JPH0751086A - 超高度原核発現系により製造されたハイブリッド蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明の目的は、ハイブリッド蛋白質とその
製法を提供することである。 【構成】 β-グルクロニダ−ゼ遺伝子DNA及びプロテイ
ンＡ DNAを含むハイブリッドプラスミドpBG9、プラスミ
ドpBG5、プラスミドpBG3-2及びプラスミドpBG3-2ΔNが
適当な原核宿主を形質転換するのに使用されると、既知
原核発現系よりもかなり高い発現で、本物と生物学的機
能が区別出来ないプロテインＡ様の化合物の製造が実現
される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は超高度原核発現系により
製造されたハイブリッド蛋白質及びその製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】発現水準ということはクロ−ン化遺伝子
製品を利用するうえで最も重要な考慮すべき点である。
評価された蛋白質発現の水準は、醗酵容量当りの蛋白質
収率、及び精製の困難性の程度、という二つの重要な結
果を有する。クロ−ン化された遺伝子製品の増加する発
現に対する殆どの努力は今日まで効率のよいリボソ−ム
結合位置に関連した強いプロモ−タ−の使用に焦点があ
てられてきた。発現を増加させるために種々のプロモ−
タ−が使用されてきており、最も一般的に使用されてい
るのはファ−ジラムダからのP_Lプロモ−タ−及び大腸菌
lacUV5及びtrpプロモ−タ−である。

【０００３】ラムダP_Lプロモ−タ−はCI857温度感受性
ラムダリプレッサ−に関連してうまく使用されてきた。
これは30℃に於ける大腸菌の生育中にクロ−ン化された
製品の低い水準の発現を可能にする。実質的な細胞密度
が一旦確立されたらクロ−ン化された遺伝子は42℃に於
ける生育によってデリプレッション（抑制解除）され
る。この方法は宿主細胞に対し致死的な遺伝子製品の発
現において使用されてきた。幾人かの研究者等は熱に不
安定なリプレッサ−制御のもとでP_Lプロモ−タ−を使用
して発現水準4%(ワルデマン エ−.エス.、ハエンスレイ
ン イ−.及びミルマン ジ−.[1983］ J. Bio. Chem. 28
5:11571-11575)、7%(ヨアクム ジ−.エッチ.、イエング
エ−.ティ−.、マッテス ダブリュ.ビ−.及びグロスマ
ン エル.[1982] PNAS 79:1766-1770, デロム シ−.、ゲ
イセン ディ−.及びフィ−ルス ダブリュ.[1982] Gene
17:45-54)及び13%（オエヘルニッヘン ア−ル.、クロッ
クジ−.、アルツシュミット エル.及びヒレン ダブリ
ュ.[1984] EMBO J. 3:539-543)を報告している。

【０００４】最近では大腸菌lacUV5及びtrpプロモ−タ
−からの配列からなるキメリックなプロモ−タ−の使用
が増加してきている。このハイブリッドプロモ−タ−は
tacプロモ−タ−として知られている。これはlacプロモ
−タ−から-10領域及びtrpの-35領域を含んでいる。こ
のハイブリッドプロモ−タ−は大腸菌lac I^q遺伝子製品
によって抑制され、5mMのイソプロピルβ-D-チオガラク
トピラノシド(IPTG)によって誘導される。この系は幾人
かの研究者によって使用されて異なる結果を得ている。
種々の蛋白質の発現は、7%水準（バグダサリアン エム.
エム.、アマン イ−.、ルルツ ア−ル.、ルッカ−ト ビ
−.及びボグダサリアン エム.[1983] Gene 26:273-28
2）、10%水準（バイケル アイ.、ロバ−ツ ティ−.エ
ム.、ブラボン エム.ティ−.、グリ−ン ア−ル.、アマ
ン イ−.及びリビングストン ディ−.エム.[1983] PNAS
80: 906-910）及び30%水準（アマン イ−.、ブロシウス
ジェ−.、及びプタッシン エム.[1983] Gene 25: 167-
178）に達している。

【０００５】蛋白質発現水準は宿主細胞の遺伝子背景に
依存する。特定の突然変異を含有する宿主細胞の利用は
クロ−ン化蛋白質の水準を増加させることが示された。
この点に関し二つの遺伝子が広く注目を受けている。即
ちlon及びpnp突然変異である。

【０００６】lon突然変異は大腸菌ゲノムのcapR領域に
マップされており、ATP依存蛋白分解酵素に対しコ−ド
を有していることが示されている(ブクハリ エ−.ア
イ.、及びジップセル ディ−. [1973] J. Bact. 116:
1460-1471 シ−ン-ベルグ ビ−.及びジップセル ディ−
[1973] J. Bact.116:1469-1471)。このATP依存蛋白分解
酵素は大腸菌中で見出されている８つの蛋白分解酵素の
ひとつである(チュング シ−.エッチ.、及びゴルドベル
グ エイ.エル.[1981] PNAS 78: 4931-4935 スリ−ドハ
ラ、スワミ− ケイ.エッチ.及びゴルドベルグ エイ.エ
ル.[1981] Nature: 292: 652-654)。これはミスセンス
突然変異及びナンセンス突然変異から造られた蛋白質の
分解に関与する主要な蛋白分解酵素であることが実証さ
れている（モント ディ−.ダブリュ−.[1980]Ann Rev.G
enet.14: 297-319)。pnp突然変異はポリリボヌクレオチ
ドホスホリラ−ゼ遺伝子に対してマップされている。ポ
リリボヌクレオチドホスホリラ−ゼはリボ核酸のホスホ
リシスに関与していることが示されており、従ってmRNA
分解に関与することが意味される。その後の研究はpnp
突然変異株中にクロ−ン化されたときにクロ−ン化され
たカビの分解産物デヒドロゲナ−ゼの特異活性に於て20
〜100倍の増加を示した（ハウタラ ジェ−.エイ.、バセ
ット シ−.エル.、ギレス エヌ.エッチ.及びクッシュナ
− エス.ア−ル.[1979] Proc. Natur. Acad. Sci. 米国
76: 5774-5778)。これらの研究は又これらの突然変異
株に於けるプラスミドコピ−数の4〜7倍の増加をも実証
した。従って酵素特異活性における増加は増加したmRNA
合成、増加したmRNA寿命及びこれらの現象の組合わせに
よるものであり得る。

【０００７】rop(プライマ−のリプレッサ−＝represso
r of primer)遺伝子はプラスミドコピ−数を制御するこ
とが知られてからかなりになる。1980年に大腸菌colE1
誘導プラスミドの非必須領域の欠失がプラスミドコピ−
数を増加させることが実証された。この領域の欠失はク
ロモソ−ムDNAの4%から20%へプラスミドDNAを増加させ
た。この欠失は野性形のプラスミドで宿主を共感染させ
ると突然変異体プラスミドのコピ−数を減少させたので
トランスレセッシブ(trans recessive)であった（ツィ
グ エ−.ジェ−.及びセラット ディ−.[1980]Nature 28
3: 216-218)。

【０００８】最近の先行技術は大腸菌発現系について報
告しており、ここで大腸菌宿主に対して外来の蛋白質が
製造され、全細胞蛋白質の約25〜30の発現水準が開示さ
れている。シモンズ等は人のインタ−フェロンγが全細
胞蛋白質の25％迄の水準で発現されたことを報告してい
る。これらの研究者たちはファ−ジラムダのP_Lのプロモ
−タ−を使用し、続いてファ−ジMS2レプリカ−ゼ又は
大腸菌トリプトファン減衰域の何れかに由来する翻訳開
始領域を使用した（シモンズ ジ−.、レマウトイ−.、
アレット ビ−.、デボス ア−ル.及びファイヤ−ス ダ
ブリュ−.[1984]Gene 28: 55-64)。アマン等はtacプロ
モ−タ−系を使用して全細胞蛋白の 30%としてラムダリ
プレッサ−を発現した（アマン イ−.、ブロシウス ジ
ェ−.及びプタッシン エム.[1983] Gene 25: 167-17
8）。上に述べた様にこのプロモ−タ−はlacUV5プロモ
−タ−の-10領域及びtrpプロモ−タ−の-35領域を含有
している(デボア− エッチ.エ−.、コムストック エル.
ジェイ.、ヤンスラ ディ−.ジ−.及びハイネッカ− エ
ッチ.エル. プロモ−タ−ズストラクチャ−アンドファ
ンクション(Promoters Structure and Function)、プラ
−ガ−、ニュ−ヨ−ク [1982] 462-481( ア−ル. エル.
ロドリクェツ及びエム.ジェ−.チャンベルリン編)）。

【０００９】

【課題を解決する手段】本発明は新規な生物学的系で製
造される新規なハイブリッド蛋白質に関するものであ
る。新規な生物系はβ-グルクロニダ−ゼ遺伝子DNA(BG)
及び所望の蛋白遺伝子DNAからなる新規なハイブリッド
プラスミドで形質転換した原核宿主からなる。本明細書
で特定的に例示したのはプラスミドpBG9、プラスミドpB
G5、プラスミドpBG3-2及びプラスミドpBG3-2ΔNと命名
される新規なハイブリッドプラスミドの構築である。こ
れらのプラスミドはβ-グルクロニダ−ゼ遺伝子DNA及び
プロテインＡ DNAからなる。適当な原核宿主を形質転換
するのに使用される時プロテインＡ様の化合物の製造が
実現される。即ち本来の蛋白Ａとは分子のFc領域におけ
るIgGを結合する鍵となる生物学的機能において元来の
プロテインＡとは区別できない化合物である。有利なこ
とにはこれらのハイブリッド蛋白質を形質転換した宿主
によって発現することは知られた任意の原核発現系で実
現されるよりもかなり高い。例えば本明細書で例示され
る融合（ハイブリッド）蛋白質は、全大腸菌宿主細胞中
のlon又はpnp突然変異の何れかを含有している宿主細胞
中で大腸菌の全細胞蛋白質の45%よりも高い水準で製造
される。又有利なことには発現されたハイブリッド蛋白
質の100%が宿主細胞を破裂させることによって可溶な細
胞質ゾルフラクション中に見出されることである。この
結果は大腸菌の外来蛋白質の比較的高い発現(約7%)が不
溶、不活性の蛋白質を製造したことを見出した多くの当
業者によって経験されていることとは逆である。

【００１０】プラスミドpBG3-2ΔNは超高度な原核発現
系の究極を例示する。このプラスミドで形質転換された
宿主は所望の融合蛋白質の60%より多くを発現する。こ
の超高水準発現はプラスミドpBG3-2中に於けるΔNde欠
失を構築することによってrop遺伝子を部分的又は全体
的に欠失させるか、又はそれ以外の方法で不活性化させ
ることによって達成される。この手順は大腸菌colE1プ
ラスミドに由来する全てのプラスミドがrop領域を含有
しているのでこれらの任意のものに本発明に於て使用で
きる。そのようなプラスミドの例はpBR322、pBR325及び
pHC79である。

【００１１】プラスミドpBG3-2ΔNはBGに由来する配列
の18 のアミノ酸を含有しており、プロテインＡ活性を示す、
即ち分子のFc領域に於けるIgG結合活性を有する、BG-プ
ロテインＡ融合蛋白を製造するのに使用できる。

【００１２】本発明の新規なハイブリッドプラスミドで
形質転換した大腸菌宿主がBGが本来の大腸菌宿主によっ
て僅かな量しか発現されないという事実に鑑みて、超高
量でBG-プロテインＡ融合製品を発現するということは
驚くべきことである。この低い本来の大腸菌によるBG発
現水準は当業者が原核表原形においてBGプロモ−タ−DN
Aを使用することをやめてしまうことに導いたと信じら
れる。BGプロモ−タ−を使用するのでなくて、原核発現
系においてlac及びtrpプロモ−タ−が広範に使用されて
きたのである。

【００１３】本発明の発現系はプロテインＡ遺伝子又は
その断片に対する融合によって例示されているが、有利
には他の有用な蛋白質例えばインタ−フェロン、インタ
−ロイキン類、インシュリン、成長ホルモン及び産業酵
素、例えばアミラ−ゼ、蛋白分解酵素、及び糖イソメラ
−ゼ、等に対しコ−ドを有している他の遺伝子に融合さ
れた時にも、ここに開示された手順に従い、そしてこの
技術で知られている付随する手順に従って有利に使用で
きる。

【００１４】図１はプラスミドpAc37からの中間プラス
ミドの構築を例示する。プラスミドpAc37はプロテイン
Ａ遺伝子及び全pBR322 DNAからなる。図２はプラスミド
pBG101-41及びpBG9に対する遺伝子DNA挿入物についての
制限マップを示す。クロ−ニング中に再生されないBamH
Ｉの位置は (BamHＩ)として印す。図３はプラスミドpBG
9からのpBG5の構築を示す。図４はpBG5及びプラスミドp
BR325からのプラスミドpBG3-2の構築を示す。図５は、
プラスミドpBG3-2からの、プラスミドpBG3-2ΔNの構築
を示す。式Ａはスタフィロコッカスオウレウス(Staphyl
o-coccus aureus)プロテインＡのアミノ酸配列に対しコ
−ドをするヌクレオチド配列を示す。式Ｂはハイブリッ
ドプラスミドpBG9のDNA配列の一部と発現された融合蛋
白のアミノ酸配列を示す。式Ｃはハイブリッドプラスミ
ドpBG5のDNA配列の一部及び発現された融合蛋白のアミ
ノ酸配列を示す。式ＤはハイブリッドpBG3-2のDNA配列
の一部（β-グルクロニダ−ゼDNA中のSau3A位置からプ
ロテインＡコ−ディング領域末端に位置するストップリ
ンカ−までの部分）と、発現された融合蛋白のアミノ酸
配列を示す。

【００１５】新規なプラスミド蛋白質及び本発明の発現
系の構成及び同定を詳細に記す前に使用された物質及び
方法を此に開示する。 (1)プラスミドDNA調製 プラスミドDNAの大規模製造に対して使用する手順は本
質的に以下の通りである。250mlの培養基を対数期へ成
長させ、クロラムフェニコ−ルで光学密度0.6〜0.7(又
は別の方法としてクロラムフェニコ−ル添加なしで)で
増殖し、一夜生育させた。細胞を6Kで20分間JA14ロ−タ
−でペレット化し、6mlグルコ−ス緩衝液(50mMグルコ−
ス、25mMトリス、10mM EDTA)中で再懸濁した。細胞を室
温で1mlの20mg/mlの新たに造ったリゾチ−ムの存在下で
で10分間培養し13.8mlの0.2N NaOH中1%SDSを添加しなが
ら、5分間氷上に置き、氷上で更に15分間7mlの5M KAC(p
H5.0-5.5)と共に保った。デブリを10Kで10分間ペレット
化し、等容量のフェノ-クロロホルム-イソアミルアルコ
−ル(25:24:1、TE飽和、0.1% 8-ヒドロキシキノリン）
で１度上澄みを抽出した。0.6容量イソプロピルアルコ
−ルで沈殿させることに続いて、DNAをCsCl勾配物上で
精製した。

【００１６】 (2)制限酵素消化及び所望断片の単離 消化を供給者の指示に従って実施した。断片の分離はア
ガロ−スゲル電気泳動で達成した（下に記載）。電気泳
動したDNAを、供給者の指示に従ってエル-チップ(Elu-t
ip)カラム(シュライヒャ−及びシュネル、キイ−ネ、N
H)上を通過させ、続いて2.5容量のEtOH中でキャリヤ−
のtRNAを添加して沈殿させることによって精製し濃縮し
た。

【００１７】(3)ミニ溶菌物プラスミド分析 形質転換した細胞を10μg/mlテトラサイクリン又は50μ
g/mlのアンピシリンの何れかを補充した1mlのL-ブロス
中に接種し、3〜5時間、37℃で生育させた。細胞を10,0
00 x gで15分間遠心することによって集め、次に50μl
のSTET緩衝液(8%庶糖、5%トライトンX-100、50mlのEDT
A、50mMの トリスHCl,pH8.0)中に再懸濁させた。 50μlのリゾチ−ム 溶液(2mg/mlのSTET緩衝液中)を加え、試験管を4分間室
温で培養し、次に100℃で3分間加熱した。試験管を次に
氷上で0℃で冷却させた。0℃で5分後不溶の物質を10,00
0xgの遠心で15分間で除いた。等容量の氷冷イソプロピ
ルアルコ−ルを上澄み液に加え、試験管を70℃で5分間
おいた。DNA沈殿を10,000 x gで10分間の遠心によって
集め、10〜25μlのTE緩衝液 (10mMトリス-Cl、0.1mM ED
TA pH 8.0)中に再懸濁した。DNAの制限消化物を上に記
載したように6.7μg/mlの RNase A (リホ゛ヌクレア-セ゛A)を含
有する15μl最終容量中の5μlのプラスミド溶液を使用
して上記のように実施した。

【００１８】(4)DNA連結 付着性末端連結及びブラント末端連結の両方にT4リガ−
ゼを用い、これは各場合に過剰で存在した(200u/μgのD
NA)。付着性末端については培養時間は16℃で2〜4時
間、そしてブラント末端に対しては時間を16時間に増加
させた。標準のベクタ−/挿入物連結に対し挿入物は５
倍のモル過剰で存在し、20μlの反応容量中で0.02 pモ
ルのベクタ−及び0.1 pモルの挿入物であった。単一分
子レサ−キュラリゼ−ション反応による欠失突然変異の
発生についてはプラスミドを1μg/mlに希釈し、続いて
制限エンドヌクレア−ゼ消化及び連結を行った。リンカ
−のブラント末端連結はリンカ−の100倍モル過剰で行
い、20μl反応当り0.02pモルでのベクタ−の濃度であっ
た。

【００１９】(5)形質転換 新たな一夜培養基をL-ブロス中で希釈し、37℃で攪拌し
ながらA₆₀₀ 0.3が得られるまで生育させた。細胞を氷の
上で冷却し、次に遠心分離により集めた(10分4100 x
g)。細胞を氷冷50mM CaCl₂の最初の容量の1/2中に再懸
濁し、氷上で20分間培養した。細胞を再度上記のように
遠心分離で集め、氷冷50mM CaCl₂(最初の容量の1/25)中
に再懸濁した。0.1mlの細胞懸濁液を1〜10μl(50-100n
g)の DNAプラスミド溶液と混合し、0℃で30分間静置さ
せた。細胞を次に37℃で2分間加熱し、1.5%の寒天及び1
0μg/mlのテトラサイクリン又は50μg/mlのクロラムフ
ェニコ−ルの何れかを含有しているL-ブロスプレ−ト上
で平板培養しこのときpBR325誘導物が形質転換された。
プレ−トを一夜37℃で培養した。1 x 10⁶コロニ−／μg
プラスミドDNAの形質転換効率が常に観測された。

【００２０】(6)アガロ−ス電気泳動 DNA断片を2X トリスボレ−ト緩衝液(178mMトリス、178m
Mホウ酸、5mM Na₂EDTApH8.4)中の0.8％アガロ−ス中で
のゲル電気泳動によって単離した。分析及び分離用ゲル
を水平ゲル箱中で電気泳動緩衝液(1X トリスボレ−ト)
中に浸漬して、60ボルトにおいて走らせた。DNAバンド
がゲル中に5.0 μg/mlのエチジウムブロマイド(EtBr)を
含ませることによって、紫外線下で見ることが出来るよ
うにされた。所望のDNAバンドを含有している切片をゲ
ルから切り取り、透析管(1/2の径)中の0.5〜1.0mlの緩
衝液を含有している1X トリスボレ−ト緩衝液中の電気
泳動によってDNAを回収した。電気泳動を30分間10ボル
ト又は染色された物質が透析管の側面に対して位置する
まで実施した。ゲルの切片を透析バッグから除去し、バ
ッグを何回もトリスボレ−ト緩衝液でフラッシュするこ
とによってDNAを回収した。NaClを最終濃度1モル迄DNA
溶液に加え、エチジウムブロマイド及びアガロ−スゲル
不純物をトリスボレ−ト緩衝液を飽和させたフェノ−ル
で二度抽出することによって除いた。フェノ−ルをエ−
テルで２回抽出することによって除き、精製したDNAを1
/50容量の5M NaCl及び及び2.5容量の冷たいエタノ−ル
で沈殿させることによって回収した。沈殿反応は-70℃
で15〜20分間実施した。沈殿したDNAを10,000 X gで15
分間遠心分離させることによって回収した。回収した断
片の収率は純粋なDNA標準とのエチジウムブロマイド蛍
光の直接比較によって検定した。典型的には50％の回収
が得られ、断片の寸法が増加するに従い収率は減少し
た。

【００２１】(7)プロテインＡラジオアッセイ プロテインＡ活性を50μlの1:10000希釈正常兎血清(NR
S)を有するダイナテック イミュノロン(Dyna-tech Immu
nolon)[ダイナテックダイアグノスティックスインコ−
ポレ−テッド、サウスウインドハムME]１ミクロ力価ウ
エルを被覆して、室温で4時間培養することによって決
定した。NRSをウェルから振動させ、これを次に1時間4
℃で培養することによって燐酸緩衝塩水中の1%オバルブ
ミン(OVA/PBS)でブロックした。ウェルを空にし、次に2
5μlの1.0及び1000ngプロテインＡの間の量を含有して
いる25μl試料を各ウェルに加えた。市販プロテインＡ
を用いた標準曲線を各検定中で走らせた。全ての希釈は
OVA/PBS中のものであった。25μlの¹²⁵I−プロテインＡ
(6000cpm)のOVA/PBS中のものを各ウェルに加え、プレ−
トを16時間37℃で小さな水のビ−カ−を含有している密
封プラスチック容器中で培養した。培養に続いてウェル
を吸引し、PBS 3X及び水で１度洗浄した。ウェルを乾燥
し、2mlのアクアソル(Aquasol)［ニュウイングランドニ
ュ−クレア−コ−ポレ−ション、マサチュウセッツ州ボ
ストン]中でベックマンモデルLS7000ベ−タカウンタ−
中で２分間計数した（ベックマンインストラメンツイン
コ−ポレ−テッド、カリフォルニア州フラ−トン）。

【００２２】(8)プロテインＡロケット免疫電気泳動(ro
cket immunoelectrophoresisi) プロテインＡの濃度及び活性を31μg/mlの人IgGをトリ
ス−グリシン pH 8.6緩衝液(3.75 g/lトリス塩基、7.5g
/lグリシン)中に含有している1%アガロ−スゲル中のロ
ケット免疫電気泳動によって測定した。0.25及び1.0μg
の間のプロテインＡ標準を各ゲル上で走らせた。電気泳
動を3時間400ボルトで電気泳動緩衝液としてトリス−グ
リシンを用いながら行った。電気泳動に続いてゲルを乾
燥させ、続いてコマッシ−ブル−で短時間染色させ、そ
して5%メタノ−ル、10%酢酸で脱染した。

【００２３】(9)細胞ホモジナイズ 形質転換した細胞を12,000xgで5分間4℃で遠心すること
によって集め、0.5容量のHEPES[4-(2-ヒドロキシエチ
ル)-1-ピペラジン-エタンスルホン酸]−KCl−DTT(ジチ
オスレイト−ル)緩衝液 (6g HEPES pH 8.0、7.5g KCl、
0.15g DTT/l)中に再懸濁させた。細胞を懸濁液をリゾチ
−ムで最終濃度300μg/mlにおいて30分37℃で消化させ
た。懸濁液を5分間で２回氷上で300ワットのパルスで高
周波による分解(sonicate)にかけた。 可溶蛋白を 25,0
00xgで30分4℃で遠心することによって単離した。上澄
み液を除去し、沈殿を等容量のHEPES/KCl/DTT緩衝液中
に懸濁した。全細胞蛋白質がSDSゲル上で走らせる実験
については100℃で5分間、5容量のSDS-均質化緩衝液(50
%容量/容量グリセロ−ル、5%容量/容量2-メルカプトエ
タノ−ル、5%重量/容量ドデシル硫酸ナトリウム及び0.0
05g/mlピロニンＹ)中で加熱することによって細胞を可
溶化した。

【００２４】(10)ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
ウエスタンアナリシス 全てのSDSゲルはラエムリの方法によって走らせた(ラエ
ムリU.K.[1970]ネイチャ−[ロンドン] 227:680-685)。
これらのゲルは12％の全アクリルアミド濃度を含有して
いた。スラブゲルは1.5mmの巾でホエファ−サイエンテ
ィックインストラメンツ（カリフォルニア州サンフラン
シスコ）から得た電気泳動装置中で走らせた。チュ−ブ
のゲルをスタッキングゲルなして6mm内径 x 10cmガラス
管中で走らせた。ウェスタンボルツはニトロセルロ−ス
フィルタ−上で実施した。蛋白質を200mAで12時間フィ
ルタ−に移した。フィルタ−を4時間0.1%牛血清アルブ
ミン(BSA) で燐酸緩衝食塩 (PBS)中で室温においてブロ
ックし、 10 uCiの [I¹²⁵]-IgG(NEN)又は100μlのパ−
オキシダ−ゼとコンジュゲ−トさせた兎IgGの何れかで
室温で一夜攪拌させながらハイブリッド化させた。この
ボルツを次に4回PBSで洗い、コダックXAR-5 X腺フィル
ムに露出するか又は25μl H₂O₂を有する 100ml PBS中2
5mgのジアミノベンジジンで展開した。

【００２５】 (11)クロ−ン化細胞中のプロテインＡ含有量の測定 醗酵に続いて細胞を0.5%のトライトンX-100を有する20m
MのトリスHCl pH 8.3中でガラスビ−ズで渦巻きさせる
か又はダイアノミル(DyamoMill)モデルKDL-パイロット
ビ−ドミル中で均質化させた（ニュ−ジャ−ジ−州メイ
ウッドのインパンデックスから得られる）。これは最高
速度で運転し、0.2mm径のグラスビ−ズを仕込んであ
る。均質化物を16,000xgで30分間遠心することによって
透明にし、上澄み蛋白濃度はロ−レ−(Lowery)蛋白質検
定又はビウレットによって測定した。プロテインＡ濃度
を人の IgG に対するロケット免疫電気泳動(rocket imm
unoelectrophoresisis)で測定した。

【００２６】(12)蛋白質のHPLC精製 プロテインＡ及びプロテア−ゼＫをウォ−タ−ス (Wate
rs)μボンダパック(Bondapak) C18カラム（ウォ−タ−
スアッソシエイツ、マサチュ−セッツミルフォ−ド）を
備えたベックマンモデル360勾配機械(ベックマンインス
トラメンツインコ−ポレ−テッド)を用いてHPLCによっ
て精製又は検定した。プロテインＡを10mM燐酸ナトリウ
ムpH7.2(緩衝液Ａ)及び60%容量/容量イソプロパノ−ル1
0mMホスフェ−ト(緩衝液Ｂ)の間で、線形勾配によって
精製した。カラムを1mM/分の流速において0及び100％緩
衝液Ｂの間で80分にわたって線形勾配で溶出させた。プ
ロテア−ゼＫを精製し、プロテインＡを同様の方法で検
定したが、但し、緩衝液Ａは0.1%トリフルオロ酢酸(TF
A)及び緩衝液Ｂは0.08％のアセトニトリル中のTFAであ
った。カラムを流速2ml/分で0及び60%緩衝液Ｂの間の60
分に亘る線形勾配によって溶出させた。

【００２７】(13)醗酵 醗酵はdo₂及びpH制御を備えた201ケマペックファ−メン
タ−（ニュ−ヨ−ク州ウッドバリ−ケマペックインコ−
ポレ−テッド）中で実施した。組替えセルを50％のdo₂
(空気＝100%)に於て、示されたpHに於て生育させた。pH
を5M NH₄OH又は5M H₂SO₄のを必要ならば添加して調製し
た。泡を消泡剤Ｂ(antifoam B)(イ−.アイ. デュポンデ
ネモア−スアンドカンパニ−インコ−ポレ−テッド、デ
ラウエア州ウィルミントン)の添加によって抑制した。
醗酵温度は37℃で全ての醗酵は最終容量9.51で実施し
た。

【００２８】(14)細菌菌株及び培地 全ての使用した細菌株の起源及び遺伝子型は以下に挙げ
られている。全ての菌株はYT培地を用いて保持及び生育
された（8g/lトリプトン、5g/l酵母抽出物、及び5g/l塩
化ナトリウム）。

【００２９】(15)化学物 ニトロセルロ−スはシュライヒャ−及びシュネル（キ−
ネ,NH）から得た。生育培地はディフコ（ミシガン州デ
トロイト）から得た。アクリルアミドはアキュレ−トケ
ミカルアンドサイエンティフィックコ−ポレ−ション
（ニュ−ヨ−ク州ウェストバリ−）から得た。プロテイ
ンＡ標準はファ−マシア（ニュ−ジャ−ジ−州フィスカ
タウェイ）から得た。全ての他の化学物質はシグマケミ
カルカンパニ−（ミズリ−州セントルイス）から得た。

【００３０】(16)培養基 (A)細菌 此に開示され
ている全ての大腸菌株は大腸菌K-12誘導菌である。菌株 関連遺伝子型 寄託番号 大腸菌 F^-,Gal^-,Thi^-,endA NRRL B-15129,1982年8月18日寄託、 MS371 sbcB, hsdR4 NRRL寄託所に請求し現在一般に入手可 SG20251 F^-,ara D139,lac, NRRL B-15918,1984年12月12日寄託 lon-100,Tn10: :cps E,strA,thi PR13 F^-,pnp-13,rna-19, 標準手順によって以下に挙げられる thr-1,leu B6, 寄託培養基から得ることが出来る。 thi-1,lac Y1, xyl-7,mtl-2, mal Al,str A132 (=rps L123)

【００３１】(B)プラスミドを含有する微生物宿主宿主 寄託番号 大腸菌MS371(pAc37) NRRL B-15127 1982年8月18日寄託、NRRL寄託所に 請求することによって一般に現在入手可能 MS371(pBG101-41) NRRL B-15905 1984年11月1日寄託 PR13(pBG9) NRRL B-15907 1984年11月20日寄託 PR13(pBG5) NRRL B-15908 1984年11月20日寄託 PR13(pBG3-2) NRRL B-15909 1984年11月20日寄託 PR13(pBG3-2ΔN) NRRL B-15910 1984年11月20日寄託

【００３２】(C)プラスミド プラスミドpBR322は良く知られていて入手可能なプラス
ミドであり大腸菌宿主ATCC 37017中で保持されている。
精製されたpBR322DNAはボリバ− エフ.、ロドロクェツ
ア−ル.エル.、グリ−ネ ピ−.ジェ−.、ベスラッチ エ
ム.シ−.、ハイネッカ− エッチ.エル.、ボイヤ− エッ
チ.ダブリュ−.、クロサ ジェイ.エッチ.、及びファル
コウ エス.(1977)、Gene 2: 95-113及びサトクリフ ジ
ェイ.ジ−.(1978) Nucleic Acids Res. 5:2721-2728中
に記載されるように得ることが出来る。プラスミドpBR3
25も良く知られているプラスミドである。これは20877
ミッドランド州ガイサ−バ−グ ピ−オ−ボックス6009
ビ−ア−ルエルインコ−ポレ−テッドから得ることが出
来る。

【００３３】NRRL B-15907、NRRL B-15908、NRRL B-159
09、NRRL B-15910及びNRRL B-15918はこれらの寄託番号
を開示している特許の付与によって一般に入手可能であ
る。これらの寄託菌が入手できるからといって行政行為
によって本発明に付与された特許権を損なってまで本発
明を実施する権利を構成するものではないことを理解す
べきである。培養寄託物はアメリカ合衆国イリノイ州ペ
オリア米国農務省ノ−ザンリ−ジョナルリサ−チラボラ
トリ−(NRRL)の永久寄託中に寄託されている。

【００３４】大腸菌PR13の代りに使用できる良く知られ
た他の大腸菌宿主、例えば大腸菌MS371、 HB101及び大
腸菌GMS407(ノベル エム.及びノベル ジ−.[1973] Mol.
Gen. Gent. 120: 319)がある。

【００３５】更に使用できる他の原核宿主は、サルモネ
ラ (Salmonella)、シュ−ドモナス(Pseudomonas)、バ
シルス(Bacillus)、 ストレプトマイセス (Strepto
myces)属からの微生物である。

【００３６】 (17)形質転換宿主からの組替えプラスミドDNAの単離 組替えプラスミドDNAはその原核宿主から良く知られた
手順、例えば透明にした溶菌物−密度勾配平衡手順など
を用いて単離することが出来る。

【００３７】(18)DNA配列決定 DNA配列決定はマックサム及びギルバ−ト(マクサム エ
−.、ギルバ−ト ダブリュ.[1977] Proc. Natl. Acad.
Sci. 米国74:560)及びハイデッカ−等（ハイデッカ−
ジ−.、メッシング ジェ−.及びグロネンボルン ビ−.
[1980] Gene 10：69）に記載されるように実施される。

【００３８】ハイブリッド蛋白遺伝子の構築 本明細書の代表として例示されるハイブリッド蛋白質遺
伝子の構築はプラスミドpBG101-41の使用で開始され
た。このプラスミドはプラスミド pBR322のBamHＩに挿
入されているおよそ6kbの大腸菌β-グルクロニダ−ゼ遺
伝子DNAを含有する。プラスミドpBG101-41はBamHＩ制限
エンドヌクレア−ゼで切断され、Bal-31エクソヌクレア
−ゼでの短い処理によってブラント末端化される。この
エクソヌクレア−ゼ処理は12の塩基を除去し、ブラント
末端を残す。

【００３９】切断されブラント末端にされたpBG101-41
への挿入のためのDNAは、pBR322中のスタフィロコッカ
スオウレウス(Staphylococcus aureus)プロテインＡ遺
伝子を含有しているプラスミドpAc37から得られた。図
面の図１を参照。

【００４０】切断しブラント末端にしたプラスミド pBG
101-41をブラント末端のClaＩプロテインＡ断片に連結
させ、そしてハイブリッドプラスミドpBG9を与える。プ
ラスミドpBG9はプロテインＡ遺伝子に融合されたβ-グ
ルクロニダ−ゼ蛋白質のN-末端167アミノ酸に対してコ
−ドを有している501のヌクレオチドを含有している。
図面の図２を参照。

【００４１】ハイブリッドプラスミドpBG5はハイブリッ
ドプラスミドpBG101-41及びハイブリッドプラスミド pB
G9から構築した。図面図３を参照。プラスミドpBG101-4
1はBamHＩで切断し、次にBal-31エクソヌクレア−ゼ(IB
I-fast-Bal-31)で消化した。生じるDNAをClaＩで消化
し、上記のようにして調製した挿入DNAを連結させた。

【００４２】完成したプロテインＡに対するコ−ド配列
を含有している上記の連結の為の挿入DNAをハイブリッ
ドプラスミドpBG9からこのプラスミドを制限酵素 Cla
Ｉ及びFnu4H1で切断することにより調製した。

【００４３】挿入及びベクタ−DNAを連結させ大腸菌株P
R13中に形質転換し、プラスミドDNAを形質転換物から製
造した。pBG5としてラベルされる一つのクロ−ンは予想
された制限プロフィ−ルを含有していた。標準のM13方
法によるこのクロ−ンの配列分析はBGコ−ド配列の18の
アミノ酸が残っていることを明らかにした。

【００４４】ハイブリッドプラスミドpBG3-2はプラスミ
ド pBG5及びプラスミドpBR325から構築した。図面の図
４を参照。プラスミドpBG3-2はプラスミド pBG5と同じ
DNAを含有するが、但しpBG5はpBR322 DNAを含有し、pBG
3-2はpBR325DNAを含有する点が違うだけである。またpB
G3-2はプロテインＡ遺伝子 DNAの末端におけるClaＩ位
置においてストップコドンリンカ−を含有している。DN
Aの構築されたリンカ−セグメントは全ての三つの読み
枠（リ−ディングフレ−ム）に於てストップコドンを含
有していた。最終的なハイブリッド蛋白質製品がどんな
pBR325に由来するアミノ酸も含有しないことを確実にす
るために、これをpBG3-2構築におけるClaＩ位置へ挿入
した。

【００４５】プラスミドpBG3-2中の融合遺伝子によって
コ−ドされるハイブリッド蛋白質の増加された発現がΔ
Nde欠失を構築することによって、即ちpBR325のNde位置
とBG配列のNde位置の間のDNAを除去することによって得
られた。この欠失はpBR325中のrop遺伝子の大部分を除
去し、並びにBGプロモ−タ−領域の最初の230塩基を除
去する。この構築はプラスミドpBG3-2ΔNとして同定さ
れる。大腸菌宿主がpBG3-2ΔNで形質転換されるとき、
宿主は全大腸菌蛋白質の60%を越える水準でプロテイン
Ａを発現する。これと対照してプロテインＡはプラスミ
ドpBG3-2を含有する宿主細胞中で全細胞蛋白質の50%で
大腸菌中で発現される。

【００４６】プロテインＡの有用性 プロテインＡは種々の診断及び基本的な研究試験系に於
てイミュノアブソ−ベント（免疫吸収材）として広く使
用されている。米国特許4,322,274を参照。プロテイン
Ａの応用における最近の興味はその抗癌処理に於ける可
能性のある臨床使用に中心がおかれてきた。感作された
末梢の血液のリンパ球は、通常は腫よう細胞の細胞毒性
の原因となっているが特定の抗原、抗体、抗グロブリン
及び免疫複合体からなると推定される血清封鎖因子によ
ってその機能が阻害されると仮説がたてられている。バ
−ナ−ズ ビ−.シ−.(1981) Cancer Bull. 33: 278参
照。これらのブロッキグ因子はプロテインＡを含有する
スタフィロコッカスオウレウスのコ−ワン(Cowan)Ｉ細
胞に吸収されることによって腫ようを有する血清から除
去され得、従ってインビトロ試験系において細胞によっ
て媒介される腫よう細胞毒性が進行できるようにする。
スティ−ル ジ−.、アンケルスト ジェ−.及びスジョグ
ルン エッチ.[1974] Int. J. Cancer 14:83参照。プロ
テインＡは又IgG結合活性と独立したポリクロナ−ル抗
体合成も活性化させる。スジョダ−ル ジェ−.及びモラ
− ジ−.[1979] Scand. J. Immunol. 10: 593参照。

【００４７】プロテインＡの抗癌剤としての広範な試験
は材料の高いコスト及びプロテインＡ調製に於ける不純
物の存在によって邪魔されてきた。プロテインＡの調製
のコストが非常に減少され、純度が改良されればプロテ
インＡの抗癌用途に対する臨床試験が更により迅速に進
行するであろう。

【００４８】本明細書に開示したデ−タを有すれば当業
者は容易に実質的に同じプロテインＡ様の生物活性を有
する分子に対しコ−ドを有する他の同等のヌクレオチド
配列の同定することを容易に認識するであろう。従って
本発明の範囲は上記の特定のヌクレオチド配列のみなら
ず、実質的に同じ同定しうるのプロテインＡ様生物活性
を有する分子に対しコ−ドを有する均等なヌクレオチド
配列全てを包含するものである。均等のという用語はそ
の通常の特許用語としての使用であって、本質的に同じ
宿主中で実質的に同じ同定しうるプロテインＡ様生物活
性を有する分子を製造するのに本明細書で同定したヌク
レオチド配列の様に実質的に作用するヌクレオチド配列
を意味する。この定義内でFc領域にIgG結合性を有する
プロテインＡ様物質のサブ断片又はポリクロナ−ルＢ細
胞活性化活性を有するサブ断片が含まれる。実施例1で
開示されるプラスミドpAc37はスタフィロコッカスオウ
レウスプロテインＡのアミノ酸配列に対し、コ−ドを有
する全ヌクレオチド配列を含有している。この配列は式
Ａに示されるが、上に定義した同定しうるプロテインＡ
の様な物質及び上に定義したプロテインＡ様の物質の同
定しうるサブ断片に対しコ−ドを有しているクロ−ン化
ヌクレオチド配列を得ることを当業者が出来るようにす
る。本発明の同定しうるプロテインＡ様の物質及びその
プロテインＡ様の同定しうるサブ断片は上に開示したプ
ロテインＡと同じ方法で使用できる。

【００４９】

【実施例】以下のものは本発明を実施するのに最良の方
法を含めた手順を例示する。これらの実施例は制限する
ものと解釈されない。特に示さなければ全ての％は重量
により、全ての溶媒混合物は容量による。

【００５０】実施例１ プラスミドpBG101-41及びプラスミドpAc37からのハイブ
リッドプラスミドpBG9の構築及び融合プロテインＡ製品
の発現 β-グルクロニダ−ゼプロモ−タ−及びβ-グルクロニダ
−ゼプロテインＡハイブリッド遺伝子を含有するプラス
ミドpBG9は、プラスミドpBG101-41及びブラント末端のC
laＩでの上記プロテインＡの断片から構築した。プラス
ミド pBG101-41 は独特の BamHＩ場所（最初のメチオニ
ンから後の179アミノ酸位置）において開き、Bal-31エ
クソヌクレア−ゼ（製造業者によって記載される通り）
での短い処理によってブラント末端にした。このエクソ
ヌクレア−ゼ処理は36の塩基（12のアミノ酸）を除去
し、ブラント末端を残した。プラスミドを更にプラスミ
ドpBR322の独特の位置においてClaＩで切断した。プラ
スミドpAc37はpBR322中にプロテインＡ遺伝子を含有す
る。プラスミドpAc37はTTG出発コドン(T=1)の後、65及
び1265位置においてプロテインＡ遺伝子を開裂させるRs
aで消化した。1199塩基対のRsa断片をアガロ−ス電気泳
動で単離した。 ClaＩリンカ− (ニュ−イングランド
バイオラブ、マサチュウセッツ州バ−レ−、 配列は CA
TCGATG)を単離したRsa断片に融合した。この構築物をCl
aＩで切断し、pBR322のClaＩ位置に挿入し、pA1と命名
される中間プラスミドを形成した。プラスミドpA1を部
分的にClaＩで消化し、ClaＩのスティッキ−末端（付着
性末端・粘性末端）を、25μlの50mMトリス-Cl pH7.2、1
0mM Mg₂SO₄、0.1mM DTT、50μg/ml BSA、及び1μgの制
限断片中に、各2mMの4-デオキシヌクレオチド三燐酸及
び5単位の大腸菌DNAポリメラ−ゼ１のクレノウ(Klenow)
断片含有する反応中で充填させた。充填反応は20分間22
℃で培養し、70℃で10分間熱不活性化することによって
止めた。プラスミドを次にSalＩで消化して1826塩基対
断片をアガロ−ス電気泳動で単離した。この断片を更に
ClaＩで切断し、上に述べた切断プラスミド中に挿入し
た（図面の図１参照）。

【００５１】プラスミドpBG9のDNA配列及び大腸菌PR13
(pBG9)によって発現された融合蛋白質のアミノ酸配列を
式Ｂに示す。

【００５２】プラスミドpBG9及びpBG101-41及び融合プ
ロテインＡ製品の発現 プラスミドpBG101-41はBamHＩによって開かれたpBR322
であって、BGプロモ−タ−及びBGコ−ディング領域を含
有しているSauＩ部分配列の挿入を有するものからな
る。プラスミドpBG101-41は BamHＩで切断し、これはメ
チオニン出発コドンの後、179アミノ酸の位置でこのプ
ラスミドを開裂させ、次にBal-31エクソヌクレア−ゼ
（IBI-fast Bal-31)で酵素濃度20U/ml及びDNA濃度100μ
g/mlに於て消化される。反応を30℃で進行させる。10
分、15分及び20分に於て消化物の1/3が除かれ、反応をE
DTAを20mM添加し、続いて-80℃に冷凍することによって
停止させる。特定時点のものを独立にフェノ−ル−エ−
テルで抽出し、エタノ−ルで沈殿させる。DNAをClaＩで
消化させ、これが pBR322の独特の位置で切断され、次
に挿入物DNAを連結させる。

【００５３】挿入物DNAは完全なプロテインＡコ−ド化
配列を含有しており、プラスミドpBG9から調製した。こ
のプラスミドを制限酵素ClaＩ及びFnu4H1で切断した。
制限エンドヌクレア−ゼFnu4H1はプロテインＡ遺伝子を
シグナルペプチド開裂位置の5'末端に対し一つの塩基の
所で切断し、そしてClaＩはこの遺伝子をC-末端繰り返
し領域において切断する。このClaＩ位置はプロテイン
Ａ遺伝子の3'-末端から284塩基対離れた位置のRsa位置
に於てClaＩリンカ−を連結させることによって構築さ
れる。

【００５４】挿入物及びベクタ−DNAを4:1の挿入物：ベ
クタ−比で20μg/mlベクタ−DNAを含有する反応中で連
結させる。T4リガ−ゼ触媒反応を15℃で一夜進行させ、
次にリガ−ゼを70℃で15分間加熱することによって不活
性化させた。反応混合物をXho（これはBG蛋白質中の独
特の位置において切断する）で消化させ、BG欠失を含有
している任意のプラスミドの形質転換を防止する。反応
混合物を大腸菌株PR13中に形質転換させ、プラスミドDN
Aを形質転換物から調製する。一つのクロ−ンである標
識されたpBG5は予想された制限プロフィ−ルを含有して
いた。このクロ−ンのM13方法による配列分析はBGコ−
ド配列の18のアミノ酸が残っていることを明らかにした
（図面の図３を参照）。

【００５５】プラスミドpBG5のDNA配列と大腸菌PR13(pB
G5)で発現された融合蛋白のアミノ酸を式Ｃに示す。

【００５６】実施例３ プラスミドpBG5及びプラスミドpBR325からのハイブリッ
ドプラスミドpBG3-2の構築及び融合プロテインＡ製品の
発現 プラスミドpBR325をClaＩ及びSalＩで消化させ、プラス
ミドコ−ド化配列のほとんどを含有している5368塩基対
断片をアガロ−ス電気泳動によって単離する。プラスミ
ドpBG5もClaＩ及びSalＩで消化させ、BGプロモ−タ−及
びプロテインＡコ−ディング配列を含有している2000塩
基対断片をアガロ−スゲル電気泳動で単離する。これら
の二つのDNA断片を等モル比で、断片当り30μg/mlに於
て混合し、T4リガ−ゼで連結させる。生じる生成物を
ClaＩで消化させ、生じる7.4kbの線状分子をアガロ−ス
電気泳動で単離する。実施例４に記載のように調製した
ストップコドンを含有するリンカ−DNA断片を大モル過
剰で加え、反応をT4リガ−ゼで一晩15℃で連結させる。
閉環状のプラスミドをClaＩ及びSmaＩで消化させ、複数
のストップリンカ−を有するか又はストップリンカ−を
有しないプラスミドに線状化させ、次に大腸菌PR13に形
質転換する（図面の図４を参照）。

【００５７】プラスミドpBG3-2のDNA配列及び 大腸菌 P
R13(pBG3-2)によって発現される融合蛋白のアミノ酸配
列を式Ｄに示す。

【００５８】実施例４ −−ストップリンカ−の構築 ストップコドンを全ての三つの読み枠（リ−ディングフ
レ−ム）中に含有しているDNAのリンカ−セグメントをp
BG3-2構築物中のClaＩ位置に挿入し、最終生成物がどん
なpBRに由来するアミノ酸も含有しないことを確実にす
る。合成DNAセグメントで配列CGGGCGCGCTAGCTAGCTAGCGC
GCCを有するものを製造業者の指示する手順にしたがっ
てアプライドバイオシステムDNA合成機械、モデル380A
(フォスタ−シティ−、カリフォルニア州）を用いて合
成する。この配列は自己アニ−リングのものであって二
重鎖DNA断片を生成する。 CGGGCGCGCTAGCTAGCTAGCGCGCC CCGCGCGATCGATCGATCGCGCGGGC を生成し、これは停止配列CTAGCTAGCTAG及びBssHＩの位
置GCGCGCをトリフェ−ジック（三重）ストップの両端に
含有している。

【００５９】実施例５ −−プラスミドpBG3-2からのプ
ラスミドpBG3-2ΔNの構築 プラスミド pBG3-2 を制限エンドヌクレア−ゼNdeで消
化し、切断したプラスミドをフェノ−ル−エ−テルで抽
出し、エタノ−ルで沈殿させた。プラスミドを希釈DNA
濃度(12μg/ml)に於て連結させてNde断片の取込なしに
分子間リサ−キュラリゼ−ションがしやすいようにして
プラスミド pBG3-2ΔNをあたえる。反応混合物を大腸
菌PR13に形質転換し、コロニ−をミニリゼ−ト分析で検
定する。図面の図５を参照。

【００６０】実施例６ −−大腸菌PR13又は大腸菌SG20
251へのプラスミドpBG3-2、pBG3-2ΔN、pBG9及びpBG5の
形質転換 大腸菌PR13又は大腸菌SG20251を(5)の形質転換で記載し
たように生育させた新たな一夜培養基から収穫した。細
胞を上記のようにCaCl₂で処理することによって形質転
換能力があるようにした。プラスミドDNAを(1)プラスミ
ドDNA調製において記載した方法によってプラスミドを
宿している細胞から調製した。能力のある（コンペテン
ト）細胞0.1mlを 50〜100ngのプラスミドDNAと30分間0
℃で混合した。細胞を37℃で2時間加熱し、次に1.5％寒
天及び10μg/mlのテトラサイクリン又は50μg/mlのクロ
ラムフェニコ−ルの何れかを含有しているL-ブロス平板
培養基上で次に平板培養し、ここでpBR325誘導物が形質
転換された。平板培養基を一夜37℃で培養した。プラス
ミドDNAμg当り1 x 10⁶コロニ−の形質転換効率が常に
観測された。

【００６１】実施例７ −−大腸菌PR13(pBG3-2)の醗酵 大腸菌PR13(pBG3-2)はこの技術の当業者に良く知られた
幾つもの方法の任意のものによって生育できる。この微
生物は大腸菌の生育を指示することのできる任意の複合
培地上で、そして定義された培地が十分な生育因子及び
細胞成長を支持するのに必要な代謝物を含有するならば
任意の定義された培地上で生育するであろう。一般にこ
れらの定義培地は、アミノ酸スレオニン及びロイシンを
もし含有するならば大腸菌を生育することのできるもの
をなす。この微生物による組替え蛋白質の製造は分解産
物抑制に従う。従って蛋白質の製造が望まれる時はグル
コ−ス又は分解産物抑制（カタボライトレプレッショ
ン）を生じることのできるどんな基質も生育培地が含有
しないように注意すべきである。大腸菌の分解産物抑制
はcAMPの水準の細胞間の減少によって仲介される。従っ
てこの生物はこのような培地が高水準のcAMP、典型的に
は4mMを含有するならば、又はこれらの培地が高水準の
脂質可溶cAMP誘導体、例えばジブテリルcAMPを約10μM
の濃度で含有するならばグルコ−スを含有している生育
培地の存在下で生育させられ得る。

【００６２】一般にプロテインＡの高水準は大腸菌PR13
(pBG3-2)の凍結原料からの接種物を調製することによっ
て製造することが出来る。これはYT/Cm上に斜面培養さ
れ、一夜生育されたものである。YTは8g/lの酵母抽出
物、5g/lのトリプトン及び5g/lのNaClを含有する。YT/C
mは50mg/lのクロラムフェニコ−ルを含有している。コ
ロニ−を平板培養基からとりあげ、10mlのYT/Cm中に接
種し、これをで37℃で6〜12時間生育させて次に直接醗
酵器中に接種する。

【００６３】大腸菌PR13(pBG3-2)を9.8 lの5g/l酵母抽
出物及び5g/lのトリプトンを仕込んだ201ケェマペック
ファ−メンタ−（ニュ−ヨ−ク州ウッドバリ−）中で生
育させる。溶解させた酸素濃度を約50%(空気=100%)に保
ち、5M NaOH又は5M H₂SO₄を自動的に添加することによ
ってpHを約6.8に保った。正常な接種物容量は約10mlで
ある。この接種物で醗酵器は9時間の生育の後に収穫で
きる。細胞がこの方法で生育される時、醗酵器中で製造
される全大腸菌に由来する蛋白質の46%がプロテインＡ
である。

【００６４】クロ−ン化されたプロテインＡが活性形で
発現されていることが証拠により実証される。[¹²⁵I]標
識された兎IgGをプロブ(探り)にしたウエスタンブロッ
トは、熱いSDS溶液での処理、及びSDSポリアクリルアミ
ドゲル中での電気泳動の後においてさえハイブリッド蛋
白質がIgG結合活性を有することを示している。

【００６５】pnp-宿主株から抽出された可溶性プロテイ
ンＡの特異的活性はラジオアッセイによって測定した
（(6)のプロテインＡラジオアッセイを参照）。この検
定は細胞原形質ゾル(cytosol)が純粋な市販物質の特異
活性の35%であるプロテインＡ活性を有したことを実証
した。この原形質ゾル(cytosolic)調製中のプロテイン
Ａ濃度はSDSゲル電気泳動によって35%と測定され、クロ
−ン化された物質が天然の蛋白質と本質的に同等の特異
的活性を有していることを示している。

【００６６】 実施例８ −−大腸菌PR13(pBG3-2ΔN)の醗酵 組替え生物を(13)醗酵のところで記載したように醗酵器
中で生育させ、pBG3-2の様にプラスミドpBG3-2ΔNを分
解産物抑制にかけた。大腸菌PR13(pBG3-2)に対して記載
した培地及び条件をこの微生物を生育させるにも使用で
きる。驚くべきことにプラスミドpBG3-2ΔNを含有して
いる大腸菌は組替え産物の驚くほど高い水準を生じた。

【００６７】次の表はpBG9、pBG3-2及びpBG3-2ΔNのプ
ロテインＡ発現水準を示すものである。 プロテインＡの含有量はロケット免疫電気泳動により、
そして全蛋白質をビウレットによって測定した。

【００６８】 実施例９ −−プラスミドで形質転換した宿主の単離 宿主微生物、例えば大腸菌PR13は、プラスミド、例えば
pBG9抜きで回収できる。これを用いて標準手順によって
これを形質転換された。例えば形質転換された宿主は0.
01%重量/容量SDSを含有しているYT培地中で生育出来、
宿主からプラスミドをエジェクトする。プラスミドのな
い宿主細胞はクロラムフェニコ−ル及び／又はアンピシ
リンに対する抵抗性がないことの為にスクリ−ンするこ
とが出来る。

【００６９】この技術で良く知られているように蛋白
質、例えばプロテインＡのアミノ酸配列はDNAのヌクレ
オチド配列によって決定できる。遺伝子コ−ドの冗長
性、即ち蛋白質を製造するのに使われるアミノ酸の多く
に対し、一個より多くのコ−ド化ヌクレオチドトリプレ
ット(コドン)が使用され得るので特定のアミノ酸に対し
て異なるヌクレオチド配列がコ−ド出来る。従って遺伝
子コ−ドは以下のように描かれる。フェニルアラニン (Phe) TTK ヒスチシ゛ン(His) CAKロイシン (Leu) XTY ク゛ルタミン(Gln) CAJイソロイシン (Ile) ATH アスハ゜ラキ゛ン(Asn) AAKメチオニン (Met) ATG リシ゛ン(Lys) AAJハ゛リン (Val) GTL アスハ゜ラキ゛ン酸(Asp) GAKセリン (Ser) QRS ク゛ルタミン酸(Glu) GAJフ゜ロリン (Pro) CCL システイン(Cys) TGKスレオニン (Thr) ACL トリフ゜トファン(Try) TGGアラニン (Ala) GCL アルキ゛ニン(Arg) WGZチロシン (Tyr) TAK ク゛リシン(Gly) GGL 末端信号 TAJ 末端信号 TGA キ−：各３文字のデオキシヌクレオチドトリプレットは
左側に5'-末端、及び右側に3'-末端を有するmRNAのトリ
ヌクレオチドに対応する。本明細書に与えられる全ての
DNA配列はその配列がmRNA配列に対応する配列の鎖のも
のであって、ウラシルの代りにチミンで置き換えられて
いる。文字はデオキシヌクレオチド配列を形成している
プリン又はピリミジン塩基を表している。 A =アデニン G =グアニン C =シトシン T =チミン X =YがA又はGの時にT又はC X =YがT又はCの時にC Y =XがCの時にA、G、C又はT Y =XがTの時にA又はG W =ZがA又はGの時にC又はA W =ZがC又はTの時にC Z =WがCの時A、G、C又はT Z =WがAの時A又はG QR=SがA、G、C又はTの時TC J =A又はG K =T又はC L =A、T、C又はG M =A、C又はT

【００７０】上記は融合されたプロテインＡ製品の新規
なアミノ酸配列及び他の有用な蛋白質が蛋白質の同じア
ミノ酸配列に対しコ−ドしている均等なヌクレオチド配
列によって製造できることを示す。従って本発明はその
ような均等のヌクレオチド配列を含むものである。更
に、変化が蛋白質の二次構造を変化させないならば、ア
ミノ酸配列を変化させることによって、同定された構造
及び機能の蛋白質を構成することが出来ることを示して
いる（カイザ− イ−.ティ−.及び ケズディ−エフ.ジ
ェ−.[1984] Science 223: 249-255）。

【００７１】ここに記載された研究は全てNIHガイドラ
インに特定された物理的及び生物学的封じ込め要求にの
っとってなされた。

【００７２】式Ａ

【化１５】 式Ａ（続き）

【化１６】 式Ａ（続き）

【化１７】 式Ａ（続き）

【化１８】 式Ｂ

【化１９】 式Ｂ（続き）

【化２０】 式Ｂ（続き）

【化２１】 式Ｂ（続き）

【化２２】 式Ｂ（続き）

【化２３】 式Ｂ（続き）

【化２４】 式Ｂ（続き）

【化２５】 式Ｃ

【化２６】 式Ｃ（続き）

【化２７】 式Ｃ（続き）

【化２８】 式Ｃ（続き）

【化２９】 式Ｃ（続き）

【化３０】 式Ｃ（続き）

【化３１】 式Ｄ

【化３２】 式Ｄ（続き）

【化３３】 式Ｄ（続き）

【化３４】 式Ｄ（続き）

【化３５】 式Ｄ（続き）

【化３６】 式Ｄ（続き）

【化３７】

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpAc37からの中間プラスミドの構
築を例示する略図であって、プラスミドpAc37はプロテ
インＡ遺伝子及び全pBR322 DNAからなる。

【図２】 プラスミドpBG101-41及びpBG9に対する遺伝
子DNA挿入物についての制限マップを示す略図であっ
て、クロ−ニング中に再生されないBamHＩの位置は(Bam
HＩ)として印す。

【図３】 プラスミドpBG9からのpBG5の構築を示す略図
である。

【図４】 pBG5及びプラスミドpBR325からのプラスミド
pBG3-2の構築を示す略図である。

【図５】 プラスミドpBG3-2からのプラスミドpBG3-2Δ
Nの構築を示す略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 アルギス アニリオニス アメリカ合衆国 02174 マサチュ−セッ ツ州 ア−リントン サマ− ストリ−ト 542

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下のヌクレオチド配列又は翻訳された
   領域が同じアミノ酸配列に対してのコ−ドを有する塩基
   を含有している均等のヌクレオチド配列 【化１】 【化２】 を有するDNAからなる組替えDNAトランスファ−ベクタ−
   を宿す原核微生物を培養することからなる、次のアミノ
   酸配列 【化３】 【化４】 を有するハイブリッド蛋白質の製造方法。
2. 【請求項２】 原核微生物がlon又はpnp突然変異を有し
   ている大腸菌Ｋ-12誘導菌であって、上記組替えDNAトラ
   ンスファ−ベクタ−がプラスミドpBG9である請求項１に
   記載の方法。
3. 【請求項３】 上記大腸菌Ｋ-12誘導菌が大腸菌SG20251
   又は大腸菌PR13である請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 以下のヌクレオチド配列 【化５】 【化６】 又は翻訳された領域が同じアミノ酸配列に対してのコ−
   ドを有する塩基を含有している均等のヌクレオチド配列
   を有するDNAからなる組替えDNAトランスファ−ベクタ−
   を宿す原核微生物を培養することからなる、次のアミノ
   酸配列 【化７】 【化８】 を有するハイブリッド蛋白質の製造方法。
5. 【請求項５】 原核微生物がlon又はpnp突然変異を有し
   ている大腸菌Ｋ-12誘導菌であって、上記組替えDNAトラ
   ンスファ−ベクタ−がプラスミドpBG5である請求項４に
   記載の方法。
6. 【請求項６】 上記大腸菌Ｋ-12誘導菌が大腸菌SG20251
   又は大腸菌PR13である請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 以下のヌクレオチド配列又は翻訳された
   領域が同じアミノ酸配列に対してのコ−ドを有する塩基
   を含有している均等のヌクレオチド配列 【化９】 【化１０】 を有するDNAからなる組替えDNAトランスファ−ベクタ−
   を宿す原核微生物を培養することからなる、次のアミノ
   酸配列 【化１１】 【化１２】 を有するハイブリッド蛋白質の製造方法。
8. 【請求項８】 原核微生物がlon又はpnp突然変異を有し
   ている大腸菌Ｋ-12誘導菌であって、上記組替えDNAトラ
   ンスファ−ベクタ−がプラスミドpBG3-2又はプラスミド
   pBG3-2ΔNである請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 上記大腸菌Ｋ-12誘導菌が大腸菌SG20251
   又は大腸菌PR13である請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 β-グルクロニダ−ゼ遺伝子DNAを含
    む、rop遺伝子を部分的に又は全体的に欠失させている
    か又は他の方法で不活性化させている大腸菌colE1プラ
    スミドに由来する組替えDNAトランスファ−ベクタ−を
    宿す原核微生物を培養することからなる有用蛋白質の製
    造方法。
11. 【請求項１１】 上記β-グルクロニダ−ゼ遺伝子DNAが
    大腸菌Ｋ-12誘導菌から得られる請求項１０に記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 上記大腸菌Ｋ-12誘導菌が大腸菌MS371
    である請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 原核微生物がlon又はpnp突然変異を有
    している大腸菌Ｋ-12誘導菌である請求項１０に記載の
    方法。
14. 【請求項１４】 上記大腸菌Ｋ-12誘導菌が大腸菌SG202
    51又は大腸菌PR13である請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 次のＡ₁-Ａ₂-Ａ₃-Ａ₄、Ａ₁-Ａ₃-Ａ₄、
    及びＡ₁-Ａ₃-Ａ₅からなる群から選ばれるアミノ酸配列
    を有するハイブリッド蛋白質〔式中Ａ₁はMet Leu Arg P
    ro Val Glu Thr Pro Thr Arg Glu Ile Lys Lys Leu Asp
    Gly Leuであり、Ａ₂は 【化１３】 であり、Ａ₃は 【化１４】 であり、Ａ₄はAsp Asp Lys Leu Ser Asn Met Arg Ile L
    eu Glu Asp Glu Arg Ala Ser であり、Ａ₅はGly Arg Al
    a Ser である〕。