JPH0759589A - モノクローナル抗体、その製造法および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 硫酸基含有ガングリオシドＴ１に、特異的に
反応するモノクローナル抗体および該モノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを提供する。 【構成】 本発明のモノクローナル抗体を用いることに
より、硫酸基含有ガングリオシドＴ１の、生体内での発
現の状況（時期、細胞周期、場所等）を検討することが
できる。さらに種々の試験管内および生体内の実験系に
添加することによって、硫酸基含有ガングリオシドＴ１
の生理的役割や病態との関与について研究し、種々の疾
患の病因・病態の解析、その予防・治療に寄与することが
期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はモノクローナル抗体、さ
らに詳しくは、Ｔ１ガングリオシドに対して作製され
た、抗Ｔ１ガングリオシドモノクローナル抗体および該
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する
ものである。

【０００２】

【従来の技術】高等動物から下等動物に至るまで、動物
の細胞膜表面には様々なシアロ糖脂質、シアル酸含有ス
フインゴ糖脂質、すなわちガングリオシドが存在する。
ガングリオシドの分子種は従来、主要なものは２０数種
知られていたが、分離・分析技術の進展により多数の微
量分子種の存在が明らかにされつつある。ガングリオシ
ドの生体内での機能として、神経組織の構造と機能の維
持、神経突起伸長作用、細胞同士の相互識別、細胞増
殖、細胞分化、たとえば血液細胞に対する分化誘導作
用、またがん化、老化などにおける関与が知られてい
る。

【０００３】本発明者らはガングリオシドの発生・分化
における役割を解明するべく、ウニ、ヒトデ等棘皮動物
の卵子、精子の各種ガングリオシドを分離・精製し、そ
の化学構造を決定してきた。本発明者らがムラサキウニ
（Anthocidaris crassispina）卵より分離・精製したガ
ングリオシドの中に、硫酸基を含むガングリオシドが存
在し、その化学構造がHSO₃-8NeuGcα2-6Glcβ1-1Cerで
あることを解析し、Ｔ１ガングリオシドと命名した（J.
Biochem., 108, 185-192(1990)）。

【０００４】一方近年、癌、白血病、神経疾患等の診断
において、腫瘍マーカー、神経組織マーカーとしてのガ
ングリオシド類に対するモノクローナル抗体が頻用され
てきており、CA19-9、CA-50、CA-125、抗GM1抗体、抗GQ
1b抗体などが知られている。またメラノーマ等の治療に
用いられている抗ガングリオシド抗体も存在する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】硫酸基を有するガング
リオシドの存在部位、その生理的役割、発生・分化での
意味などの解明には、そのものに対する特異的なモノク
ローナル抗体を作製することが必須である。また作製さ
れたモノクローナル抗体の特異性を明らかにした上で、
該モノクローナル抗体が結合するガングリオシドの存在
・分布を、広く下等から高等までの動物各組織・細胞に
おいて探索し、該モノクローナル抗体の有用性、特にヒ
トの各種疾患、たとえば、癌、神経疾患、内分泌疾患、
免疫疾患、先天的代謝異常疾患などにおける診断・治療
への利用の可能性等を明らかにすることは重要である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、Ｔ１ガン
グリオシドを特異的に認識するモノクローナル抗体を得
るべく鋭意検討した結果、それを得ることに成功し、本
発明を完成させるに至った。すなわち、本発明はＴ１ガ
ングリオシドを特異的に認識するモノクローナル抗体、
またＴ１ガングリオシドを免疫された動物のＢ細胞と、
形質細胞腫株との融合細胞株の産生するＴ１ガングリオ
シドと特異的に反応するモノクローナル抗体、およびそ
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、さら
には該モノクローナル抗体および該ハイブリドーマを製
造する方法を提供するものである。また該モノクローナ
ル抗体を用いる各種疾患の診断薬、治療薬を提供するも
のである。

【０００７】以下に本発明の詳細を説明する。

【０００８】本発明の抗Ｔ１ガングリオシドモノクロー
ナル抗体は次の各工程を経て製造された。 １．抗原の製造 ２．免疫 ３．抗体価の測定系の設定 ４．細胞融合 ５．ハイブリドーマの選択、クローニング ６．モノクローナル抗体の採取 以下各工程につき説明する。 １．抗原の製造 ムラサキウニ（Anthocidaris crassispina）などのウ
ニ、またヒトデなどの棘皮動物等の配偶子、特に卵子を
海水でジェリー層を除去後、凍結乾燥する。ついで凍結
乾燥卵からクロロホルム−メタノール−水混合溶媒で、
脂質画分を抽出する。この脂質画分をフォルチ分配法に
より、更に分画し、ついで上層、下層をそれぞれDEAE−
セファデックスA-25カラムにかけ、溶出液を再びDEAE−
セファデックスA-25カラムにかけ、メタノールに酢酸ア
ンモニウムを溶解させた溶液を濃度勾配をつくり、ガン
グリオシド各画分を溶出する。モノシアロ−、ジシアロ
−、トリシアロ−ガングリオシド各画分は明確に分離さ
れていることが薄層クロマトグラフィー（以下TLCと略
記する）で確認される。ついでトリシアロガングリオシ
ド画分をヤトロビーズカラムで分画して、精製Ｔ１ガン
グリオシドが得られる。

【０００９】得られたＴ１ガングリオシドをエタノール
に溶解し、超音波処理により微粒化し、リン酸緩衝液な
どを加え、再び超音波処理し、ついでアジュバントとし
て酸処理されたサルモネラ菌体（Salmonella minnesot
a）を含むリン酸緩衝液とまぜ合わせ、更に超音波処理
して、Ｔ１ガングリオシド−アジュバント混合溶液が得
られる。アジュバントとしては市販のフロイント完全ア
ジュバント、フロイント不完全アジュバント、BCG、キ
ーホールリンペットヘモシアニン（KLH）含有オイルな
ども用いることができる。 ２．免疫 上記のようにして得られた免疫原を哺乳動物、たとえば
ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ハム
スター、ラット、マウス等に投与する。モノクローナル
抗体を得るためには、ラット、ハムスター、マウスが好
ましく、特にマウスが好ましい。免疫の方法は、動物の
皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内等のいずれの投与
経路でも可能であるが、主として静脈内、皮下、腹腔内
に注入するのが好ましい。また免疫間隔、抗原免疫等は
いくらも変えることが可能であるが、数日から４週間隔
で、好ましくは３日〜２週間隔で、２〜１０回免疫し、
最終免疫後、１〜５日、好ましくは約２〜４日後に、抗
体産生細胞を採取すればよい。抗体産生細胞としては、
脾臓細胞、各部位のリンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細
胞が用いられるが、脾臓細胞を用いるのが一般である。
抗原の免疫量は１回にマウス１匹あたり、0.1〜500μ
g、好ましくは１〜300μg用いることが望ましい。免疫
の方法として、免疫される動物を予め、免疫抑制状態に
しておく方法も、免疫による抗体産生細胞の活性化に効
果がある方法として用いられる。その場合にシクロホス
ファミド、アザチオプリン、シクロスポリン、FK-506な
どの免疫抑制剤が用いられうる。免疫した動物の脾臓を
摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の上昇を
確認することが望ましい。 ３．抗体価の測定系の設定 免疫した動物の血中抗体価、あるいは後記の抗体産生細
胞の培養上清中の抗体価を測定する方法を確立する必要
がある。抗体検出の方法としてRIA、EIA、Elisa 、FIA
などの方法が一般によく使われており、本発明において
も特にどの方法を用いるという限定はしないが、Elisa
が簡便である。12〜96穴のプラスチックプレートの各ウ
エルにＴ１ガングリオシド抗原を添加して室温で放置
し、固相化する。仔牛血清アルブミンまたはウシ胎児血
清あるいはスキムミルクなど用いて、抗原非着部位をブ
ロックする。ついでリン酸緩衝生理食塩水（以下PBS と
略記する）で希釈した抗血清あるいはハイブリドーマ培
養上清などをプラスチックプレート上の固相体に添加す
る。次にPBS で希釈した市販の酵素あるいは蛍光あるい
はビオチン標識抗マウス免疫グロブリン溶液を添加し、
ついでElisa においては、基質を加えて発色させ、抗Ｔ
１ガングリオシド抗体の存在量を分光学的に測定するこ
とができる。 ４．細胞融合 上記脾臓細胞と形質細胞腫株との細胞融合は、たとえば
摘出したマウスの脾臓細胞を、ヒポキサンチン−グアニ
ン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（HGPRT^-）
や、チミジンキナーゼ欠損（TK^- ）の様なマーカーを持
った同種または異種の、好ましくは同種の細胞腫株との
間で融合させる。細胞腫株としてはミエローマが好まし
く、マウスミエローマとしてPAI（BALB/cミエローマ、I
gE非分泌型）、MOPC-21ライン由来のP3-X63/Ag8、p3-X6
3/Ag8.653、Sp2/0-Ag14、p3-NS1/1Ag4.1、NSO/uなど、
またラットミエローマとしてY3-AG1.2.3.、YB2/3.0AG2
0、IR983F、210.RCY3Ag1.2.3.など、またヒトミエロー
マとしてU-266-AR1、GM15006TG-A12 などがあげられ
る。細胞融合はたとえばケラーおよびミルシュタインら
の方法（Nature, 256, 495(1975)）に準じて行うことが
できる。10⁷〜10⁸個のミエローマ細胞と脾臓細胞とを混
合比１：１〜１：10で、たとえば約１：５の割合で、ME
M、RPMI-1640培地、あるいはRPMI-1640 培地とジメチル
スルホキサイド（DMSO）の混合溶液等の培地中で、融合
促進剤の存在下、30〜37 ℃水浴中で1〜10分間混合する
ことにより細胞融合を行う。融合促進剤としてセンダイ
ウイルス、平均分子量1000〜6000のポリエチレングリコ
ール（PEG ）、ポリビニールアルコールなどを用いるこ
とができる。PEG は濃度が約10〜80％、好ましくは30〜
50％で、約0.5〜30分、好ましくは約3〜15分間処理する
ことにより、効率良く細胞融合が達成される。融合促進
剤のかわりに電気刺激等の方法も用いられる。 ５．ハイブリドーマの選択、クローニング 融合細胞は、10〜20％ウシ胎児血清含有RPMI-1640培地
などで希釈し、マイクロタイタープレートに1×10⁵〜1
×10⁶個／ウエルの濃度でまき、ヒポキサンチン−アミ
ノプテリン−チミジン培地（HAT 培地）等を用いて、選
択的に増殖させることができる。10〜14日目頃からヒポ
キサンチン−チミジン（HT）培地に交換し、更に培養を
継続する。培養7〜10日目頃から生育してくる細胞は、
すべてハイブリドーマである。増殖してきた細胞の培養
上清につき、目的とする抗体産生があるか否かをスクリ
ーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、常
法によればよく、特に限定はされない。たとえばハイブ
リドーマの生育したウエルの上清の一部を採取し、目的
とする抗Ｔ１ガングリオシド抗体と標識したＴ１ガング
リオシドとをインキュベートするか、Ｔ１ガングリオシ
ドを固相化し、目的とする抗Ｔ１ガングリオシド抗体と
を結合させた後、標識した第２抗体を加えてインキュベ
ートし、その結合能を３．で示したElisaやRIA、FIAな
どにより測定することにより、抗Ｔ１ガングリオシド抗
体産生ハイブリドーマを得ることができる。この際、各
ウエル中には２種以上のハイブリドーマが生育している
可能性があり、そのためピックアップ法または限界希釈
法などによりクローニングを行い、モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマを取得できる。 ６．モノクローナル抗体の採取 目的とする抗体を産生するハイブリドーマを、約0.1〜4
0％、好ましくは10〜20％のウシ胎児血清、仔牛血清な
どの血清を含むMEM 、RPMI-1640培地などの適当な培養
液中で、あるいは無血清培地中で約2〜14日間、好まし
くは3〜7日間、培養し、その培養液から、抗体を得るこ
とができる。また大量の抗体を得るためにはミエローマ
細胞の由来の哺乳動物と同種の動物にプリスタン（2、
6、10、14−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油
を腹腔内投与し、その後ハイブリドーマを1×10⁴〜10⁷
個、好ましくは1〜5×10⁶個を腹腔内に投与し、ハイブ
リドーマを大量に増殖させ、約6〜25日後、好ましくは8
〜18日後に腹水または血清を採取する。得られた腹水ま
たは血清から抗Ｔ１ガングリオシド抗体を精製するに
は、塩析、クロマトグラフィーなどの通常の分画方法を
用いて実施できる。たとえば硫安分画、DEAE-セルロー
スイオン交換カラムクロマトグラフィー、プロテインA
やプロテインG を用いたアフィニティーカラムクロマト
グラフィー等により、容易にモノクローナル抗体を免疫
グロブリンとして単離することができる。またモノクロ
ーナル抗体は、その使用の目的によって、ハイブリドー
マ培養上清そのものの形で提供することもできる。

【００１０】このようにして得られた各モノクローナル
抗体につき抗原特異性を調べることが必要で、各種の糖
脂質との交差反応性を検討した。Ｔ１ガングリオシドの
他、ムラサキウニ卵より得たNeuGcα2-6Glcβ1-1Cer(M
5)、NeuAcα2-6Glcβ1-1Cer(M4)またGlcβ1-1Cer(Glc.
C)などを対照として用いたが、Ｔ１ガングリオシド以外
の糖脂質との反応は全くないか弱い、モノクローナル抗
体を取得していることが明らかにされた。これらＴ１ガ
ングリオシドに特異的なモノクローナル抗体を産生する
２種のハイブリドーマおよびそれの産生する抗体はとも
にそれぞれＴ１−１、Ｔ１−４などと名付けられた。そ
れぞれの抗体の免疫グロブリンクラス、サブクラスはIg
G3(κ)およびIgM(κ)であった。

【００１１】本発明のモノクローナル抗体はＴ１ガング
リオシドに対し特異的に結合することから、Ｔ１ガング
リオシドの測定用試薬として有用である。また本抗体は
生体臓器、組織、細胞、血液中のＴ１ガングリオシドあ
るいはＴ１ガングリオシドとエピトープを共通とする他
の類似抗原の存在、分布を明らかにする有用な試薬であ
り、その存在量を測定する試薬・診断薬として価値があ
るものである。生体臓器、組織、細胞、血液中のＴ１ガ
ングリオシドの検出ならびに測定は、EIA、RIA、FIA 、
ウエスタンブロット法などによる定性、定量に基づき実
施できる。たとえばヒト腫瘍組織の凍結標本、ホルマリ
ン等固定標本を、本発明の抗Ｔ１ガングリオシドモノク
ローナル抗体を用い、免疫組織化学法により染色したと
ころ、各種の癌、肉腫などがよく染色され、Ｔ１ガング
リオシドの発癌過程、細胞増殖、細胞分化における関与
が推察された。この知見をもとに担癌動物に放射線同位
元素で標識した本抗体を投与すると、癌組織がよくイメ
ージングされ、また担癌動物に本抗体を反復投与する
と、癌組織が縮小していった。よって本発明のモノクロ
ーナル抗体を用いて、上記の各種の癌等の治療も可能で
ある。

【００１２】本発明のモノクローナル抗体は、Ｔ１ガン
グリオシドの精製にも用いることができる。本抗体をア
ガロース、セルロース、ポリアクリルアミドゲルビー
ズ、たとえばアフィゲル-10 （バイオラド社）、ヤトロ
ビーズなどの担体に常法に従ってカップリングさせた
後、カラムにつめ、Ｔ１ガングリオシドを含有する細胞
抽出液、細胞培養液などをこの抗体アフィニティーカラ
ムにかけ、吸着させた後、洗浄し、その後適当な溶媒、
緩衝液で溶出させることにより、Ｔ１ガングリオシドを
効率良く精製できる。

【００１３】

【実施例】以下に実施例、実験例をもって本発明をより
詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【００１４】［実施例１］ Ｔ１ガングリオシド抗原と抗Ｔ１ガングリオシドモノク
ローナル抗体の調製 １．抗原の製造 福井県若狭湾で採集されたムラサキウニ（Anthocidaris
crassispina）の体腔内に0.5M KCl を注入すると排卵
が誘発された。この卵をPH5.0にした海水で洗ってジェ
リー層を除去し、凍結乾燥した。ついで凍結乾燥卵をク
ロロホルム−メタノールで抽出し、さらに10倍量のクロ
ロホルム-メタノール-水（4：8：3(v/v)）で３回抽出操
作を行い、脂質溶液画分を得、蒸発乾固した。次に乾固
した脂質画分を３回５倍量の冷アセトンで洗い、フォル
チ分配法により、更に分画した。下層はクロロホルム-
メタノール−水（30：60：8(v/v)）混合溶媒で平衡化し
たDEAE-セファデックスA-25 カラム（2.2×53cm、アセ
テート型、ファルマシア社製）を通した。このカラムを
カラム容量の３倍容量の同じ溶媒で洗浄した。カラムに
吸着している脂質をクロロホルム-メタノール-0.8M酢酸
ナトリウム（30：60：8(v/v)）混合溶媒で溶出し、蒸発
乾固し、ついで蒸留水に対して透析して、さらに凍結乾
燥した。上層も透析と凍結乾燥を行い、得られた脂質は
下層と同様にDEAE-セファデックスA-25 （1.7×25cm）
カラムにかけ部分的に精製した。このようにして集めた
フォルチ分配法の上層および下層を一緒にして、クロロ
ホルム−メタノール-水（30：60：8(v/v)）混合溶媒で
平衡化したDEAE-セファデックスA-25カラム（2.2×54cm
）にかけた。ついでカラムの３倍容量の同じ溶媒、そ
してカラム容量と同量のメタノールでカラムを洗った後
に、順に0.05M、0.15M、最後に0.45M酢酸アンモニウム
含有メタノール溶液各800mlで濃度勾配をかけて、ガン
グリオシド画分を溶出した。溶出液は12g ごとに、フラ
クションコレクターで試験管に分取した。各試験管の溶
出画分をTLCプレート（E.Merck社製）上でクロロホルム
-メタノール-2.5Mアンモニア水（60：35：8(v/v)）混合
溶媒で展開し、レゾルシノールスプレーによってチェッ
クしたところ、上記カラムクロマトによってモノシア
ロ、ジシアロ、トリシアロガングリオシド画分が明瞭に
分画されていることがわかった。ついでトリシアロガン
グリオシド画分をヤトロビーズ6RS-8060カラム（1×25c
m、ヤトロン社製）にかけ、クロロホルム-メタノール-
3.5M アンモニア水（80：20：0.5(v/v)）混合溶媒との
直線濃度勾配により、Ｔ１ガングリオシド画分を溶出し
た。本発明者らはこのＴ１ガングリオシドの化学構造が
HSO₃-8NeuGcα2-6Glcβ1-1Cerであることを報告した
（J.Biochem., 108, 185-192(1990)）。

【００１５】上記のようにして得たＴ１ガングリオシド
抗原をエタノールに溶解し、1mg/mlの濃度にした。つい
で抗原400μgを含むエタノール溶液400μlを５分間、超
音波処理により微粒化し、リン酸緩衝液含有生食（PB
S）３mlとまぜ、更に5分間、超音波処理し、ついで1ml
のサルモネラミネソタ菌株1mg/mlのPBS懸濁液（菌体200
mgに0.1％の酢酸10mlを加え、100℃で2時間煮沸し、つ
いで遠心によりペレットを集め、水で洗った後凍結乾燥
したものを溶解した）を加え、更に5分間超音波処理を
行った。 ２．免疫 得られた懸濁液状のＴ１ガングリオシド免疫原200μlを
6週齢♀C3H/HeNCrjマウス（日本チャールズ・リバー
社）に、26G×1/2注射針を用いテルモツベルクリン注射
用シュリンジ（1ml）で、尾静脈より注入し免疫した。
この免疫に先立つ3日前に、シクロホスファミドを含むP
BS溶液（シクロホスファミド100mgを水5mlに溶解し、そ
のうち0.187mlを取りPBSを加えて2mlにしたもの）をマ
ウス1匹あたり200μl、腹腔内に投与した。その後3日ご
とに、0、3、6、9日目にこの免疫原を尾静脈より注入
し、第19日目に5回目の免疫をし、その3日後にマウスを
屠殺し、脾臓を摘出した。同時に心臓より1mlほどの血
液を取り、血清を分離し、56℃30分間非働化した。 ３．抗体価の設定および測定 免疫したマウス、非免疫マウスの血清中の抗体価、およ
び抗体産生細胞、抗体産生ハイブリドーマなどの培養上
清中の抗体価の測定のためElisa 法を設定した。Ｔ１ガ
ングリオシド抗原をエタノールに溶解し、1μg/mlの濃
度に調製した。Dynatech laboratories社の96ウエルMic
rotiter Immunoassay Platesに各ウエル50μl（抗原は5
0ng/ウエル）まいた。このプレートを真空デシケーター
中で蒸発乾固した。ついで1％ヒト血清アルブミン（住
友製薬ブミネート25％、アルブミン含量250mg/ml）含有
PBSを各ウエルに加え、室温で30分間静置し、ブロック
（遮蔽）した。次に抗体価を測定しようとする血清ない
しその希釈液、あるいは抗体産生細胞培養上清ないしそ
の希釈液を各ウエルに加え60分間静置した。そして上清
を捨て、PBS で3回各ウエルを洗浄した。ついで第２抗
体を各ウエルに加えた。用いた第２抗体は2種類あり、
抗マウスIgG（γ）（γ chain specificのFcフラグメン
ト）ヤギ抗体（1/500）にパーオキシダーゼコンジュゲ
ートのもの（Cappel社製）、あるいは抗マウスIgM
（μ）（μ chain specificでaffinity purifiedのも
の）ヤギ抗体（1/500）にパーオキシダーゼコンジュゲ
ートのもの（Cappel社製）を目的に応じて使用した。次
に室温で30分間反応させた後、捨て、PBSで5回洗浄し
た。ついでo-フェニレンジアミン（80mMのクエン酸緩衝
液10ml中に、東京化成工業製の4mgを溶解させたもの）
と30％H₂O₂（同じ緩衝液10ml中に4μl加えたもの）を加
え、更に5N-硫酸を加え、しかるのち東ソーマイクロプ
レートリーダーMPR A4にて吸光度A492を測定した。Ｔ１
ガングリオシド抗原で免疫したマウスの血清中には確か
に抗体が産生し、一方非免疫マウスの血清中には、抗体
はないことがわかった（表１）。

【００１６】

【表１】 ４．細胞融合 摘出した脾臓細胞をRPMI1640培養液（日水製薬製）に浮
遊させた。BALB/cミエローマ細胞PAI（IgE非分泌型）
を、融合に用いる脾臓細胞数の1/5量を用意し、脾臓細
胞浮遊液に加えた。次に血清フリーのRPMI で2回洗浄
し、ついで50％（w/v）重合度4000のポリエチレングリ
コール（E.Merck社製）含有RPMI培養液（血清フリー）
を1分かけて1ml滴下していった。さらに血清フリーのRP
MI培地を1分かけて1ml、ついで1分かけて又1mlのRPMI培
地を加え、最後に3分かけて8mlのRPMI培地を加え混合し
た。ついでこの混合液を室温で5分遠沈し、細胞沈澱物
を15％牛胎児血清を（積水化学社製、United Biotechno
logical Corp製）を含むHAT培地に浮遊させ、96穴プレ
ート（コーニング社製）に3〜4×10⁵個／ウエルの細胞
をまいた。なおHAT（たとえばヒポキサンチン1×10
^-4M、アミノプテリン4×10^-7M、チミジン1.6×10^-5M含
有）培地には10％のハイブリドーマクローニングファク
ター、オリゲン（Origen、ボクスイ・ブラウン社製）を
加えた。 ５．ハイブリドーマの選択、クローニング 融合細胞の培養を開始し、3日おきに培地の1/2量をHAT
培地と交換し、培養上清の抗体価を前記のElisa法で測
定していった。ここで用いた2次抗体は、IgMについては
血清抗体価を測定する時と同じものを用いたが、IgGに
ついては抗マウスIgG （whole molecule、affinity pur
ified）ヤギ抗体にパーオキシダーゼコンジュゲートの
もの（Cappel社製）を用いた。HAT培地で選択的に増殖
させた、抗体産生能の高い、ハイブリドーマを10〜14日
目頃から、10％の牛胎児血清と10％のハイブリドーマク
ローニングファクターを含むヒポキサンチン-チミジン
（HT）培地に交換し、更に培養を継続した。10日培養
し、Elisaで測定を行い、抗体価の高いウエルのハイブ
リドーマを選び、更に3度リクローニングを行い、Ｔ１
−１、Ｔ１−４の2種の抗Ｔ１ガングリオシド抗体を分
泌するハイブリドーマを樹立した。これら細胞は20％の
牛胎児血清を含むRPMI培地に10％になるようDMSOを加
え、液体窒素内に貯蔵した。 ６．モノクローナル抗体の採取 Ｔ１−１およびＴ１−４を15％の牛胎児血清を含むRPMI
培地で7日間培養し、培養上清よりモノクローナル抗体
を得た。

【００１７】［実施例２］ 抗Ｔ１ガングリオシドモノクローナル抗体の免疫グロブ
リンクラスの決定 実施例１で得られたＴ１−１およびＴ１−４モノクロー
ナル抗体をマウス抗体サブクラス検出キット（アイソタ
イピングキットRPN29、アマーシャム社製）により、各
種標品免疫グロブリンと反応させ、モノクローナル抗体
の免疫グロブリンクラスを測定した。Ｔ１−１はIgG3
（κ）、Ｔ１−４はIgM（κ）であった。

【００１８】［実施例３］ 抗体の特異性の検討 抗原としてムラサキウニ卵より得たHSO₃-8NeuGcα2-6Gl
cβ1-1Cer（Ｔ１）、NeuGcα2-6Glcβ1-1Cer（Ｍ５）お
よびNeuAcα2-6Glcβ1-1Cer（Ｍ４）またGlcβ1-1Cer
（Glc.C）を用意し、Ｔ１−１モノクローナル抗体およ
びＴ１−４モノクローナル抗体との交差反応性をElisa
で検討した。Ｔ１−１は、表２に示したようにＴ１ガン
グリオシドとのみ反応し、Ｍ５、Ｍ４およびGlc.C とは
反応せず、Ｔ１特異的モノクローナル抗体であることが
わかった。一方Ｔ１−４は表３に示したようにＴ１ガン
グリオシド以外に、Ｍ５およびＭ４と若干ながら交差反
応性を示した。

【００１９】

【表２】

【００２０】

【表３】 ［実験例１］ヒト腫瘍組織、即ち中枢神経系、甲状腺、
肺、乳腺、肝、大腸、腎、睾丸などにつきビオチン・ア
ビジン法により、抗Ｔ１ガングリオシドモノクローナル
抗体との反応を調べた。抗Ｔ１ガングリオシド抗体はい
ずれの腫瘍組織とも高率に反応した。なかでも中枢神経
系、肝、腎の腫瘍との反応に強い例が多く、乳腺、大腸
の腫瘍との反応は弱い例が多かった。乳癌では硬癌に反
応陰性例が見られ、腫瘍の分化度ないし組織型との関連
が示唆された。対照として検討した抗CEAモノクローナ
ル抗体が中枢神経系、甲状腺腫瘍の全例で、反応陰性で
あったことから、抗Ｔ１ガングリオシドモノクローナル
抗体の特徴が歴然としている。

【００２１】ハイブリドーマＴ１−１は平成５年８月１
８日に日本国通商産業省 工業技術院 生命工学工業技
術研究部 特許微生物寄託センターに寄託された。（受
記番号Ｐー ）

【００２２】

【発明の効果】本発明の抗Ｔ１ガングリオシドモノクロ
ーナル抗体は基礎医学的研究にもまた臨床医学的応用に
も有用な抗体である。硫酸基含有ガングリオシドの生体
内での存在、分布、役割、また細胞の増殖、分化、がん
化におけるＴ１ガングリオシドの消長を明らかにするの
に本抗体は役立つ。癌、神経疾患、内分泌疾患、先天的
代謝異常疾患などにおける血清診断、組織化学的診断等
の診断、さらにはこれら疾患の治療に本抗体は適応しう
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＡＡ ＡＤＵ Ｎ ＡＥＤ ＡＥＥ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｔ１ガングリオシドを特異的に認識する
   モノクローナル抗体。
2. 【請求項２】 Ｔ１ガングリオシドにて免疫された動物
   のＢ細胞と、形質細胞腫との融合細胞株の産生する、Ｔ
   １ガングリオシドと特異的に反応する請求項１記載のモ
   ノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 請求項２記載のモノクローナル抗体を産
   生するハイブリドーマ。