WO1994018240A1 - Proteines de champignons filamenteux capables de realiser la fixation et le transport de lipides, leur procede d'obtention et leurs applications - Google Patents

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Laurence Lesage
Didier Marion
Bernard Cahagnier
Daniel Richard-Molard
Marcel Asther
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    • Y10S530/824—Yeasts

Definitions

  • the present invention relates to a family of proteins for fixing and transporting lipids, to their process for obtaining from mushrooms, as well as to their applications in cosmetology, in the food industry and in pharmacy field.
  • the present invention also relates to crude extracts of fungi containing such proteins and to their applications in the field of pharmacy, cosmetology and in the agro-food field.
  • Phospholipid transfer proteins
  • PTPL neurospora crassa
  • the present invention has therefore given itself the aim of providing phospholipid transfer proteins (PTPL), capable of being produced in large quantities by filamentous fungi and capable of carrying out selective intermembrane transport of lipids (phospholipids and sterols ) and active ingredients; such proteins better meet the needs of the practice, in particular in that they improve the biological and surfactant activities of the membranes.
  • PTPL phospholipid transfer proteins
  • the membranes are the seat of many functions in the development of living organisms (cell recognition and exchange, breathing, excretion, etc.) and constitute a difficultly modifiable barrier; however, the engineering of biomembranes involves modifying their composition and organization.
  • the present invention relates to a process for the preparation of phospholipid transfer proteins (PTPL), from non-toxic filamentous fungi of the type comprising the preparation of a crude extract, the separation of proteins from said extract and the purification of said proteins, which process is characterized in that said fungi are cultured in a medium rich in phospholipids.
  • PTPL phospholipid transfer proteins
  • said culture medium rich in phospho ⁇ lipids comprises between 3 and 20 g / 1 of phospholipids. According to another advantageous embodiment of said method, it comprises:
  • said filamentous fungi are selected from the group which comprises Ascomycetes chosen from Aspergillus candidus, A. flavipes, A. fumigatus, A. giganteus, A. niger, A. ochraceus, A. oryzae, A. terreus, A. versicolor, A. wentii, Penicillium roque- fortii and Eurotium chevalieri, the Zygomycetes chosen from Mucor mucedo and Rhizopus stolonifer and the Basidio-fungi selected from the species Phanerochaete chryso spori um.
  • these different groups include both the parent strains and the variants or mutants of these parent strains.
  • strains without limitation, are in particular deposited with collections, as specified in the table below:
  • step (a) further includes:
  • the sporulation medium is advantageously made up of whole corn grains, moistened.
  • step (c) the acid precipitation of step (c) is carried out at pH 5.1.
  • Acid precipitation preferably at pH 5.1, has the advantage of ridding lipid transfer proteins of soluble lipoprotein complexes, which interfere in phospholipid transfer assays. It is, moreover, necessary to bring the pH of the crude extract to neutral pH, so as to stabilize said proteins.
  • steps (b) and (c) are carried out cold.
  • the filamentous fungus is a strain of filamentous fungus A. oryzae.
  • step (5) provides a protein having a lipid transfer activity and having a molecular weight of approximately 19 kDa.
  • step (5) provides a protein having a lipid transfer activity and having a molecular weight of approximately 30 kDa.
  • phos ⁇ pholipids as a carbon source, specifically increases the endoplasmic reticulum of cells (xlO-20) (place of synthesis of phospholipids) and therefore the syn- transfer protein thesis, and therefore allows to obtain a significant biomass with increased metabolic activities towards membrane lipids. Under these conditions, the synthesis of phospholipid transfer proteins is increased and presents an important industrial interest.
  • the present invention also relates to purified preparations of lipid binding and transfer proteins, characterized: - in that they are capable of carrying out the intermixture fixing, transport and / or rearrangement of lipids, possibly associated to active principles,
  • fungus in that they are capable of being obtained from a crude extract of a non-toxic filamentous fungus, cultured on a medium rich in phospholipids, which fungus is selected from the group comprising Ascomycetes chosen from Aspergillus candidus, A. flavipes, A. fumi gatus, A. giganteus, A. niger, A. oryzae, A. terreus, A. versicolor, A.
  • said purified protein preparations can preferably be obtained from the filamentous fungus strain A. oryzae.
  • said acid lipid transfer proteins have a molecular weight of approximately 19 kDa.
  • said acid lipid transfer proteins have a molecular weight of approximately 30 kDa.
  • Both the 19 kDa protein and the 30 kDa protein are active for lipid transfer; however, the 30 kDa protein is more active than the 19 kDa protein for the transfer of phosphatidylcholine.
  • such PTPL ensure the specific and preferential transport of phosphatidylglycerol and phosphatidylinositol; with regard to the other phospholipids, the order of importance of the transfer of phospholipids is as follows: phosphatidylcholine> phosphatidylethanolamine> phosphatidylserine.
  • Such proteins find application in pharmacy, in cosmetology and in the agroalimentary field, associated with lipids and preferably with liposomes. They are advantageously associated with the latter, either in the external phase or in the internal phase, in an encapsulated form.
  • lipid binding and transfer proteins also known as protein shuttles
  • the shuttle proteins according to the invention constitute vectors of active principles and make it possible to select the cells to be reached.
  • these proteins allow, in particular, the development of soy lecithins (main sources of phospholipids).
  • the present invention also relates to crude extracts of filamentous fungi, characterized in that they are capable of being obtained from a non-toxic filamentous fungus by:
  • step (a) includes:
  • the sporulation medium advantageously consists of whole corn grains, moistened.
  • the invention also comprises other provisions, which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the method which is the subject of the present invention.
  • the following steps consist in extracting the proteins after grinding the mycelium obtained by culture on a medium rich in phospholipids, and in determining the activity of transfer of phospholipids from the extract by fluorescence spectrometry, using don liposomes. ⁇ of fluorescent probes and acceptor liposomes, unlabeled.
  • the strains are cultivated in the laboratory on a natural medium, namely on whole corn kernels, humidified 48 hours at 4 ° C (on average 40 grains per 100 ml flask) and sterilized twice 30 min at 110 "C . incubation is carried out at 25 ° C for 10 to 13 days (maximum). during this period, the mycelium develops on the surface of the grains by producing spores. These spores are detached from the surface of the grains by stirring glass beads (3 mm diameter) bathed in a sterile Tween 80 solution, 0.033 g / l (in order to avoid flocculation of the spores).
  • the spore suspension thus obtained is filtered through glass wool, in order to remove mycelial fragments and grain debris.
  • a count is carried out on a Malassez cell.
  • We can then quantify the inoculum of cultures by using an aliquot of known volume of the solution of spores.
  • the concentration of the mother solution is generally of the order of 2.10 'spores / ml.
  • A. oryzae soybeans (rich in phospholipids) moistened and sterilized twice 30 min at 110 ° C and a synthetic medium (MYA2), composed of solid malt (20 g / L), yeast extract (1 g / 1) and agar
  • culture medium 100 ml of culture medium (composition detailed below) are used in baffled vials of 500 ml capacity. These media are inoculated with spores, at a rate of 2.10 5 spores / ml. The cultures are incubated at 25 ° C. and subjected to rotary shaking of 120 rotations / min for 3 days. At the end of this incubation period, the mycelium is filtered through sintered glass (n * 2), weighed, then frozen at -20 ° C. * Composition of the culture medium:
  • the source of phospholipids is preferably a mixture of phospholipids depleted in phosphatidylcholine. * Preparation:
  • the grinding is carried out in a buffer containing a solution of Tris-HCl 100 mM pH 7.0, supplemented with EDTA 2 mM (inhibitor of proteases-dependent cations), sucrose 400 mM (osmotic protective agent), dithiothreitol 2 mM and 8 mM 2-mercaptoethanol (reducing agents).
  • Acid precipitation at pH 5.1 offers the advantage of ridding the phosipolipid transfer proteins from the soluble lipoprotein complexes which interfere in the phospholipid transfer tests.
  • the pH is reduced to 7.8 to stabilize the proteins.
  • the transfer measurements are carried out by monitoring the increase in fluorescence in a dilution buffer, after addition of a protein solution contained the phospholipid transfer proteins, to a mixture of labeled donor liposomes A (with a pyrene monomer), blocked by the "quenching" effect, and an excess of unlabeled recipient liposomes B.
  • the "quenching" effect comes down to a decrease, or even an inhibition of fluorescence, due to too high a concentration of the probe.
  • FIG. 2 illustrates this measurement of phospholipid transfer via the ⁇ medium of protein shuttles from a donor liposome A (•) consisting of phosphatidylcholine pyrene (fluorescent probe) to an acceptor liposome B (O) consisting of egg phosphatidylcholine.
  • a donor liposome A consisting of phosphatidylcholine pyrene (fluorescent probe)
  • acceptor liposome B O
  • a SLM 4800 C Aminco spectrofluorometer (USA) is used for the measurements.
  • the light source is a xenon lamp.
  • the excitation (Glan Thomson) and emission (polaroid polarizing film) monochromators select respectively the wavelengths of 346 and 378 nm.
  • a corrected measurement of the variations in the lamp is obtained by dividing the emission signal of the analyzed solution by that observed with the reference solution (rhodamine cell).
  • the device is equipped with a tank rack thermostated by water circulation.
  • the spectrofluorimeter is controlled by a microcomputer which allows data acquisition and processing.
  • the fluorescent probe used is 3-palmitoyl-2- (1 pyrene decanoyl) -L ⁇ phosphati ⁇ dylcholine (Molecular Probes, USA) with molecular weight 852 (see Figure 2). It is in the form of a dry extract of 1.17 ⁇ mol / mg in a plastic tube, stored at -20 ° C It has a maximum excitation at 346 n and a maximum emission at 378 nm.
  • Reagent the preparation of these liposomes is carried out using a solution of L this phosphatidyl ⁇ choline from egg yolk (see FIG. 2) at 100 mg / ml (dissolved in tetradecane (Sigma) and of molecular weight cular 775. Storage is done at -20 "C.
  • MLVs are subjected to ultrasound using a Vibra Cell (Sonic and Materials, Danbury, Connecticut, USA) fitted with a 1/2 microprobe. Sonication takes place in pulsation with an average power (position 4) and a cycle proportion of 50%. The operation is carried out twice 10 min with cooling in an ice bath. The solution obtained is filtered on a 0.2 ⁇ Sartorius filter and stored at 4 ° C.
  • Assay conditions The assay is carried out in 1.5 ml of fluorescence buffer, with 10 ⁇ l of fluorescent material and 14 ⁇ l of the liposome solution. The liposome / probe ratio is 60, in order to be in excess of recipient vesicles.
  • the fluorescence measurements are carried out in 10 mm quartz cells with 4 mm optical path in emission and excitation respectively.
  • the excitation and emission wavelengths are fixed respectively at 346 and 378 nm (maximum excitation and emission of the fluorescent probe) and the slots of the excitation and emission monochromators at 4 nm.
  • the transfer kinetics are performed over 1400 seconds with intensity records every 5 seconds.
  • the transfer activity is represented by the initial slope of the kinetics (unit of the intensity of relative fluorescence over time).
  • the value of the relative transfer activity is calculated relative to the maximum value of fluororescence. This maximum is obtained by adding a 20% (W / V) SDS solution (50 ⁇ l) to the sample.
  • the SDS dissociates the donor liposomes diluting all of the fluorescent probes in the measurement cell, thus eliminating the "quenching" effect.
  • the fluorescence intensity obtained under these conditions therefore corresponds to the quantity of probe injected in the test (1.17 nmole).
  • the specific activity is obtained by carrying out the ratio of the relative activity on the quantity of protein which are brought into the test.
  • the specific activity is expressed in nmoles of phosphatidylcholine transferred per minute and per mg of protein. 6. Results. a) Selection of strains having phospholipid transfer activity:
  • the cultures were harvested at the optimum of the phospholipid transfer activity (age of spores from corn kernels, 13 days and age of cultures, 3 days).
  • Figure 3 illustrates the specific activity (nmoles of phosphatidylcholine transferred / min / mg) in different strains. b) Comparison of the quality of different inocula:
  • a maximum of phospholipid transfer activity is observed in three days of culture for A. ory ⁇ zae from an inoculum of corn kernels. From the second day, activity is detected and it decreases beyond three to four days ( Figures 4 and 5).
  • Figure 4 illustrates the growth of A. oryzae from different inocula (-M-: corn; - • -: soy; -A-: MYA2) and has the number of days of culture on the abscissa and the dry weight (in g) of A on the ordinate. oryzae.
  • Figure 5 illustrates the phospholipid transfer activity of A. oryzae from different inocu ⁇ lums and has the number of days on the abscissa and in or ⁇ given the transfer activity of inoculums grown on corn (-O-), soybeans (-O-) or synthetic medium (MYA2) (- ⁇ -).
  • the maximum transfer activity for A. oryzae from a spore inoculum on synthetic medium is three days as observed on corn kernels, but it is half that. Activity then tends to decrease, but less suddenly ( Figures 4 and 5).
  • the maximum phospholipid transfer activity is obtained with A. oryzae from an inoculum on corn kernels.
  • the spores from the corn inoculum also respond more quickly to the needs of the cell.
  • the proteins are purified from the crude extract as obtained in Example 1, as shown diagrammatically in FIG. 6.
  • the proteins of the crude extract are concentrated (supernatant of the acid precipitation at pH 5.1), by ultrafiltration.
  • the membrane used for the concentration of the crude extract is a Pel ⁇ con PLGC membrane from Millipore. It has a cutoff threshold of 10 kDa and a surface of 0.1 m 2 . ; such ultrafiltration makes it possible to concentrate the extract and to eliminate all the proteins with a molecular weight of less than 10 kDa.
  • Such a technique also has the advantage cause negligible protein loss; this is important, especially when the initial protein concentration is less than 1 mg / ml.
  • Le ⁇ two fraction ⁇ (about 300 ml) from Sephadex chromatography are loaded on DEAE-Sephacel column 2.6 x 15 cm after 1/2 dilution for P2 (in order to lower the ionic strength).
  • the column is equilibrated beforehand with buffer A.
  • the column is eluted until the optical density has returned to the base, in order to remove all the unbound proteins: a) the proteins of Pi are eluted with 200 ml of a linear gradient (200-700 ml NaCl), b) the protein of P2 is eluted with 350 ml of a linear gradient (100-500 ml NaCl).
  • the flow rate is 30 ml / hour and the collected fractions 5 ml.
  • fractions 51-61 approximately 350 mM NaCl.
  • MonoQ® chromatography FPLC
  • 30 ml of P2 from DEAE are loaded onto a MonoQ® HR 515 column balanced with buffer A.
  • the elution of the active protein is carried out with 40 ml of a linear gradient from 0 to 500 mM in NaCl in the same stamp.
  • the flow rate is 60 ml / hour and the fraction fraction collected is 2 ml.
  • the phospholipid transfer activity is detected for approximately 120 mM in NaCl.
  • Figures 7 and 8 illustrate these different purification steps for the PI peak ( Figure 7) and the P2 peak ( Figure 8) and include in ab ⁇ ci ⁇ e ⁇ number ⁇ fraction and ordinate, absorbance at 280 nm (left axis and line continuous) and the phospholipid transfer activity, measured on aliquots (A) and expressed in nmole ⁇ of pho ⁇ phatidylcholine / min. (right axis).
  • the NaCl gradient (mM) was established by conductivity measurement (dotted line).
  • Figures 7 (A) and 8 (A) are equivalent and correspond to the filtration gel on the Sephadex® G75 column.
  • Figures 7 (B1) and 7 (Cl) illustrate the 2nd and 3rd stages of purification of the PI peak (DEAE column, gradient 200-700 mM and Sephacryl® S400).
  • Figures 8 (B1) and 8 (Cl) illustrate the 2nd and 3rd stage of purification of the peak P2 (DEAE column, gradient 100-500 mM and MonoQ®, gradient 100-500 mM).
  • the molecular specificity is determined by fluorescence using fluorescent probes (pyrene) as in Example 1.
  • the donor and acceptor lipo ⁇ omes are prepared by injection of an ethanolic solution of phospholipids in an appropriate buffer, according to the method of G. LAFER (Biochimica and Biophysica Acta, 1991, 1069, 139-144).
  • the proteins according to the invention and in particular those obtained from A. oryzae have the originality of transporting more specifically phosphatidylglycerol and phosphatidylinositol. Preferably in decreasing order, they also transport: phosphatidylglycerol> phosphatidylinositol> phosphatidylcholine> phosphatidylethanolamine> phosphatidyl ⁇ erine.
  • the i ⁇ oelectric point was determined with the Pha ⁇ t- ⁇ y ⁇ tem from Pharmacia.
  • the 19 kDa protein has a pi of 4.8.
  • FIG. 10 illustrates the transfer activity of phospholipids which includes on the ordinate the transfer activity of phosphatidyl ⁇ choline expressed in nmol .min -1 .mg -1 of intra-cellular protein and in ab ⁇ ci ⁇ e the incubation time in days.
  • Curve (B) illustrates the transfer activity obtained after culture in a medium based on glucose
  • the curve (A) illustrates the transfer activity obtained after culture in a medium based on phospholipids; this figure 10 clearly shows a significantly higher stimulation of the transfer in the presence of phospholipids (curve A) compared to a culture on glucose (curve ⁇ ) -.

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Abstract

Famille de protéines de fixation et de transport de lipides, leur procédé d'obtention à partir de champignons, ainsi que leurs applications en cosmétologie, dans l'industrie agro-alimentaire et dans le domaine de la pharmacie. Ces protéines sont aptes à réaliser la fixation, le transport et/ou le réarrangement intermembranaires de lipides, éventuellement associés à des principes actifs, sont hydrophobes et acides, présentent un poids moléculaire inférieur à 50 kDa, et sont susceptibles d'être obtenues à partir d'un champignon filamenteux non toxique, capable de se développer sur un milieu riche en lipides, notamment à partir d'extraits bruts de ces champignons.

Description

PROTEINES DE CHAMPIGNONS FILAMENTEUX CAPABLES DE REALISER LA FIXATION ET LE TRANSPORT DE LIPIDES, LEUR PROCEDE D'OBTENTION ET LEURS APPLICATIONS.
La présente invention est relative à une famille de protéines de fixation et de transport de lipides, à leur procédé d'obtention à partir de champi¬ gnons, ainsi qu'à leurs applications en cosmétologie, dans 1'industrie agro-alimentaire et dans le domaine de la pharmacie. La présente invention est également relative aux extraits bruts de champignons contenant de telles protéines et à leurs applications dans le domaine de la pharmacie, de la cosmétologie et dans le domaine agro¬ alimentaire. Des protéines de transfert de phospholipides
(PTPL) ont été isolées de champignons, tels que Mucor mucedo, Aspergillus ochraceus ou Neurospora crassa
(Intern. J. Biochem. , 1990, 22, 1, 93-98 ; Develop. Plant
Biol., 1984, £, 303-306 ; BBA, 1992, 1126, 2, 286-290), à partir de cultures de champignons, réalisées sur des milieux synthétiques utilisant le glucose, comme source de carbone. Cependant, la culture de champignons sur de tels milieux synthétiques, ne permet d'obtenir que de faibles quantités de PTPL (rendements très faibles) ; en conséquence, de tels procédés de culture ne sont pas d'application industrielle.
La nécessité d'un procédé d'obtention, en quantités importantes, de protéines de fixation et de transport de lipides, capables de réaliser des transports intermembranaires de lipides et l'obtention de protéines permettant un transport sélectif de certains phospholi¬ pides [ (phosphatidylglycérol (PG) , phosphatidylinositol (PI)] se fait crucialement sentir, notamment pour amélio¬ rer l'efficacité de l'action des liposomes, dont les applications sont nombreuses aussi bien dans le domaine du médicament qu'en cosmétologie et de manière générale, pour produire des biomembranes modifiées.
La présente invention s'est en conséquence donné pour but de pourvoir à des protéines de transfert de phospholipides (PTPL), susceptibles d'être produites en quantités importantes par des champignons filamenteux et capables de réaliser des transports intermembranaires sélectifs de lipides (phospholipides et stérols) et de principes actifs ; de telles protéines répondent mieux aux besoins de la pratique, notamment en ce qu'elles permettent d'améliorer les activités biologiques et tensioactives des membranes.
En effet, les membranes sont le siège de nom¬ breuses fonctions dans le développement des organismes vivants (reconnaissance et échange cellulaires, respira- tion, excrétion...) et constituent une barrière diffici¬ lement modifiable ; or, l'ingénierie des biomembranes, implique la modification de leur composition et de leur organisation.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation de protéines de transfert de phospholi¬ pides (PTPL) , à partir de champignons filamenteux non toxiques du type comprenant la préparation d'un extrait brut, la séparation des protéines à partir dudit extrait et la purification desdites protéines, lequel procédé est caractérisé en ce que lesdits champignons sont mis en culture dans un milieu riche en phospholipides.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit milieu de culture riche en phospho¬ lipides comprend entre 3 et 20 g/1 de phospholipides. Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta¬ geux dudit procédé, il comprend :
(1) la préparation d'un extrait brut à pH sensiblement neutre par :
(a) mise en culture desditε champignons dans ledit milieu riche en phospholipides, jusqu'à l'obtention d'une quantité suffisante de mycélium, (b) broyage desdits mycéliums dans un tampon d'extraction à pH neutre,
(c) séparation de l'extrait brut contenant les protéines de fixation et de transfert de lipides, à par- tir dudit broyât, par centrifugation dudit broyât à une vitesse supé¬ rieure à 20 000 g (première centrifugation) et récupéra¬ tion du surnageant SI,
. précipitation acide du surnageant SI, suivie d'une centrifugation à une vitesse supérieure à 20 000 g (deuxième centrifugation) et récupération du surnageant S2,
(d) obtention de l'extrait brut contenant les- dites protéines de fixation et de transfert de lipides, à partir du surnageant Ξ2, tamponné à pH sensiblement neutre,
(2) la concentration des protéines par ultrafiltration,
(3) la séparation des fractions présentant une activité de fixation et de transfert de lipides par gel, filtration et sélection des fractions actives par mesure de l'activité de fixation et de transfert de lipides, et
(4) la purification des protéines des diffé¬ rentes fractions sélectionnées, par une succession d'étapes chromatographiques, lesquelles protéines obtenues, sont aptes à réaliser la fixation, le transport et/ou le réarrangement intermem- branaires de lipides, éventuellement associés à des prin¬ cipes actifs, sont hydrophobes et acides, et présentent un poids moléculaire inférieur à 50 kDa.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta¬ geux dudit procédé, lesdits champignons filamenteux sont sélectionnés dans le groupe qui comprend les Ascomycètes choisis parmi Aspergillus candidus , A . flavipes , A . fumi - gatus , A . giganteus , A . niger, A . ochraceus , A . oryzae, A . terreus, A . versicolor, A . wentii , Pénicillium roque- fortii et Eurotium chevalieri , les Zygomycètes choisis parmi Mucor mucedo et Rhizopus stolonifer et les Basidio- mycètes sélectionnés parmi l'espèce Phanerochaete chryso- spori um .
Au sens de la présente invention, ces diffé¬ rents groupes incluent aussi bien les souches mères que les variants ou mutants de ces souches mères.
Les différentes souches précitées, de manière non limitative, sont en particulier déposées auprès de collections, comme précisé dans le tableau ci-après :
Figure imgf000006_0001
Ces différentes souches sont accessibles, selon les cas, au Laboratoire de Microbiologie et Techno¬ logie Céréalières (LMTC) de 1 ' INRA de Nantes, à la Myco- thèque de l'Université Catholique de Louvain (MUCL, Belgique) et au Laboratoire de Biotechnologie des Champi¬ gnons Filamenteux (LBCF) de 1 ' INRA de Marseille.
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, l'étape (a) inclut, en outre :
* la mise en culture desdits champignons sur un milieu de sporulation,
* l'incubation pendant 2 à 13 jours jusqu'à obtention d'une quantité suffisante de spores, * la mise en culture desdites spores sur ledit milieu de culture riche en phospholipides, et
* l'incubation jusqu'à obtention d'une quan¬ tité suffisante de mycélium. Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, le milieu de sporulation est avanta¬ geusement constitué de grains de maïs entiers, humidi¬ fiés.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta- geux dudit procédé, la précipitation acide de l'étape (c) est réalisée à pH 5,1.
La précipitation acide, de préférence à pH 5,1, offre, l'avantage de débarrasser les protéines de transfert de lipides des complexes lipoprotéiques so- lubies, qui interfèrent dans les essais de transfert de phospholipides. Il est, en outre, nécessaire de ramener le pH de l'extrait brut à pH neutre, de manière à stabi¬ liser lesdites protéines.
Selon encore un autre mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, les étapes (b) et (c) sont réa¬ lisées à froid.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avanta¬ geux dudit procédé, le champignon filamenteux est une souche de champignon filamenteux A . oryzae . Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'étape (5) fournit une protéine ayant une activité de transfert de lipides et présentant un poids moléculaire d'environ 19 kDa.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'étape (5) fournit une protéine ayant une activité de transfert de lipides et présentant un poids moléculaire d'environ 30 kDa.
De manière inattendue, l'utilisation des phos¬ pholipides comme source de carbone, augmente spé- cifiquement le réticulum endoplasmique des cellules (xlO- 20) (lieu de synthèse des phospholipides) et donc la syn- thèse des protéines de transfert, et permet donc d'obtenir une biomasse importante possédant des activités métaboliques accrues envers les lipides membranaires. Dans ces conditions, la synthèse des protéines de trans- fert de phospholipides est augmentée et présente un inté¬ rêt industriel important.
La présente invention a également pour objet des préparations purifiées de protéines de fixation et de transfert de lipides, caractérisées : - en ce qu'elles sont aptes à réaliser la fixation, le transport et/ou le réarrangement intermem- branaireε de lipides, éventuellement associés à des prin¬ cipes actifs,
- en ce qu'elles sont susceptibles d'être ob- tenues à partir d'un extrait brut d'un champignon fila¬ menteux non toxique, mis en culture sur un milieu riche en phospholipides, lequel champignon est sélectionné dans le groupe comprenant les Ascomycètes choisis parmi Asper- gillus candidus , A . flavipes , A . fumi gatus , A . giganteus , A . niger, A . oryzae, A . terreus , A . versicolor, A . wentii , Pénicillium roquefortii et Eurotium chevalieri , le Zygomycète Rhizopus stolonifer et le Basidiomycète Phanerochaete chrysosporium, lesdites protéines présen¬ tant une activité spécifique de transfert de phos- pholipides exprimée en nmoles de phosphatidylcholine transférées par minute et par mg de protéine, supérieure ou égale à 0,3 nmoles/min/mg,
- en ce qu'elles sont hydrophobes et acides, et - en ce qu'elles présentent un poids molécu¬ laire inférieur à 50 kDa.
Ces protéines acides d'origine fongique per¬ mettent, en raison de leur capacité de fixation, de transport et de transfert intermembranaires de lipides (phospholipides et stérols) , d'améliorer, de manière surprenante, les activités biologiques et tensioactives des membranes cellulaires et des biomembranes.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, lesdites préparations purifiées de protéines sont susceptibles d'être obtenues de préférence, à partir de la souche de champignon filamenteux A . oryzae .
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdites protéines acides de transfert de lipide présentent un poids moléculaire d'environ 19 kDa.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, lesdites protéines acides de trans¬ fert de lipide présentent un poids moléculaire d'environ 30 kDa.
Aussi bien la protéine de 19 kDa que la pro¬ téine de 30 kDa sont actives pour le transfert des lipides ; la protéine de 30 kDa est toutefois plus active que la protéine de 19 kDa, pour le transfert de la phos- phatidylcholine.
Conformément à l'invention, de telles PTPL assurent le transport spécifique et préférentiel du phosphatidylglycérol et du phosphatidylinositol ; pour ce qui concerne les autres phospholipides, l'ordre d'importance du transfert de phospholipides est le sui¬ vant : phosphatidylcholine > phosphatidyléthanolamine > phosphatidylsérine. De telles protéines trouvent application en pharmacie, en cosmétologie et dans le domaine agro-ali¬ mentaire, associées à des lipides et de préférence à des liposomes . Elles sont avantageusement associées à ces derniers, soit en phase externe soit en phase interne, sous une forme encapsulée.
De manière générale, de telles protéines de fixation et de transfert de lipides, également dénommées navettes protéiques, améliorent l'efficacité de l'action des liposomes, par leur utilisation en tant que "vecteurs naturels" de phospholipides et d'autres molécules hydro- phobes, dans toutes les applications de ces derniers. Dans le domaine du médicament, les protéines navettes conformes à l'invention constituent des vecteurs de principes actifs et permettent de sélectionner les cellules à atteindre. Dans le domaine agro-alimentaire, ces pro¬ téines permettent, en particulier, la valorisation des lécithines de soja (principales sources de phospholi¬ pides) .
La présente invention a également pour objet des extraits bruts de champignons filamenteux, caractéri¬ sés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus à par¬ tir d'un champignon filamenteux non toxique par :
(a) mise en culture desdits champignons dans un milieu riche en phospholipides, jusqu'à l'obtention d'une quantité suffisante de mycélium,
(b) broyage desdits mycéliums dans un tampon d'extraction à pH neutre,
(c) séparation de l'extrait brut contenant les protéines de fixation et de transfert de lipides, à par- tir dudit broyât, par centrifugation dudit broyât à une vitesse supé¬ rieure à 20 000 g (première centrifugation) et récupéra¬ tion du surnageant SI,
. précipitation acide du surnageant SI, suivie d'une centrifugation à une vitesse supérieure à 20 000 g (deuxième centrifugation) et récupération du surnageant S2,
(d) obtention de l'extrait brut contenant les¬ dites protéines de fixation et de transfert de lipides, à partir du surnageant S2, tamponné à pH sensiblement neutre.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, l'étape (a) inclut :
* la mise en culture desdits champignons sur un milieu de sporulation naturel,
* l'incubation pendant 2 à 13 jours jusqu'à obtention d'une quantité suffisance de spores,
* la mise en culture desdites spores sur un milieu de culture riche en phospholipides, et
* l'incubation jusqu'à obtention d'une quan- tité suffisante de mycélium.
Selon une modalité avantageuse de cette dispo¬ sition, le milieu de sporulation est avantageusement constitué de grains de maïs entiers, humidifiés.
Outre les dispositions qui précèdent, 1 ' inven- cion comprend encore d'autres dispositions, qui ressorti- ront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la pré¬ sente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Obtention d'un extrait brut, contenant les PTL. 1. Principe.
Les étapes suivantes consistent à extraire les protéines après broyage du mycélium obtenu par culture sur un milieu riche en phospholipides, et à doser l'acti¬ vité de transfert de phospholipides de l'extrait par spectrométrie de fluorescence, à l'aide de liposomes don¬ neurs de sondes fluorescentes et de liposomes accepteurs, non marqués .
2. Souches sélectionnées.
Quinze souches de moisissures appartenant aux classes des Zygomycètes (ordre des Mucorales) , des Asco- mycètes et des Basidiomycètes ont été sélectionnées.
Ces souches ont pour origine et sont la pro¬ priété du Laboratoire de Microbiologie et Technologie Cé- réalières (LMTC) de 1 ' INRA de Nantes, de la Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain (MUCL, Belgique) et du Laboratoire de Biotechnologie des Champignons Filamenteux (LBCF) de 1 'INRA de Marseille. Leur liste est donnée ci- après. Ascomycètes :
Euroti um chevali eri Espèces anamorpheε :
Aspergillus candi dus A . flavipes A . fumigatus A . giganteus A . niger
A . ochraceus A . oryzae A . terreus A . versi color A . wentii
Pénicillium roquefortii
* Zygomycètes : .Mucor mucedo
Rhizopus stolonifer
* Bθsidiomycète : Phanerochaete chrysosporium 3. Préparation des inoculums et réalisation des cultures.
Les souches sont cultivées au laboratoire sur un milieu naturel, à savoir sur des grains de maïs en¬ tiers, humidifiés 48 heures à 4°C (en moyenne 40 grains par fiole de 100 ml) et stérilisés deux fois 30 min à 110"C. L'incubation est réalisée à 25*C pendant 10 à 13 jours (au maximum) . Durant cette période, le mycélium se développe à la surface des grains en produisant des spores. Ces spores sont décrochées de la surface des grains par agitation de billes de verre (diamètre de 3 mm) baignant dans une solution de Tween 80 stérile, à 0,033 g/1 (afin d'éviter la floculation des spores). La suspension de spores ainsi obtenue est filtrée sur laine de verre, afin d'éliminer les fragments myceliens et les débris de grains. Un dénombrement est réalisé sur une cellule de Malassez. On peut alors quantifier 1 ' inoculum des cul¬ tures en utilisant un aliquot de volume connu de la solu¬ tion de spores. La concentration de la solution mère est en général de l'ordre de 2.10' spores/ml.
Deux autres milieux de sporulation ont été testés avec A . oryzae : des grains de soja (riches en phospholipides) humidifiés et stérilisés deux fois 30 min à 110'C et un milieu synthétique (MYA2), composé de Malt solide (20 g/L) , d'extrait de levure (1 g/1) et d'agar
(13 g/1) stérilisé à l'autoclave 20 min à 120'C.
100 ml de milieu de culture (composition détaillée ci-dessous) sont utilisés dans des fioles baf- flées de 500 ml de capacité. On inocule ces milieux par des spores, à raison de 2.105 spores/ml. Les cultures sont incubées à 25°C et soumises à une agitation rotative de 120 rotations/min pendant 3 jours. A la fin de cette période d'incubation, le mycélium est filtré sur verre fritte (n* 2), pesé, puis congelé à -20°C. * Composition du milieu de culture :
- KH2P04 0,2 g/1
- MgS04, 7H20 0,5 g/1
- CaCl2, 2H20 0,0132 g/1
- Tartrate d'ammonium 1,84 g/1 - Extrait de levure 0,5 g/1
- Source de phospholipides 3-20 g/1
La source de phospholipides est de préférence un mélange de phospholipides appauvri en phosphatidyl- choline. * Préparation :
Elle s'effectue à partir des volumes sui¬ vants :
- 50 ml d'eau distillée stérile,
- 10 ml de solution mère 1 : KH2PO 2 g/1, MgS0 , 7H20 5 g/1, CaCl2, 2H20 0,132 g/1, autoclavee dans une fiole 20 min à 120 'C et stockée à 4'C, - 10 ml de solution mère 2 : tartrate d'ammo¬ nium 18,4 g/1 autoclavee 20 min à 120"C et stockée à 4'C,
- 10 ml de solution mère 3 : extrait de levure 5 g/1, autoclavee 20 min à 120'C et stockée à 4'C, - 20 ml de solution mère 4 : Nat 89 à 50 g/L, préparée en utilisant un bain à ultrason, puis agité. La solution est ensuite autoclavee 20 min à 120'C et stockée à 4°C.
4. Obtention de l'extrait brut. 2 grammes de mycélium (poids frais) sont broyés à 0°C en présence d'environ 2 g de sable de Fontainebleau dans un mortier à l'aide d'un pilon. Le sable a été lavé avec une solution de HC1, rincé plu¬ sieurs fois à l'eau, puis stérilisé à 200'C, 30 min dans un four Pasteur.
Le broyage s'effectue dans un tampon contenant une solution de Tris-HCl 100 mM pH 7,0, additionné d'EDTA 2 mM (inhibiteur de protéases-cations dépendantes) , de saccharose 400 mM (agent protecteur osmotique) , de dithiothreitol 2 mM et de 2-mercaptoéthanol 8 mM (agents réducteurs) .
Les étapes suivantes (centrifugations et ob¬ tention de l'extrait brut) sont décrites à la figure 1.
La précipitation acide à pH 5,1 offre l'avan- tage de débarrasser les protéines de transfert de phos¬ pholipides des complexes lipoprotéiques solubles qui interfèrent dans les essais de transfert de phospholi¬ pides.
Dans l'étape finale, le pH est ramené à 7,8 pour stabiliser les protéines.
5. Mise en évidence de la présence des pro¬ téines de transfert de lipides. a) Principe :
Les mesures de transfert sont effectuées en suivant l'augmentation de fluorescence dans un tampon de dilution, après addition d'une solution protéique conte- nant les protéines de transfert de phospholipides, à un mélange de liposomes A donneurs marqués (par un monomère de pyrène) , bloqués par effet de "quenching", et un excès de liposomes B receveurs non marqués. L'effet de "quenching" se résume en une diminution, ou même une inhibition de fluorescence, due à une trop forte concentration de la sonde.
L'activité de transfert de phospholipides est suivie par les mouvements de la sonde entre les deux populations de liposomes après addition de l'extrait pro- téique fongique, conformément à la figure 2, qui illustre cette mesure de transfert de phospholipides par l'inter¬ médiaire de navettes protéiques d'un liposome A donneur (•) constitué de pyrène phosphatidylcholine (sonde fluo- rescente) vers un liposome B accepteur (O) constitué de phosphatidylcholine d'oeuf. b) Appareillage :
On utilise pour les mesures un spectrofluori- ètre SLM 4800 C Aminco (USA) . La source lumineuse est une lampe xénon. Les monochromateurs d'excitation (Glan Thomson) et d'émission (film polariseur polaroïd) sélectionnent respectivement les longueurs d'onde de 346 et 378 nm. Une mesure corri¬ gée des variations de la lampe est obtenue en divisant le signal d'émission de la solution analysée par celui ob¬ servé avec la solution de référence (cellule à rhoda- mine) . L'appareil est équipé d'un portoir de cuve thermo- staté par circulation d'eau. Le spectrofluorimètre est piloté par un microordinateur qui permet l'acquisition et le traitement des données. c) Liposomes donneurs A :
. Réactifs : la sonde fluorescente utilisée est le 3-palmitoyl-2- (1 pyrène décanoyl)-L α phosphati¬ dylcholine (Molecular Probes, USA) de poids moléculaire 852 (voir figure 2) . Elle se présente sous forme d'un extrait sec de 1,17 μmole/mg dans un tube plastique, conservée à -20 'C Elle a un maximum d'excitation à 346 n et un maximum d'émission à 378 nm.
. Préparation: le contenu est solubilisé dans
10 ml d'alcool absolu. Cette solution mère a pour concen- tration, 117 mM. Elle est conditionnée en volume de
0,5 ml dans des tubes en verre et conservée à -20'C à l'abri de la lumière.
Pour le dosage, une prise d'essai de 10 μl permet d'avoir 1,17 nmole de la sonde dans la cuve de dosage. d) Liposomes accepteurs B :
. Réactif : la préparation de ces liposomes s'effectue à partir d'une solution de L ce phosphatidyl¬ choline de jaune d'oeuf (voir figure 2) à 100 mg/ml (solubilisé dans du tétradécane (Sigma) et de poids molé¬ culaire 775. Le stockage se fait à -20 "C.
. Préparation : 385 μl de cette solution sont prélevés, évaporés 15 min sous un courant d'azote, puis dilués dans 10 ml de tampon de fluorescence (Tris-HCl 20 mM, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM, pH 7, 4 filtré sur filtre Millipore 0,45 μ) pour obtenir une suspension de 5 mM constituée de vésicules multilamellaires (MLV) hétéro¬ gènes .
Pour passer au stade de vésicules unilamel- laires (SUV) , on a recours à la sonification. Les MLV sont soumises aux ultrasons à l'aide d'un Vibra Cell (Sonic and Materials, Danbury, Connecticut, USA) pourvu d'une microsonde de 1/2. La sonification s'effectue en pulsation avec une puissance moyenne (position 4) et une proportion de cycle de 50 %. L'opération se fait deux fois 10 min avec refroidissement dans un bain de glace. La solution obtenue est filtrée sur filtre Sartorius 0,2 μ et conservée à 4'C. e) Conditions de dosage : Le dosage s'effectue dans 1,5 ml de tampon de fluorescence, avec 10 μl de sende fluorescente et 14 μl de la solution de liposomes. Le rapport liposomes/sonde est de 60, afin d'être en excès de vésicules receveuses.
La solution de protéines (50 μl) est rajoutée en dernier pour démarrer la cinétique de transfert de phospholipides entre les deux populations de liposomes. La réaction se fait à 25'C. f) Conditions de mesure :
Les mesures de fluorescence sont réalisées dans des cuves en quartz de 10 mm sur 4 mm de trajet op- tique en émission et en excitation respectivement.
Les longueurs d'onde d'excitation et d'émis¬ sion sont fixées respectivement à 346 et 378 nm (maximum d'excitation et d'émission de la sonde fluorescente) et les fentes des monochromateurs d'excitation et d'émission à 4 nm. g) Calcul de l'activité de transfert de phos¬ pholipides :
Les cinétiques de transfert sont réalisées sur 1400 secondes avec des enregistrements d'intensité toutes les 5 secondes. L'activité de transfert est représentée par la pente initiale de la cinétique (Unité de l'inten¬ sité de fluorescence relative sur le temps) .
La valeur de l'activité de transfert relative est calculée par rapport à la valeur maximale de fluorés- cence. Ce maximum est obtenu par l'addition à l'échantil¬ lon d'une solution de SDS (50 μl) à 20 % (P/V) . Le SDS dissocie les liposomes donneurs diluant la totalité des sondes fluorescentes dans la cuve de mesure, il supprime ainsi l'effet de "quenching". L'intensité de fluorescence obtenue dans ces conditions correspond donc à la quantité de sonde injectée dans l'essai (1,17 nmole) .
L'activité spécifique est obtenue en effec¬ tuant le rapport de l'activité relative sur la quantité de protéine qui sont apportées dans l'essai. L'activité spécifique s'exprime en nmoles de phosphatidylcholine transférées par minutes et par mg de protéines. 6. Résultats . a) Sélection de souches ayant une activité de transfert de phospholipides :
Les cultures ont été récoltées à l'optimum de l'activité de transfert de phospholipides (âge des spores issues de grains de maïs, 13 jours et âge des cultures, 3 jours) .
Toutes les souches testées montrent une acti¬ vité de transfert de phospholipides, mais avec toutefois une souche qui s'avère nettement plus performante (figure 3) . Il s'agit d 'Aspergillus oryzae qui a une activité deux fois plus importante qu'A, candidus ou A . niger.
La figure 3 illustre l'activité spécifique (nmoles de phosphatidylcholine transférées/min/mg) chez différentes souches. b) Comparaison de la qualité de différents inoculums :
Un milieu purement synthétique et un milieu naturel (les graines de soja) connues pour leur richesse en phospholipides ont été testées en plus des grains de maïs .
On observe un maximum d'activité de transfert de phospholipides en trois jours de culture pour A . ory¬ zae issu d'un inoculum de grains de maïs. Dès le deuxième jour, l'activité est détectée et elle décroît au delà de trois à quatre jours (figures 4 et 5) .
La figure 4 illustre la croissance d'A. oryzae issu de différents inoculums ( -M- : maïs ; -•- : soja ; -A- : MYA2) et comporte en abscisse le nombre de jours de cultures et en ordonnée le poids sec (en g) de A . oryzae .
La figure 5 illustre l'activité de transfert de phospholipides d'A. oryzae issu de différents inocu¬ lums et comporte en abscisse le nombre de jours et en or¬ donnée l'activité de transfert des inoculums cultivés sur maïs (-O-) , soja (-O-) ou milieu synthétique (MYA2) (-Δ-) . Le maximum d'activité de transfert pour A. oryzae issu d'un inoculum de spores sur milieu synthé¬ tique se situe à trois jours comme observé sur grains de maïs, mais il est moitié moindre. L'activité a ensuite tendance à décroître mais de façon moins brutale (figures 4 et 5) .
L'activité de transfert d'A. oryzae issu d'un inoculum de spores sur graines de soja est à son maximum plus tard, à cinq jours. L'activité est alors un peu plus faible qu'avec le maïs pour inoculum (figures 4 et 5) .
En conclusion, le maximum d'activité de trans¬ fert de phospholipides est obtenu avec A. oryzae issu d'un inoculum sur grains de maïs. Les spores issues de 1 ' inoculum de maïs répondent aussi plus vite aux besoins de la cellule.
EXEMPLE 2 : Purification et caractérisation des protéines .
1) Purification :
On purifie les protéines à partir de l'extrait brut tel qu'obtenu à l'exemple 1, comme schématisé à la figure 6.
Pour cela, 900 g de mycélium (poids humide) sont broyés dans 3 litres de tampon d'extraction (Triε- HC1 100 mM pH 7,0, EDTA 2 mM, dithiothreitol 2 mM, 2- mercaptoéthanol 8 M, saccharose 400 mM) .
On concentre les protéineε de l'extrait brut (εurnageant de la précipitation acide à pH 5,1) , par ultrafiltration.
La membrane utilisée pour la concentration de l'extrait brut (surnageant de la précipitation à pH 5,1) est une membrane Pelιcon PLGC de Millipore. Elle a un seuil de coupure de 10 kDa et une surface de 0,1 m2. ; une telle ultrafiltration permet de concentrer l'extrait et d'éliminer toutes les protéines de poids moléculaire inférieur à 10 kDa.
Une telle technique a, en outre, l'avantage d'entraîner une perte en protéine négligeable ; ceci est important, notamment lorsque la concentration initiale en protéine est inférieure à 1 mg/ml .
La purification proprement dite comprend plu- sieurs étapes, et à chaque étape, il y a :
- contrôle de l'activité de transfert,
- électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de sodium dodécyl sulfate,
- dosage des protéines . * 1ère étape de purification :
Gel filtration sur colonne Sephadex G75® (2,6 x 100 cm) équilibrée avec le tampon B : Triε 50 mM, 2-mercaptoéthanol 8 mM, NaCl 200 mM, glycérol 10 % (p/v) pH 7,8, avec un débit de 15 ml/heure. On collecte deε fractionε de 5 ml . Le profil d'elution eεt montré figure 7 (A) ou figure 8 (A) et comprend 2 picε d'activité : Pi et P2. Leε fractionε activeε εont εéparément regroupées : fractions 38 à 52 pour PI et 62 à 79 pour P2.
* 2ème étape de purification : DEAE-Séphacel® (FPLC) .
Leε deux fractionε (300 ml environ) provenant de la chromatographie Sephadex sont chargées sur colonne DEAE-Séphacel 2,6 x 15 cm après dilution au 1/2 pour P2 (afin de baisεer la force ionique) . La colonne est équi- librée préalablement avec le tampon A. On élue la colonne jusqu'à ce que la densité optique soit revenue à la base, afin d'éliminer toutes les protéines non liées : a) les protéines de Pi sont éluéeε avec 200 ml d'un gradient linéaire (200-700 ml NaCl), b) leε protéineε de P2 εont éluéeε avec 350 ml d'un gradient linéaire (100-500 ml NaCl) .
Le débit eεt de 30 ml/heure et les fractions collectées de 5 ml.
Les activités de transfert correspondant à Pi et P2 sont respectivement éluées avec leε fractions 23-36
(environ 500 nM en NaCl) et les fractions 51-61 (environ 350 mM en NaCl ) .
* 3ème étape de purification :
3a. chromatographie Séphacryl® S400. 166 ml de la fraction PI isεuε de la DEAE εont chargés sur une colonne Séphacryl® S400 (4,5 x 85 cm) équilibrée avec le tampon B. Le débit est de 60 ml/heure et leε fractions collectées de 5 ml . La figure 7 (Cl) montre le profil avec un pic d'activité pour les fractions 185 à 204.
3b. chromatographie MonoQ® (FPLC) . 30 ml de P2 issuε de la DEAE εont chargés sur une colonne MonoQ® HR 515 équilibrée avec le tampon A. L ' élution de la pro¬ téine active est faite avec 40 ml d'un gradient linéaire de 0 à 500 mM en NaCl dans le même tampon. Le débit est de 60 ml/heure et leε fractionε collectéeε de 2 ml . L'activité de tranεfert de phospholipides est détectée pour environ 120 mM en NaCl.
Masse moléculaire : une bande de 30 kDa cor¬ respondant à la fraction PI est observée sur gel de poly- acrylamide. Une bande de 19 kDa est observée pour la fraction P2.
Les figures 7 et 8 illustrent ceε différenteε étapeε de purification pour le pic PI (figure 7) et le pic P2 (figure 8) et comportent en abεciεεe leε numéroε de fraction et en ordonnée, 1 'absorbance à 280 nm (axe gauche et trait continu) et l'activité de transfert de phospholipideε, mesurée sur des aliquots (A) et exprimée en nmoleε de phoεphatidylcholine/min. (axe droit) . Le gradient en NaCl (mM) eεt établi par meεure de conducti- vité (trait diεcontinu) . Leε figureε 7 (A) et 8 (A) sont équivalentes et correεpondent à la gel filtration εur colonne Sephadex® G75.
Leε figures 7(B1) et 7 (Cl) illustrent les 2ème et 3ème étapeε de purification du pic PI (colonne DEAE, gradient 200-700 mM et Séphacryl® S400) .
Les figures 8(B1) et 8 (Cl) illustrent les 2ème et 3ème étapes de purification du pic P2 (colonne DEAE, gradient 100-500 mM et MonoQ®, gradient 100-500 mM) .
2) Caractérisation des protéines de transfert de phospholipides : - Spécificité moléculaire :
La spécificité moléculaire est déterminée par fluorescence à l'aide de sondes fluorescenteε (pyrène) comme danε l'exemple 1. Leε lipoεomes donneurs et accep¬ teurs sont préparés par injection d'une solution éthano- lique de phospholipideε dans un tampon approprié, suivant la méthode de G. LAFER (Biochimica et Biophysica Acta, 1991, 1069, 139-144) .
Les protéines conformes à 1 ' invention et notamment celles obtenues à partir de A . oryzae ont l'originalité de transporter plus spécifiquement le phos- phatidylglycérol et le phosphatidylinositol . Dans l'ordre décroisεant de préférence, elles transportent également : phosphatidylglycérol > phosphatidylinositol > phosphatidylcholine > phosphatidyléthanolamine > phospha- tidylεérine.
- Séquence N-terminale de la protéine de 19 kDa, obtenue à partir d'A. oryzae :
Cette εéquence a été déterminée εuivant la mé¬ thode d'Edman avec l'appareil Applied Bioεystem 470A. La séquence en acides aminéε ne révèle aucune homologie avec d'autres PLTP :
I^N-Ala-Lys-Ser-Val-Pro-Gly-Aεn-Aεn-Pro-Leu-Glu-Tyr-Cyε- Asn-Aεp-Pro-Ser-Gly-Aεp-Ile-Leu-Aεp-Ile-Lyε-Gin-Val-Asp- Leu-Ser-Pro-Aεn-Pro. - Point iεoélectrique :
Le point iεoélectrique a été déterminé avec le Phaεt-εyεtem de Pharmacia. La protéine de 19 kDa a un pi de 4,8.
- Réεistance de la protéine à la chaleur : La PLTP de 19 kDa pure est portée 10 min à
100 "C puis refroidie dans de la glace avant de doser l'activité de tranεfert de phoεpholipideε . Les résultats obtenus indiquent que la protéine est εtable aprèε ce raitement .
- Activité εpécifiσue : Avec un extrait brut (εurnageant de la préci¬ pitation acide à pH 5,1) , il y a une activité de 3,3 nmoleε/min/mg εoit 198 nmoles/h/mg avec Aspergillus oryzae . Après purification, il y a, pour la protéine de 19 kDa pure, une activité de 20 000 nmoleε/h/mg. EXEMPLE 3 : Rôle du milieu de culture riche en phospho¬ lipides dans la stimulation du réticulum endoplasmique et dans 1 'augmentation de la production des protéines de transfert de phospholipides : comparaiεon avec une cul¬ ture εur milieu à base de glucose. - On compare l'activité du réticulum endo¬ plasmique d'un champignon cultivé dans un milieu liquide à baεe de glucoεe (figure 9, courbe B) ou danε un milieu riche en phoεpholipideε (figure 9, courbe A) par dosage de l'activité enzymatique de la cytochrome-C-oxydoréduc- tase (marqueur spécifique du réticulum) εuivant la méthode de R.L. JONES (1980, Planta, 150, 58-69) . A la figure 9, l'ordonnée correspond à l'activité cytochrome- C-oxydoréductaεe, exprimée en nmole.min" . g-1 de pro¬ téine intracellulaire et l'abscisse correspond au temps d'incubation en jours.
- Dès le premier jour, on note une très impor¬ tante εtimulation de l'activité du réticulum endoplas¬ mique (lieu de synthèεe deε phoεpholipideε) , lorsque le champignon eεt cultivé sur milieu riche en phospholipides (figure 9, courbe A) .
- En parallèle, l'activité de tranεfert de phospholipides est illustrée à la figure 10 qui comprend en ordonnée l'activité de transfert de phosphatidyl¬ choline exprimée en nmol .min-1.mg-1 de protéine intra- cellulaire et en abεciεεe la durée d'incubation en jourε. La courbe (B) illustre l'activité de transfert obtenue après culture dans un milieu à base de glucose et la courbe (A) illustre l'activité de tranεfert obtenue aprèε culture dans un milieu à base de phospholipides ; cette figure 10 montre bien une stimulation significativement supérieure du tranεfert en présence de phospholipideε (courbe A) par rapport à une culture sur glucose (courbe Λ) -. en effet, cette figure montre bien que, à 3 jours, l'activité de transfert à partir d'un milieu riche en phospholipide est 2 fois plus importante. Ainsi que cela resεort de ce qui précède, l'invention ne εe limite nullement à ceux de εeε modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien¬ nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em¬ brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent ve- nir à l'esprit du technicien en la matière, sanε ε 'écar¬ ter du cadre, ni de la portée de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS 1°) Procédé de préparation de protéineε de transfert de phospholipides (PTPL), à partir de champi¬ gnons filamenteux non toxiques du type comprenant la pré- paration d'un extrait brut, la séparation des protéines à partir dudit extrait et la purification desdites pro¬ téines, lequel procédé est caractérisé en ce que lesdits champignons sont mis en culture dans un milieu riche en phospholipides . 2°) Procédé de préparation de protéines de tranεfert de phoεpholipideε (PTPL) , à partir de champi¬ gnons filamenteux non toxiques selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit milieu de culture riche en phoεpholipides comprend entre 3 et 20 g/1 de phospholi- pides . 3°) Procédé de préparation de protéines selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend :
(1) la préparation d'un extrait brut à pH sensiblement neutre par :
(a) -mise en culture desditε champignonε dans ledit milieu riche en phospholipides, jusqu'à l'obtention d'une quantité suffiεante de mycélium,
(b) broyage deεdits mycéliums dans un tampon d'extraction à pH neutre,
(c) εéparation de l'extrait brut contenant leε protéineε de fixation et de transfert de lipides, à par¬ tir dudit broyât, par centrifugation dudit broyât à une vitesεe supé- rieure à 20 000 g (première centrifugation) et récupéra¬ tion du surnageant SI,
. précipitation acide du surnageant SI, suivie d'une centrifugation à une vitesεe εupérieure à 20 000 g (deuxième centrifugation) et récupération du εurnageant S2,
(d) obtention de l'extrait brut contenant leε- dites protéines de fixation et de transfert de lipides, à partir du surnageant S2 , tamponné à pH sensiblement neutre,
(2) la concentration deε protéines par ultrafiltration,
(3) la séparation des fractionε présentant une activité de fixation et de transfert de lipideε par gel filtration et εélection deε fractions actives par mesure de l'activité de fixation et de transfert de lipides, et (4) la purification des protéines des diffé¬ rentes fractions sélectionnées, par une succeεεion d' étapeε chromatographiqueε, lesquelles protéineε εont aptes à réaliser la fixation, le transport et/ou le réarrangement intermembranaires de lipideε, éventuellement aεεociéε à deε principes actifs, sont hydrophobeε et acides, et présentent un poids moléculaire inférieur à 50 kDa.
4°) Procédé de préparation des protéines acides εelon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractériεé en ce que lesdits champignons filamenteux εont εélectionnés dans le groupe qui comprend leε Asco- mycèteε choisis parmi Aspergillus candi dus , A . flavipes, A. fumigatus , A . giganteus , A . niger, A . ochraceus , A . oryzae, A . terreus , A . versicolor, A . wentii , Péni cillium roquefortii et Eurotium chevalieri , les Zygomycèteε choi- εiε parmi Mucor mucedo et Rhizopus stolonifer et leε Basidiomycètes εélectionnéε parmi 1 ' eεpèce Phanerochaete chrysosporium.
5°) Procédé de préparation εelon l'une quel- conque deε revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape (a) inclut, en outre :
* la mise en culture desdits champignons sur un milieu de sporulation,
* l'incubation pendant 2 à 13 jours jusqu'à obtention d'une quantité suffisante de sporeε,
* la miεe en culture deεditeε spores sur ledit milieu de culture riche en phoεpholipides, et
* l'incubation jusqu'à obtention d'une quan¬ tité εuffisante de mycélium.
6°) Procédé de préparation selon la revendica- tion 5, caractérisé en ce que le milieu de sporulation est avantageusement constitué de grains de maïε entiers, humidifiéε.
7°) Procédé de préparation selon l'une quel¬ conque deε revendicationε 1 à 6, caractérisé en ce que la précipitation acide de l'étape (c) est réaliεée à pH 5,1.
8°) Procédé de préparation de protéineε acides selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caracté- riεé en ce que les étapes (b) et (c) εont réalisées à froid. 9°) Procédé de préparation de protéines acides selon l'une quelconque des revendicationε 1 à 8, caracté- riεé en ce que le champignon filamenteux est une souche de champignon filamenteux A. oryzae .
10°) Procédé de préparation de protéineε acideε selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'étape (5) fournit une protéine ayant une activité de transfert de lipides et présentant un poids moléculaire d'environ 19 kDa.
11°) Procédé de préparation de protéines acides selon la revendication 9, caractérisé en ce que en ce que l'étape (5) fournit une protéine ayant une acti¬ vité de tranεfert de lipides et présentant un poids molé¬ culaire d'environ 30 kDa.
12°) Préparationε purifiéeε de protéineε acides de fixation et de transfert de lipides, caractéri- εéeε :
- en ce qu'elleε sont aptes à réaliser la fixation, le transport et/ou le réarrangement intermem- branaireε de lipideε, éventuellement associés à des prin- cipeε actifε,
- en ce qu'elles εont εusceptibles d'être ob- tenues à partir d'un extrait brut d'un champignon fila¬ menteux non toxique, mis en culture sur un milieu riche en phoεpholipideε, lequel champignon eεt εélectionné danε le groupe comprenant les Ascomycètes choisis parmi Asper- gillus candidus, A. flavipes, A . fumigatus, A . giganteus, A. niger, A . oryzae, A . terreus, A. versicolor, A . wen- tii , Pénicillium roquefortii et Eurotium chevalieri , le Zygomycète Rhizopus stolonifer et le Basidiomycète Phanerochaete chrysoεporium, lesdites protéines présen- tant une activité spécifique de tranεfert de phoεpholi¬ pideε exprimée en nmoleε de phoεphatidylcholine transfé¬ rées par minute et par mg de protéine, supérieure ou égale à 0,3 nmoleε/min/mg,
- en ce qu'elles sont hydrophobeε et acideε, et
- en ce qu'elleε préεentent un poidε molécu¬ laire inférieur à 50 kDa.
13 " ) Préparationε purifiées de protéines selon la revendication 12, caractérisées en ce qu'elles sont susceptibles d'être obtenues de préférence, à partir de la εouche de champignon filamenteux A. oryzae.
14°) Préparationε purifiées de protéines selon la revendication 13, caractérisées en ce lesdites pro¬ téines acides de transfert de lipide présentent un poidε moléculaire d'environ 19 kDa.
15°) Préparationε purifiées de protéines selon la revendication 14, caractériséeε en ce leεdites pro¬ téines acides d'environ 19 kDa présentent la séquence en amino-acides N-terminale εuivante : H2N-Ala-Lyε-Ser-Val-Pro-Gly-Aεn-Aεn-Pro-Leu-Glu-Tyr-Cyε- Aεn-Aε -Pro-Ser-Gly-Aεp-Ile-Leu-Aεp-Ile-Lyε-Gin-Val-Aεp- Leu-Ser-Pro-Aεn-Pro et ont un point isoélectrique de 4,8.
16°) Préparations purifiées de protéineε εelon la revendication 13, caractériséeε en ce que leεditeε protéines acides de transfert de lipide préεentent un poidε moléculaire d'environ 30 kDa. 17 ° ) Extraits bruts de champignons filamen¬ teux, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus à partir d'un champignon filamenteux non toxique par : (a) mise en culture deεditε champignonε danε un milieu riche en phospholipides, jusqu'à l'obtention d'une quantité εuffisante de mycélium,.
(b) broyage desditε mycéliumε danε un tampon d'extraction à pH neutre, (c) εéparation de l'extrait brut contenant leε protéineε de fixation et de tranεfert de lipideε, à par¬ tir dudit broyât, par centrifugation dudit broyât à une vitesse supé¬ rieure à 20 000 g (première centrifugation) et récupéra- tion du surnageant SI,
. précipitation acide du surnageant SI, suivie d'une centrifugation à une vitesεe supérieure à 20 000 g (deuxième centrifugation) et récupération du surnageant S2, (d) obtention de l'extrait brut contenant les¬ dites protéines de fixation et de transfert de lipides, à partir du surnageant S2 , tamponné à pH senεiblement neutre.
18°) Extraitε brutε εelon la revendication 17, caractériεéε en ce que l'étape (a) inclut :
* la miεe en culture deεditε champignonε sur un milieu de εporulation naturel,
* l'incubation pendant 2 à 13 jourε juεqu'à obtention d'une quantité suffisante de sporeε, * la miεe en culture deεdites sporeε εur un milieu de culture riche en phoεpholipideε, et
* l'incubation juεqu'à obtention d'une quan¬ tité εuffiεante de mycélium.
19°) Extraitε bruts selon la revendication 18, caractériséε en ce que le milieu de sporulation est avan¬ tageusement constitué de grains de maïs entiers, humidi- f iés .
20°) Biomembranes modifiées, caractérisées en ce qu'elles εont susceptibles d'être obtenues par modifi¬ cation de leur structure lipidique à l'aide de protéines de fixation et de transfert de lipides obtenues selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 ou selon l'une quelconque des revendications 12 à 16.
21°) Compositions pharmaceutiques, caracté¬ risées en ce qu'elleε comprennent un principe actif hydrophobe, associé aux protéines de transfert de lipides, obtenues εelon l'une quelconque deε reven¬ dicationε 1 à 11 ou εelon l'une quelconque deε revendica¬ tionε 12 à 16.
22°) Compositions cosmétologiques, caracté- risées en ce qu'elleε comprennent deε lipoεomeε appro- priéε, aεsociés aux protéineε de tranεfert de lipideε, obtenueε selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 ou selon l'une quelconque des revendicationε 12 à 16.
23°) Procédé de tranεport de phoεpholipideε intermembranaire, caractériεé en ce qu'il met en oeuvre des protéines obtenues selon l'une quelconque deε reven¬ dications 1 à 11 ou selon l'une quelconque deε revendica¬ tionε 12 à 16.
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