JPH0759592B2 - 水溶性キサンチリウム誘導体基質 - Google Patents

水溶性キサンチリウム誘導体基質

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は水溶性キサンチリウム誘導体基質、その合成方
法及びフロテアーゼ酵素、抑制因子、補因子、活性化因
子及び非活性化因子の各々又は互いに組み合わせたもの
の活性測定に対するかかる合成基質の利用に関するもの
である。
従来の合成ローダミン110誘導体基質は、ライタス（Ley
tus）らによるバイオケム・ジャーナル（Biochem.Journ
al）209:299-307（1983）、及びライタスらによるバイ
オケム・ジャーナル215:253-260（1983）に報告される
如くプロテアーゼ酵素活性の蛍光測定に利用されてい
た。ライタスらの基質は、従来報告された基質と比べて
酵素活性の測定に対して極めて感応性があった。しか
し、ライタスらのローダミン110誘導体基質は37℃で約1
20マイクロモルという低い水溶性を示すことが確かめら
れ、従って基質の溶解性を高めるためにジメチルホルム
アミド及びエタノールのような有機溶媒添加剤の添加を
必要とした。しかし、酵素アッセイへの有機溶媒の添加
は、アッセイ処理を阻害することが知られ、即ちたんぱ
く質を変性し、反応速度を減じ更に／又は他の反応物若
しくは生成物の沈殿を生ぜしめて最適試験性能より劣る
結果を得ることとなる。
ライタスらの開示に加えて、生物流体中のたんぱく質分
解酵素の蛍光測定及び分光光度測定用のクマリン誘導体
基質がスミスらにより米国特許第4,294,923号に開示さ
れた。ガルギウロ（Gargiulo）らの米国特許第4,274,15
3号及び第4,336,186号に生物学的サンプル中のプロテア
ーゼ酵素活性度の測定用螢光発生アミノイソフタレート
基質が開示されている。
本発明は、プロテアーゼ酵素活性の螢光測定及び分光光
度用の水溶性キサンチリウム誘導体基質（以下ローダミ
ン110（rhodamine）及びロドール（rhodol）と称す）に
関するもので、該基質は作用濃度で水溶性を示すため
に、例えばジメチルホルムアミド及びエタノールのよう
な有機可溶化剤を用いる必要性を除き、従って、付随す
る試験障害を排除する。更に、水溶性ローダミン110と
ロドール誘導体基質は従来のローダミン110誘導体基質
より酵素活性度の量を測定するのにより高い感応性を示
す。従って、かかる増大した感応性の結果として、水溶
性ローダミン110とロドール誘導体基質は分光光度試験
処理に有効である；一方、従来の低い水溶性のローダミ
ン110誘導体基質は分光光度及び螢光測定の両方を行う
のに、より少量の容積のサンプル及び基質を用いて使用
されるに十分な感応性を示さない。本発明の水溶性キサ
ンチリウム誘導体基質はプロテアーゼ酵素、補因子、抑
制因子、活性化因子、及び非活性化因子各々又は互いの
組み合わせの活性を測定するのに有効であり、特にトリ
プシンの如き酵素の活性を測定するのに有効である。
本発明の目的は、酵素により加水分解される側鎖を有す
る水溶性キサンチリウム誘導体基質複合体を提供するこ
とにあり、かかる側鎖の加水分解は酵素活性に正比例す
る。
本発明の他の目的は、増大した水溶解性を有するキサン
チリウム誘導体基質を提供することに関するものであ
る。
本発明の他の目的は従来技術と比べてプロテアーゼ酵
素、補因子、抑制因子、活性化因子及び非活性化因子の
活性及び特にトロンビン形成を測定するためのアッセイ
処理における有機溶溶の必要性を除去することである。
更に本発明の目的は、分光光度、並びに螢光測定を実施
するに十分な感応性を有するキサンチリウム誘導体基質
を提供することにある。
ここでの合成基質及びそれらの加水分解生成物は作用濃
度で水溶性であり、これにより有機溶媒添加剤及び／又
は特定の水可溶化剤を使用することなく分光光度及び螢
光測定の双方への使用を可能にする。新規な水溶性基質
は次の一般式： （式中のＲ1はサルコジル、ピログルタミル及びグルタ
リルから成る群より選ばれる水可溶化基； Ｒ2はキサンチリウム、３′,6′−ジアミノ−９′−
（２−カルボキシフェニル）；及び Ｒ3はキサンチリウム、３′−アミノ−６′−ヒドロキ
シ−９′−（２−カルボキシフェニル）及びそれらの水
溶性塩を示す）で表される。
ローダミン110及びロドールの化学構造を下記に示す。
かかる化合物のプロテアーゼ酵素の感応性は増大して、
既知の方法を用いて従来検出できた量よりも低量の酵
素、抑制因子、補因子、活性化因子、及び非活性化因子
の検出を包含する；感応性は最も少ない検出可能量とし
て規定される。かかる改良は、プロトロンビン時間（P
T）、活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）及び
トロンボテスト（TT）によるトロンビンのアッセイを本
発明の新規な水溶性ローダミン110及びロドール誘導体
基質を用いて実施することを可能にする。
例 水溶性キサンチリウム誘導体基質の合成、該基質の分析
試験結果及び基質の使用例を下記に示す。次の例は本発
明の範囲を制限するものではない。
特記しない限り、使用する全てのアミノ酸はＬ−配置を
有する。次例において用いられる略語は次の通りであ
る： Arg＝アルギニン Cbz＝カルボベンジルオキシ DMF＝ジメチルホルムアミド EDAC＝１−エチル−３−（３′−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミドHC1 Glt＝グルタリル HAc＝酢酸 Pro＝プロリン Pyro＝ピログルタミル Sar＝サルコジル 溶離液及び生成物の薄層クロマトグラフィー（TLC）分
析において、吸収媒質としてシリカゲル60,254（EM
（株）製、試薬）をあらかじめ塗布したガラス板を用い
る。薄層クロマトグラムの展開に対して次の溶媒系を用
いる： Ｓ1＝２−ブタノン：アセトン：H2O;8:1:1（v/v） Ｓ2＝メタノール：酢酸：H2O;9:0.5:0.5（v/v） 合成基質の合成 水溶性キサンチリウム誘導体基質を式（Ｈ−Ｌ−Pro-An
g）2−ローダミン110を有するキサンチン誘導体基質を
最初に調整することにより合成する。（Ｈ−Ｌ−Pro−A
rg）2−ローダミン110の合成はライタスらにより詳しく
開示されている。
例１ 従来技術 工程I: 0.96g（2.62mmol）のローダミン110を、1:1の容量比（v
/v）の400mlの冷ジメチルホルムアミド（DMF）とピリジ
ン中に４℃の氷浴温度で向流で撹拌しながら溶解し、そ
の後25.6g（135.5mmol）のEDACを混合物に添加した。約
１分間の撹拌をした後、1:1の比の冷DMF:ピリジン溶液9
6ml中に11.52g（33.41mmol）のCbz−Ｌ−アルギニン−H
Clを素早く添加した。約24時間後、得られた生成物を、
1.6lの無水エーテルを添加し、次いで10000gで約10分間
遠心分離することにより単離し油状生成物を形成した。
得られた油を50mlの冷DMF中に溶解し、1.3lの冷アセト
ンを添加することにより、沈殿された。該油状物を1000
0gで10分間遠心分離により分離した。該油状物を50mlの
冷DMF中に再び溶解して500mlの冷1.2NHClを添加した。
赤色の沈殿物を10000gで10分間遠心分離することにより
単離した。赤色沈殿物を50mlの冷メタノールに溶解し35
0mlの冷酢酸エチルを添加することにより沈殿された。
得られた沈殿物（Cbz−Ｌ−Arg）2−ローダミン110を10
000gで10分間遠心分離することにより集収した。最終工
程を３回繰り返した。
収量:2.08g（＋79.4％）の（Cbz−Ｌ−Arg）2−ローダ
ミン110 工程II 工程Ｉで調製した3.4g（3.40mmol）の（Cbz−Ｌ−Arg）
2−ローダミン110を75mlの32％HBr-HAc溶液に溶解し
た。得られた赤色溶液を室温（RT）で約１時間撹拌し
た。得られた生成物を800mlの無水エーテルで遠心分離
することにより単離した。遠心分離工程を更に３回繰り
返した後、得られた褐色の固体、（Ｈ−Ｌ−Arg）2−ロ
ーダミン110を真空中で16時間乾燥した。
収量:3.4g（＋100％）の（Ｈ−Ｌ−Arg）2−ローダミン
110 TLC,S2:Rf 0.09。
工程III 工程IIで調製した2.75g（2.79mmol）の（Ｈ−Ｌ−Arg）
2−ローダミン110を300mlの1:1のDMF:ピリジン容量比
（v/v）の溶液中に４℃の氷浴温度で向流で撹拌しなが
ら溶解し、その後32g（116.9mmol）のEDACを混合物に添
加した。溶解を促進するため約１分間撹拌した後10.40g
（41.7mmol）のCbz−Ｌ−プロリンを60mlの1:1のDMF:ピ
リジン溶液に素早く添加した。約24時間後、生成物を工
程Ｉの方法により単離した。得られた黄褐色固体、（Cb
z−Ｌ−Pro-Arg）2−ローダミン110を真空中で16時間乾
燥した。
収量:1.86g（52.0％）の（Cbz−Ｌ−Pro-Arg）2−ロー
ダミン110 TLC,S2:Rf 0.44 工程IV 工程IIIで調製した1.80g（1.40mmol）の（Cbz−Ｌ−Pro
-Arg）2−ローダミン110を45mlの32％HBr-HAc溶液に溶
解し、得られた赤色溶液を室温（RT）で約１時間撹拌し
た。得られた生成物を工程Ｉに記載の如く無水エーテル
を用いて遠心分離することにより単離した。得られた褐
色固体、（Ｈ−Ｌ−Pro-Arg）2−ローダミン110を真空
中で16時間乾燥した。
収量:1.90g（＋100.0％）の（Ｈ−Ｌ−Pro-Arg）2−ロ
ーダミン110 TLC,S2:Rf 0.03 例II （Ｈ−Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110の製造 工程Ａ 工程Ｉ−IVで調製した1.90g（1.63mmol）の（Ｈ−Ｌ−P
ro-Arg）2−ローダミン110を190mlの1:1のDMF:ピリジン
溶液中に氷浴温度４℃で溶解し、その後該混合物に17.8
5g（93.1mmol）のEDACを添加した。溶解を促進するため
約１分間撹拌した後、5.20g（23.3mmol）のCbz−サルコ
ジン溶液を40mlの1:1のDMF:ピリジン溶液に素早く添加
した。約24時間後、得られた生成物を工程Ｉに記載の方
法により単離した。得られたピンク色の固体、（Cbz-Sa
r-Pro-Arg）2−ローダミン110を真空中で24時間乾燥し
た。
（Cbz-Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110の収量は1.1g（4
9.6％）であった。
工程Ｂ 工程Ａで調製した1.1g（0.78mmol）の（Cbz-Sar-Pro-Ar
g）2のローダミン110を24mlの32％HBr-HAc溶液に溶解
し、得られた深赤溶液を室温（RT）で約１時間撹拌し
た。得られた生成物を、350mmlの無水エーテルを用いて
遠心分離により単離した。かかる工程を更に３回繰り返
した後得られた茶色の固体、（Ｈ−Sar-Pro-Arg）2−ロ
ーダミン110を真空中で24時間乾燥した。
（Ｈ−Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110・5 1/2臭化水素
酸塩５水和物の収量は1.00g（84.7％）であった。
C48H64N14O9・5 1/2HBr5H2Oの元素分析 理 論％ 結果％ Ｃ＝38.00 37.84,38.11 Ｈ＝ 5.24 5.17, 4.81 Ｎ＝12.93 12.69,12.76 Br＝29.03 29.58 TLC,S2:Rf 0.01 例III （Ｈ−Ｌ−Pyro-Pro-Arg）2−ローダミン110の製造 工程Ａ 工程Ｉ〜IVで調製した380mg（0.325mmol）の（Ｈ−Ｌ−
Pro-Arg）2−ローダミン110を50mlの1:1のDMF:ピリジン
溶液中に氷浴温度４℃で溶解し、その後3.58g（18.62mm
ol）のEDACを混合物に添加した。溶解を促進するため約
１分間撹拌した後、Cbz−Ｌ−ピログルタミン酸を11ml
の1:1の冷DMF:ピリジン中に素早く添加した。約24時間
後、得られた生成物を工程Ｉに記載の方法により単離し
た。得られた茶色の固体、（Cbz−Ｌ−Pyro-Pro-Arg）2
−ローダミン110を真空中で16時間乾燥した。
（Cbz−Ｌ−Pyro-Pro-Arg）2−ローダミン110の収量は2
78mg（57.1％）であった。
工程Ｂ 78mg（0.0521mmol）の（Cbz−Ｌ−Pyro-Pro-Arg）2−ロ
ーダミン110を3mlの32％HBr-HAc溶液に溶解し得られた
赤色溶液を室温（RT）で約１時間撹拌した。得られた生
成物を75mlの無水エーテルを用いて遠心分離により単離
した。かかる遠心分離工程を更に３回繰り返した後、得
られた茶色の固体、（Ｈ−Ｌ−Pyro-Pro-Arg）2−ロー
ダミン110を真空中で16時間乾燥した。
（Ｈ−Ｌ−Pyro-Pro-Arg）2−ローダミン・4 1/2臭化水
素酸塩・5 1/2水和物の収量は57mg（71.7％）であっ
た。
C52H66N14O11・4 1/2HBr5 1/2H2Oの元素分析 理 論％ 結果％ Ｃ＝40.90 40.54,40.32 Ｈ＝ 5.01 5.08, 5.06 Ｎ＝12.85 12.55,12.73 Br＝23.60 23.56 例IV （Glt-Pro-Arg）2−ローダミン110の製造 工程Ａ 工程Ｉ〜IVで調製した110mg（0.094mmol）の（Ｈ−Ｌ−
Pro-Arg）2−ローダミン110を12mlの1:1のDMF:ピリジン
溶液中に氷浴温度４℃で溶解し、その後171ml（1.5mmo
l）のグルタル無水物を該混合物に添加した。約24時間
後、得られた生成物を工程Ｉに記載の方法により単離し
た。得られた茶色の固体、（Glt-Pro-Arg）2−ローダミ
ン110を真空中で16時間乾燥した。
（Glt-Pro-Arg）2−ローダミン110の収量は118.3mg（9
7.5％）であった。
例Ｖ Cbz-Argロドールの製造 工程Ａ 3.5g（0.54mmol）のローダミン110を25mlの濃硫酸中に
室温（RT）で向流撹拌をして溶解し、その後700mg（1.4
5mmol）の窒化ナトリウム及び10mlの濃硫酸を約20分間
に渡って添加した。約16時間の後、得られた混合物を25
0gの氷水に注入した。得られた深赤色溶液、ジアゾ化合
物を温度65〜70℃で約30分間加熱して窒素を追い出し
た。得られた薄色溶液を冷却することなく濾過した。冷
却後、赤茶色の綿状沈殿物を濾過し少量の水で洗浄し、
次いで真空中90℃で16時間乾燥した。赤茶色の綿状生成
物、ロドールヘミ硫酸塩がTLCにより75％で示された。
ロドールヘミ硫酸塩の収量は3.5g（96.6％）であった。
TLC,S1:Rf 0.70 工程Ｂ 1.14g（3mmol）のロドールヘミ硫酸塩を500mlの1:1のDM
F:ピリジン溶液中に氷浴温度４℃で溶解し、その後8.98
g（75mmol）のEDAC溶液を混合物に添加した。約１分間
の撹拌の後、60mlの1:1のDMF:ピリジン溶液に6.55g（19
mmol）のCbz−Ｌ−Arg-HClが溶解した溶液を素早く添加
した。約24時間後、得られた生成物を工程Ｉに記載の方
法により単離した。得られた赤みがかった茶色の固体、
Cbz−Ｌ−Arg−ロドールを真空中で16時間乾燥した。
Cbz−Ｌ−Arg−ロドールの収量は0.2g（10％）であっ
た。
TLC,S1:Rf 0.20 溶解度−（Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110と従来の（C
bz-Pro-Arg）2−ローダミンとの比較 水溶性ローダミン110の誘導体基質の高い感応性の一例
を次のデータにより示す：トロンビン反応速度を水溶性
基質、（Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110と従来の低い
水溶性基質、（Cbz-Pro-Arg）2−ローダミン110を用い
て測定した。温度37℃、容積1.0ml、0.05MKClを用いたp
H7.0の0.10MAces緩衝液を含む理想的試験条件を用い
た。サルコジル（Sar）及びカルボベンジルオキシ（Cb
z）は同様な分子量を有するので両者共100μg/mlで試験
した。15％エタノールの使用は（Cbz-Pro-Arg）2−ロー
ダミン110の溶解度を高めるのに必要とされた。Cbz誘導
体基質の溶解度は15％エタノールを添加したにもかかわ
らず37℃で120マイクロモルにまでしか増加しなかっ
た。逆に（Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110の溶解度は3
7℃で120マイクロモルにまで上昇し、溶解度で千倍の増
加であった。
吸光度変化、496nm/単位トロンビン/ml 従来技術 本発明
（Cbz-Pro-Arg）2−ローダミン110 （Sar-Pro-Arg）2−ローダミ
ン110 80マイクロモル 80マイクロモル 800マイク
ロモル 0.122 1.700 2.87
2 従来の基質と本発明の基質を比較した上記データは、本
発明の水溶性誘導体基質が従来の低い水溶性基質よりも
同じモル濃度で約14倍感度が高いことを示した。本発明
の基質は水溶性基質の濃度が高い場合で従来の基質より
も感度が24倍程高い。
水溶性キサンチリウム誘導体基質を用いたアッセイ 新規な水溶性キサンチリウム誘導体基質はタンパク質分
解酵素、抑制因子、補因子、活性化因子、及び非活性化
因子の活性の測定を分光光度及び螢光測定により可能に
する。新規な水溶性キサンチリウム誘導体基質を、フィ
ブリンの凝結を基礎にした血液凝固試験において天然基
質、フィブリノーゲンのかわりに用いることができる。
本発明を更に詳細に理解するため、若干のアッセイ例を
次に示す。
アッセイ例 例Ｉ （Pyro-Pro-Arg）2−ローダミン110を用いたトロンビン
の分光光度アッセイ 468nm及び496nmでの吸光度増加を測定することによりト
ロンビンの３種の異なる濃度に関して薬量、応答曲線を
決定した。用いるトロンビン稀釈液を次の如く調製し
た： 精製した人間のアルファ−トロンビン、ジョンフェント
ン博士（Dr.John Fenton）、ニューヨーク州デパートメ
ントオブヘルス（N.Y.State Dept.of Health）、を0.25
MNaClを含むpH8.0の0.05MHEPES中1.04U/ml、0.52U/ml及
び0.26U/mlに稀釈し、４℃で保持した。基質、（Pyro-P
ro-Arg）2−ローダミン110を0.3MKClを含むpH8.0の0.20
MHEPES中78μg/mlに溶解した。1cm光路を備える使い捨
てアクリル性クベット、センタウアサイエンス株式会社
（Centaur Sciences,Inc.）を使用した。1mlにわけた基
質をクベット中に滴下し、加熱ブロックで37℃まで暖め
た。用いるトロンビン稀釈液の1mlサンプルをクベット
に添加した。トロンビンと基質を混合した後、468nm及
び496nmでの吸光度をハウレット−パッカードモデル845
0A（Hewlett-Packard Model 8450A）分光光度測定器を
用いて30秒間測定した。上記時間の間に増加した吸光度
は次の如くである： トロンビン濃度と各波長で測定した吸光度間に直線的な
関係があった。
468nmと496nmで測定した吸光度間の関係は相関係数,r＝
0.9998であった。
上記データから吸光度の読みを468nm又は496nmのいずれ
か一方で評価し得ることが確証される。
例II （Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110を用いる螢光凝固因
子アッセイ 活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）アッセイを
基礎とした凝固因子VIII及びIXに対する螢光アッセイを
基質（Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110を用いて実施し
た合成基質をヒト及び動物血漿中双方に存在する天然基
質フィブリノーゲンにかえてトロンビン発生の検出に用
いた。標準検量線を正常な血漿カーチンマテゾンサイエ
ンティフィク（Curtin Matheson Scientific）からのト
ロンボスクリーン（Thromboscreen）を用いて描き、こ
れをジョージキングバイオメディカル（GeorgeKingBiom
edical）のVIII因子及びIX因子欠損血漿を修正するのに
用いた。APTT試薬には精製した大豆リン脂質及びエラグ
酸活性化剤、ダーデジアグノスティックス（DadeDiagno
stics）製を包含した。125μg/mlの基質サンプルを0.05
MKCl及び5mMCaCl2を含むpH7.0の0.10M,ACES中に溶解し
た。温度制御サンプルセルホルダー（37℃）を備えたチ
ューナーモデル430分光光度測定器をカイネティック（K
inetic）螢光測定を行うのに用いた。励起及び発光波長
を各々468nm及び525nmに設定した。ガラス試験管を血漿
酵素活性化を実施するのに用い、センタウアサイエンス
社（Centaur Sciences,Inc.）の使い捨てアクリル製ク
ベットを螢光測定に用いた。
100μｌの0.85％生理的食塩水又は生理的食塩水で稀釈
した正常血漿を試験管に添加し次いで100μｌの因子欠
損血漿及び100μｌのAPTT試薬を添加した。試験管を加
熱ブロック中37℃で２分間温置し、その後100μｌの25m
MCaCl2を添加し更に30秒間温置を続けた。温置した混合
物を、37℃に予備加熱し且つ螢光速度が測定された2.0m
lの基質溶液を含むクベットに移した。線状の薬量−応
答曲線がVIII因子及びIX因子に関して正常の１％〜100
％の間で得られた。
例III （Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110を用いたプラズミノ
ゲンの分光光度アッセイ ストレプトキナーゼ活性化プラズミノゲンを血漿サンプ
ルで測定し、得られた結果を、ポクロン、エス・ピー
（Pochron,S.P）らによるトロンボシスリサーチ（Throm
bosis Research）13,733-739（1978）の標準螢光アッセ
イ方法と比較した。ハイランドジアグノスティックス
（Hyland Diagnostics）からの凍結乾燥した正常クエン
酸添加血漿を用いてアッセイ標準検量線を作成した。ス
トレプトキナーゼ、カルビオケムベーリング（Calbioch
em-Behring）を、pH7.5の0.01MHEPES中で2000単位/mlに
した。（Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110を0.05MKClを
含むpH7.0の0.10MACES中に375μg/mlに溶解した。20μ
ｌの各血漿サンプル及び50μｌのH2Oを1cm光路を備える
セミーミクロ使い捨てクベット・エバーグリーンサイエ
ンティフィック（Evergreen Scientific）製に添加して
アッセイを実施した。加熱ブロックで37℃まで加熱した
後、500μｌのストレプトキナーゼ溶液を混合しながら
添加し37℃で２分48秒間温置した。２分48秒の活性化時
間を使用したが、これはクールター ダコス（COULTER
DACOS ）ケミストリー システムの確定した増殖時
間であるからである。完全なプラズミノゲン活性化が約
２分で生じるが、それより長い15分までの活性化時間も
使用することができる。次いで500μｌにわけた基質溶
液を37℃で添加し、次いで混合し、吸光度をモデル4850
Aハウレット−パッカード（Hewlett-Packard）分光光度
測定器を用いて460nm、37℃で３分間測定した。ストレ
プトキナーゼ、プラスミノゲンの活性を対象血漿データ
と比較することにより正常％で表した。40正常％〜140
正常％の範囲の値を有する12個の血漿サンプルのデータ
を参照アッセイデータと比較した。比較データに対する
相関係数はｒ＝0.990で最小２乗法による式はｙ＝0.956
x＋4.08として計算した。
例IV （Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110を用いた分光プロト
ロンビン時間 プロトンビン時間（PT）を血漿凝固の外因性経路を検出
するのに用いた。かかる試験を血漿サンプルにトロンボ
プラスチンを添加することにより行い、フィブリンクロ
ットの最終形成を伴う凝固因子プロテアーゼの活性化が
得られた。ロット形成速度を測定し、該速度は血漿サン
プル中の外因性凝固因子活性に正比例した。合成基質
（Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110をかかる試験におい
て天然基質フィブリノーゲンにかえて用いることができ
た。最終的に得られる外因性経路凝固因子、トロンビン
は合成基質により検出された。
基質をpH7.5の0.05MAces緩衝液中40μＭ濃度で調製し
た。トロンボプラスチンを緩衝処理した基質に添加し、
その割合は1.0ml基質当たり0.05mlであり、混合物を37
℃まで暖めた。25μｌの血漿サンプルを1cm光路を備え
たセミーミクロアクリル性クベット、エバーグリーンサ
イエンティフィク製に静置した。0.5mlのトロンボプラ
スチン基質混合物を血漿サンプルを含むクベットに添加
し、496nmでの吸光度における変化をモデル8450Aハウレ
ット−パッカード分光光度測定器を用いて測定した。抗
凝血剤ヘパリン及び／又はクマディンを投与した数人の
患者を含む56人の患者サンプルに対する合成基質試験結
果をプロトロンビン時間（PT）凝固値と比較した。３種
の市場で入手し得るトロンボプラスチン剤を使用した：
ジェネラル ジアグノスティクス（General Diagnostic
s）、オルトジアグノスティクス（Ortho Diagnostics）
及びダーデ ジアグノスティクス（Dade Diagnostics）
である。患者サンプルクロット時間は9.8〜40.6秒の範
囲にあり、ジェネラルジアグノスティクスの光学（Phot
o-optical）クロット検出システム、Coag−ａ−Mate 2
001により検出した。合成基質試験結果はクロットアッ
セイ値に対して反比例し３種のトロンボプラスチンを用
いた比較データに関する相対係数は−0.944、−0.953及
び−0.963であった。
例Ｖ （Sar-Pro-Arg）2−ローダミン110を用いた分光光度ア
ンチトロンビンIII−ヘパリン補因子アッセイ アンチトロンビンIIIを、水溶性基質、（Sar-Pro-Arg）
2−ローダミン110を用いて血漿サンプル中で測定し、基
準とするミッシェル・ジー・エー（Mitchell,G.A）らの
トロンボシスリサーチ（Thrombosis Research）12,219-
225（1978）の分光光度基質アッセイ方法をその結果を
比較した。５μｌの血漿と50μｌの純水を1cm光路を備
えたセミーミクロアクリル性クベット・エバーグリーン
サイエンティフィク製に添加した。37℃まで暖めた後、
緩衝生理食塩水に５単位/mlのトロンビン及び10単位/ml
のヘパリンを含む溶液の0.5mlをわけたクベットに添加
した。混合物を37℃で２分48秒間温置した。２分48秒の
活性化時間を使用したが、これはクールターダコス（CO
ULTER DACOS ）システムの確定増殖時間であるからで
ある。500μｌの水溶性基質を、0.05MKClを含むpH7.9の
0.1MACES中濃度375μg/mlの濃度でクベットに添加し
た。460nmでの吸光度における変化を20秒間測定した。4
0〜115正常％の範囲にあるアンチトロンビンIII量を用
いて26個の血漿サンプルに対する結果を基準アッセイ値
と相関した。比較データに対する相関係数はｒ＝0.983
で最小２乗法による式はｙ＝1.026x-2.90で表された。
新規な水溶性キサンチリウム誘導体基質も同様にトロン
ビン形成の内因子及び外因子経路を従来のよく知られて
いるトロンビン試験、初めてピー・エー・オーレン博士
（Dr.P.A.Owren）によるLancetII、p754〜758（1959）
に開示された方法により検出するのに用いることができ
る。
トロンボ試験は内因子及び外因子経路双方の因子に対し
て敏感で、更に２経路から生じたトロンビンはほぼ等し
い。トロンボ試験試薬には、トロンボプラスチン、部分
トロンボプラスチン、吸着した血漿（adsorbed plasm
a）及びフィブリノーゲンが含まれる。新規な水溶性キ
サンチリウム誘導体基質をトロンボ試験において、形成
されたトロンビンの活性を測定するのに天然基質、フィ
ブリノーゲンにかえて用いることもできる。
上記例は一般的な凝固試験、プロトロンビン時間、活性
化部分トロンボプラスチン及びトロンボ試験における水
溶性ローダミン110及びロドール誘導体基質の使用を支
持するものである。
本発明の特定例及び例をここで詳細に記載したが、本発
明を限定せんとするものではない。かかる例の記載にこ
れとは逆に、本発明の趣旨は、本発明の変形、変更、具
体例、使用及び価値全てを本発明明細書及び請求の範囲
の配内に含まれるものとしてカバーせんとするものであ
る。
フロントページの続き (72)発明者 ソロルザノ・マリリン・エム アメリカ合衆国フロリダ州33323 サンラ イズ エヌ ダブリュー サーティフィフ ス ストリート 12030 (56)参考文献 特表 昭55−500076（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．，215（1983）, 253−260. Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｊ．，209（1983）, 299−307.

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次式、 及びそれらの酸性塩 （式中のＲ1はサルコジル、ピログルタミル及びグルタ
    リルから成る群より選ばれる水溶性ラジカル； Ｒ2はキサンチリウム、３′,6′−ジアミノ−９′−
    （２−カルボキシフェニル）；及び Ｒ3はキサンチリウム、３′−アミノ−６′−ヒドロキ
    シ−９′−12−カルボキシフェニル）を示す）で表され
    る群から選ばれるキサンチリウム誘導体基質。
  2. 【請求項２】Ｒ1がサルコジルである請求の範囲第１項
    記載の基質。
  3. 【請求項３】Ｒ1がピログルタミルである請求の範囲第
    １項記載の基質。
  4. 【請求項４】Ｒ1がダルタミルである請求の範囲第１項
    記載の基質。
  5. 【請求項５】たんぱく質分解酵素、抑制因子、補因子、
    活性化因子及び非活性化因子を各々及び組み合わせて少
    なくとも一種含むサンプルの活性を測定するに当たり； 請求の範囲第１項記載のキサンチリウム誘導体基質を上
    記たんぱく質分解酵素、抑制因子、補因子、活性化因子
    及び非活性化因子の少なくとも一種を含むサンプルと混
    合し、上記サンプル中の活性を測定するのに用いること
    ができる加水分解生成物を得るのに十分な時間該混合物
    を静置する工程から成る活性測定方法。
  6. 【請求項６】上記たんぱく質分解酵素はプラスミノゲン
    を含み、更に上記サンプルを上記基質と混合する前に上
    記たんぱく質分解酵素を予め活性化する工程を含む請求
    の範囲第５項記載の方法。
  7. 【請求項７】上記抑制因子はアンチトロンビンIIIを含
    み、更に上記基質と混合する前に上記サンプルをトロン
    ビンと予め温置する工程を含む請求の範囲第５項記載の
    方法。
  8. 【請求項８】上記サンプルの活性を少なくとも分光光度
    及び螢光方法により測定する構成を含む請求の範囲第７
    項記載の方法。
  9. 【請求項９】上記サンプルの活性を測定する工程を含む
    請求の範囲第５項記載の方法。
  10. 【請求項１０】上記サンプルは上記たんぱく質分解酵
    素、抑制因子、補因子、活性化因子及び非活性化因子の
    少なくとも２種を含み、更に上記基質をトロンボプラス
    チンで処理し形成したトロンビンの活性を測定する工程
    を含む請求の範囲第９項記載の方法。
  11. 【請求項１１】上記サンプルは上記たんぱく質分解酵
    素、抑制因子、補因子、活性化因子及び非活性化因子の
    少なくとも２種を含み、更に上記基質を活性化部分トロ
    ンボプラスチンで処理し、形成したトロンビンの活性を
    測定する工程を含む請求の範囲第９項記載の方法。
  12. 【請求項１２】上記サンプルは上記たんぱく質分解酵
    素、抑制因子、補因子、活性化因子及び非活性化因子の
    少なくとも２種を含み、更に上記基質をトンロボプラス
    チン、部分トロンポプラスチン及び吸収血漿で処理し、
    内因子及び外因子経路双方から生じるトロンビン活性を
    測定する工程を含む請求の範囲第９項記載の方法。
  13. 【請求項１３】水溶性キサンチリウム誘導体基質を製造
    するに当たり、式（Cbz-Pro-Arg）2−ローダミン110で
    表されるキサンチリウム誘導体基質を選定し、次いで、
    Cbz基を、サルコジル、ピログルタミル及びグルタリル
    から成る群より選ばれる水溶化剤で置き換える工程から
    成る水溶性キサンチリウム誘導体基質の製造方法。
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