JPH0755803A - 自己会合性分子複合体の安定な測定方法及びその標準物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 疾患に伴って複合体を形成したりあるいはそ
の量が変化する自己会合性分子の複合体を正確に測定す
る方法、及びその測定に使用される安定な複合体からな
る標準物質の提供。 【構成】 自己会合性分子複合体を免疫学的に測定する
方法において、標準物質として自己会合性分子が共有結
合した複合体を用いることを特徴とする測定方法、及び
前記自己会合性分子の共有結合した複合体であることを
特徴とする免疫学的測定方法の標準物質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な自己会合性複合
体を用いる免疫学的測定方法及びその標準物質に関す
る。さらに、該物質の検出及び定量に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、自己会合性を有する分子の複合体
を測定する場合、測定に使用される標準物質は生体試料
に存在する状態の複合体をそのまま使用していた。この
方法では標準物質の保存条件や保存中に測定値が変動す
るという問題があった。

【０００３】疾患に伴ってその量あるいは質が変動する
生体内の成分は、疾患の診断のために重要であり、これ
らを測定する様々の診断方法が開発され応用されてい
る。これらの疾患で変動する成分のなかには自己会合性
（複数の分子同士が凝集し複合体を形成する性質）を有
し、疾患に伴って複合体を形成したりあるいはその量が
変化することが知られている。このような、自己会合性
を有する分子の複合体の測定はその複合体が不安定なた
め正確な測定は困難であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、疾患
に伴って複合体を形成したりあるいはその量が変化する
自己会合性分子の複合体を正確に測定する方法、及びそ
の測定に使用される安定な複合体からなる標準物質を提
供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は、自
己会合性分子複合体を免疫学的に測定する方法におい
て、標準物質として自己会合性分子が共有結合した複合
体を用いることを特徴とする測定方法、及び前記自己会
合性分子の共有結合した複合体であることを特徴とする
免疫学的測定方法の標準物質により達成された。好まし
くは、前記標準物質は共有結合していない自己会合性複
合体を実質的に含まない物質であり、自己会合性分子あ
るいはその複合体を架橋剤で処理して共有結合した複合
体である。

【０００６】この架橋剤としては、アルデヒド架橋剤が
好ましく用いられる。例えば、グルタルアルデヒドがあ
げられる。

【０００７】また、自己会合性分子は蛋白質（糖蛋白も
含む）であり、複合体はその凝集あるいは会合したもの
である。

【０００８】本発明の標準物質は、精製された自己会合
性分子又はその複合体を架橋剤で処理することで作成さ
れる。架橋剤としては、グルタルアルデヒドが好ましく
用いられ、0.05〜１％濃度で室温で数時間、あるいは４
℃でover night反応させることで調製される。反応終了
後、透析などによって、不要な架橋剤を除き、これをヒ
トプール血清，動物血清、あるいは７％ＢＳＡなどに適
当な濃度になるように添加し、免疫学的測定方法の標準
物質とする。好ましくは、前記透析後に架橋していない
分子をゲル濾過などの方法によって、分離することが好
ましい。このとき、未反応の共有結合していない自己会
合性分子を乖離させた後、ゲル濾過することで、共有結
合していない自己会合性分子を除くことができる。前記
の乖離させる条件としては、例えば８Ｍの尿素処理が上
げられるが、自己会合性分子を不可逆的に変性させない
条件であれば使用することができる。

【０００９】このようにして調製された自己会合性分子
複合体は、免疫学的測定方法の標準物質として使用する
ことができ、保存安定性に優れることが確認された。本
発明の標準物質及びそれを用いた免疫学的測定方法によ
って、自己会合性分子複合体を正確に測定することが可
能になった。

【００１０】自己会合性分子複合体としては、例えば、
癌患者腹水よりα-ラクトアルブミンアフィニティクロ
マトグラフィーによりガラクトース転移酵素とのヘテロ
多量体として分離され、ドデシル硫酸ナトリウム処理又
は８Ｍ尿素処理により単分子状態となり、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ還元条件下電気泳動で約48ｋＤａの分子量を示し、
等電点が約4.6〜5.0であり、抗α₁-アンチトリプシンポ
リクローナル抗体と反応し、プロテアーゼ・インヒビタ
ー活性を持たず、ガラクトース転移酵素との会合及び自
己会合が可能なタンパク質、該タンパク質とガラクトー
ス転移酵素との会合体及び該タンパク質の自己会合体が
得られる。本発明によって前記自己会合性分子複合体を
グルタルアルデヒドなどで処理して共有結合した複合体
としたものを、免疫学的測定方法の標準物質とすること
が可能となり、この自己会合性分子複合体を正確に測定
するための安定な標準品を得ることができる。

【００１１】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づきより具体的に
説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定される
ものではない。

【００１２】１．ガラクトース転移酵素（ＧＴ）画分の
分離α-ラクトアルブミンアフィニティクロマトグラフィー ＧＴ−ＢＰ会合体を含むＧＴ画分は卵巣癌患者の腹水中
から以下の手順により得た。操作は全て４℃で実施し
た。

【００１３】卵巣癌患者の腹水約１リットルを遠心分離
し、不溶物を除去した。上清を約２０倍量の蒸留水で１
晩透析した後、これを10ｍＭ MnCl₂、５ｍＭ N-アセチ
ルグルコサミン、0.01％トライトンX-100（Tx-100）を
含む20ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（pＨ7.3）（緩衝液
Ａ）に調整した。２時間静置後、遠心分離（16000ｇ，3
0分間）して再度不溶物を除去した。

【００１４】この上清をあらかじめ緩衝液Ａで平衡化し
たα-ラクトアルブミン・セファロース ４Ｂ アフィ
ニティカラム（５×30cm）に通し、同緩衝液で十分に洗
浄した。タンパク質のモニターは280nmの吸光度の測定
により行った。カラムを通過するタンパク質が認められ
なくなった後、GlcNAcを除いた緩衝液ＡによりＧＴ画分
を溶出した（約50ml）。これにGlcNAcを加え、最終濃度
５ｍＭとした。

【００１５】これらをあらかじめ緩衝液Ａで平衡化した
ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧアフィニティカラム（1.5
×３cm）（シグマケミカル社製）に通し、ＧＴを含む画
分を集めて透析チューブに入れアクアサイドII（カルバ
イオケム製）を用いて約10mlに濃縮した。さらに蒸留水
で透析した後、イスコ電気泳動コンセントレイターを用
いて濃縮し0.5mlとした。なおＧＴ画分はＧＴ活性測定
により追跡した。なお、ＧＴ活性の測定は、特公平3-13
879号に記載の方法により行った。

【００１６】ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動 濃縮されたＧＴ画分試料の分子量を、ドデシル硫酸ナト
リウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）により測定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ファストシ
ステム（ファルマシア社製）により12.5％ポリアクリル
アミドゲルを用いて行い銀染色を行った結果、分子量約
４８ｋＤａのバンドが確認された。

【００１７】２．抗ＢＰ抗体の調製免疫プロトコール 実施例１で調製したＧＴ画分の試料約50μgをリビ・ア
ジュバントシステム（リビ イムノケム リサーチ社
製）を用いてＢＡＬＢ／ｃ系マウス（雌、８週齢）に免
疫し、再度３週間後に同量注射した。この投与後２週間
目に採血して、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により抗
体価を測定して陽性であることを確認した後、ＧＴ画分
試料300μgをリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解して
静脈注射した。３日後、該マウスより脾臓を摘出し以下
のように細胞融合を行った。

【００１８】エライザ（ＥＬＩＳＡ） 96穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）のウェル
に、ＰＢＳに希釈したＧＴ画分試料を５μg／mlの濃度
で50μlづつ分注し４℃で一晩吸着した。該液を除去
し、ウェルをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡを含むＰ
ＢＳを各ウェルに100μlづつ加え、37℃で１時間インキ
ュベートした。ＢＳＡ溶液を除去した後、抗体を含む液
（即ち、培養上清あるいは抗血清）50μlを加え、37℃
で１時間インキュベートした。抗体を含む液を除去しＰ
ＢＳで充分に洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液に希
釈したペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスイムノグロブ
リン（Ａ＋Ｇ＋Ｍ）（カッペル社製）溶液を加えて、室
温で１時間反応させた。溶液を除去し、ＰＢＳで充分に
洗浄した後、基質として濃度３mg／mlのo-フェニレンジ
アミンを溶解したクエン酸・リン酸緩衝液（pＨ5.0）
（0.02％H₂O₂を含む）を各ウェルに100μlづつ添加し発
色させた。９Ｎ硫酸50μlを各ウェルに加えて発色反応
を停止し、波長492nmの吸光度をマイクロプレートリー
ダーＭＰＲＡ４（東ソー製）を用いて測定した。

【００１９】細胞融合 免疫されたマウスから脾臓を無菌的に摘出し、ステンレ
スメッシュにより単細胞にほぐし、脾細胞の1/5量のマ
ウスミエローマ細胞株P3X63-Ag8-653細胞とRPMI1640培
地（日水製薬製）を混合し遠心分離後、細胞のペレット
に50％ポリエチレングリコール1500（ベーリンガー社
製）を加え、融合操作を行った。その後徐々にＲＰＭＩ
1640液で希釈し遠心分離により上清を除去した融合細胞
を、20％牛胎児血清（ＦＣＳ）を加えたＨＡＴ培地（0.
01ｍＭヒポキサンチン、1.6μMチミジン、0.04μMアミ
ノプテリンを含むＲＰＭＩ1640培地）に懸濁し、９６穴
マイクロプレートに１ウェルあたり４×10⁵個の細胞を
まき込み５％CO₂下37℃で培養した。２週間後、コロニ
ー生育ウェルの培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡ法により
ＧＴ画分試料と強く反応する抗体をスクリーニングし
た。抗体産生コロニーについて限界希釈法によりクロー
ニングを３回行い、安定した抗体産生クローンを得た。
最終的にクローン５個を得て、Ｍ801、Ｍ524、Ｍ623、
Ｍ177、Ｍ691と命名した。

【００２０】モノクローナル抗体の精製 ５個のクローンをそれぞれ10％ＦＣＳを加えたＲＰＭＩ
1640培地で培養し、遠心分離（200ｇ，５分間）してＲ
ＰＭＩ1640培地で洗浄して再度遠心分離した後ＲＰＭＩ
1640で１×10⁷個／mlの濃度に懸濁した。これを７日前
にあらかじめプリスタン（２、６、10、14-テトラメチ
ルペンタデカン）を注射しておいたＢＡＬＢ／ｃ系マウ
スの腹腔に0.5mlづつ接種した。約２週間後、腹部の膨
張したマウスから腹水を採取し、遠心分離（200ｇ，５
分間）により細胞を除去した後、これを硫酸アンモニウ
ムを加えて50％飽和溶液とし、沈殿を分離してＰＢＳに
溶解した。

【００２１】Ｍ801，Ｍ524，Ｍ623については、100倍量
の20ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（pＨ7.8）で十分に透析
した。これらを陰イオン交換クロマトグラフィーにより
精製した。すなわち、ＤＥＡＥ−セファロース（ファル
マシア社製）カラムを用いて上記試料をアプライし、20
ｍＭトリス−ＨＣｌ（pＨ7.8）、塩化ナトリウム濃度０
−１Ｍの条件により濃度勾配溶出を行った。溶出液は28
0nmの吸光度によりモニターし、得られた各画分につい
てＥＬＩＳＡを行いモノクローナル抗体溶出画分を同定
して集めた。

【００２２】Ｍ177，Ｍ691については、ゲル濾過法によ
り精製した。すなわち、スーパーローズ12カラム（２×
50cm）（ファルマシア社製）を用いて上記試料をアプラ
イし、ＰＢＳにより溶出した。溶出液は280nmの吸光度
によりモニターし、得られた各画分についてＥＬＩＳＡ
を行いモノクローナル抗体溶出画分を同定して集めた。

【００２３】モノクローナル抗体の特徴づけ （１）モノクローナル抗体のクラス及びサブクラス 各モノクローナル抗体の抗体クラスとサブクラスは、マ
ウスモノクローナル・サブ−アイソタイピングキット
（AMERICAN QUALEX 社製）を使用して決定した。その結
果、Ｍ801，Ｍ524はIgG₁、Ｍ623はIgG_2b、Ｍ177，Ｍ691
はIgMと決定された。

【００２４】（２）特異性 得られた５種類のモノクローナル抗体の特異性を以下に
示す試験により決定した。それぞれのモノクローナル抗
体を結合したゲル懸濁液25μlに癌患者の腹水500μlを
加えて４℃で一晩振盪した。２mlの冷ＣＫＴ緩衝液（20
ｍＭカコジル酸ナトリウム、150ｍＭ塩化ナトリウム、
0.01％トリトンＸ-100）を加えて１ｇで５分間放置して
から上澄み液を吸引した。再度ＣＫＴ緩衝液による洗浄
を行った後、70μlのＧＴ基質液を加え（７μlの0.5ｍ
Ｍ［³H］UDP-gal液、全投入量150000dpm（ニューイング
ランドヌクレアー社製）、３μlの0.2Ｍ二酸化マンガン
液、60μlのＣＫＴ緩衝液、２mgの卵白アルブミン（Ｏ
ＶＡ）、この混合液を37℃で２時間振盪した。50μlの
反応混合液を１インチ角の濾紙ホワットマン３ＭＭ紙に
スポットして、即座に10％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で
10分間洗浄した。このＴＣＡ洗浄操作を３回行った後、
この試験紙を95％エタノール、ジエチルエーテルにて順
次10分間づつ洗浄した。空気中で乾燥した後、この試験
紙をシンチレーション用小ビンに入れてシンチレーショ
ンカクテルを加えて、濾紙状に沈殿した放射性タンパク
質量を液体シンチレーションカウンターにより測定し、
結果を下記に示す。

【００２５】ゲルへ固定した モノクローナル抗体 cpm Ｍ８０１ 630 M524 1750 Ｍ６２３ 1600 Ｍ１７７ 2150 Ｍ６９１ 1470 また、健常人乳汁、癌患者腹水、卵巣癌細胞培養上清か
ら前記手順に従いガラクトース転移酵素を精製して、モ
ノクローナル抗体の反応性の試験に使用した。なお、乳
汁は遠心分離により中間層に得られる白濁不透明液を得
た後、0.2Ｍ酢酸緩衝液を等量添加してpＨ4.6に調製し
て30分間静置した。これを20000rpmで30分間遠心分離を
して上清を分離して乳清を調製し、これを用いた。

【００２６】各モノクローナル抗体を濃度10μg／mlに
ＰＢＳで希釈して、96穴マイクロタイタープレート（ヌ
ンク社製）に100μlづつ加えて４℃で一晩吸着させた。
これをＰＢＳで洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を
200μlづつ加えて37℃で１時間静置してブロッキングし
てから液を除去した。次に、上記精製ＧＴを１％ＢＳＡ
・ＰＢＳで50倍に希釈して各々100μｌづつ各ウェルに
加え37℃で１時間静置した。反応後、ＰＢＳで３回づつ
各ウェルを充分に洗浄した。次に、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ
溶液に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識MAb862
8（特開平3-259093号、微工研菌寄第11221号）を100μl
づつ各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。反応終
了後、ＰＢＳで充分に洗浄してから基質として濃度３mg
／mlのo-フェニレンジアミンを溶解したクエン酸-リン
酸緩衝液（pＨ5.0）（0.02％H₂O₂を含む）を各ウェルに
100μlづつ添加して室温で10分間発色反応させた。９Ｎ
硫酸を50μlづつ各ウェルに加えて反応を停止して、波
長492nmにおける吸光度を測定した。その結果を表１に
示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】以上の結果から、得られた抗体はＡ（Ｍ80
1）、Ｂ群（Ｍ524，Ｍ623）、Ｃ群（Ｍ177，Ｍ691）に
分類される。このなかでＢ群はすべてのＧＴ分子に反応
する一群であり、これらは特願平3-29091号の抗ＧＴ抗
体のグループ１に相当するものである。また、Ｃ群は癌
関連ＧＴに反応する一群であり、これらはグループ２に
相当するものである。しかしながらＡのＭ801抗体は、
その反応性の特徴からＧＴ分子に結合した癌患者腹水中
の他の分子を認識しているものと考えられる。なお、Ｍ
801抗体を産生するハイブリドーマは工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託され、その受託番号は、微工研菌
寄第12942号である。

【００２９】３．ＢＰ自己会合体の単離モノクローナル抗体Ｍ801のアフィニティカラムの作製 アガロースゲル担体を用いたアフィ・ゲル10（バイオラ
ッド社製）２mlを冷蒸留水（４℃）ですばやく３回洗浄
し、ＰＢＳ溶液のモノクローナル抗体Ｍ801（20mg）を
加えて４℃で４時間振盪した。反応終了後、１Ｍ塩化ナ
トリウムを含む100ｍＭグリシン−ＨＣｌ緩衝液（pＨ2.
8）、１Ｍ塩化ナトリウムを含む100ｍＭジエチルアミン
溶液（pＨ11.5）、３Ｍチオシアン酸カリウムを含む50
ｍＭリン酸緩衝液（pＨ7.2）で順次洗浄し、ＰＢＳで平
衡化した。

【００３０】ＢＰ自己会合体の単離 癌患者の腹水約１リットルを遠心分離して不溶物を除去
した。上清を約20倍量の蒸留水で一晩透析した後、あら
ためてＰＢＳで透析した。これを遠心分離（16000ｇ，3
0分間）して再度不溶物を除去した。

【００３１】この上清をモノクローナル抗体Ｍ801アフ
ィニティカラム（７mm×50mm）に通し、１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含むＰＢＳで充分に洗浄した。次いで３Ｍチオシ
アン酸カリウムを含む50ｍＭリン酸緩衝液（pＨ7.2）で
溶出した。溶出タンパクのモニターは280nmの吸光度の
測定により行った。溶出したタンパク質の画分を集めて
ＰＢＳで充分に透析した。これを再度ＰＢＳで平衡化し
た前述のアフィニティカラムに通し、同様にして再度溶
出して、ＰＢＳで透析した。この試料を透析チューブに
入れアクアサイドII（カルバイオケム社製）を用いて約
10mlに濃縮し、さらに蒸留水で透析した後イスコ電気泳
動コンセントレイターを用いて濃縮し0.5mlとした。こ
の濃縮液をさらにスーパーロース12カラム（１ｘ30cm）
（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過クロマトグラフ
ィーを行い単量体画分を除去し、得られた試料を同様の
方法により濃縮して１mlとした。

【００３２】標準物質の調製 分離精製したＢＰ自己会合体（200μg／ml・ＰＢＳ溶
液）に50％グルタルアルデヒド溶液を加えて最終濃度0.
1％（ｖ／ｖ）として、室温で２時間反応させた。反応
後ＰＢＳで十分に透析して、未反応のグルタルアルデヒ
ドを除去した。これを７％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液に添加し
て本発明の標準物質１とした。

【００３３】また、上記透析後の試料に最終濃度が８Ｍ
になるまで尿素を添加し、37℃１時間静置した。これを
スーパーロース12カラム（１ｘ30cm）（ファルマシア社
製）を用いてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、未反
応のＢＰの単量体画分を除去した。これをＰＢＳで十分
に透析・濃縮した後、７％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液に添加し
て本発明の標準物質２とした。

【００３４】一方、前記の単離したＢＰ自己会合体を７
％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液に添加して、比較用の標準物質と
した。

【００３５】４．ＢＰ自己会合体の検出 ＢＰ自己会合体を測定する方法として、同一抗体による
２抗体酵素免疫測定法を用いた。その操作手順を以下に
示す。

【００３６】本法に用いることのできる抗体としては抗
ＢＰ抗体とその標識抗体であり、例えばモノクローナル
抗体Ｍ801が挙げられる。また標識抗体は、前述の過ヨ
ウ素酸法に従い西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したも
のを使用した。

【００３７】Ｍ801を濃度10μg／mlにＰＢＳで希釈し
て、96穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）に10
0μlづつ加えて４℃で一晩吸着させた。これをＰＢＳで
洗浄した後、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶液を200μlづつ加え
て37℃で１時間静置してブロッキングしてから液を除去
した。次に、本発明の標準物質１、２及び比較用の標準
物質で、冷蔵保存でそれぞれ０〜６ヶ月間経時したもの
をＰＢＳで５倍に希釈し、各々100μlづつ各ウェルに加
え37℃で１時間静置した。反応後、ＰＢＳで３回づつ各
ウェルを充分に洗浄した。次に、１％ＢＳＡ・ＰＢＳ溶
液に希釈した西洋ワサビペルオキシターゼ標識Ｍ801を1
00μlづつ各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。
反応終了後、ＰＢＳで充分に洗浄してから基質として濃
度３mg／mlのo-フェニレンジアミンを溶解したクエン酸
-リン酸緩衝液（pＨ5.0）（0.02％H₂O₂を含む）を各ウ
ェルに100μlづつ添加して室温で10分間発色反応させ
た。９Ｎ硫酸を50μlづつ各ウェルに加えて反応を停止
して、波長492nmにおける吸光度を測定した。その結果
（検体の希釈は５倍）を図１に示す。図１からも明らか
な通り、本発明の標準物質は６ケ月に亙り安定に使用で
きることが解る。

【００３８】

【発明の効果】疾患に伴って複合体を形成したりあるい
はその量が変化する自己会合性分子の複合体を正確に測
定する方法、及びその測定に使用される安定な複合体か
らなる標準物質が得られた。

【図面の簡単な説明】

【図１】標準物質の経時変化の測定結果を示す図であ
る。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 自己会合性分子複合体を免疫学的に測定
   する方法において、標準物質として自己会合性分子が共
   有結合した複合体を用いることを特徴とする測定方法。
2. 【請求項２】 自己会合性分子複合体を免疫学的に測定
   する際に使用する標準物質が、前記自己会合性分子の共
   有結合した複合体であることを特徴とする免疫学的測定
   方法の標準物質。
3. 【請求項３】 共有結合していない自己会合性複合体を
   実質的に含まないことを特徴とする請求項２記載の標準
   物質。
4. 【請求項４】 自己会合性分子あるいはその複合体を架
   橋剤で処理して共有結合した複合体であることを特徴と
   する免疫学的測定方法の標準物質。