＊充分な量 の菌糸体が得られるまでインキュベートすることを含む。

本方法の他の有利な態様によれば、前記胞子形成培地が湿らせた全トウモロコシ 粒（ｍｏｉｓｔｅｎｅｄ　ｗｈｏｌｅ　ｍａｉｚｅ　ｇｒａｉｎｓ）からなる。

本方法の他の有利な態様によれば、前記（Ｃ）の工程の酸による沈殿がｐＨ５， １で行われる。

ｐＨ５，１で有利に行われる上記の酸による沈殿には、リン脂質転移アッセイ（ ａｓｓａｙｓ　）を阻害する可溶性リポタンパク質複合体から前記脂質転移タン パク質を遊離させるという利点がある。また、前記粗抽出物のｐＨを中性ｐＨに 調整することによって本タンパク質を安定化させることができる。

本方法の他の有利な態様によれば、前記（ｂ）及び（ｃ）の工程が冷温で行われ る。

本方法の他の有利な態様によれば、前記糸状菌が、糸状菌の一株であるアスペル ギルス・オリ七である。

本方法の他の有利な態様によれば、前記（５）の工程において、脂質転移活性を 存し、且つ、分子量が約１９ｋＤａのタンパク質が得られる。

本方法の他の有利な態様によれば、前記（５）の工程において、脂質転移活性を 有し、且つ、分子量が約３０ｋＤａのタンパク質が得られる。

リン脂質を炭素源として使用することは、予想以上に、リン脂質の合成部位とし ての細胞の小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ　ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ　）を特異的 に増加させ（ｘｌＯ〜２０）、従って、前記転移タンパク質の合成を増加させ、 その結果、膜脂質へ向けられた増加した代謝活性を有する高いバイオマス（ｂｉ ｏｍａｓｓ　）を得ることができる。これらの条件の下で、リン脂質転移タンパ ク質の合成が増加し、工業的に大きな利点となる。

本発明の主題は、また、脂質結合・転移タンパク質の精製された調製物であって 、 一活性成分と組み合わされることにより若しくは組み合わされることなく、脂質 の膜間結合、輸送、及び／又は、再配列を行う性質を有し、−宮リン脂質培地に おいて培養された非毒性糸状菌の粗抽出物から得られ、その菌か、アスペルギル ス・カンジダス、アスペルギルス・フラヴイペス、アスペルギルス・フミガタス 、アスペルギルス・ギガンテウス、アスペルギルス・ニゲル、アスペルギルス・ オリゼ、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・ヴエルソコロル、アスペ ルギルス・ウエンティイ、ペニシリウム・ロクエフォルティイ及びエラロチイウ ム・ケヴアリエリから選択される子嚢菌類と、接合菌類のリゾプス・ストロニフ エルと、担子菌類のファネロカエテ・クリソスポリウムとを含む群から選択され 、前記タンパク質が、Ｉｍｇ当たり、１分間に、０．３ｎｍｏ１以上のホスファ チジルコリンを転移する特異脂質転移活性を有し、−疎水性であり、且つ、酸性 であり、 −５０ｋＤａより低い分子量を存する ことを特徴とする調製物を提供することである。

菌類起源のこれらの酸性タンパク質は、脂質（リン脂質及びステロール）の膜間 結合、輸送及び転移を行う能力を有する故に、細胞膜及び生体膜の生物学的作用 及び表面活性作用を驚くほど改善する。

本発明の有利な態様によれば、前記調整物が糸状菌の一株であるアスペルギルス ・オリ七から得られる。

本発明のを利な態様によれば、前記酸性の脂質転移タンパク質が、約＋９ｋＤａ の分子量を有する。

本発明の他の有利な態様によれば、前記酸性の脂質転移タンパク質が、約３０ｋ Ｄａの分子量を有する。

１９ｋＤａのタンパク質も３０ｋＤａのタンパク質も共に脂質を転移する活性を 有する。もっとも、ホスファチジルコリンの転移については３０ｋＤａのタンパ ク質の方か＋９ｋＤａのタンパク質よりも活性能が高い。

本発明に従う前記のＰＬＴＰは、ホスファチジルグリセロールとホスファチジル コリントールの輸送を特異的且つ優先的に行う。他のリン脂質についての転移の 程度は、ホスファチジルコリン〉ホスファチジルエタノールアミン〉ホスファチ ジルセリンの順序である。

上記のタンパク質は、脂質と組み合わせられて、また、有利にはリポソームと組 み合わせられて、薬剤、美容術、及び農／食品分野に利用することができる。

前者は後者と共に、外相（ｅｘｔｅｒｎａｌ　ｐｈａｓｅ）若しくは内相（ｉｎ ｔｅｒｎａｌ　ｐｈａｓｅ）として、または、内包された形態て（ｅｎｃａｐｓ ｕｌａｔｅｄ　ｆｏｒｍ　）　、有利に組み合わせられる。

上記の脂質結合・転移タンパク質は、一般にタンパク質シャトルとも呼ば札リン 脂質及び他の疎水性分子の「天然のベクター１として使用されることにより、あ らゆる利用態様において、リポソームの作用性能を改善する。

薬剤の分野においては、本発明に従うシャトルタンパク質は有効成分のベクター として作用し、到達すべき細胞の選択を可能にする。

農／食品分野においては、これらのタンパク質は、特に、大豆レシチン（リン脂 質の主要資源）の安定化（ｖａｌｏｒｉｚａｔｉｏｎ）を許容する。

本発明の主題はまた、粗製の糸状菌抽出物であって、非毒性糸状菌から、（ａ） 前記菌を富リン脂質培地において充分な量の菌糸体が得られるまで培養し、 （ｂ）得られた菌糸体を中性ｐＨの抽出用緩衝剤中において破砕し、（ｃ）得ら れた破砕物から、 ・　その破砕物を約２０，０００ｇを越える速度で遠心分離（第１回遠心分離） して得られる上澄みＳｌを回収し、・　回収した上澄みＳｌを酸により沈殿させ た後に、約２０．０００ｇを越える速度で遠心分離（第２回遠心分離）して得ら れる上澄みＳ２を回収する ことにより、脂質結合・転移タンパク質を含む粗抽出物を分離し、（ｄ）上澄み Ｓ２から得られた脂質結合・転移タンパク質を含む粗抽出物を略中性ｐＨに緩衝 させる 二とにより得られることを特徴とする抽出物を提供することである。

上記抽出物の有利な特徴によれば、前記（ａ）の工程が、＊前記菌を天然の胞子 形成培地において培養し、＊充分な量の胞子が得られるまで２〜１３日間インキ ュベートし、＊得られた胞子を富リン脂質培地において培養し、＊充分な量の菌 糸体か得られるまでインキュベートすることを含む。

上記抽出物の他の有利な特徴によれば、前記胞子形成培地が湿らせた全トウモ０ コツ粒からなる。

上記の諸特徴に加えて、本発明は、その主題としての方法の具体的な実施例に関 する以下の記載から明らかとなる他の特徴をも含む。

もっとも、以下の具体例は本発明の詳細な説明としてのみ記載されるものであり 、本発明の如何なる限定ともならないことが理解されるべきである。

以下の工程は、富リン脂質培地における培養によって得られる菌糸体を破砕した 後に前記タンパク質を抽出し、その抽出物のリン脂質転移活性を、蛍光探子（ｐ ｒｏｂｅｓ）の供与体としてのリポソームと非標識の受容体リポソームとを用い た蛍光分光法によって検定（ａｓｓａｙ　）するものである。

２、選択菌株 接合菌類（特に接合菌亜門ケカビ目）、子嚢菌類、及び、担子菌類に属する１５ 種類の菌株を選択した。

これらの株は、ナンドにあるザ・ＩＮＲΔ・ラボラトリ・才ブ・セリアル・マイ クロバイオロジー・アンド・テクノロジー（ＬＭＴＣ）　、ベルギーにあるザ・ ファンガス・カルチャー・コレクション・オブ・す・カドリック・ユニヴアーシ ティ・才ブ・ルーパン（ＭＵＣＬ）、及び、マルセイユにあるザ弓ＮＲＡ・ラボ ラトリ・オブ・フィラメンタスファンガス・ノ（イオテクノロジー（Ｌ　Ｂ　Ｃ Ｆ）の所有に係り、それらの施設から取得されるものである。それらのリストを 、以下に示す。

子嚢菌類 エラロチイウム・ケヴアリエリ アナモルフ種（ａｎａｍｏｒｐｈｉｃ　５ｐｅｃｉｅｓ）アスペルギルス・カン ディトニス アスペルギルス・フラヴイベス アスペルギルス・フミガトユス アスペルギルス・ギガンテウス アスペルギルス・ニゲル アスペルギルス・オクラセウス アスペルギルス・オリゼ アスペルギルス・テレウス アスペルギルス・ヴエルシコロル アスペルギルス・ウエンテイイ ペニシリウム・ロクエフオルテイイ 接合菌類 ムコル・ムセド リゾプス・ストロニフエル 担子菌類 ファネロカエテ・クリソスポリウム ３、接種原の調製と培養の実施 上記菌株を、実験室において、４°Ｃで４８時間湿らせた後に１１０’Ｃで３０ 分間の殺菌を２回行った全トウモロコシ粒からなる天然培地（１０（１ｍｊ！の フラスコ１個につき４０トウモロコン粒）において培養した。インキュベーショ ン１よ２５°Ｃて１０日〜１３日（最長）間行った。この期間中に、トウモロコ シ粒の表面に菌糸体か発達し、胞子を形成した。

そられの胞子を、トウモロコシ粒の表面から、０．０３３ｇ／ｌのトウイーン８ ０の無菌溶液に〔胞子の凝集（ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ）を避けるために〕浸 したガラスピーズ（直径３ｍｍ）を震盪することによって、分離した。さらに、 得られた胞子の懸濁液をグラスウールて濾過することにより、菌糸体部とトウモ ロコシ粒の残滓を除去した。

計数（ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ　）をマラセズ細胞（Ｍａｌａｓｓｅｚ　ｃｅｌ ｌ　）上て行った。その結果、培養のための接種原は、胞子溶液を既知の体積に 等分したものを使用することにより定量することかできた。保存液の濃度は略２ ＸＩＯ’胞子／ｍｌｌのオーダてあった。

アスペルギルス・オリゼを用いて他に２つの胞子形成培地を試験しｔこ。一方（ よ、大豆粒（リン脂質に富む）を湿らせた後に１１０°Ｃで３０分の殺菌を２回 行ったしのであり、他方は、加圧滅菌器（ａｕｔｏｃｌａｖｅ　）におし）て１ ２０°Ｃで２０分間の殺菌を行った、固形の麦芽（２０ｇ／β）と酵母菌抽出物 （１ｇ／β）と寒天（１３ｇ／ｆ）とからなる合成培地（ＭＹＡ２）である。

５００ｍｌ容量の各バソフルフラス：＋　（ｂａｆｆｌｅ　ｆｌａｓｋ）に、Ｉ 　００ｍ１の培地（以下にその詳細な組成を示す）を入れた。さらに、各培地に 、２ＸＩＯ’胞子／ｍ１！の量の胞子を接種した。得られた培養を２５°Ｃで、 ３日間、１２０回転／分の回転震盪を加えながら、インキュベートした。インキ ュベーション期間の終了後、菌糸体を焼結ガラス（ｎｏ、２）上で濾過し、重さ を量った後に、−２０°Ｃてｔ東らせた。

＊使用した培地の組成 −ＫＨ２Ｐｏｔ　０．　２ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４，７Ｈｘ　Ｏ０，５ｇ／１ −ＣａＣＬ、２Ｈ２００，０１３２ｇ／Ｖ−酒石酸アンモニウム　１．８４ｇ／ Ａ−酵母菌抽出物　０．５ｇ／Ｉ！ −リン脂質の元　３〜２０ｇ／ｌ 上記リン脂質の元は、好ましくは、ホスファチジルコリンを奪ったＩル脂質の混 合物かよい。

＊懸 以下の容量を使用して行った。

一無菌窩留水　５０ｍｐ −保存液１１０ｍｌ’　：ＫＨ，Ｐｏ、２ｇ／ｆｆ、ＭｇＳ○、・７ＨｔＯ５ｇ ／１２．ＣａＣＬ　−２Ｈ２００，１３２ｇ／Ｖ０フラスコ中（こおし）て、１ ２０°Ｃて２０分間加圧滅菌し、４’Ｃて保存した。

−保存液２　１０ｒｒｌ　酒石酸アンモニウム　１８．４ｇ／１２．＋２０°Ｃ て２０分間加圧滅菌し、４°Ｃて保存した。

−保存液３　１０ｍｆ：酵母菌抽出物　５ｇ／β。１２０’ｃて２０分間加圧滅 菌し、４°Ｃて保存した。

一保存液４　２０ｍｆ　超音波浴（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ　ｂａｔｈ　）を使用 して調製しｔコ後に攪拌した５０ｇ／ｆのナンド（Ｎａｔ　）　８９゜本溶液を 引き続き１２０°Ｃて２０分間ＩＪｔｌ圧滅菌し、４°Ｃで保存した。

４　ｍ抽出物の調製 ２ｇの菌糸体（生の状態の重さ）を、約２ｇのフォンテンブロー砂（Ｆｏｎｔａ ｉｎｅｂｒｅａｕ　５ａｎｄ）と共に、乳鉢と乳棒を使用して、０℃ですりつぶ して破砕した。この砂をＨＣｊ？溶液で洗い、水で数回濯いだ後に、パスツール オーブンにおいて２００°Ｃで３９分間殺菌した。

上記破砕は、２ｍＭのＥＤＴＡ　（カチオン依存プロテアーゼ阻害剤）と４００ ｍＭのスクロース（浸透圧保護剤）と２ｍＭのジチオスレイトールと８ｍＭの２ −メルカプトエタノール（還元剤）とを加えた、ｐＨ７，０の１００ｍＭトリス （Ｔｒｉｓ）　−ＨＣｌ溶液を含む緩衝液中で行った。

以下の工程（遠心分離と粗抽出物の調製）を図１に示す。

ｐＨ５，１での酸による沈殿には、リン脂質転移検定を阻害する可溶性リポタン パク質複合体からリン脂質転移タンパク質を遊離させるという利点がある。

最後の工程では、粗抽出物のｐＨを７．８に調整することによって上記タンパク 質を安定化させる。

５　脂質転移タンパク質の存在の検出 ａ）原理・ 転移の測定は、ピレンモノマ（ｐｙｒｅｎｅ　ｍｏｎｏｍｅｒ）によって標識さ れた供与体リポソームＡ（ｒクエンチングｊ効果でブロックされている）と過剰 の非標識受容体リポソームＢの混合物に、上記リン脂質転移タンパク質を含むタ ンパク質溶液を加えた後に、希釈緩衝液中の蛍光の増加を監視することにより行 った。

「クエンチング」効果とは、孫子の濃度が高すぎるために、蛍光が減少したり、 抑制されたりすることである。

リン脂質転移活性は、図２に従って、菌タンパク質抽出物の添加の後に、２つの リポソーム集団間の探子の移動によって監視した。図２は、ピレンホスファチノ ルコリン（蛍光探子）からなる供与体リポソームＡ（・）から卵ホスファチジル コリンからなる受容体リポソームＢ（○）へのタンパク質シャトルによるリン脂 質転移の測定を示す。

ｂ）装置 上記の測定には、ＳＬＭ４８００Ｃアミンコ（Ａｍｉｎｃｏ）分光蛍光計（米国 ）を使用した。

光源はキセノンランプである。励起〔グラン・トムソン（Ｇｌａｎ　Ｔｈｏｍｓ ｏｎ）　）と発光〔ポラロイド偏光フィルム（ｐｏｌａｒｏｉｄ　ｐｏｌａｒｉ ｚｉｎｇ　ｆｉｌｍ）　）のモノクロメータは、それぞれ、３４６ｎｍと３７８ ｎｍの波長を選択する。ランプの変更について補正された測定値は、被分析溶液 についての放出信号を、標準溶液（ローダミン細胞（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ　ｃｅ ｌｌ）　）について観察された放出信号で除することによって得られる。本装置 は、水の循環によって温度調節されるキュヴエット・ラック（ｃｕｖｅｔｔｅ　 ｒａｃｋ）を備えている。本分光蛍光計はデータの取得と処理を行うことができ るマイクロコンピュータによって制御される。

Ｃ）供与体リポソームＡ。

・試験薬・使用される蛍光探子は、分子Ｍ８５２の３−バルミトイル−２−（ｌ −ピレンデカノイル）−Ｌ−ａ−ホスファチジルコリン（モレキュラー・プロー ブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）　、米国）である（図２参照）。こ れは、プラスチック管内に一２０°Ｃで保存された、１．１７μｍｏｌ／ｍｇの 乾燥抽出物として供給され、その励起の最大は３４６ｎｍであり、その発光の最 大は３７８ｎｍである。

・調製　この内容物をＩ　Ｏｍｊｌ’の無水アルコールに溶解させる。この保存 液は１１７ｍＭの濃度を持つ。ガラス管に０．５ｍｊ７を取って封入し、光を遮 断した状態で一２０°Ｃで保存した。

検定の実施に際しては、試料ｌＯμ！で、検定キュベツト内に１．１７ｎｍ。

１の探子を含むことになる。

ｄ）受容体リポソームＢ： ・試験薬：これらのリポソームの調製を、分子量７７５の卵黄−Ｌα−ホスファ チジルコリン（図２参照）の１００ｍｇ／ｍＩ！の溶液〔テトラデカン（シグマ （Ｓｉｇｍａ　）に溶解したもの〕を使用して行った。得られたものを一２０℃ で保存した。

・調製二二の溶液３８５μｌを取り、窒素流の下で１５分間蒸発させた後に、１ ０ｍｌの蛍光緩衝液（トリス−Ｈ（１２０ｍＭ、ＥＤＴＡ５ｍＭ、ＮａＣｌ！１ ００ｍＭ、ｐＨ７，４，を０．４５μミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　）フィル タで濾過したもの）に希釈することにより、異質多重ラメラ小胞（ｈｅｔｅｒｏ ｇｅｎｏｕｓ　ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｉａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　、　ＭＬＶ） からなる５ｍＭ懸濁液を得た。

単ラメラ小胞段階（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅ　ｓｔａｇｅ　、 　５ＵＶ）　ヘの移行のために、音波処理を行った。ＭＬＶに、１／２マイクロ プローブ（ｍｉｃｒｏｐｒｏｂｅ）を備えたヴイブラ細胞（Ｖｉｂｒａ　Ｃｅ１ ｌ、　ソニック・アンド・マテリアルズ（Ｓｏｎｉｃ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａ ｌｓ　）　、　ダンベリー（Ｄａｎｂｕｒｙ　）　、コネチカット州、米国）を 使用して、超音波を適用した。音波処理は、中間パワー（ポジション４）で且つ ５０％のサイクル割合（ｃｙｃｌｅ　ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）の脈動（ｐｕｌｓ ａｔｏｒｙ　）モードで実施した。この操作を、水浴で冷却しながら、各１０分 間、２度行った。得られた溶液を０．２μザルトリウス型（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 　）フィルタで濾過した後に、４°Ｃで保存した。

ｅ）検定の条件： 検定は、１０μｌの蛍光探子と１４μｌのリポソーム溶液を使用し、１．５ｍｌ の蛍光緩衝液で行った。リポソーム対蛍光探子の比率は６０とし、受容小胞（ｒ ｅｃｉｌ）ｉｅｎｔ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ）を過剰とした。

最後に、タンパク質溶液（５０μ！りを加えて、２種類のリポソーム集団間での リン脂質転移動態を開始させた。反応は２５°Ｃで行った。

ｆ）測定条件： 蛍光測定は、発光モードと励起モードにおいて、４ｍｍの光路長を用い、１０ｍ ｍのクォーツ°キュベツト（ｑｕａｒｔｚ　ｃｕｖｅｔｔｅ）において行った。

励起波長と発光波長は、それぞれ３４６ｎｍと３７８ｎｍ（蛍光探子の励起と発 光の極大）で固定し、励起モノクロメータと発光モノクロメータのそれぞれのス リットを４ｎｍとした。

ｇ）リン脂質転移活性の計算： 転移の動態を、１４００秒間継続し、５秒毎に強度を記録した。転移活性は、こ の動態（単位は時間に対する相対蛍光強度）の初期傾斜によって表される。相対 転移活性の値は、極大蛍光値との関係て計算される。この極大は、試料に２０９ ６　（Ｗ／Ｖ）のＳＤＳ溶液を加えることにより得られる。ＳＤＳは、測定キュ ベトにおいて全蛍光探子を希釈する供与体リポソームを解離させ、それにより、 「クエンチング」効果を抑制する。従って、以上の条件下で得られた蛍光強度は 、本検定（１，１７ｎｍｏｌ）に使用された探子の量に対応する。

比活性を、相対活性の、検定に使用されたタンパク質の量に対する比を計算する ことにより得た。比活性は、タンパク質１ｍｇ当たり、１分間に転移したホスフ ァチジルコリンの量（単位ｎｍｏ　Ｉ）で表した。

６　結果 ａ）リン脂質転移活性を有する株の選択培養は、最大リン脂質活性（トウモロコ シ粒から得た胞子の日齢１３田培養の日齢３日）で回収しｔこ。

試験した全ての株かリン脂質転移活性を示したが、その中に、著しく高い効率を 示す株か確認された（図３参照）。それは、アスペルギルス・オリゼであり、ア スペルギルス・カンジダスやアスペルギルス・ニゲルよりも２倍も高い活性を示 した。

図３は、種々の株の比活性（タンパク質１ｍｇ当たり、１分間に転移したホスフ ァチジルコリンの量ｎｍｏｌ）を示している。

ｂ）種々の接種原の質の比較。

トウモロコシ粒の他に、純粋な合成培地と、リン脂質を高い割合で含むことが知 られている天然培地（大豆種子）とを試験した。

最大のり〉・脂質転移活性は、トウモロコシ粒の接種原から得たアスペルギルス ・オリゼの培養の３日以内で確認された。２日目から活性が見られ、３日目から ４日巨を過ぎると減少に転じた。（図４及び図５参照）。

図４は、各接種原（−一層　トウモロコシ、−・−：大豆：−ム一：ＭＹＡ２） から得たアスペルギルス・オリゼの成長を示し、ｙ軸が培養の日数を示し、ｙ軸 かアスペルギルス・オリゼの乾重ｆｉ（単位ｇ）を示す。

図５は、各接種原から得たアスペルギルス・オリゼのリン脂質転移活性を示し、 ｙ軸が日数を示し、Ｙ軸かトウモロコシ（−口−）、大豆（−〇−）及び合成培 地（ＭＹＡ２．　−△−）て培養された各接種原の転移活性を示す。

合成培地の接種原胞子から得たアスペルギルス・オリゼの最大の転移活性は、ト ウモロコシ粒の場合と同し３日目に観察されたが、その値は後者の半分であつた 。活性はその後減少傾向を示したが、それ程急激なものではなかった（図４及び 図５参照）。

大豆種子培地の接種原胞子から得たアスペルギルス・オリゼの転移活性は、それ よりも遅く、５日目に最大を示した。活性はその後、接種原としてのトウモロコ シ粒の場合よりも僅かに低い値を示した（図４及び図５参照）。

結局、最大のリン脂質転移活性は、トウモロコシ粒での接種原から得たアスペル ギルス・オリゼについて観察された。トウモロコシ接種原から得た胞子は、また 、細胞の要求に対して一層迅速に応答した。

本タンパク質は、図６に図式化して示すように、実施例１て得た粗抽出物から精 製される。

そのために、先ず、菌糸体９００ｇ（湿重量）を、３１の抽出用緩衝液（１００ ｍＭのトリス−Ｈ（Ｊ’、ｐＨ７，０，２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのジチオスレ イト−ル、８ｍＭの２−メルカプトエタノール、４００ｍＭのスクロース）中で 破砕した。

また、粗抽出物（ｐＨ５，１での酸による沈殿の上澄み）のタンパク質を限外濾 過によって濃縮した。

粗抽出物（ｐＨ５，１での沈殿の上澄み）を濃縮するための膜として、ミリポア ・ペリコン〔λ１ｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅ１ｉｃｏｎ　（登録済み））ＰＬＧＣ 膜を使用した。この膜は、分子ｉｌｌ　０ｋＤａの分子の通過を許さず、また、 表面積が０．１ｍ２である。この限外濾過によって、粗抽出物を濃縮でき、また 、分子量が１０ｋＤａより低い全ての分子を除去することができる。

上記の技法には、タンパク質の損失が無視し得る程度であるという利点もある。

このことは、タンパク質の初期濃度がＩｍｇ／ｍＩ！を下回る場合に特に重要で ある。

精製自体には数工程が含まれ、各工程では、−転移活性の確認と、 一ドデシル硫酸ナトリウムの存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動法の実 施と、 一タンパク質の検定と か行われる。

＊第１精製工程： 緩衝液Ｂ：５０ｍＭのトリス、８ｍＭの２−メルカプトエタノール、２００ｍＭ のＮａＣｊ！、１０％（ｗ／ｖ）のグリセロール、ｐＨ７，８で平衡化したセフ ァデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　７５　（登録済み）カラム（２，６Ｘ１ ００ｃｍ）を使用し、１５ｍ！！／時の流速で、ゲル濾過を行い、各５ｍｊ７の 分画を採取した。図７（Ａ）若しくは図８（Ａ）に示すように、溶出曲線は、Ｐ ＩとＰ２の２つのピークを示した。活性を示す分画を別々に集めた。すなわち、 ピークＰＨこつｐｚては３８〜５２番目の分画を、ピークＰ２については６２〜 ７９番目の分画を集めｔこ。

＊第２精製工程　ＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ、登録済、ＦＰＬＣ ）セファデックスによるクロマトグラフィから得た両分画（約３００ｍｆ）を、 Ｐ２については（イオン強度を弱めるために）ｌ／２に希釈後、２．６Ｘ１５ｃ ｍのＤＥＡＥ−セファセルカラム上に適用した。このかラムは事前に、緩衝液Ａ で平衡化しておいた。全ての非結合タンノくり質を除去するため（こ、光学濃度 力（基線（ｂａｓｅ）に戻るまで、カラムを以下のようにして溶出した。

ａ）ＰＩタンパク質を２００ｍ１の線型傾斜（２００〜７００ｍ！！のＮａＣｊ ））で溶出し、 ｂ）Ｐ２タンパク質を３５０ｍ１の線型傾斜（１００〜５００ｍ！！のＮａＣｊ ７）で溶出した。

流速は３０ｍ１１時とし、各５ｍｆの分画を採取した。

ＰｌとＰ２に対応する転移活性は、２３〜３６番目の分画（約５００ｎＭのＮａ Ｃβ）と５１〜６１番目の分画（約３５０ｍＭのＮａ（Ｊ’）にそれぞれ溶出し ３ａ　セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ　、登録済み）Ｓ４００によるクロマ トグラフィ。上記ＤＥＡＥから得たＰ１分画の１６６ｍ１を、緩衝液Ｂで平衡化 したセファクリル８４００カラム（４，５Ｘ８５ｃｍ）上に適用した。流速は６ ０ｍ１７時とし、各５ｍｌの分画を採取した。図７（ＣＩ）は、１８５〜２０４ 番目の分画に活性ピークを有する曲線を示す。

３ｂ、モノＱ　（ＭｏｎｏＱ　、登録済み）によるクロマトグラフィ（ＦＰＬＣ ）。上記ＤＥＡＥから得たＰ２の３０ｍ１を、緩衝液Ａで平衡化したモノＱ　Ｈ Ｒ５１５カラム上に適用した。活性タンパク質の溶出を、同一緩衝液での０〜５ ００ｍＭの線型傾斜ＮａＣ１の４０ｍＡ’を用いて行った。流速は６０ｍｆ／時 とし、各２ｍｌの分画を採取した。リン脂質転移活性が、約１２０ｍＭＮａＣｊ ７で検出された。

分子量：Ｐ１分画に対応する３０ｋＤａのバンドが、ポリアクリルアミドゲルで 観察された。また、Ｐ２分画に対応する１９ｋＤａのバンドが観察された。

図７及び図８はそれぞれ、ＰＩピーク（図７）とＰ２ビーク（図８）についての 上記の各精製工程に対応し、各図のＸ軸は分画数を示し、ｙ軸は２８０ｎｍでの 吸光度（左側の軸と連続線）とリン脂質転移活性（右側の軸）を示す。リン脂質 転移活性は、等分されたもの（ａｌ　１Ｑｕｏｔｓ、　−ム一）について測定し 、１分間当たりのホスファチジルコリンのｎｍｏ　Ｉで表した。ＮａＣＡ’の傾 斜（ｍＭ）を電導度測定（破線）によって確認（ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　）　した 。

図７（Ａ）と図８（Ａ）は同一であり、セファデックス０７５カラム上でのゲル 濾過に対応する。

図７（Ｂｌ）と図７（ＣＩ）はそれぞれ、ＰＩピークについての第２と第３の精 製工程を示す（ＤＥＡＥカラム、傾斜２００〜７００ｍＭ及びセファクリル５４ ００）。

図８（Ｂｌ）と図８（ＣＩ）はそれぞれ、Ｐ２ピークについての第２と第３の精 製工程を示す（ＤＥＡＥカラム、傾斜１００〜５００ｍＭ及びモノＱ、傾斜１０ ０〜５００ｍＭ）。

２）リン脂質転移タンパク質の特徴ニ ー分子の特異性： 分子の特異性を、実施例１と同様の蛍光探子（ピレン）を用いて、蛍光によって 決定した。供与体リポソームと受容体リポソームを、Ｇ、レイファー（ＬＡＦＥ Ｒ）法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　＋ ９９１　、１０６９．１３９−１４４　）に従って、リン脂質のエタノール溶液 を適当な緩衝液に注入することによって調製した。

本発明に従うタンパク質、その中でも特にアスペルギルス・オリゼから得られる タンパク質は、ホスファチジルグリセロールとホスファチジルイノシトールをよ り特異的に輸送するという新規性を存する。他のリン脂質を含めた輸送の優先度 は、高い方から、ホスファチジルグリセロール〉ホスファチジルイノシトール〉 ホスファチジルコリン〉ホスファチジルエタノールアミン〉ホスファチジルセリ ンの順である。

一アスペルギルス・オリセから得られる１９ｋＤａタンパク質のＮ−末端配列。

配列は、エドマン法により、アプライド・バイオシステム４７０Ａ装置を使用し て決定した。アミノ酸配列は以下の如くであり、他のＰＬＴＰとの間で相同性を 有しない。

８２　Ｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ａｓｎ −Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−３ｅｒ 　−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｇｉｎ−Ｖａ ｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｐｒ。

−等電点： 等電点を、ファーマシア・ファストーシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐｈａｓ ｔ−ｓｙｓｔｅｍ）を用いて決定した。＋９ｋＤａタンパク質のｐｌは４．８で あった。

−タンパク質の熱に対する抵抗： 純粋な１９ｋＤａＰＬＴＰを１００℃で１０分間加熱し、氷上で冷却した後、リ ン脂質転移活性を検定した。得られた結果は、このタンノくり質がこの処理の後 も安定であることを示した。

層比活性： 粗抽出物（ｐＨ５，１での酸による沈殿の上澄み）については、３．３ｍｍ。

１／分／ｍｇの活性があったが、これは、アスペルギルス・オリゼについての１ ９８ｎｍｏｌ／時／ｍｇに相当する。精製後では、純粋な＋９ｋＤａタンノ（り 質の場合で、２００００ｎｍｏｌ／時／ｍｇの活性があった。

実施例３：富リン脂質培地の、小胞体に対する刺激及びリン脂質転移タンパク質 の生成の増加における作用ニゲルコースを主体とする培地における培養との比較 グルコースを主体とする液体培地（図９、曲線■）と富リン脂質培地（図９、曲 線ム）の各々で培養された菌の小胞体の活性を、Ｒ，Ｌ、　ジョーンズ（ＪＯＮ ＩＥＳ）法（１９８０，Ｐｌａｎｔａ、　１５０．５８−６９）に従って、チト クロムＣオキシドレダクターゼ（小胞体の特異的マーカー）の酵素活性を検定す ることにより比較した。図９において、ｙ軸は細胞内タンパク質のｎｍｏ］、分 六ｍ　ｇ　−＋で表したチトクロムＣオキシドレダクターゼ活性を示し、Ｘ軸は インキュベーションの時間を日数で示す。

一菌が富リン脂質培地（図９、曲線ム）で培養された場合には、第１８目から、 小胞体（リン脂質の合成部位）の活性の極めて高い刺激が見られた。

−同様に、図１Ｏは、リン脂質転移活性を示す。図１Ｏにおいて、ｙ軸は細胞内 タンパク質のｎｍｏ　１．分六ｍｇ−１で表したホスファチジルコリン転移活性 を示し、Ｘ軸はインキュベーションの期間を日数で示す。曲線（閣）は、グルコ ースを主体とする液体培地での培養後に得られる転移活性を示し、曲線（ム）は 富リン脂質培地での培養後に得られる転移活性を示す。図１Ｏから明らかなよう に、グルコース（■）での培養に比べて、リン脂質の存在下では転移活性が著し く高められる。図１Ｏは、富リン脂質培地の場合の転移活性の方が３日目で２倍 も高いことを確かに示している。

上記の記載から明らかなように、本発明は以上に明示的に記載された実施例、実 施細目及び応用例に何ら限定されるものではなく、本発明の枠組ないしは範囲を 逸脱しない限りにおいて当業者が容易に想到するあらゆる変更を包含する。

０°Ｃでの破砕 上澄み　ペレット（細胞残滓） リン脂質転移タンパク質を 含む粗抽出物 ＦＩＧＵＲＥ　１ ＦＩＧＵＲＥ　２ ＦＩＧＵＲＥ　３ 日 Ｆ工ＧＩＪＲＥ　５ 精製工程 １　第１工程（２種類のｒ’ＬＴＰに共通）ＤＥＡＩミ　Ｄ　ＩＥ　Ａ　Ｅ 傾斜２００−７００ｍＭ　傾斜１００〜５００ｍＭセファクリル５４００　モノ Ｑ １　傾斜１００〜５００ｍＭ Ｆ工ＧＵＲＥ　６ 分画番号 ｒ工ＧＩＪ肛７ 分画番号 Ｆ’ｍＧｔＪＲＥ　８ ＦＩＧＵＲＥ　９ ＦＴＧＵＲＥ　１０ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１／３４ （７２）発明者　ルサージュ、ローラシスフランス国　１３００８　マルセイユ 　アヴニュ・ドウ・う・セランヌ　バルク・ドウ・う・セランヌ　８ （７２）発明者　マリオン、ディプイエフランス国　４４３００　ナンド　プラ ス・ペロス・ギレク　３ Ｉ （７２）発明者　カアニエ、ベルナールフラシス国　４４１００　ナンド　リュ ・ドウ・う・ヴイクトワール　２９ （７２）発明者　リシャールーモラール、ダニエルフラシス国　４４７００　オ ルヴオー　リュ・デ・ヴユー・ムーラン　８ （７２）発明者　アステール、マルセルフラシス国　１３６００　ラ・シオタ　 レジダンス・し・パルミニ　アレ・リュミエール

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．非毒性糸状菌からリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）を調製する方法であ って、粗抽出物の調製と、その抽出物からの前記タンパク質の分離と、そのタン パク質の精製とを含み、前記菌が富リン脂質培地において培養されることを特徴 とする方法。
2. ２．前記富リン脂質培地が３〜２０ｇ／ｌのリン脂質を含むことを特徴とする請 求項１に従う非毒性糸状菌からリン脂質転移タンパク質（ＰＬＴＰ）を調製する 方法。
3. ３．（１）（ａ）前記菌を前記富リン脂質培地において充分な量の菌糸体が得ら れるまで培養し、 （ｂ）得られた菌糸体を中性ｐＨの抽出用緩衝剤中において破砕し、（ｃ）得ら れた破砕物から、 その破砕物を約２０，０００ｇを越える速度で遠心分離（第１回遠心分離）して 得られる上澄みＳ１を回収し、回収した上澄みＳ１を酸により沈殿させた後に、 約２０，０００ｇを越える速度で遠心分離（第２回遠心分離）して得られる上澄 みＳ２を回収することにより、脂質結合・転移タンパク質を含む粗抽出物を分離 し、（ｄ）上澄みＳ２から得られた脂質結合・転移タンパク質を含む粗抽出物を 略中性ｐＨに緩衝させる ことにより、略中性ｐＨの前記粗抽出物を調製し、（２）前記タンパク質を限外 濾過によって濃縮し、（３）脂質結合・転移活性を有する分画をゲルを用いて分 離し、その活性分画を脂質結合・転移活性を測定する二とによって濾過、選択し 、（４）選択された種々の分画のタンパク質を一連のクロマトグラフィ工程にお いて精製すること を含み、その精製されたタンパク質が、活性成分と組み合わされることにより若 しくは組み合わされることなく、脂質の膜間結合、輸送、及び／又は、再配列を 行う性質を有し、疎水性で且つ酸性であり、５０ｋＤａより低い分子量を有する ことを特徴とする請求項１若しくは請求項２に従うタンパク質の調製方法。
4. ４．前記糸状菌が、アスペルギルス・カンジダス，アスペルギルス・フラヴィペ ス，アスペルギルス・フミガタス，アスペルギルス・ギガンテウス，アスペルギ ルス・ニゲル，アスペルギルス・オクラセウス，アスペルギルス・オリゼ，アス ペルギルス・テレウス，アスペルギルス・ヴェルシコロル，アスペルギルス・ウ ェンティイ，ペニシリウム・ロクエフォルティイ及びエウロティウム・ケヴァリ エリから選択される子嚢菌類と、ムコル・ムセド及びリゾプス・ストロニフェル から選択される接合菌類と、ファネロカエテ・クリソスポリウム種から選択され る担子菌類とを含む群から選択されることを特徴とする請求項１〜３の何れかに 従う酸性タンパク質の調製方法。
5. ５．前記（ａ）の工程が、更に、 ＊前記菌を胞子形成培地において培養し、＊充分な量の胞子が待られるまで２〜 １３日間インキュベートし、＊得られた胞子を前記富リン脂質培地において培養 し、＊充分な量の菌糸体が得られるまでインキュベートすることを含むことを特 徴とする請求項１〜４の何れかに従う調製方法。
6. ６．前記胞子形成培地が湿らせた全トウモロコシ粒からなることを特徴とする請 求項５に従う調製方法。
7. ７．前記（ｃ）の工程の酸による沈殿がｐＨ５．１で行われることを特徴とする 請求項１〜６の何れかに従う調製方法。
8. ８．前記（ｂ）及び（ｃ）の工程が冷温で行われることを特徴とする請求項１〜 ７の何れかに従う調製方法。
9. ９．前記糸状菌が、糸状菌の一株であるアスペルギルス・オリゼであることを特 徴とする請求項１〜８の何れかに従う酸性タンパク質の調製方法。
10. １０．前記（５）の工程において、脂質転移活性を有し、且つ、分子量が約１９ ｋＤａのタンパク質が得られることを特徴とする請求項９に従う酸性タンパク質 の調製方法。
11. １１．前記（５）の工程において、脂質転移活性を有し、且つ、分子量が約３０ ｋＤａのタンパク質が得られることを特徴とする請求項９に従う酸性タンパク質 の調製方法。
12. １２．酸性の脂質結合・転移タンパク質の精製された調製物であって、一活性成 分と組み合わされることにより若しくは組み合わされることなく、脂質の膜間結 合、輸送、及び／又は、再配列を行う性質を有し、一富リン脂質培地において培 養された非毒性糸状菌の粗抽出物から得られ、その菌が、アスペルギルス・カン ジダス，アスペルギルス・フラヴィペス，アスペルギルス・フミガタス，アスペ ルギルス・ギガンテウス，アスペルギルス・ニゲル，アスペルギルス・オリゼ， アスペルギルス・テレウス，アスペルギルス．ヴェルシコロル，アスペルギルス ・ウェンティイ，ペニシリウム・ロクエフォルティイ及びエウロティウム・ケヴ ァリエリから選択される子嚢菌類と、接合菌類のリゾブス・ストロニフェルと、 担子菌類のファネロカェテ・クリソスポリウムとを含む群から選択され、前記タ ンパク質が、１ｍｇ当たり、１分間に、０．３ｎｍｏｌ以上のホスファチジルコ リンを転移する脂質転移特異活性を有し、 一疎水性であり、且つ、酸性であり、 一５０ｋＤａより低い分子量を有する ことを特徴とする調製物。
13. １３．糸状菌の一株であるアスペルギルス・オリゼから得られることを特徴とす る請求項１２に従うタンパク質の精製された調製物。
14. １４．前記酸性の脂質転移タンパク質が、約１９ｋＤａの分子量を有することを 特徴とする請求項１３に従うタンパク質の精製された調製物。
15. １５．分子量約１９ｋＤａの前記酸性の脂質転移タンパク質が、【配列がありま す】 のＮ末端アミノ酸配列を有し、且つ、等電点が４．８であること特徴とする請求 項１４に従うタンパク質の精製された調型物。
16. １６．前記酸性の脂質転移タンパク質が、約３０ｋＤａの分子量を有することを 特徴とする請求項１３に従うタンパク質の精製された調型物。
17. １７．粗製の糸状菌抽出物であって、非毒性糸状菌から、（ａ）前記菌を富リン 脂質培地において充分な量の菌糸体が得られるまで培養し、 （ｂ）得られた菌糸体を中性ｐＨの抽出用緩衝剤中において破砕し、（ｃ）得ら れた破砕物から、 その破砕物を約２０，０００ｇを越える速度で遠心分離（第１回遠心分離）して 得られる上澄みＳ１を回収し、回収した上澄みＳ１を酸により沈殿させた後に、 約２０，０００ｇを越える速度で遠心分離（第２回遠心分離）して得られる上澄 みＳ２を回収することにより、脂質結合・転移タンパク質を含む粗抽出物を分離 し、（ｄ）上澄みＳ２から得られた脂質結合・転移タンパク質を含む粗抽出物を 略中性ｐＨに緩衝させる ことにより得られることを特徴とする抽出物。
18. １８．前記（ａ）の工程が、 ＊前記菌を天然の胞子形成培地において培養し、＊充分な量の胞子が得られるま で２〜１３日間インキュベートし、＊得られた胞子を富リン脂質培地において培 養し、＊充分な量の菌糸体が得られるまでインキュベートすることを含む二とを 特徴とする請求項１７に従う粗抽出物。
19. １９．前記胞子形成培地が湿らせた全トウモロコシ粒からなることを特徴とする 請求項１８に従う粗抽出物。
20. ２０．請求項１〜１１若しくは請求項１２〜１６の何れかに従って得られる脂質 結合・転移タンパク質を用いて、脂質構造を修正することによって得られること を特徴とする修正生体膜。
21. ２１．請求項１〜１１若しくは請求項１２〜１６の何れかに従って得られる脂質 転移タンパク質と組み合わされた疎水性活性成分を含むことを特徴とする薬剤組 成物。
22. ２２．請求項１〜１１若しくは請求項１２〜１６の何れかに従って得られる脂質 転移タンパク質と組み合わされたりボソームを含むことを特徴とする化粧用組成 物。
23. ２３．請求項１〜１１若しくは請求項１２〜１６の何れかに従って得られるタン パク質を用いることを特徴とする、膜間リン脂質の輸送方法。