JPH0751096A - アミロイド前駆体タンパク質のタンパク質分解に基づいてのアルツハイマー病についての診断アッセイ - Google Patents

アミロイド前駆体タンパク質のタンパク質分解に基づいてのアルツハイマー病についての診断アッセイ

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Abstract

(57)【要約】 【目的】 ヒトにかけるアルツハイマー病についての診
断方法に関する。 【構成】 （ａ）前記患者から得られた脳脊髄液及び血
液から選択された体液のサンプルとＡＰＰ基質とを組合
し、そして、（ｂ）前記サンプルの存在下で前記ＡＰＰ
基質のタンパク質分解切断を検出する段階を含んで成
り、ここで前記ＡＰＰ基質のそのようなタンパク質分解
切断の程度が、対照の個人からの脳脊髄液及び血液サン
プルの存在下で生じるタンパク質分解切断とは実質的に
異なる、アルツハイマー病を有することが知られている
個人からの脳脊髄液又は血液サンプルの存在下で生じ
る、アルツハイマー病の診断に使用するための方法に関
する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】背景 本発明はヒトにおけるアルツハイマー病についての診断
方法に関する。より詳しくは、本発明は、試験されるべ
き患者から得られた脳脊髄液又は血液のサンプルの存在
下でアルツハイマー病β−アミロイドタンパク質へのそ
の前駆体のタンパク質分解の検出に基づかれる診断アッ
セイである。
【０００２】アルツハイマー病（この後、“ＡＤ”と称
する）は、通常、前頭皮質、壁側皮質及び後頭皮質にお
ける進行性萎縮症により特徴づけられる脳の進行性退化
性疾患である。ＡＤの臨床学的発現は、進行性記憶障
害、言語及び視覚空間熟練の損失及び行動的欠陥を包含
する（Mckhanなど.,１９８６，Neurology ３４：９３
９〜９４４）。全体的な認識障害は、小脳半球じゅうに
位置する神経細胞の退化に寄与する（Price,１９８６，
Annu. Rev. Neurosci 。９：４８９〜５１２０）。
【０００３】病理学的には、ＡＤ患者の死後の脳の主な
区別できる特徴は、１）神経細線維もつれの蓄積を含む
神経細胞質から構成される病理学的損傷；２）脳血管性
アミロイド沈着物；及び３）神経炎プラークである。脳
血管性アミロイド及び神経炎プラークの両者は、“Ａ
４”又は“β−アミロイド”と単純に称せられる特別な
ペプチドを含む。
【０００４】β−アミロイドは４，５００の相対的分子
質量の不溶性で高い凝集性の小さなポリペプチドであ
り、そして３９〜４２個のアミノ酸から構成される。Ka
ngなど.,１９８７，Nature ３２５：７３３〜７３６
は、大きな前駆体タンパク質に起因し、そしてその一部
としてβ−アミロイドタンパク質を記載している。この
前駆体を同定するために、そのタンパク質をコードする
十分な長さの相補的ＤＮＡクローンが、既知のβ−アミ
ロイド配列から得られたオリゴヌクレオチドプローブを
用いて、同定され、そして配列決定された。予測された
前駆体は、６９５個の残基を含み、そして現在、“ＡＰ
Ｐ６９５”（アミロイド前駆体タンパク質６９５）と令
名される。
【０００５】ＡＰＰ６９５は、ヒト脳に見出されるＡＰ
Ｐの最も富んだ形であるが、しかし３種の他の形、ＡＰ
Ｐ７１４，ＡＰＰ７５１及びＡＰＰ７７０が存在する。
異なった長さのイソ形が、ヒト染色体２１上に位置する
単一のＡＰＰ遺伝子からの選択的スプライシングから生
じる（Goldgaber など.,１９８７，Science ２３５：８
７７〜８８０；Tanzi など.,１９８７，Science ２３
５：８８０〜８８５）。
【０００６】ＡＰＰタンパク質をコードする遺伝子の続
くクローニングは、Ａ４領域が２つの隣接するエキソン
上にコードされ、Ａ４蓄積が選択的にスプライスされた
ｍＲＮＡの直接的な発現の結果である可能性を妨げるこ
とを示した。これは、Ａ４蓄積がＡＰＰ内のペプチド領
域への両Ｎ−及びＣ−末端部位でのＡＰＰの異常なタン
パク質分解切断に起因することを包含する。
【０００７】最近の研究は、十分な長さのＡＰＰ分子の
Ｃ−末端の方にＡ４のＮ−末端から延長するＡＰＰフラ
グメント（この後、“Ｃ−１００フラグメント”と称す
る）がまた、凝集できることを示している（Wolfなど.,
１９９０，ＥＭＢＯ ９：２０７９〜２０８４）。さら
に、トランスジエニックマウスにおけるＣ−１００フラ
グメントの過剰発現は、神経退化と共に生じる神経細線
維のもつれ及び神経炎プラークの蓄積に起因する（Kawa
bataなど.,１９９１，Natune３２５：４７６〜４７
８）。集合的には、これらのデータは、Ａ４領域のＮ−
末端でのＡＰＰの単一のタンパク質分解切断がＡＤに関
与する病理学を開始するのに十分であることを示唆す
る。
【０００８】ＡＰＰはまた、ＡＰＰ細胞外ドメインの分
泌のために生理学的経路においてＡ４領域内の部位で分
解される（Eschなど.,１９９０，Scieue ２４８：１１
２２〜１１２４；Wangなど.,１９９１，Ｊ．Biol. Che
m. ２６６：１６９００〜１６９６４）。この経路はい
くつかの細胞系において作動し、そして必然的に、前駆
体のＡ４、アミロイド領域の破壊をもたらす。そのよう
な経路がまたヒト脳においても作動する証拠が得られた
（Palmert など.,１９８９，Biochem. Biophys.Res. Co
mm.１６５：１８２〜１８８）。
【０００９】ＡＰＰの通常の非病理学的プロセッシング
を相当する酵素は、“セクリターゼ（secretase)”と呼
ばれている。セクリターゼ作用に起因するＣ−末端フラ
グメントは、１７個のアミノ酸によりＣ−１００フラグ
メント（上記に定義される）よりも小さく、そしてこの
後、“生理学的Ｃ−末端フラグメント”として言及さ
る。
【００１０】Ａ４の正味の病理学的蓄積は、ＡＰＰ分解
の病理学的及び生理学的経路の相対的活性により調節さ
れることが仮定された。ＡＤ患者の脳におけるＡ４の蓄
積の劇的な上昇に起因する不均衡が、セクリターゼの活
性の上昇又は病理学的プロテアーゼ活性の上昇、又は両
者の組合せに起因するかどうかは不確かである。
【００１１】いくつかの研究が、セクレターゼ及び意図
された病理学的プロテアーゼの両者の精製及び特徴化を
着手して来た。初期研究は、ＡＰＰ内の予測される切断
部位を単に模倣する合成ペプチド基質を特徴とするアッ
セイを利用した。これらのアッセイは、必要なプロテア
ーゼ特異性を供給するのに失敗し、そしてこのようにし
て定量化されたペプチダーゼ活性が、ヒト脳組織からの
候補体ＡＰＰプロセッシング酵素活性の精製を追求する
ために、成攻を伴わないで使用された。今日まで、いづ
れかの方法のための信頼できる候補体プロテアーゼも出
現しておらず、そして種々の研究の結果は矛盾して来
た。
【００１２】たとえば、多くの利用できる研究は、病理
学的プロテアーゼが次のものであることを示唆した：リ
ソソームカテプシン、Cataldo など.,１９９０，Proc.
Natl. Acad, Sci. USA ８７：３８６１〜３８６５；カ
ルシウム依存性セリンプロテアーゼ、Abrahamsなど.,１
９９０，Ｊ．Neuroputhol. Exp. Neurul.,４９：３３３
（摘要）；カルパインＩ，Siman など.,１９９０，Ｊ．
Neuroscience １０：２４００〜２４１１；多触媒性プ
ロテアーゼ、Ishiura など.,１９８９，ＦＥＢＳ．Let
t. ２５７：３８８〜３９２；又はキモトリプシン様セ
リンプロテアーゼ、Nelsonなど.,１９９０，Ｊ．Biol C
hem.２６５：３８３６〜３８４３。
【００１３】類似する矛盾が、請求項に記載されたセク
リターゼ、すなわちメタローペプチダーゼ，McDermott
など.,１９９１，Biochem. Biophys. Res. Comm.１７
９：１１４８〜１１５４；アセチルコリンエステラーゼ
関連プロテアーゼ，Small など.,１９９１，Biochemist
ry ３０：１０７９５〜１０７９９；又はカテプシン
Ｂ，Tagawaなど., Biochem. Biophys. Res. Comm. １７
７：３７７〜３８７を同定するための努力に発生した。
【００１４】ＡＰＰ処理酵素の性質を同定する過去及び
現在の努力の成攻の一般的な欠失は、使用されるアッセ
イの良好でない特異性、及び脳組織に関連するプロテア
ーゼの複雑な不均質性を由来した。
【００１５】本発明は、組換えＡＰＰのタンパク質分解
切断に基づく特異性アッセイを用いてＡＰＰ処理酵素を
同定することを目的とした。そのようなアッセイは、健
康な対照に比較して、ＡＤ患者から得られた脳脊髄液
（この後、“ＣＳＦ”と称する）のサンプルにおけるＡ
ＰＰ分解酵素活性の実質的に異なったレベルの予測でき
ない発見によるＡＤの診断に使用されることが発見され
た。
【００１６】本発明は、患者に由来する体液におけるＡ
ＰＰ６９５に対して特異的なタンパク質分解酵素活性の
レベルにおけるＡＤ関連差異を検出するためのインビト
ロアッセイに関する。ＡＤ患者に由来するＣＳＦは、検
出できるレベルのプロテアーゼ活性を含まず、又は非Ａ
Ｄ個人に由来するＣＳＦの対応する対照サンプルよりも
有意に且つ確実に低いレベルのプロテアーゼ活性を含む
ことが意外にも発見された。従って、このアッセイは、
ヒトにおけるＡＤについての診断としての使用のために
適切であり、そしてより効果的な初期治療仲介のために
必要とされる場合、初期検出の手段を提供するであろ
う。
【００１７】本発明の開示の前の利用できる知識及びデ
ータに基づけば、ＡＤ患者からのＣＮＳと連続してこの
流体についてのＣ−１００フラグメントをもたらす比較
的高められたプロテアーゼ活性のための論理的な可能性
が存在する。本明細書に開示される結果は、反対を示
し、すなわち非ＡＤ患者からのＣＳＦは、Ｃ−１００フ
ラグメントをもたらす比較的且つ確実に高い酵素活性を
示す。
【００１８】現在、臨床学的診断の決定的な確認のため
の唯一の手段は、脳脊髄アミロイド沈着物、神経炎プラ
ーク及び神経細線維もつれの存在についてのＡＤと診断
された患者の脳の死後試験である。対照的に、本発明の
アッセイは、プロテアーゼ活性を定量化するために、生
存する患者に由来する体液サンプルに対して行われ得
る。
【００１９】対照と可能性ある診断に使用されるＡＤ患
者との間の生化学的差異の他の報告、たとえば放射性ヨ
ウ素置換された誘導性を用いることでの皮膚アミロイド
沈着物の検出（アメリカ特許第５，０３９，５１１
号）；ＡＤにおける高められた血漿α−１−抗キモトリ
プシレベル（Matsubara など.,１９９０，Ann. Neurol.
２８：５６１〜５６７）；及び免疫化学的マーカー、た
とえばＡ６８，すなわちニューロンを分解することによ
って発現され、そしてモノクローナル抗体ＡＬＺ−５０
により検出できる６８ＫＤａタンパク質の存在（Walozi
n など.,１９８６，science,３２３：６４８〜６５０）
が知られている。
【００２０】アメリカ特許第４，８７４，６９４号は、
プロテインキナーゼＣ−リン酸化に対して敏感な非特異
的ペプチドについてＣＳＦを試験する方法を記載する。
基準からそれているプロテインキナーゼＣ活性は、いづ
れの特定の特異性も伴わないで、広範囲の種類の神経学
的又は精神学的疾患のためのインジケーターであると言
われる。
【００２１】従って、患者の死の前、ＡＤの臨床的な徴
候を確かめることができる便利な診断方法についての必
要性が当業界において存在する。対照と本発明のＡＤ患
者との間に得られる活性の高い質的な差異は、信頼でき
る臨床学的診断方法を提供する。その差異は、ＡＰＰ基
質と共に酵素のインキュベーションの時間を長めること
によって追加のシグナル増幅のための可能性を提供する
酵素活性に依存する。
【００２２】さらに、現在開示されるアッセイ型は、適
度に多数のサンプルを処理する能力を付与し、そして検
出の免疫化学的方法により良好な感受性を付与する。さ
らに、アッセイの単純性が、実験技術者による日常使用
のための容易な適合性を可能にし、そして調和した再生
できる結果を付与する。それらの及び他の改良点が下記
に示される。
【００２３】発明の要約 本発明は、患者から採集された脳脊髄液又は血液のサン
プル（この後、“試験サンプル”として言及する）がＡ
ＰＰ基質と共に組合され、そして前記サンプルの存在下
でのＡＰＰ基質のタンパク質分解切断が検出される、ア
ルツハイマー病の診断に使用するための方法を提供す
る。アルツハイマー病を有することが知られている個人
から得られた試験サンプルは、対照個人から得られた試
験サンプルにより示される特徴的なＡＰＰタンパク質分
解活性を欠いていることが見出された。
【００２４】前記方法は、検出できるタンパク質分解切
断がＡＤ個人からの試験サンプルの存在下で実質的に生
成されない条件下で行われ、それによって、患者サンプ
ルの存在下での検出できるタンパク質分解切断の不在が
アルツハイマー病を示す。
【００２５】ＡＰＰ基質のタンパク質分解切断は、多く
の便利な態様、たとえば基質のタンパク質分解により生
成されるポリペプチド又はペプチドフラグメントの検出
により検出され得る。そのようなフラグメントは、いづ
れか便利な手段、たとえば抗体結合により検出され得
る。タンパク質分解切断を検出するためのもう１つの便
利な方法は、色素ＡＰＰ基質の使用を通してであり、そ
れによって基質試薬の切断が色素原、たとえば着色され
た又は蛍光性生成物を開放する。
【００２６】従って、本発明はさらに、アルツハイマー
病の診断の助けとして患者の脳脊髄液又は血液サンプル
の試験への使用のための試験キットを提供し、ここで前
記キットは、（ａ）ＡＰＰ基質、及び（ｂ）対照の個人
からのサンプルの存在下で生じるが、しかしアルツハイ
マー病を有する個人の試験サンプルに実質的に存在しな
いか又は実質的に低レベルで存在するタンパク質分解切
断の特性を示す。好ましくは検出可能なラベル、たとえ
ば酵素を含んで成る抗体試薬を保持する１又は複数の容
器を含んで成る。
【００２７】他方、本発明は、アルツハイマー病の診断
の助けとして患者からの試験サンプルの試験への使用の
ための色素基質を提供する。そのような色素基質は、対
照の患者の脳脊髄液又は血液に存在するプロテアーゼに
より切断できるが、しかしアルツハイマー病を有する個
人の脳脊髄液又は血液の存在下で、実質的に切断できな
いか又は実質的にほとんどの程度切断できないペプチド
結合を通して色素インジケーター部分に結合されるＡＰ
Ｐ基質部分から形成される。好ましくは、そのような色
素ＡＰＰ基質の切断は、着色されたインジケーター成分
を開放する。
【００２８】発明の記載 本発明は、ＡＤを有する個人の脳脊髄液が、健康な又は
対照の個人の脳脊髄液におけるＡＰＰタンパク質分解活
性のレベルに比較して、測定できる低レベルの又は特定
条件下で、検出できないレベルのＡＰＰプロテアーゼ
（又はＡＰＰプロテアーゼ様活性を有するプロテアー
ゼ）を含む予期しない発見に基づかれている。そのため
には、対照の個人は、ＡＤの臨床学的又は病理学的徴候
を現さない個人である。ＡＤサンプルにおけるＡＰＰタ
ンパク質分解活性のそのような低下を相当する現象は明
確ではない。
【００２９】アルツハイマー病は、アミロイドーシスの
経路への到達を可能にするような態様でＡＰＰを切断す
るように作用するセクレターゼ酵素のレベルの欠乏によ
ることが推定される。これに関して、本発明において測
定される酵素活性はセレクターゼによる生理学的Ｃ−末
端フラグメントの形成に相当すると思われる。しかしな
がら、この結論は、本発明において観察されたように、
その生理学的フラグメントがＣ−１００よりもアミノ酸
約１７個小さく、そして組換えＣ−１００と共に同時移
動すると思われない事実によりほとんどもっともらしく
ない。
【００３０】結局、予期できない観察が、アルツハイマ
ー病の診断への助けとして有用な便利で且つ多方面にわ
たる方法のための基礎を提供する。さらに、その発見
は、種々のＡＰＰのイソ形が種々の血液成分、最も明白
には血小板に見出されるので、血液サンプル、特に抹消
血液、たとえば血漿及び血清のサンプルの試験に拡張で
きる。より侵略的な測定により得られるが、脳脊髄液
は、正常なＣＳＦにおける高レベルのＡＰＰタンパク質
分解活性の存在、及び血液に現れるプロテアーゼインヒ
ビターの処理のために好ましい試験サンプルであり得
る。
【００３１】本発明の方法に使用されるＡＰＰ基質は、
対照の個人とＡＤ患者との間に観察される特異的なタン
パク質分解切断のための部位を含んで成る。従って、そ
のようなＡＰＰ基質は、種々の形で試験試薬として供給
され得る。好ましくは、ＡＰＰ６９５に由来し、又はＡ
ＰＰ６９５のアミノ酸配列と少なくとも部分的に対応す
るが、他のＡＰＰイソ形（前記）の誘導体又は類似体が
本発明に使用され得る。ＡＰＰ６９５は、Schubertな
ど.,１９８９、Proc. Natl. Acad. Sci.８６：２０６６
に記載されるような天然源からの生化学的単離又は精製
により；又はそのタンパク質又はその機能的部分をコー
ドする組換えＤＮＡクローンの発現（Knops など.,１９
９９，Ｊ．Bio. Chem.２６６：７２８５；Bnasinなど.,
１９９１，Proc. Natl. Acad. Sci.８８：１０３０７）
により得られる。
【００３２】本明細書で使用される場合、“ＡＰＰ基
質”とは、生物学的源からの単離又は精製により、又は
ＡＰＰ又はその類似体をコードするクローンされた遺伝
子の発現により得られたとしても、十分な長さのＡＰ
Ｐ、及びそのようないづれかのタンパク質のフラグメン
ト、たとえばそのタンパク質の消化により得られるフラ
グメント又はその一部、ＡＰＰタンパク質の一部をコー
ドする遺伝子の発現により得られるフラグメント、及び
ＡＰＰタンパク質の一部に対応するアミノ酸配列を有す
る合成ペプチドを意味するであろう。前記ＡＰＰタンパ
ク質のフラグメントは、適切なタンパク質分解試験サン
プル活性による認識及び切断のための十分なアミノ酸配
列を含むであろう（前記）。
【００３３】生物学的材料からのＡＰＰの単離は通常、
従来技術、たとえばクロマトグラフィー、特にアフィニ
ティークロマトグラフィーによる精製を包含するであろ
う。精製されたＡＰＰは、従来の方法に従ってアフィニ
ティー精製に続いて使用され得るモノクローナル又はポ
リクローナル抗体を調製するために使用され得る。得ら
れる精製されたＡＰＰ材料は、化学的又は酵素的消化に
よりさらに処理され、たとえば断片化され得る。有用な
フラグメントは、適切なタンパク質分解試験サンプル活
性に対しこの所望する感受性についてスクリーンするこ
とによって同定されるであろう（前記）。
【００３４】前記に言及されたように、ＡＰＰ基質はま
た、ＡＰＰ又はその一部をコードする組換えＤＮＡクロ
ーンの発現により調製され得る。クローン化されたＡＰ
Ｐ遺伝子は、それ自体天然又は合成のものであり得、そ
して天然の遺伝子は、既知のアミノ酸配列に基づいての
変性プローブを用いてｃＤＮＡ又はゲノムライブラリィ
ーのために得られる（Kangなど.,１９８７，Nature ３
２５：７３３）。適切な組換えＤＮＡクローンを得るた
めの他の技法及びクローン化された遺伝子を発現するた
めの方法は当業者に明らかであろう。
【００３５】さらに、ＡＰＰ基質は、所望するＡＰＰイ
ソ形の推定されるアミノ酸配列に従って、従来のペプチ
ド合成により便利な大きさに調製され得る。特に、アミ
ノ酸分析に基づけば、オーバーラップするペプチドが合
成され、そして適切なタンパク質分解感受性について試
験され得る。有用なペプチドが見出される場合、より小
さなペプチドが、所望により、より小さな反応単位を地
図に示すために調製され得る。
【００３６】種々の便利な方法が、試験サンプルの存在
下でのＡＰＰ基質のタンパク質分解切断の検出に適用で
きる。現在、より好ましい方法のうちいくつかが下記に
示されるが、しかしながら、多くの方法は、その発明の
特徴からそれることなしに、この段階に適用され得るこ
とが当業者により認識されるであろう。一般的に、ＡＰ
Ｐ基質のタンパク質分解切断の発生を検出できるこの目
的のために、いづれかの方法が使用され得る。そのよう
な方法は、切断がシグナル生成種、たとえば光学的敏感
生成物、たとえば着色された又は蛍光染料を生成するよ
うにＡＰＰ基質の適切な企画により付与され得る。もう
１つの主要アプローチは、１又は複数の切断生成物の敏
感な検出、たとえばイムノアッセイを包含する。検出さ
れるべきそのような切断生成物は、ＡＤを有する個人に
比べて対照の個人からの試験サンプルとＡＰＰ基質との
反応により特徴的に生成されるものである。現在、その
ような切断生成物は、ＡＰＰ基質のＣ−末端フラグメン
トであり；しかしながら、対照サンプルと共にインキュ
ベーションすることによって出現するが、しかしＡＤ試
験サンプルを含んで成るアッセイ混合物としては、不在
であり、又は実質的に少ない量で出現するいづれかのフ
ラグメントが検出の対象である。
【００３７】ＡＤサンプルに比較して対照のサンプルに
観察される特定のタンパク質分解活性の特徴を示す１又
は複数の切断生成物の検出は、多くの手段で達成され得
る。続く例においてさらに例示される１つのそのような
方法は、ウェスターンブロットとして通常知られている
方法を包含する。典型的には、試験サンプルと共にＡＰ
Ｐをインキュベートした後、ゲル電気泳動が、反応混合
物をもたらす成分を分離するために行われる。次に、そ
の分離されたタンパク質成分は、固体マトリックス、た
とえばニトロセルロース膜に移される。次に、対照対Ａ
Ｄ個人の特徴を示すフラグメントに対して特異的な抗体
が、前記膜に固定された成分と反応せしめられ、そして
第２酵素ラベルされた抗体接合体の添加により検出され
る。得られる結合された接合体の位置は、酵素ラベルの
ための色素基質により展開される。
【００３８】現在利用できる診断試験システムに改める
ことができる種々のイムノアッセイ形がまた、ＡＰＰフ
ラグメントの検出に適用され得る。典型的には、ＡＰＰ
基質は試験サンプルと共にインキュベートされ、そして
得られる損なわれていないＡＰＰが固定され（たとえば
固相上への捕獲により）、又は他方、試験サンプルがＡ
ＰＰ基質の固定形と共にインキュベートされる。次に、
ＡＤ個人に比較しての対照の集団の特徴を示すタンパク
質分解切断が、ＡＰＰ基質から切断され、又は切断部位
を定義するＡＰＰ基質の一部に向けられる抗体試薬と固
定されたＡＰＰ基質とを反応せしめることによって検出
される。その抗体試薬は、抗原結合部位、たとえばＦａ
ｂ又はＦａｂ′を含む抗原を含んで成る完全な抗体又は
抗体フラグメントを含んで成り、そしてモノクローナル
又はポリクローナルタイプのものであり得る。固相に結
合される抗体試薬の検出は、特徴的なタンパク質分解切
断の不在の表示であり、そして従って、ＡＤの患者を示
す。抗体試薬の結合の検出は一般的に、そのような抗体
試薬のラベルされた形の使用又はラベルされる第２、又
は抗−（抗体）抗体の使用を包含するであろう。
【００３９】ＡＰＰの捕獲又は固定は多くの手段により
達成され得る。切断できるフラグメント上には存在しな
いＡＰＰのエピトープに対して特異的な抗体が生成され
得る。そのような抗体は、損なわれていないＡＰＰを捕
獲し、又は固定するために固定され、そして使用され
る。他方、リガンド又はハプテンがＡＰＰに共有結合さ
れ得、そして対応する固定されたレセプター又は抗体が
ＡＰＰを捕獲し、又は固定するために使用され得る。こ
の目的のために有用な典型的なリガンド：レセプター対
はビオチン：アビジンである。この目的のために有用な
ハプテンの例は、フルオレセイン及びディジトキシゲニ
ンである。
【００４０】ＡＰＰ基質が固定され、又は捕獲される固
相は、種々の材料、たとえばマイクロタイマープレート
ウェル、試験管、ストリップ、ビーズ、粒子及び同様の
ものから構成され得る。特に有用な固相は磁気又は常磁
性粒子である。そのような粒子は、単純な化学反応によ
り種々の化合物に結合され得る化学的に活性な基を含む
ように誘導体化され得る。粒子は、その粒子を含む容器
に磁気を隣接することによって懸濁液から澄まされる。
従って、粒子は、やっかいな遠心分離又は濾過を伴わな
いで反復して洗浄され得、アッセイ方法を十分に自動化
するための基礎を提供する。
【００４１】第１又は第２抗体試薬のためのラベルは、
当業界において良く知られているものから選択され得
る。いくつかのそのようなラベルは、蛍光又は化学ルミ
ネセンスラベル、放射性同位体であり、そして好ましく
は、この目的のための酵素はアルカリホスファターゼ、
ペルオキシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼである。こ
れらの酵素は、種々の条件下で安定し、高い触媒性ター
ンオーバー比を有し、そして単純な色素基質を用いて検
出され得る。
【００４２】ＡＰＰ基質のタンパク質分解切断はまた、
ＡＰＰフラグメントを分離し、そして次に検出するであ
ろうクロマトグラフィー技法により検出され得る。高圧
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が特に、有用であ
る。この技法を適用する際、蛍光的に標識されたＡＰＰ
基質が調製される。試験サンプルとのインキュベーショ
ンの後、反応混合物は、クロマトグラフィーカラムに適
用され、そして蛍光フラグメント対損なわれていないＡ
ＰＰの移動差速が観察される。
【００４３】
【実施例】例１ 組換えＡＰＰ６９５を発現するチャイニースハム
スター卵巣（ＣＨＯ）細胞系の開発。 ａ）ベクター構成．ＦＣ−４（Kangなど.,前記）からの
ＡＰＰ６９５ｃＤＮＡの既知の２．３６ＫｂのＮｒｕＩ
／ＳｐｅＩフラグメントを、Ｅ．コリＤＮＡポリメラー
ゼＩの大きなフラグメントによりフィルインし、そして
ブラント末端を、ＰＭＴＩ−５（Ｔ３プロモーター下で
ＡＰＰ６９５）を創造するＫＳ Bluescript Ｍ１３＋
（Stratagene Cloning Systems, La Jolla, （Ａ）のSm
aIクローニング部位中に挿入した。次に、新しい最適な
Kozak コンセンサスＤＮＡ配列を、ＰＭＴＩ−３９を創
造するためにオリゴ：５′−CTCTAGAACTAGTGGGTCGACACG
ATGCTGCCCGGTTTG-3 ′（配列番号１）により、部位特異
的突然変異誘発を用いて創造した（Kunkelなど.,１９８
７、Methods in Enzymology,１５４：３６７〜３８
２）。次に、このプラスミドを部位特異的突然変異誘発
（Kunkelなど.,前記）により変更し、位置６１４でバリ
ンをグルタメートに変えた（Kangなど.,前記に従って番
号を付与された読み取り枠）。
【００４４】最適なKozak コンセンサス配列及びＧｌｕ
へのＶａｌの変異を含む十分な長さのＡＰＰ ｃＤＮＡ
を次に、ＮｏｔＩ及びＨｉｎｄIII 部分消化物によりＰ
ＭＴＩ−３９から切断した。次に、２．３６ＫｂのＡＰ
Ｐ６９５フラグメントをゲル精製し、そしてＮｏｔＩ／
ＨｉｎｄIII 切断ｐｃＤＮＡＩＮｅｏ（Invitrogen Cor
p. San Diego, （Ａ．）に連結し、ＡＰＰ６９５発現が
ＣＭＶプロモーターの制御下で配置されているＰＭＴＩ
９０を創造した。ＧｌｕへのＶａｌの変異を配列確認
し、そしてそのベクターを用いて、ＣＨＯ細胞を安定し
て形質転換した。 ｂ）ＡＰＰ６９５ムテンを発現する安定ＣＨＯ細胞の生
成。
【００４５】チャイニーズハムスター卵巣Ｋ−１細胞
（ＡＴＣＣ ＣＣＬ６）を、ＡＰＰ６９５構成体による
トランスフェクションのために使用した。ＡＰＰ６９５
及びネオマシン耐性マーカーを含む発現プラスミド２０
μｇを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ GeneApparatus（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ Labo ratories, Richmond,ＣＡ．）を用いて、電
気泳動によりＰＢＳ０．５ml中、１×１０7 個のＣＨＯ
細胞中にトランスフェクトした。２５μｆのキャパシタ
ンスで１２００Ｖの１回のパルスを前記細胞に付与し
た。
【００４６】電気泳動の後、細胞を氷中で１０分間イン
キュベートし、そして遠心分離により集めた。細胞ペレ
ットを５×１０4 個の細胞／mlの密度でαＭＥＭ、１０
％ウシ胎児血清に再懸濁し、そして１mlのアリコートを
５個の２４−ウェル組織培養クラスタープレートの個々
のウェル中に分配した。４８時間のインキュベーション
後、ネオマイシン耐性マーカーを含む細胞を、１mg／ml
のGeneticin （ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Grand Island, Ｎ
５．）を含む培地１mlの添加により選択し、そしてイン
キュベーションを続け、そして２週ごとに、薬物含有培
地を変えた。
【００４７】薬物耐性細胞を、ウエスターンブロットに
よりＡＰＰ６９５発現について試験した。ＡＰＰ６９５
発現についての陽性の細胞を、制限希釈法によりクロー
ン化し、そして個々のクローンを単離し、そしてＡＰＰ
６９５発現について試験した。ＡＰＰ６９５発現につい
て陽性のクローンを継代培養し、そしてＡＰＰ６９５発
現細胞の大規模生成及び続く組換えタンパク質の単離の
ためにローラーボトル中で拡張した。
【００４８】例２．哺乳類細胞の一時的な感染により標
準化された組換えＣ−１００の生成のために発現ベクタ
ーの開発。 Ｃ−１００ペプチドフラグメントは、Ａ４ペプチドのＮ
−末端から完全な長さのＡＰＰのＣ−末端に拡張するＡ
ＰＰのＣ−末端部分を含む（上記背景セクションを参照
のこと）。このＣ−１００フラグメントは、Ａ４ペプチ
ドの極局的な形成を導く意図された初期分解生成物であ
る。
【００４９】本発明の１つの態様において、組換えＣ−
１００を発現するＨｅｌａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ２．２）からの細胞溶解物を、ＣＳＦと共にインキュ
ベートされた組換えＡＰＰサンプルと同時にイムノブロ
ットアッセイで分析した（図１を参照のこと）。Ｃ−１
００フラグメントの移動及び検出は、病理学的プロテア
ーゼにより形成される生成物のゲネシス（genesis ）の
ためのサイズマーカーとして及び一般的にＣ−末端ＡＰ
Ｐフラグメントの免疫検出のための陽性対照として作用
する。
【００５０】酵素的に生成された生成物の大きさとＣ−
１００フラグメントの大きさとの比較は、酵素的に生成
されたフラグメントがＡ４ペプチドのＮ−末端に隣接す
る切断又は他方、セクレターゼにより触媒されたＡ４セ
グメント内での切断に起因するか又はいなかの洞察力を
提供することができる。
【００５１】ａ）プラスミド構成 ２種の方法を用いて、Ｃ−１００発現のためのプラスミ
ドを製造した。個々のプラスミドを、ＰＭＴＩ７３又は
ＰＭＴＩ１００のいづれかとして別々に同定することが
できる。ＰＭＴＩ７３構成：市販のプラスミドＰＵＣ−
１９をＥｃｏｒＩにより消化し、そのポリリンカーを除
去した。次に、市販のＰＷＥ１６を、前記消化されたＰ
ＵＣ−１９中に挿入し、ＰＭＴＩ２３００を創造した。
ＰＭＴＩ２３０１は、オリゴヌクレオチドアダプターを
用いてのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII 消化に続いてＰＭＴ
Ｉ２３００から誘導された、ＡＰＰのＥｃｏＲＩプロモ
ーターフラグメントを、ブラント末端連結によりＰＭＴ
Ｉ２３０１のＨｉｎｄIII部位中に挿入し、ＰＭＴＩ２
３０７を創造した。
【００５２】ＦＣ−４（Kangなど.,前記）からのＢａｍ
ＨＩフラグメントをＰＭＴＩ２３０７のＢａｍＨＩ部位
中に連結することによって、ＰＭＴＩ３２１１を生成し
た。ＦＣ−４からのＸｈｏＩフラグメントを、ＰＭＴＩ
２３１１のＸｈｏＩ部位中に挿入し、ＰＭＴＩ２３１２
を創造した。マウスメタロチオネイン−Ｉ遺伝子のＥｃ
ｏＲＩゲノムクローンからの２．２ＫｂのＢｇｌII／Ｅ
ｃｏＲＩフラグメントのＰＭＴＩ２３１２のＣｌａＩ部
位中への挿入によりＰＭＴＩ２３２３を生成した。ミニ
遺伝子ＰＭＴＩ２３３７を生成するために、ＰＭＴＩ２
３２３のＫｐｎＩ及びＢｇｌII部位間の配列を欠失し、
そしてクローンを合成オリゴヌクレオチドアダプター、
すなわちＳＰ−スペーサーＡ４を用いて連結した。
【００５３】ＰＭＴＩ２３３７をＢａｍＨＩ／ＳｐｅＩ
により切断し、そしてそのフラグメントをbluescript
ＫＳ（＋）（Stratagene）のＢａｍ ＨＩ／Ｘｂａ１制
限部位中に連結し、ＰＭＴＩ２３７１を創造した。ＰＭ
ＴＩ２３７１をＨｉｎｄIII／ＮｏｔＩにより切断し、
ＡＰＰ６９５の末端の１００個のアミノ酸をコードする
０．７Ｋｂのフラグメントを開放した。また、シグナル
ペプチドのための配列がコードされた。この挿入体をｐ
ｃＤＮＡＩＮＥＯ（Invitrogen Corp.）のＨｉｎｄIII
／ＮｏｔＩ部位中に連結し、プラスミドＰＭＴＩ７３を
創造した。ＰＭＴＩ１００構成：ＰＭＴＩ９０（例１を
参照のこと）を、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄIII により切断
し、ＡＰＰ６９５の末端の１００個のアミノ酸をコード
する０．６Ｋｂのフラグメントを再び開放し、そしてこ
れをｐｃＤＮＡＩＮＥＯのＸｂａＩ／ＨｉｎｄIII 部位
に連結し、ＰＭＴＩ１００を創造した。個々の場合、ベ
クター、挿入体及びプラスミドを、当業者に知られてい
る方法により精製した。
【００５４】ｂ）Ｃ−１００フラグメントのトランスフ
ェクション及び発現．Ｃ−１００対照の小規模発現のた
めの調製を、使用の２４時間前に、６個のウェルコース
タークラスター（３．５の直径）の個々のウェルに５×
１０5 個の細胞のＨｅｌａＳ１細胞を接種することによ
って開始した。
【００５５】十分なワクシニアウィルスｖＴＦ７−３を
トリプシン処理し、細胞当たり２０プラーク形成単位の
多重度で感染せしめ、等体積の粗ウィルス原液及び０．
２５mg／mlのトリプシンを混合し、次に激しく振盪し
た。トリプシン処理されたウィルスを、１０分間隔で振
盪しながら、３７℃で３０分間インキュベートした。ク
ランプが存続する場合、そのインキュベーション混合物
を０℃に急冷し、そして音波処理水槽において３０秒
間、音波処理した。その急冷された音波処理を、クラン
プが検出されなくなるまでくり返した。
【００５６】次にトリプシン処理されたウィルスを、Ｈ
ｅｌａ Ｓ１細胞を含む個々のウェルが０．５mlのウィ
ルスを有するように十分な血清フリーＤＭＥＭにより希
釈した。培地をアスピレートし、次に細胞を、１０分間
隔でロッキングしながら、３０分間ウィルスにより感染
せしめ、ウィルスを分配した。
【００５７】感染を止めた後、約５分で、新鮮なトラン
スフェクション混合物を次のようにして調製した：個々
のウェルに、ポリスチレン管中、０．０１５mlのリポフ
ェクチン試薬（Betheseda Research Labs, Gathersbur
g, ＭＤ．）及び１mlのＯＰＴＩＭＥＭ（Betheseda Res
earch Labs, Gathersburg, ＭＤ．）を添加し、軽く混
合した。渦は回避された。次に、３μｇのＣｓＣｌ精製
されたＤＮＡを添加し、そして軽く混合した。
【００５８】ウィルス混合物を細胞からアスピレート
し、次にトランスフェクション溶液を導入した。得られ
た混合物を３７℃で時間インキュベートした。次に個々
のウェルを１mlのＯＰＴＩＭＵＭにより被覆し、そして
ＣＯ2 インキュベーター中で一晩、３７℃でインキュベ
ートした。
【００５９】細胞を、トランスフェクションの２０時間
後、遠心分離により収穫し、そして溶解物を氷上に用意
し、そし１％TritonＸ−１００、１０μｇ／mlのＢＰＴ
Ｉ，１０μｇ／mlのLeupeptin,２００ｍＭのＮａＣｌ，
１０ｍＭのＨＥＰＥＳ，１ｍＭのＣｕＣｌ2,１ｍＭのμ
ｇＣｌ2,１ｍＭのＥＤＴＡを含む溶菌緩衝液（ｐＨ７．
５に調整された）０．２mlを添加した。完全な溶菌を光
顕微鏡によりモニターし、そしてすぐに収穫した。溶菌
は完結するのに１分かからず、そしてこの段階での遅延
は、ゼラチン状をもたらす核の溶解を引き起こす。
【００６０】組換え溶解物を、後での使用のために−２
０℃で貯蔵した。好ましくは、組換え溶解物は、凍結の
前、２−メルカプトエタノールを欠いている（３×）Ｓ
ＤＳＰＡＧＥサンプル緩衝液に１：５０で希釈されるべ
きである。
【００６１】ＳＤＳ−ＤＡＧＥ／イムノブロットを用い
てＰＭＴＩ７３又はＰＭＴＩ１００のいづれかによる発
現により生成されるタンパク質の大きさとＡＰＰＣ−末
端抗体との比較を行った。その研究は、ＰＭＴＩ１００
が単一の免疫反応性バンドの発現を指図し、ところがＰ
ＭＴＩ７３は類似する分子サイズの３つのバンドの発現
を指図することを示した。中間サイズのバンドは、上部
及び下部バンドに比較して、ほとんど濃くなく、そして
発現を指図するＰＭＴＩ１００を用いる場合に観察され
る単一の生成物バンドと同時移動した。
【００６２】ＰＭＴＩ７３により生成される３つのバン
ドの最大バンドは、ＰＭＴＩ１００に関して観察される
単一バンドよりもわずかに大きかった。ＰＭＴＩ７３発
現からの最大のバンドのアミノ酸配列分析は、シグナル
ペプチド配列が初期翻訳生成物から切断され、Ｎ−末端
で５個の特別なアミノ酸を含むＣ−１００フラグメント
を生成することを示した。例５における初期結果は、Ｐ
ＭＴＩ７３のタンパク質生成物が移動マーカーとして使
用される研究の結果を示すが、ＰＭＴＩ１００によりコ
ードされるタンパク質の使用が好ましい。
【００６３】例３．ウサギポリクローナル抗血清の調
製。 抗血清を、ヒトＡＰＰ６９５のＣ−末端ドメインに誘発
し、そしてBuxbaum など.,１９９０，Proc. Natl. Aca
d. Sci.８７：６００３〜６００６に記載されるような
方法に従って調製した。ＡＰＰ６９５のＣｏｏＨ−末端
領域に対応する合成ペプチド（この後、“βＡＰＰ６４
５−６９４”と称する）を、Yale Uninecsity, Protein
and Nucleic Acid Chemistry, Facility, New Haven,
ＣＴから得た。
【００６４】ポリクローナル抗体を誘発するために、β
ＡＰＰ６４５−６９４を用いてウサギを免疫化した。血
清を、ヒトＡＰＰ６９５のアミノ酸１９〜６９５を含む
融合タンパク質を発現するＥ．コリの溶解物のイムノブ
ロット分析によりスクリーンした。組換え融合タンパク
質に対して免疫反応性である血清を、〔35Ｓ〕メチオニ
ンラベル化ＡＰＰ６９５に対する活性を免疫沈殿するた
めにさらにメクリーンし、ここで前記タンパク質は連続
的なインビトロ転写（Stratagene, La Jolla,ＣＡから
購入されたキット）及び翻訳（Promega Corp., Madiso
n, ＷＩから購入された網状赤血球溶解物）によりβＡ
ＰＰ６９５ｃＤＮＡから生成された。
【００６５】例４．組換えＣＨＯ細胞からのＡＰＰ６９
５の精製。 すべての段階は、特にことわらない限り、０〜４℃で行
われた。Ｈｏｌｏ−ＡＰＰ６９５を、下記例５に記載さ
れるようにして抗ヒトＡＰＰ６９５Ｃ−末端抗体を用い
てのイムノブロット分析により検出した。
【００６６】ａ）細胞膜の単離．ローラーボトルにおけ
るＣＨＯ細胞の連続培養物からの完全な細胞ペレット
（１７９８）を遠心分離（１５００ｇ×５分）により集
め、そして塩化ナトリウム（３０ｍＭ）、塩化マグネシ
ウム（１ｍＭ）、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）、ＰＭＳＦ（２
００μｇ／ml）、Ｅ−６４（４２μｇ／ml）及びペプス
タチン（３．８μｇ／ml）を含むｐＨ８．０の５０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁し、６００mlの合計体積
にした。細胞を、テフロン製ポーターを用いて均質化し
（１０回のくり返してのストローク）、次に４１％のス
クロースを含み、そしてプロテアーゼインヒビターＥＤ
ＴＡ、ＤＭＳＦ、Ｅ−６４及びペプスタチンを含まない
均質化緩衝液１０ml上に積層した（遠心分離管当たり２
５ml）。遠心分離（Beckman ＳＷ−２８ローターで２
６，８００ＲＰＭ×６０分）の後、界面層を注意して除
き（組合された体積で約１５０ml）、等体積の均質化緩
衝液により希釈し（−プロテアーゼインヒビター）、テ
フロン製ポーターにより再懸濁し（３回のくり返しての
ストローク）、そして上記のようにして再遠心分離し、
堅くパックされたペレットを得た。上清液をデカント
し、そしてペレットを、５０ｍＭのトリスＨＣｌ，ｐＨ
８．０により合計１００mlの体積で再懸濁した（テフロ
ン製ポーターにより３回のくり返してのストローク）。
再遠心分離（Beckman ７０Ｔｉローターにより５０，０
００ＲＰＭ×６０分）は、５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０中、合計７５mlの体積に再懸濁されるペレット
を生成した。
【００６７】ｂ）細胞膜の溶解。上記再懸濁されたＣＨ
Ｏ細胞膜調製物３７mlを、プロテアーゼインヒビター及
び原液の２０％（Ｖ／Ｖ）のトリトンＸ−１００のカク
テルに連続的に添加し、次の成分の濃度を達成した：均
質化緩衝液（４５mlの合計可溶化体積) において、ＥＤ
ＴＡ（１ｍＭ）、Ｅ−６４（２４μｇ／ml）、ＰＭＳＦ
（５３μｇ／ml）、ペプスタチンＡ（１１μｇ／ml）、
及びトリトンＸ−１００（２．２％Ｖ／Ｖ、最終）。４
℃で３０分間、前記混合物を軽くロッキングした後、非
溶解性材料を遠心分離（Beckman ７０Ｔｉローターによ
り５０，０００ＲＰＭ×４０分）により除去した。溶解
されたホローＡＰＰを含む上清液を、０．４５μＭのデ
ィスクフィルターに通した。
【００６８】ｃ）強いアニオン交換クロマトグラフィー
による溶解されたホローＡＰＰ６９５の精製。ハローＡ
ＰＰ６９５を含む上記上清液を、同体積の希釈水により
希釈し、そして０．１％のトリトンＸ−１００を含む２
０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０により前も
って平衡化されたモノーＱＲＨ１０／１０カラムに適用
した。負荷した後すぐに、カラムを、平衡化緩衝液合計
２１０ml内に含まれる０〜１ＭのＮａＣｌの線状グラジ
エントで溶離した。流速は、３ml／分で維持された。１
７〜２２mmho（４℃）の導電率範囲間で溶離するタンパ
ク質は、免疫反応性ＡＰＰ６９５の主要部を含む、そし
て組合し、そして０．０２５％のトリトンＸ−１００を
含む２ｌの５ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０に対して
４時間、透析し、そして遠心分離（Beckman ＳＷ ２８
ローリーにより２６，８００×６０分）によりわずかな
濁りを除去するために澄ました。
【００６９】ｄ）ヘパリンアガロースクロマトグラフィ
ー。澄まされたサンプルを、透析緩衝液により前もって
平衡化されたヘパリンアガロースのカラム（１５×１．
６cm）に適用した。負荷に基づいて、薄カッ色のバンド
がカラムの１／３上部内に形成された。負荷後すぐに、
５分の直分を集めた（１ml／分の流速が用いられた）。
次に、カラムを、８５mlの平衡化緩衝液により段階的に
溶離し、ここで塩化ナトリウムは次の最終濃度に連続的
に調節されている：０，１５０，３００，６００及び２
０００ｍＭ。免疫検出可能なホローＡＰＰの主要部分は
６００ｍＭのＮａＣｌで溶離し、次の定量画分が３００
ｍＭで回収された。３００ｍＭ及び６００ｍＭのＮａＣ
ｌで回収されたＡＰＰを別々に集め、そして−８０℃で
貯蔵した。次の研究に使用されるＡＰＰは３００ｍＭの
画分からであった。３００ｍＭのヘパリンアガロース溶
出液からの一部純粋なＡＰＰの収量は、湿潤ＣＨＯ細胞
ペレット１ｇ当たり５．５μｇ（Bradfordアッセイ）で
あった。
【００７０】例５．対照及びＡＤのＣＳＦにより触媒さ
れたＡＰＰ６９５の分解の差異の検出のためのイムノブ
ロットアッセイ。 ａ）ＡＰＰと共にＣＳＦのインキュベーション： ｉ）ＣＳＦ（５μｌ）を、基質ＡＰＰ６９５と共に２４
〜４８時間インキュベートした。この例のためには、４
８時間のインキュベーション時間が選択され、そして他
のインキュベーションパラメーターは次の通りであっ
た：２Ｍの原液緩衝液の必要な量の添加によりＭＥＳ緩
衝液ｐＨ６．５において１４０ｍＭの最終濃度に調節さ
れた１０．７５μｌの組換えヒトＡＰＰ６９５と共に３
７℃。インキュベーションにおける最終緩衝液濃度は、
９５ｍＭ、ｐＨ６．５である。ＣＳＦと共に混合された
後の一部純粋なＡＰＰ調製物及びＭＥＳ緩衝液の最終濃
度は、１５．７５μｌの合計反応体積において、それぞ
れ３７μｇ／ml及び９５ｍＭであった。インキュベーシ
ョン時間の間、ＡＰＰ６９５のいくらかのタンパク質分
解切断が生じ、低分子量フラグメントを生成する。
【００７１】ii）タンパク質分解反応を、７．５μｌの
次の３Ｘ Laemlie ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液：
１．５ｍのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．４５、３６％（Ｖ／
Ｖ）のグリセロール及び１２％（Ｖ／Ｖ）のＳＤＳ、１
０％（Ｖ／Ｖ）の２−メルカプトエタノール及び微量の
ブロモフェノールブルートラッキング染料を含む溶液の
添加により停止し、そして次に冷却した。
【００７２】ｂ）ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析：反応混合物
（１５μｌ）を、１０〜２０％のアクリルアミドグラジ
エントTricine ゲル（通常１．０mmの厚さ、１５ウェル
のNovex プレキャストゲル、NovexExperimental Techno
logy, San Diego, ＣＡ）のウェルに適用した。ゲル
を、一定の電圧条件下で運転し、そしてサンプルがゲル
に浸入するまで５０Ｖで運転し、その後すぐに、電圧を
１００Ｖに上げた。電気泳動を、トラッキング染料がゲ
ル底０．５cm以内に達した時、止めた。ゲルを、Ｍｒに
おいて３〜１９５ＫＤａの範囲の予備染色されたＭｒマ
ーカーを用いて検量した（Bethescla Research Laborat
ories, Gaithersburg,ＭＤ．）。高及び低分子量マーカ
ーを含む個々のキット１０μｌを、３Ｘサンプル緩衝液
１０μｌと共に混合し、そしてセクション（ａ）（ii）
に記載されているようにして処理した。
【００７３】ｃ）イムノブロッティング： ｉ）次に、ゲルをミニトランス−ブロット電気泳動セル
（Biorad Labs, Richmond,ＣＡ．）に移した。タンパク
質を、１５０ｍＭのグリシン及び２０％（Ｖ／Ｖ）のメ
タノールを含む２０ｍＭのトリスＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．
５の、４℃で維持されているトランスファー緩衝液を用
いて、ProBlott（ＴＭ）膜（Applied Biosystams, Fost
er City,ＣＡ．）上で、１００Ｖ（一定）で１時間、電
気−ブロットした。
【００７４】ii）ProBlott膜を除き、そして次の組成：
１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのトリスＨＣｌ緩
衝液中、５％（Ｖ／Ｖ）の非脂肪ドライミルクのブロッ
キング緩衝液１５mlに室温で１時間置いた。
【００７５】ｄ）ＡＰＰ及びＣ−末端分解生成物の免疫
検出：膜を、合成ヒトＡＰＰ６９５Ｃ−末端ペプチド免
疫原に誘発されたウサギポリクローナル抗血清を１：１
０００希釈度で含むブロッキング緩衝液１５mlに移し、
そして４℃で一晩インキュベートした。
【００７６】膜を、３度の連続的な１５mlのブロッキン
グ緩衝液により５分間、軽く振盪することによりすすい
だ。次に、膜を、アルカリホスファターゼが結合ヤギ抗
−ウサギＩｇＧ（Fisher Scientific, Pittsburgh,Ｐ
Ａ）を１：１０００希釈度で含むブロッキング緩衝液１
５mlに移し、そして室温で９０分間インキュベートし
た。次に、膜を３図の連続的な１５mlのブロッキング緩
衝液により１０分間、軽く振盪することによりすすい
だ。
【００７７】次に、膜を、１００ｍＭのＮａＣｌ及び５
ｍＭのＭｇＣｌ2 を含む１００ｍＭのトリスＨＣｌ，ｐ
Ｈ９．５を含んで成るアルカリホスファターゼ緩衝液１
５mlにより、それぞれ５分間、３度洗浄した。次に、ゲ
ルを、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのμｇＣｌ2 及び
５０μｌのＢＣＩＰ基質（５０mg／ml、Promega, Madis
on, ＷＩ．）及び９９μｌのＮＢＴ基質（５０mg／ml,
Promega ）を含む１００ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ９．
５の溶液１５mlと共に暗室でインキューベートした。イ
ンキュベーションは、低Ｍｒ免疫反応性バンドの追加の
増強が明白でなくなるまで（典型的には室温で３時間）
続けられた。
【００７８】次に、ゲルを脱イオン水によりすすぎ、そ
して乾燥せしめた。そのような分析の典型的な最終結果
は図１に示され、これはさらに、表１，２及び３に示さ
れ、そして下記に説明される。
【００７９】対照及びＡＤのＣＳＦにおける活性を比較
しての典型的な分析の結果：対照のＣＳＦ及びＡＤ患者
のＣＳＦにおけるＡＰＰ分解性プロテアーゼのレベルの
間の可能性ある差異を試験するために、次の実験を行っ
た。
【００８０】死後、ＡＤに関して診断される９人の患者
（死での平均年令は７７であり、範囲は６９〜８４才で
あり、平均自己分解時間は４．３８時間であり、ｎ＝
９）及び臨床的評価及び死後の試験に基づいてＡＤを有
さないと診断された５人の患者（平均年令は７２であ
り、範囲は５７〜８５才であり、ｎ＝４、平均自己分解
時間は３．５時間であり、ｎ＝５）からのＣＳＦを、上
記例５に記載されるアッセイ条件を用いて、ＡＰＰ分解
活性についてそれぞれ試験した。
【００８１】次の調節を行った： ｉ）ＡＰＰを、反応緩衝液の存在下で及びＣＳＦの不在
下でインキュベートし、ＡＰＰ調製物自体内で微量のプ
ロテアーゼから生じるＡＰＰ分解の程度を評価した（図
１、個々のゲルＡ，Ｂ及びＣに関してレーン１、また下
記表１〜３も参照のこと）；
【００８２】ii）例２により誘導された純粋な組換えＣ
−１００フラグメントを含む細胞溶解物を、個々のゲル
（図１、個々のゲルＡ，Ｂ及びＣにおいてレーン２）
に、元のＨｅｌａ Ｓ３細胞培養物１μｌに存在する量
に等しい量で適用し；
【００８３】iii ）ＣＳＦ及びＡＰＰを含む個々のイン
キュベーションのために、ＡＰＰが除かれた対応するイ
ンキュベーションを行い、ＣＳＦが組換えＡＰＰタンパ
ク質分解に由来する内因性免疫反応性バンドを含むかど
うかを決定した。このＡＰＰ調節が、完全なシステムを
含むインキュベーションに対して隣接する電気泳動レー
ンにおいて分析された。
【００８４】
【表１】
【００８５】＊Ｍｒマーカーは次のものである：ミオシ
ンＨ−鎖（１９６ＫＤａ）、ホスホリラーゼＢ〔１０６
ＫＤａ）、ウシ血清アルブミン（７１ＫＤａ）、オボア
ルブミン（４４ＫＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ
（２８ＫＤａ）、ベータラクトグロブリン（１８ＫＤ
ａ）、リゾチーム（１５ＫＤａ）、ウシトリプシンヒン
ヒビター（５．８ＫＤａ）及びインシュリンＡ及びＢ鎖
（３ＫＤａ）。 注：図１の上部の矢印は、転換されていないＡＰＰ６９
５の位置を示し、そして低部の矢印は、酵素的に生成さ
れたバンドの移動の位置を示す。ＡＤ患者に低部のＭｒ
バンドが存在せず、しかし５人の対照のうち４人にそれ
が存在することが注目される。
【００８６】
【表２】
【００８７】
【表３】
【００８８】Ｘ＝死での正確な年令は測定され得なかっ
た。 ＊＝Ｍｒマーカーは上記表１のためにと同じである。 実験比較の結果が図１に示される。表１，２及び３にお
ける説明は、個々のイムノプロットレーンの内容物を他
に、患者の診断の詳細な反応記載、性別、死での年令及
びＣＳＦのサンプリングの前、経過した死後の時間（自
己分解時間）を提供する。すべてのサンプルを除去の後
できるだけ早くドライアイス上で又は−８０℃で凍結
し、そして分析されるまで貯蔵した。
【００８９】図１の矢印は、低分子量Ｃ末端フラグメン
トへのＡＰＰの分解の評価において興味ある領域を示
す。上記の矢印は、分解されなかった組換えＡＰＰの移
動を示し、これは約１１０ＫＤａの見掛けの大きさを示
唆するホスホリラーゼＢマーカーと共に同時移動する。
低部の矢印は、Ｃ−１００の移動の位置を示す。
【００９０】このフラグメントはリゾチームのわずかな
前方に移動し、これは約１４ＫＤａの見掛け分子質量を
示す。５人の患者のうち４人において、異なった対照の
患者からのＣＳＦを用いてのＡＰＰと共にＣＳＦのイン
キュベーションは、組換えＣ−１００に対応する大きさ
の範囲内で、同時移動する免疫反応性バンドの形成を引
き起こした（図１、ゲルＣ、レーン５，７，９及び１
２）。
【００９１】鋭い対照として、このバンドは、ＡＤから
のＣＳＦを用いての９のインキュベーションのうち８の
インキュベーションに完全に不在であることが見出され
（図１、ゲルＡ、レーン３，５，７，９及び１１；及び
ゲルＢ、レーン３，５及び７）、そして９人のＡＤ患者
からのＣＳＦのインキュベーションにおいてはかすかに
見えるのみであることが見出された（ゲルＡ、レーン
Ｂ）。バンドは、ＣＳＦを伴わないでＡＰＰを含む対照
のインキュベーションのいづれにも存在せず（レーン
１，ゲルＡ，Ｂ，及びＣ、これは、それがＡＰＰ調製物
自体内に見出されるタンパク質分解活性に由来しないこ
とを示す。さらに、組換えＡＰＰを伴わないでインキュ
ベーションされる場合、ＣＳＦサンプルのいづれも、そ
のフラグメントの存在を示さず（ゲルＡ、レーン４，
６，８，１０，１２及び１４；ゲルＢ、レーン４，６及
び９；ゲルＣ、レーン４，６，８，１０及び１３）、こ
れはそのフラグメントが組換えＡＰＰの分解に由来した
ことを示す。従って、データは、ＡＰＰ基質と共にＣＳ
Ｆのインキュベーションにより特異的に形成されたこの
Ｃ−末端ＡＰＰ生成物のレベルにおいて対照及びＡＤの
ＣＳＦ間で有意な差異を示す。
【００９２】配列の列挙 （１）一般情報 （ｉ）出願者：Paul P. Tamburini, Robert N. Ureyer,
及びKathryn M. Bausch （ii）発明の名称：アミロイド前駆体タンパク質のタン
パク質分解に基づいてのアルツハイマー病についての診
断アッセイ （iii ）配列の数：１ （iv） 通信先： （Ａ）住所：Miles Inc. （Ｂ）通り：400 Morgan Lane （Ｃ）町：West Haven （Ｄ）州：Connecticut （Ｅ）国：USA （Ｆ）郵便番号：06516 （ｖ）コンピューター読み取りフォーム： （Ａ）メディアムタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：IBM PC （Ｃ）操作システム：MS−DOS （Ｄ）ソフトウェアー：Displayw ite 4.0 （vi）出願日： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （vii ）アトニー／エージェント情報： （Ａ）名称：Jae H. Kim, Eaq. （Ｂ）登録番号：32,907 （Ｃ）参照／ドケット番号：MTI 222 （viii）電信情報： （Ａ）電話：（203 ）937 −2340 （Ｂ）ファックス：（203 ）937 −2795
【００９３】（２）配列番号１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：３９個のヌクレオチド （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の長さ：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類： cDNA〜mRNA （iii ）出版物情報： （Ａ）著者：Kang et al. （Ｂ）雑誌：Nature （Ｃ）巻：325 （Ｄ）ページ：733 （Ｅ）年度：1987 （iv）配列：配列番号１ CTCTAGAACT AGTGGGTCGA CACGATGCTG CCCGGTTTG 39
【図面の簡単な説明】
【図１】これは、本発明のための典型的なイムノブロッ
ト分析の結果を示す３種のゲルを示す図面に代わる写真
である。その結果は、Ｃ−末端ＡＰＰフラグメント（ゲ
ルＡ，Ｂ，及びＣにおいて低部の矢印により示される）
を生成するためにアミロイド前駆体タンパク質のインビ
トロ分解を触媒する、対照及びアルツハイマー病患者か
らのＣＳＦの相対的能力を示す。９人のＡＤ及び５人の
対照の患者のタンパク質分解活性が比較される。その結
果は、５人の対照の患者のうち４人からのＣＳＦは検出
できるタンパク質分解活性を含むが、９人のＡＤのＣＳ
Ｆのうちたった１人のＣＳＦサンプルが同じ活性を有し
たことを示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年８月９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】これは、本発明のための典型的なイムノブロッ
ト分析の結果を示す３種のゲルのクロマトグラムを示す
図面に代わる写真である。その結果は、Ｃ−末端ＡＰＰ
フラグメント（ゲルＡ，Ｂ、及びＣにおいて低部の矢印
により示される）を生成するためにアミロイド前駆体タ
ンパク質のインビトロ分解を触媒する、対照及びアルツ
ハイマー病患者からのＣＳＦの相対的能力を示す。９人
のＡＤ及び５人の対照の患者のタンパク質分解活性が比
較される。その結果は、５人の対照の患者のうち４人か
らのＣＳＦは検出できるタンパク質分解活性を含むが、
９人のＡＤのＣＳＦのうちたった１人のＣＳＦサンプル
が同じ活性を有したことを示す。
フロントページの続き (72)発明者 ロバート エヌ．ドレイヤー アメリカ合衆国，コネチカット 06492, ウォーリングフォード，イースト センタ ー ストリート 838 (72)発明者 キャサリン エム．ボーシュ アメリカ合衆国，コネチカット 06516, ウェスト ヘイブン，エルム ストリート 184，アパートメント 12

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 患者におけるアルツハイマー病の診断に
    使用するための方法であって、下記段階： （ａ）前記患者から得られた脳脊髄液及び血液から選択
    された体液のサンプルとＡＰＰ基質とを組合し、そして
    （ｂ）前記サンプルの存在下で前記ＡＰＰ基質のタンパ
    ク質分解切断を検出する段階を含んで成り、ここで前記
    ＡＰＰ基質のそのようなタンパク質分解切断の程度が、
    対照の個人からの脳脊髄液及び血液サンプルの存在下で
    生じるタンパク質分解切断とは実質的に異なる、アルツ
    ハイマー病を有することが知られている個人からの脳脊
    髄液又は血液サンプルの存在下で生じる方法。
  2. 【請求項２】 前記段階（ａ）及び（ｂ）が、アルツハ
    イマー病を有することが知られている個人からの脳脊髄
    液又は血液サンプルの存在下で、実質的に検出できるタ
    ンパク質分解切断が生成されない条件下で行われ、それ
    によって、患者のサンプルの存在下での検出できるタン
    パク質分解切断の不在がアルツハイマー病を有すること
    を示す請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記体液サンプルが脳脊髄液である請求
    項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記ＡＰＰ基質が組換え的に発現された
    ポリペプチドを含んで成る請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記ＡＰＰ基質が合成ペプチドを含んで
    成る請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 タンパク質分解切断が、アルツハイマー
    病を有することが知られている個人からの脳脊髄液又は
    血液サンプルの存在下で生じるタンパク質分解切断と比
    較して、対照の個人からの脳脊髄液又は血液サンプルの
    存在下で生じるタンパク質分解切断に特有である前記Ａ
    ＰＰ基質のポリペプチド又はペプチドフラグメントの生
    成を検出することによって検出される請求項１記載の方
    法。
  7. 【請求項７】 前記ポリペプチド又はペプチドフラグメ
    ントがＣ−末端フラグメントである請求項６記載の方
    法。
  8. 【請求項８】 前記ポリペプチド又はペプチドフラグメ
    ントが抗体結合により検出される請求項６記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記ＡＰＰ基質が色素基質であり、そし
    てタンパク質分解切断がその色素応答を測定することに
    よって検出される請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 アルツハイマー病の診断の助けとして
    患者の脳脊髄液又は血液サンプルの試験への使用のため
    の試験キットであって： （ａ）ＡＰＰ基質、及び（ｂ）アルツハイマー病を有す
    ることが知られている個人からの脳脊髄液又は血液サン
    プルの存在下で生じるタンパク質分解切断と比較して、
    対照の個人からの脳脊髄液又は血液サンプルの存在下で
    生じるタンパク質分解切断に特有であるポリペプチド又
    はペプチドフラグメントを結合する抗体試薬を保持する
    １又は複数の容器を含んで成るキット。
  11. 【請求項１１】 前記ＡＰＰ基質が組換え的に発現され
    たポリペプチドを含んで成る請求項１０記載のキット。
  12. 【請求項１２】 前記ＡＰＰ基質が合成ペプチドを含ん
    で成る請求項１０記載のキット。
  13. 【請求項１３】 前記抗体試薬が検出可能なラベルを含
    んで成る請求項１０記載のキット。
  14. 【請求項１４】 前記検出可能なラベルが酸素である請
    求項１３記載のキット。
  15. 【請求項１５】 前記ポリペプチド又はペプチドフラグ
    メントがＣ−末端フラグメントである請求項１０記載の
    キット。
  16. 【請求項１６】 アルツハイマー病の診断の助けとして
    患者の脳脊髄液又は血液サンプルの試験への使用のため
    の色素基質であって： （ａ） ＡＰＰ基質部分、及び（ｂ） 対照の患者の脳
    脊髄液又は血液に存在するプロテアーゼにより切断でき
    るが、しかしアルツハイマー病を有する個人の脳脊髄液
    又は血液の存在下で、実質的に切断できないか又は実質
    的にほとんどの程度切断できないペプチド結合を通して
    前記ＡＰＰ基質部分に結合される色素インジケーター部
    分を含んで成る基質。
  17. 【請求項１７】 前記ＡＰＰ基質が組換え的に発現され
    たポリペプチドを含んで成る請求項１６記載の基質。
  18. 【請求項１８】 前記ＡＰＰ基質が合成ペプチドを含ん
    で成る請求項１６記載の基質。
  19. 【請求項１９】 前記プロテアーゼによる切断が着色さ
    れた指示薬成分を開放する請求項１６記載の基質。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007119685A1 (ja) * 2006-04-13 2007-10-25 Sanko Junyaku Co., Ltd. β－アミロイドの血中分解速度測定によるアルツハイマー病の検定方法及び診断試薬
JP2013158281A (ja) * 2012-02-03 2013-08-19 Shionogi & Co Ltd 新規ｂａｃｅ１活性測定方法

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW327194B (en) * 1992-05-01 1998-02-21 American Cyanamid Co Novel amyloid precursor proteins and methods of using same
AU679675B2 (en) * 1992-05-11 1997-07-10 Bayer Corporation Methods for detecting beta amyloid precursor protein processing enzymes
AU5726494A (en) * 1992-12-16 1994-07-04 Bayer Corporation Cathepsin d is an amyloidogenic protease in alzheimer's disease
ATE165168T1 (de) * 1994-03-29 1998-05-15 Lepetit Spa Festphasenimmunoassay zum nachweis von inhibitoren von einem proteolytischen enzym
US5863902A (en) * 1995-01-06 1999-01-26 Sibia Neurosciences, Inc. Methods of treating neurodegenerative disorders using protease inhibitors
US5804560A (en) * 1995-01-06 1998-09-08 Sibia Neurosciences, Inc. Peptide and peptide analog protease inhibitors
US6800287B2 (en) * 1998-09-25 2004-10-05 Yeda Research And Development Co., Ltd. Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use
DE19909357A1 (de) * 1999-03-03 2000-09-07 Gerd Multhaup Kupferagonist, der an die Kupferbindungsstelle von APP bindet und/oder eine hemmende Wirkung auf die Freisetzung des Amyloid-Aß-Peptids ausübt
WO2002005634A2 (en) 2000-07-13 2002-01-24 University Of South Florida Transgenic animal and methods
AU2001277217A1 (en) * 2000-07-28 2002-02-13 Blood Center Research Foundation Synthetic and recombinant substrates for the detection of the von willebrand factor-cleaving protease
WO2002010768A2 (en) * 2000-07-31 2002-02-07 The Regents Of The University Of California Model for alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases
FR2816411B1 (fr) * 2000-11-03 2003-07-04 Inst Nat Sante Rech Med Moyens de detection de la transformation pathologique de la proteine app et leurs applications
US6649346B2 (en) 2001-03-30 2003-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas Methods of identifying agents that affect cleavage of amyloid-β precursor protein
DE10230838B4 (de) * 2002-07-04 2005-02-03 Mediquant Gmbh Diagnostische Verwendung von pharmazeutischen Substanzen
DE60326153D1 (de) * 2002-07-30 2009-03-26 David Gladstone Inst Verfahren zur diagnose von morbus alzheimer
EP1539941A4 (en) * 2002-08-27 2006-11-29 ADZYMES AND THEIR USES
WO2008027017A1 (en) * 2006-08-31 2008-03-06 Singapore Health Services Pte Ltd Modulation of neural activity and/or condition
AR064501A1 (es) * 2006-12-22 2009-04-08 Genentech Inc Antagonistas del dr6 (receptor de muerte 6) y usos de los mismos en el tratamiento de trastornos neurologicos
BRPI0909898A2 (pt) * 2008-06-12 2015-12-01 Genentech Inc método para a triagem de compostos que inibem a neurodegeneração
US20110256559A1 (en) * 2008-10-20 2011-10-20 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Method for Detecting Soluble Amyloid Precursor Protein (APP) Alpha and/or Soluble APP Beta
AU2009319864A1 (en) 2008-11-25 2011-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Use of DR6 and P75 antagonists to promote survival of cells of the nervous system
TW201034684A (en) * 2009-02-18 2010-10-01 Genentech Inc Method for inhibiting neurodegeneration
US20110110942A1 (en) * 2009-11-12 2011-05-12 Genentech, Inc. Method of promoting dendritic spine density
KR101352670B1 (ko) 2010-06-15 2014-01-17 울산대학교 산학협력단 알츠하이머 전구단백질 분비 펩타이드의 축적물을 포함하는 뇌 노화 감별 진단 마커
US20120181450A1 (en) * 2011-01-18 2012-07-19 Electronics And Telecommunications Research Institute Method and apparatus for detecting bio material using photoelectric conversion device, and method for manufacturing photoelectric conversion device
WO2012142301A2 (en) 2011-04-12 2012-10-18 Quanterix Corporation Methods of determining a treatment protocol for and/or a prognosis of a patients recovery from a brain injury

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5223482A (en) * 1986-11-17 1993-06-29 Scios Nova Inc. Recombinant Alzheimer's protease inhibitory amyloid protein and method of use
US4874694A (en) * 1987-04-07 1989-10-17 The Rockefeller University Use of phosphoprotein patterns for diagnosis of neurological and psychiatric disorders
US5039511A (en) * 1987-04-08 1991-08-13 Salutar, Inc. Amyloidosis and alzheimer's disease diagnostic assay and reagents therefor
US5234814A (en) * 1989-06-01 1993-08-10 Du Pont Merck Pharmaceutical Company Diagnostic assay for alzheimer's disease
AU661270B2 (en) * 1990-03-05 1995-07-20 Cephalon, Inc. Chymotrypsin-like proteases and their inhibitors
US5595883A (en) * 1990-06-01 1997-01-21 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method of diagnosing alzheimer's disease by measuring acetylcholinesterase activity in ocular fluid
WO1992000521A1 (en) * 1990-06-29 1992-01-09 Case Western Reserve University Diagnostic and prognostic methods based on soluble derivatives of the beta amyloid protein precursor
HUT69771A (en) * 1990-08-17 1995-09-28 Univ Boston Proteases causing abnormal degradation of amyloid beta-proteine precursors
US5200339A (en) * 1990-08-17 1993-04-06 Abraham Carmela R Proteases causing abnormal degradation of amyloid β-protein precursor
US5200324A (en) * 1990-09-04 1993-04-06 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method of diagnosing senile dementia of the Alzheimer type
US5686269A (en) * 1994-07-28 1997-11-11 The Mclean Hospital Corporation Method of diagnosing Alzheimer's disease by detecting the level of cathepsin D in cerebrospinal fluid

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007119685A1 (ja) * 2006-04-13 2007-10-25 Sanko Junyaku Co., Ltd. β－アミロイドの血中分解速度測定によるアルツハイマー病の検定方法及び診断試薬
JP4790013B2 (ja) * 2006-04-13 2011-10-12 エーディア株式会社 β−アミロイドの血中分解速度測定によるアルツハイマー病の検定に用いられる方法及び診断試薬
JP2013158281A (ja) * 2012-02-03 2013-08-19 Shionogi & Co Ltd 新規ｂａｃｅ１活性測定方法

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Publication number Publication date
US5981208A (en) 1999-11-09
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