JPH0411199B2 - - Google Patents
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- JPH0411199B2 JPH0411199B2 JP59098355A JP9835584A JPH0411199B2 JP H0411199 B2 JPH0411199 B2 JP H0411199B2 JP 59098355 A JP59098355 A JP 59098355A JP 9835584 A JP9835584 A JP 9835584A JP H0411199 B2 JPH0411199 B2 JP H0411199B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は第ａ因子および第ａ因子様酵素に
対する新規発色性、螢光性基質に関する。本発明
の基質は、従来報告されている基質に比して、極
めて選択性がよく第ａ因子の定量を行うことが
でき、第ａ因子が形成、阻害または消費される
反応の研究、またはそれ等に関与する因子の測
定、例えば、第因子、抗ａ因子、第因子、
第因子、第因子およびヘパリンの測定に適し
ている。 凝固、線溶反応に於ける合成基質の導入は、
1954年S.Shermy等〔J.B.C.，208 85 105
（1954）〕の合成したTAMe（Tos−Arg−OMe）
等のアルギニンエステルが、基質としてトロンビ
ンのエステラーゼ活性の測定に使用されたのに始
まるが、エステル水解活性が凝固活性と一致せ
ず、基質の特異性や感度が低い等の問題があつ
た。しかし、最近のペプチド化学の進歩からフイ
ブリノーゲンのトロンビンによる解裂部のアミノ
酸構造に類似したペプチド基質、Bz−Phe−Val
−Arg−PNA（Ｓ−2160）がBlombach
〔Thromb，Research１267〜278（1972）〕らによ
り合成され、酵素反応を受けて遊離したパラニト
ロアニリン（PNA）の黄色の発色による酵素化
学的分光分析の容易な事、試薬調整の容易さなど
からしだいに研究検査に用いられるに至つた。 第ａ因子は、血液凝固カスケードで酵素前駆
体第因子の活性化により形成され、リン脂質お
よびカルシウムイオンと一緒になつて、第因子
（プロトロンビン）をペプチド鎖の２点で蛋白質
分解して、第ａ因子（トロンビン）に変じる蛋
白質分解酵素である。特定の病気、例えば肝臓疾
患、ビタミン欠乏症等の際に、第因子の形成が
減少し、また、この第因子形成の合成に関する
遺伝的障害により、もちろん第因子の形成が相
応して減少する。従つて、簡単かつ正確な方法
で、血漿中の第ａ因子の測定ができることは大
きな意義がある。 一方、酵素活性測定用合成基質は、酵素に対す
る高感度および特異性、水または生物学的試験液
に対する良好な溶解性および分解物の易検出性の
４点を満足させることが重要である。 このうちでも、測定しようとする酵素に対する
高い特異性は特に重要である。 一般に、血漿中の第因子、あるいは抗ａ因
子等を、発色性基質を利用して測定しようとする
場合、血漿中に存在すると予測される第ａ因子
以外の凝固線溶関連酵素である、プラスミン、ト
ロンビン、ウロキナーゼ等と交差反応を起すと、
正確な測定が期しがたい。 従来、開発されて来た最良の第ａ因子用基質
としては、西ドイツ国特許出願公開第2552570号
にテトラペプチド誘導体が記載されている。Bz
−Ile−Glu−Gly−Arg−PNA（Ｓ−2222）が、
第ａ因子により水解されて、ｐ−ニトロアニリ
ンを形成するテトラペプチド誘導体の１例として
記載されているが、基質特異性の点において、必
ずしも満足できるものではない。すなわち、凝固
線溶関連酵素のうち、第ａ因子以外に、プラス
ミン、ウロキナーゼ、トロンビンとも反応するこ
とが知られている。 さらに、上記テトラペプチド誘導体は、水溶媒
体中に難溶であるため、基質飽和で実施されるべ
き第ａ因子の分析が可能ではない。例えば、病
的血漿中の測定すべき第ａ因子の濃度が低い場
合には、前記テトラペプチド誘導体は、相応する
正確な測定値を得る程度に充分敏感ではなく、ま
た、測定すべき第ａ因子の量が、さらに血漿を
加えることにより増加したら、血漿蛋白質の影響
下にテトラペプチド基質の沈殿が生じ、その結果
として、酵素活性分析を実施することが不可能と
なる。 また、上記基質のごとく、生成するｐ−ニトロ
アニリンの黄色を比色する方法は、血漿成分の影
響を免がれることはできない。 本発明者等は、かかる点を改良すべく、新規な
第ａ因子活性用基質の開発研究を行つた結果、
上記の欠点を著しく改善し、前述の４条件を満足
する優れた性質を有する基質を見出した。 本発明による新規な発色性、螢光性基質は、一
般式 〔式中、 ｎは３〜４であり、 R1は−Ｈまたは
対する新規発色性、螢光性基質に関する。本発明
の基質は、従来報告されている基質に比して、極
めて選択性がよく第ａ因子の定量を行うことが
でき、第ａ因子が形成、阻害または消費される
反応の研究、またはそれ等に関与する因子の測
定、例えば、第因子、抗ａ因子、第因子、
第因子、第因子およびヘパリンの測定に適し
ている。 凝固、線溶反応に於ける合成基質の導入は、
1954年S.Shermy等〔J.B.C.，208 85 105
（1954）〕の合成したTAMe（Tos−Arg−OMe）
等のアルギニンエステルが、基質としてトロンビ
ンのエステラーゼ活性の測定に使用されたのに始
まるが、エステル水解活性が凝固活性と一致せ
ず、基質の特異性や感度が低い等の問題があつ
た。しかし、最近のペプチド化学の進歩からフイ
ブリノーゲンのトロンビンによる解裂部のアミノ
酸構造に類似したペプチド基質、Bz−Phe−Val
−Arg−PNA（Ｓ−2160）がBlombach
〔Thromb，Research１267〜278（1972）〕らによ
り合成され、酵素反応を受けて遊離したパラニト
ロアニリン（PNA）の黄色の発色による酵素化
学的分光分析の容易な事、試薬調整の容易さなど
からしだいに研究検査に用いられるに至つた。 第ａ因子は、血液凝固カスケードで酵素前駆
体第因子の活性化により形成され、リン脂質お
よびカルシウムイオンと一緒になつて、第因子
（プロトロンビン）をペプチド鎖の２点で蛋白質
分解して、第ａ因子（トロンビン）に変じる蛋
白質分解酵素である。特定の病気、例えば肝臓疾
患、ビタミン欠乏症等の際に、第因子の形成が
減少し、また、この第因子形成の合成に関する
遺伝的障害により、もちろん第因子の形成が相
応して減少する。従つて、簡単かつ正確な方法
で、血漿中の第ａ因子の測定ができることは大
きな意義がある。 一方、酵素活性測定用合成基質は、酵素に対す
る高感度および特異性、水または生物学的試験液
に対する良好な溶解性および分解物の易検出性の
４点を満足させることが重要である。 このうちでも、測定しようとする酵素に対する
高い特異性は特に重要である。 一般に、血漿中の第因子、あるいは抗ａ因
子等を、発色性基質を利用して測定しようとする
場合、血漿中に存在すると予測される第ａ因子
以外の凝固線溶関連酵素である、プラスミン、ト
ロンビン、ウロキナーゼ等と交差反応を起すと、
正確な測定が期しがたい。 従来、開発されて来た最良の第ａ因子用基質
としては、西ドイツ国特許出願公開第2552570号
にテトラペプチド誘導体が記載されている。Bz
−Ile−Glu−Gly−Arg−PNA（Ｓ−2222）が、
第ａ因子により水解されて、ｐ−ニトロアニリ
ンを形成するテトラペプチド誘導体の１例として
記載されているが、基質特異性の点において、必
ずしも満足できるものではない。すなわち、凝固
線溶関連酵素のうち、第ａ因子以外に、プラス
ミン、ウロキナーゼ、トロンビンとも反応するこ
とが知られている。 さらに、上記テトラペプチド誘導体は、水溶媒
体中に難溶であるため、基質飽和で実施されるべ
き第ａ因子の分析が可能ではない。例えば、病
的血漿中の測定すべき第ａ因子の濃度が低い場
合には、前記テトラペプチド誘導体は、相応する
正確な測定値を得る程度に充分敏感ではなく、ま
た、測定すべき第ａ因子の量が、さらに血漿を
加えることにより増加したら、血漿蛋白質の影響
下にテトラペプチド基質の沈殿が生じ、その結果
として、酵素活性分析を実施することが不可能と
なる。 また、上記基質のごとく、生成するｐ−ニトロ
アニリンの黄色を比色する方法は、血漿成分の影
響を免がれることはできない。 本発明者等は、かかる点を改良すべく、新規な
第ａ因子活性用基質の開発研究を行つた結果、
上記の欠点を著しく改善し、前述の４条件を満足
する優れた性質を有する基質を見出した。 本発明による新規な発色性、螢光性基質は、一
般式 〔式中、 ｎは３〜４であり、 R1は−Ｈまたは
【式】であり、
R2は−Ｈまたは−CH3であり、
R3は
【式】であり、
R4は−Ｈ、−CH3または
【式】であり、
そして
R5は
【式】（R6は−Ｈである）
である〕
である。
で表わされ、特に発色基として、３−カルボキシ
−４−ヒドロキシ−アニリド（CHA）を用いる
ことを特徴とする。本基質は、発色基にヒドロキ
シル基、アルボキシル基という極めて親水性の基
を持つために、卓越した水に対する溶解特性を持
つている。代表的な用途としては、〔〕基質を、
第ａ因子測定用基質として用い、生成する３−
カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリンをペンタ
シアノアミンフエロエート法や適当なカプラーと
酸化縮合させた着色物質に導き、これを比色定量
する場合があげられる。また、励起328nm、螢光
540nmにて螢光分析法により定量することにより
第ａ因子を特異的に測定することもできる。 本基質の特徴は、前述した如く、その第ａ因
子に対する優れた基質特異性と水に対する溶解性
にある。基質特異性については、新規基質PS−
2001、Ｚ−Ｄ−Lys（For）−Gly−Arg−CHAを
Ｓ−2222および参考の為に合成した上記新規基質
と同じアミノ酸配列でPNAを発色基としたPS−
2000N，Ｚ−Ｄ−Lys（For）−Gly−Arg−PNA
と各凝固、線溶に関与する酵素である第ａ因子
（Ｆａ）、トロンビン（TH）、プラスミン
（PL）、カリクレイン（KL）、ウロキナーゼ
（UK）等に於ける相対反応性をPS−2000N，Ｎ
−Ｄ−Lys（For）−Gly−Arg−PNAを100として
示すと第１表のごとくなり、トロンビン、プラス
ミン、ウロキナーゼ等に対する反応性が、CHA
系の新規基質の場合には、著しく低く、例えば、
トロンビン４％、プラスミン１％、ウロキナーゼ
２％しか反応せず、またＳ−2222のトロンビン31
％、プラスミン16％、ウロキナーゼ40％と比較し
て著しく選択性が改良されていることがわかる。
−４−ヒドロキシ−アニリド（CHA）を用いる
ことを特徴とする。本基質は、発色基にヒドロキ
シル基、アルボキシル基という極めて親水性の基
を持つために、卓越した水に対する溶解特性を持
つている。代表的な用途としては、〔〕基質を、
第ａ因子測定用基質として用い、生成する３−
カルボキシ−４−ヒドロキシ−アニリンをペンタ
シアノアミンフエロエート法や適当なカプラーと
酸化縮合させた着色物質に導き、これを比色定量
する場合があげられる。また、励起328nm、螢光
540nmにて螢光分析法により定量することにより
第ａ因子を特異的に測定することもできる。 本基質の特徴は、前述した如く、その第ａ因
子に対する優れた基質特異性と水に対する溶解性
にある。基質特異性については、新規基質PS−
2001、Ｚ−Ｄ−Lys（For）−Gly−Arg−CHAを
Ｓ−2222および参考の為に合成した上記新規基質
と同じアミノ酸配列でPNAを発色基としたPS−
2000N，Ｚ−Ｄ−Lys（For）−Gly−Arg−PNA
と各凝固、線溶に関与する酵素である第ａ因子
（Ｆａ）、トロンビン（TH）、プラスミン
（PL）、カリクレイン（KL）、ウロキナーゼ
（UK）等に於ける相対反応性をPS−2000N，Ｎ
−Ｄ−Lys（For）−Gly−Arg−PNAを100として
示すと第１表のごとくなり、トロンビン、プラス
ミン、ウロキナーゼ等に対する反応性が、CHA
系の新規基質の場合には、著しく低く、例えば、
トロンビン４％、プラスミン１％、ウロキナーゼ
２％しか反応せず、またＳ−2222のトロンビン31
％、プラスミン16％、ウロキナーゼ40％と比較し
て著しく選択性が改良されていることがわかる。
【表】
さらに、水に対する溶解特性については、Ｓ−
2222が6mmol／程度であるのに対して、CHA
系の新規基質は20mmol／以上の溶解性を有
し、界面活性剤、有機溶媒等の溶解補助剤を特に
必要としないため、試薬調整あるいは測定作にお
いて、非常に管理し易く、且つ反応に必要十分な
基質濃度を使用できるという長所を有している。 これ等のことは、本発明が第ａ因子用基質と
して極めて優れていることを示している。 本発明の化合物の用途は、すでに述べた通り第
ａ因子活性測定用の基質であるが、その場合、
当該基質をPH8.0〜8.7間の緩衝液中で第ａ因
子に作用させ、生成する３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシアニリンを適当な着色物に導き、これを
比色定量することにより第ａ因子活性を測定す
るが、このほかに励起328nm、螢光540nmにて螢
光分析法により、定量することもできる。 着色物に導く方法としては、ペンタアミンフエ
ロエート法やカプラーと酸化縮合させる法があ
る。カプラーとしては、酸性側での発色の場合
は、アニリン系化合物、例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ルアニリン、またアルカリ側では、フエノール、
ナフトール、チモール、ｏ−クレゾール、ｏ−エ
チルフエノール等が用いられる。 また、酸化縮合の酸化剤として、過酸化水素、
過硫酸塩等、種々のものが用いられるが、メタ過
ヨウ素酸が好適である。 ３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンを適
当な着色物に導くことにより、極大波長は560〜
770nm間に分布し、呈色の温度による変動は極め
て少く安定で、第ａ因子活性測定に適してい
る。さらに、発色感度を比べてみても、ｐ−ニト
ロアニリンの場合、一般測定波長405nmにてε＝
10600であるのに対し、ペンタアミンフエロエー
ト法ではλ＝700nmでε＝21500、酸化縮合によ
る発色においては、ｏ−エチルフエノールの場合
λ＝645nmでε＝29000、２，６−キシレノール
の場合λ＝615nmでε＝21600と極めて吸光度が
大きく、この点においても測定上極めて有利であ
る。 本発明の特徴の一つとして、生体試料中の夾雑
物による測定上の影響をほとんど受けないことが
あげられる。ｐ−ニトロアニリド系化合物におい
ては、560nm以下の波長で測定するのに対して、
本発明では560nm以上の波長で測定するため、試
料中の夾雑物の影響を受けず、基質本来の高特異
性とあわせて、正確な測定結果が得られる。 以上の通り本発明の化合物は、第ａ因子活性
測定用基質として、従来のものに比べて、非常に
優れていることが明らかである。 〔〕で表わされる本発明の化合物は、ペプチ
ド化学においてよく知られる方法により合成する
ことができる。 α−アミノ保護基としては、カルボベンゾキシ
またはｔ−ブチルオキシカルボニルまたは、それ
に関連する基、例えば、ｐ−メトキシカルボベン
ゾキシ、ｐ−ニトロカルボベンゾキシ、またはｐ
−メトキシフエニルアゾールカルボベンゾキシ等
を用いるのが有利である。 アルギニンのδ−グアニジル基の保護は、プロ
トン化で行うのが有利である。２個のアミノ酸カ
ツプリングまたはジペプチドとアミノ酸のカツプ
リングは、α−カルボキシル基の活性化により行
われる。例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシニツクイ
ミド、ｐ−ニトロフエノール、トリクロロフエノ
ール、４，６−ジメチルピリミジル−２−チオー
ル等を用いることができる。前述のエステル誘導
体への活性化は、カルボジイミド、例えば、Ｎ，
Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）
の存在下で行うのが有利である。 基質合成は、最初発色基をアルギニル基に結合
させ、逐次的にカツプリングしていく方法によ
る。あるいは、Ｎ−末端ジペプチドフラグメント
自体を合成し、次いで、これを発色基を有するア
ルギニル基に結合してもよい。 本発明を以下実施例により詳細に説明するが、
本発明は、これら実施例に限定されるものではな
い。 略号 Lys ＝リジン Gly ＝グリシン Arg ＝アルギニン Sar ＝ザルコシン Orn ＝オルニチン Ｚ ＝ベンジルオキシカルボニル BOC ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル Ac ＝アセチル For ＝ホルミル DMF ＝ジメチルホルムアミド MeOH ＝メタノール NEM ＝Ｎ−エチルモルホリン −PNA ＝ｐ−ニトロアニリド −CHA＝３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニ
リド TLC ＝薄層クロマトグラフイー GPC ＝ゲル濾過クロマトグラフイー AcOH ＝酢酸 BuOH ＝ｎ−ブタノール AcOEt ＝酢酸エチル Osu ＝サクシニツクイミド （注 アミノ酸は特にことわらなければＬ−体
を示す。） 薄層クロマトグラフイー TLC分析はシリカゲルF254（メルク製）プレー
トを使用。 溶媒は Rf1 ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：１ Rf2 ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：２ Rf3 ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：５ ゲル濾過には、東洋曹達工業株式会社のポリ
ビニールゲル、トヨパールＨ W40F（商品名）を使用した。 実施例 １ Ｚ−Ｄ−Lys（For）−Gly−Arg−CHA（PS−
2001）の合成 BOC−Arg−CHA・HCl BOC−Arg−OH・HCl・H2O381.1ｇ
（1.16mol）をDMF1392mlに溶解し、NEM151ml
を加え、これに−20℃にてイソブチルクロロホル
メート152.3mlを滴下する。10分間反応後、５−
アミノサリチル酸・塩酸塩219.8ｇ（1.16mol）と
NEM301.6mlのDMF928ml溶液を上記反応液に−
15〜−10℃にて滴下する。滴下後、同温度にて３
時間反応させ、さらに室温にて15時間反応させ
る。反応後、DMFを減圧留去し、残渣を
MeOH464mlとｎ−BuOH332mlに溶解する。
AcOH3300mlを加え、食塩を飽和させた冷５％塩
酸2160mlにて２回洗浄後、無水硫酸マグネシウム
にて乾燥する。乾燥後硫酸マグネシウムを濾別し
て溶媒を減圧留去すると、BOC−Arg−CHA・
HCl464.8ｇ（89.9％）を得る。 Rf1＝0.64 m.p.225.0℃（分解） 〔α〕20 D −10.7（ｃ＝１、MeOH） 元素分析 C26H50N5O9Cl Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 50.79 8.04 11.52 計算値 51.01 8.23 11.44 BOC−Gly−Arg−CHA・HCl BOC−Arg−CHA・HCl243.7ｇ（0.55mol）
を2N HCl／AcOH1093mlと少量のMeOHに溶解
して、１時間室温にて反応させる。反応終了後、
イソプロパノール1093mlを加え、AcOEt中に再
沈する。析出結晶を濾取・乾燥するとＨ−Arg−
CHA・2HCl 156.2ｇ（74.3％）を得る。 Rf3＝0.15 m.p.250.5℃（分解） 〔α〕20 D ＋53.5（ｃ＝１、M2O） 109.2ｇ（0.27mol）のＨ−Arg−CHA・2HCl
をDMF290mlに溶解させ、NEM70.2ml
（0.54mol）を加える。これに０〜５℃にてBOC
−Gly−OSu 81.7ｇ（0.3mol）を加え、室温にて
18時間反応させる。反応終了後、DMFを減圧留
去し、残渣をMeOH500mlに溶解して、AcOEt
８に再沈する。析出結晶を濾取、乾燥すると、
BOC−Gly−Arg−CHA・HCl 135.8ｇ（100％）
を得る。 Rf1＝0.46 m.p.214.5℃（分解） 〔α〕20 D −22（ｃ＝１、MeOH） 元素分析 C20H30N6O7・HCl・H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 46.55 6.80 16.15 計算値 46.11 6.39 16.13 Ｚ−Ｄ−Lys（For）−Gly−Arg−CHA・
HCl BOC−Gly−Arg−CHA・HCl 125.7ｇ
（0.25mol）を少量のMeOHに溶解後、2N HCl／
AcOH500ml（0.10mol）を加え、１時間室温にて
撹拌反応させる。反応終了後、エーテル4.5に
再沈し、析出結晶を濾取・乾燥するとＨ−Gly−
Arg−CHA・2HCl 109.8ｇ（100％）を得る。 Rf3＝0.09 m.p.219.5℃（分解） 〔α〕20 D −21.0（ｃ＝１、AcOH：H2O＝
１：１） 4.4ｇ（10mA）のＨ−Gly−Arg−CHA・
2HClを0.75NNEM／DMF20mlに溶解し、０〜５
℃に冷却撹拌しながらＺ−Ｄ−Lys（For）−
OSu8.1ｇ（20mmol）を加えて、室温にて15時間
反応させる。反応後、溶媒を減圧留去し、残渣を
メタノールに溶解してAcOEt800mlに再沈する。
析出結晶を濾取、乾燥すると粗製のＺ−Ｄ−Lys
（For）−Gly−Arg−CHA・HClを得、これを展
開溶媒がMeOHのトヨパールHW40Fカラムにて
精製すると3.6ｇ（52.2％）のＺ−Ｄ−Lys（For）
−Gly−Arg−CHA・HClを得る。 Rf1＝0.40 m.p.吸湿性 〔α〕20 D −13.6（ｃ＝0.5、AcOH：H2O＝
１：１ 元素分析 C30H40N8O9・HCl・2.5H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 48.50 6.18 15.60 計算値 48.74 6.28 15.18 実施例 ２ Ｚ−Ｄ−Lys−Gly−Arg−CHA（PS−2002）
の合成 Ｚ−Ｄ−Lys（BOC）−Gly−Arg−CHA・
HCl Ｈ−Gly−Arg−CHA・2HCl 8.8ｇ
（20mmol）をDMF21.5mlに溶解し、NEM5.1ml
（40mmol）を加える。これに０〜５℃にてＺ−
Ｄ−Lys（BOC）−OSu9.6ｇ（20mmol）を加え、
室温にて18時間反応させる。反応後DMFを減圧
留去し、残渣をMeOHに溶解してAcOEt １に
再沈する。析出結晶を濾取、乾燥するとＺ−Ｄ−
Lys（BOC）−Gly−Arg−CHA・HCl 14.9ｇ
（97.4％）を得る。 Rf1＝0.56 m.p.207.5℃（分解） 〔α〕20 D −8.0（ｃ＝0.5、MeOH） 元素分析 C34H48N8O10・HCl・1.5H2O Ｃ Ｎ Ｏ 測定値 51.64 6.81 13.61 計算値 51.54 6.62 14.14 Ｚ−Ｄ−Lys−Gly−Arg−CHA・2HCl Ｚ−Ｄ−Lys（BOC）−Gly−Arg−CHA・HCl
2.7ｇ（3.5mmol）を少量のMeOHに溶解し、こ
れに2NHCl／AcOH7mlを加え、室温にて１時間
反応させる。反応終了後、乾燥エーテルに再沈
し、析出結晶を濾取、乾燥すると粗製のＺ−Ｄ−
Lys−Gly−Arg−CHA・2HClを得る。これを展
開溶媒がMeOHのトヨパールHW40Fカラムにて
精製すると1.8ｇ（74.6％）のＺ−Ｄ−Lys−Gly
−Arg−CHA・2HClを得る。 Rf2＝0.31 m.p.220.0℃（分解） 〔α〕20 D −16.0（ｃ＝１、50％AcOH） 元素分析 C29H40O8N8・2HCl 2.2H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 47.08 5.89 14.94 計算値 46.99 6.28 15.12 実施例 ３ 同様な方法にて、下記の基質を合成した。
2222が6mmol／程度であるのに対して、CHA
系の新規基質は20mmol／以上の溶解性を有
し、界面活性剤、有機溶媒等の溶解補助剤を特に
必要としないため、試薬調整あるいは測定作にお
いて、非常に管理し易く、且つ反応に必要十分な
基質濃度を使用できるという長所を有している。 これ等のことは、本発明が第ａ因子用基質と
して極めて優れていることを示している。 本発明の化合物の用途は、すでに述べた通り第
ａ因子活性測定用の基質であるが、その場合、
当該基質をPH8.0〜8.7間の緩衝液中で第ａ因
子に作用させ、生成する３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシアニリンを適当な着色物に導き、これを
比色定量することにより第ａ因子活性を測定す
るが、このほかに励起328nm、螢光540nmにて螢
光分析法により、定量することもできる。 着色物に導く方法としては、ペンタアミンフエ
ロエート法やカプラーと酸化縮合させる法があ
る。カプラーとしては、酸性側での発色の場合
は、アニリン系化合物、例えば、Ｎ，Ｎ−ジエチ
ルアニリン、またアルカリ側では、フエノール、
ナフトール、チモール、ｏ−クレゾール、ｏ−エ
チルフエノール等が用いられる。 また、酸化縮合の酸化剤として、過酸化水素、
過硫酸塩等、種々のものが用いられるが、メタ過
ヨウ素酸が好適である。 ３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンを適
当な着色物に導くことにより、極大波長は560〜
770nm間に分布し、呈色の温度による変動は極め
て少く安定で、第ａ因子活性測定に適してい
る。さらに、発色感度を比べてみても、ｐ−ニト
ロアニリンの場合、一般測定波長405nmにてε＝
10600であるのに対し、ペンタアミンフエロエー
ト法ではλ＝700nmでε＝21500、酸化縮合によ
る発色においては、ｏ−エチルフエノールの場合
λ＝645nmでε＝29000、２，６−キシレノール
の場合λ＝615nmでε＝21600と極めて吸光度が
大きく、この点においても測定上極めて有利であ
る。 本発明の特徴の一つとして、生体試料中の夾雑
物による測定上の影響をほとんど受けないことが
あげられる。ｐ−ニトロアニリド系化合物におい
ては、560nm以下の波長で測定するのに対して、
本発明では560nm以上の波長で測定するため、試
料中の夾雑物の影響を受けず、基質本来の高特異
性とあわせて、正確な測定結果が得られる。 以上の通り本発明の化合物は、第ａ因子活性
測定用基質として、従来のものに比べて、非常に
優れていることが明らかである。 〔〕で表わされる本発明の化合物は、ペプチ
ド化学においてよく知られる方法により合成する
ことができる。 α−アミノ保護基としては、カルボベンゾキシ
またはｔ−ブチルオキシカルボニルまたは、それ
に関連する基、例えば、ｐ−メトキシカルボベン
ゾキシ、ｐ−ニトロカルボベンゾキシ、またはｐ
−メトキシフエニルアゾールカルボベンゾキシ等
を用いるのが有利である。 アルギニンのδ−グアニジル基の保護は、プロ
トン化で行うのが有利である。２個のアミノ酸カ
ツプリングまたはジペプチドとアミノ酸のカツプ
リングは、α−カルボキシル基の活性化により行
われる。例えば、Ｎ−ヒドロキシサクシニツクイ
ミド、ｐ−ニトロフエノール、トリクロロフエノ
ール、４，６−ジメチルピリミジル−２−チオー
ル等を用いることができる。前述のエステル誘導
体への活性化は、カルボジイミド、例えば、Ｎ，
Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）
の存在下で行うのが有利である。 基質合成は、最初発色基をアルギニル基に結合
させ、逐次的にカツプリングしていく方法によ
る。あるいは、Ｎ−末端ジペプチドフラグメント
自体を合成し、次いで、これを発色基を有するア
ルギニル基に結合してもよい。 本発明を以下実施例により詳細に説明するが、
本発明は、これら実施例に限定されるものではな
い。 略号 Lys ＝リジン Gly ＝グリシン Arg ＝アルギニン Sar ＝ザルコシン Orn ＝オルニチン Ｚ ＝ベンジルオキシカルボニル BOC ＝ｔ−ブチルオキシカルボニル Ac ＝アセチル For ＝ホルミル DMF ＝ジメチルホルムアミド MeOH ＝メタノール NEM ＝Ｎ−エチルモルホリン −PNA ＝ｐ−ニトロアニリド −CHA＝３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニ
リド TLC ＝薄層クロマトグラフイー GPC ＝ゲル濾過クロマトグラフイー AcOH ＝酢酸 BuOH ＝ｎ−ブタノール AcOEt ＝酢酸エチル Osu ＝サクシニツクイミド （注 アミノ酸は特にことわらなければＬ−体
を示す。） 薄層クロマトグラフイー TLC分析はシリカゲルF254（メルク製）プレー
トを使用。 溶媒は Rf1 ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：１ Rf2 ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：２ Rf3 ｎ−BuOH：AcOH：H2O＝４：１：５ ゲル濾過には、東洋曹達工業株式会社のポリ
ビニールゲル、トヨパールＨ W40F（商品名）を使用した。 実施例 １ Ｚ−Ｄ−Lys（For）−Gly−Arg−CHA（PS−
2001）の合成 BOC−Arg−CHA・HCl BOC−Arg−OH・HCl・H2O381.1ｇ
（1.16mol）をDMF1392mlに溶解し、NEM151ml
を加え、これに−20℃にてイソブチルクロロホル
メート152.3mlを滴下する。10分間反応後、５−
アミノサリチル酸・塩酸塩219.8ｇ（1.16mol）と
NEM301.6mlのDMF928ml溶液を上記反応液に−
15〜−10℃にて滴下する。滴下後、同温度にて３
時間反応させ、さらに室温にて15時間反応させ
る。反応後、DMFを減圧留去し、残渣を
MeOH464mlとｎ−BuOH332mlに溶解する。
AcOH3300mlを加え、食塩を飽和させた冷５％塩
酸2160mlにて２回洗浄後、無水硫酸マグネシウム
にて乾燥する。乾燥後硫酸マグネシウムを濾別し
て溶媒を減圧留去すると、BOC−Arg−CHA・
HCl464.8ｇ（89.9％）を得る。 Rf1＝0.64 m.p.225.0℃（分解） 〔α〕20 D −10.7（ｃ＝１、MeOH） 元素分析 C26H50N5O9Cl Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 50.79 8.04 11.52 計算値 51.01 8.23 11.44 BOC−Gly−Arg−CHA・HCl BOC−Arg−CHA・HCl243.7ｇ（0.55mol）
を2N HCl／AcOH1093mlと少量のMeOHに溶解
して、１時間室温にて反応させる。反応終了後、
イソプロパノール1093mlを加え、AcOEt中に再
沈する。析出結晶を濾取・乾燥するとＨ−Arg−
CHA・2HCl 156.2ｇ（74.3％）を得る。 Rf3＝0.15 m.p.250.5℃（分解） 〔α〕20 D ＋53.5（ｃ＝１、M2O） 109.2ｇ（0.27mol）のＨ−Arg−CHA・2HCl
をDMF290mlに溶解させ、NEM70.2ml
（0.54mol）を加える。これに０〜５℃にてBOC
−Gly−OSu 81.7ｇ（0.3mol）を加え、室温にて
18時間反応させる。反応終了後、DMFを減圧留
去し、残渣をMeOH500mlに溶解して、AcOEt
８に再沈する。析出結晶を濾取、乾燥すると、
BOC−Gly−Arg−CHA・HCl 135.8ｇ（100％）
を得る。 Rf1＝0.46 m.p.214.5℃（分解） 〔α〕20 D −22（ｃ＝１、MeOH） 元素分析 C20H30N6O7・HCl・H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 46.55 6.80 16.15 計算値 46.11 6.39 16.13 Ｚ−Ｄ−Lys（For）−Gly−Arg−CHA・
HCl BOC−Gly−Arg−CHA・HCl 125.7ｇ
（0.25mol）を少量のMeOHに溶解後、2N HCl／
AcOH500ml（0.10mol）を加え、１時間室温にて
撹拌反応させる。反応終了後、エーテル4.5に
再沈し、析出結晶を濾取・乾燥するとＨ−Gly−
Arg−CHA・2HCl 109.8ｇ（100％）を得る。 Rf3＝0.09 m.p.219.5℃（分解） 〔α〕20 D −21.0（ｃ＝１、AcOH：H2O＝
１：１） 4.4ｇ（10mA）のＨ−Gly−Arg−CHA・
2HClを0.75NNEM／DMF20mlに溶解し、０〜５
℃に冷却撹拌しながらＺ−Ｄ−Lys（For）−
OSu8.1ｇ（20mmol）を加えて、室温にて15時間
反応させる。反応後、溶媒を減圧留去し、残渣を
メタノールに溶解してAcOEt800mlに再沈する。
析出結晶を濾取、乾燥すると粗製のＺ−Ｄ−Lys
（For）−Gly−Arg−CHA・HClを得、これを展
開溶媒がMeOHのトヨパールHW40Fカラムにて
精製すると3.6ｇ（52.2％）のＺ−Ｄ−Lys（For）
−Gly−Arg−CHA・HClを得る。 Rf1＝0.40 m.p.吸湿性 〔α〕20 D −13.6（ｃ＝0.5、AcOH：H2O＝
１：１ 元素分析 C30H40N8O9・HCl・2.5H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 48.50 6.18 15.60 計算値 48.74 6.28 15.18 実施例 ２ Ｚ−Ｄ−Lys−Gly−Arg−CHA（PS−2002）
の合成 Ｚ−Ｄ−Lys（BOC）−Gly−Arg−CHA・
HCl Ｈ−Gly−Arg−CHA・2HCl 8.8ｇ
（20mmol）をDMF21.5mlに溶解し、NEM5.1ml
（40mmol）を加える。これに０〜５℃にてＺ−
Ｄ−Lys（BOC）−OSu9.6ｇ（20mmol）を加え、
室温にて18時間反応させる。反応後DMFを減圧
留去し、残渣をMeOHに溶解してAcOEt １に
再沈する。析出結晶を濾取、乾燥するとＺ−Ｄ−
Lys（BOC）−Gly−Arg−CHA・HCl 14.9ｇ
（97.4％）を得る。 Rf1＝0.56 m.p.207.5℃（分解） 〔α〕20 D −8.0（ｃ＝0.5、MeOH） 元素分析 C34H48N8O10・HCl・1.5H2O Ｃ Ｎ Ｏ 測定値 51.64 6.81 13.61 計算値 51.54 6.62 14.14 Ｚ−Ｄ−Lys−Gly−Arg−CHA・2HCl Ｚ−Ｄ−Lys（BOC）−Gly−Arg−CHA・HCl
2.7ｇ（3.5mmol）を少量のMeOHに溶解し、こ
れに2NHCl／AcOH7mlを加え、室温にて１時間
反応させる。反応終了後、乾燥エーテルに再沈
し、析出結晶を濾取、乾燥すると粗製のＺ−Ｄ−
Lys−Gly−Arg−CHA・2HClを得る。これを展
開溶媒がMeOHのトヨパールHW40Fカラムにて
精製すると1.8ｇ（74.6％）のＺ−Ｄ−Lys−Gly
−Arg−CHA・2HClを得る。 Rf2＝0.31 m.p.220.0℃（分解） 〔α〕20 D −16.0（ｃ＝１、50％AcOH） 元素分析 C29H40O8N8・2HCl 2.2H2O Ｃ Ｈ Ｎ 測定値 47.08 5.89 14.94 計算値 46.99 6.28 15.12 実施例 ３ 同様な方法にて、下記の基質を合成した。
【表】
【表】
実施例 ４
新規に合成した基質の特異性を各酵素と反応さ
せることにより試験した。 １ 基質液：2mmol／ H2O ２ 緩衝液：トリス、NaCl、CaC2の各濃度およ
び反応、PHは酵素により次の通りとした
せることにより試験した。 １ 基質液：2mmol／ H2O ２ 緩衝液：トリス、NaCl、CaC2の各濃度およ
び反応、PHは酵素により次の通りとした
【表】
３ 使用酵素
【表】
４ 反応停止液（PNA）：10％−酢酸
５ 発色試薬（CHA）：ペンタアミンフエロエー
ト 測定法： 緩衝液0.3mlと酵素試薬0.1mlをシリコン処理硬
質ガラス製試験管又は、プラスチツク製試験管に
採取し、37℃恒温槽中にて５分間予加温する。次
いで基質液0.1mlを加えて酵素反応を37℃５分間
実施する。正確に５分後、反応停止液、または停
止発色試薬2.0mlを加えて酵素反応を停止後、続
いて37℃で10分間放置後405nmまたは700nmの吸
光度を測定する。 結果を第２表に示す。
ト 測定法： 緩衝液0.3mlと酵素試薬0.1mlをシリコン処理硬
質ガラス製試験管又は、プラスチツク製試験管に
採取し、37℃恒温槽中にて５分間予加温する。次
いで基質液0.1mlを加えて酵素反応を37℃５分間
実施する。正確に５分後、反応停止液、または停
止発色試薬2.0mlを加えて酵素反応を停止後、続
いて37℃で10分間放置後405nmまたは700nmの吸
光度を測定する。 結果を第２表に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式 〔式中、 ｎは３〜４であり、 R1は−Ｈまたは【式】であり、 R2は−Ｈまたは−CH3であり、 R3は【式】 であり、 R4は−Ｈ、−CH3または【式】であり、 そして R5は【式】（R6は−Ｈである） である〕 で表わされる化合物またはその塩であることを特
徴とする、第ａ因子及び第ａ因子様酵素に対
して発色性又は蛍光性を有する新規な第ａ因子
測定用基質。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59098355A JPS60241900A (ja) | 1984-05-16 | 1984-05-16 | 新規な第Ｘａ因子活性測定用基質 |
| US06/732,396 US4622389A (en) | 1984-05-16 | 1985-05-09 | Novel substrate for determining the activity of blood coagulation factor Xa (Stuart-Prower factor) |
| EP85105988A EP0170797B1 (en) | 1984-05-16 | 1985-05-15 | Novel substrate for determining the activity of blood coagulation factor xa (stuart-prower factor) |
| DE8585105988T DE3560635D1 (en) | 1984-05-16 | 1985-05-15 | Novel substrate for determining the activity of blood coagulation factor xa (stuart-prower factor) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59098355A JPS60241900A (ja) | 1984-05-16 | 1984-05-16 | 新規な第Ｘａ因子活性測定用基質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60241900A JPS60241900A (ja) | 1985-11-30 |
| JPH0411199B2 true JPH0411199B2 (ja) | 1992-02-27 |
Family
ID=14217579
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59098355A Granted JPS60241900A (ja) | 1984-05-16 | 1984-05-16 | 新規な第Ｘａ因子活性測定用基質 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4622389A (ja) |
| EP (1) | EP0170797B1 (ja) |
| JP (1) | JPS60241900A (ja) |
| DE (1) | DE3560635D1 (ja) |
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| US4946775A (en) * | 1985-09-05 | 1990-08-07 | Yin E Thye | Composition, kit and method for assaying heparin and a method for making the composition |
| US4948724A (en) * | 1985-09-05 | 1990-08-14 | Yin E Thye | Composition, kit and method for assaying heparin and a method for making the composition |
| JPS62126197A (ja) * | 1985-11-26 | 1987-06-08 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規な血漿キニノゲナーゼ測定用化合物 |
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| SE8601327D0 (sv) * | 1986-03-21 | 1986-03-21 | Kabivitrum Ab | Nya peptidderivat |
| US4784940A (en) * | 1987-06-26 | 1988-11-15 | Mesa Medical, Inc. | Quantitation of cancer procoagulant activity in serum |
| US5023236A (en) * | 1988-04-07 | 1991-06-11 | Corvas, Inc. | Factor VII/VIIA active site inhibitors |
| US5187155A (en) * | 1989-06-23 | 1993-02-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Anticoagulant peptides |
| JP3041457B2 (ja) * | 1989-08-17 | 2000-05-15 | バクスター ダイアグノスティックス インコーポレーテッド | 因子ｉｘ発色アッセイ |
| US5308755A (en) * | 1992-06-08 | 1994-05-03 | Research Corporation Technologies, Inc. | Method for measuring heparin |
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| US6379975B1 (en) | 1996-11-27 | 2002-04-30 | T.A.C. Thrombosis And Coagulation Aktiebolag | Methods and reagents for determining protein S |
| NL1006429C2 (nl) * | 1997-06-27 | 1998-12-29 | Univ Maastricht | Werkwijze voor het bepalen van het heparinegehalte. |
| US6855509B2 (en) * | 2000-12-19 | 2005-02-15 | Instrumentation Laboratory Company | Protein S functional assay and kit therefor |
| GB2485590A (en) * | 2010-11-22 | 2012-05-23 | Univ Ruprecht Karis Heidelberg | Method for detecting at least one direct factor Xa inhibitors |
| AU2012254169B2 (en) | 2011-02-25 | 2016-02-25 | Wellstat Diagnostics, Llc | Assays for detecting enzymatic activity |
| WO2017059060A1 (en) * | 2015-09-30 | 2017-04-06 | The Johns Hopkins University | Salicylic acid-based polymeric cest contrast agents targeting prostate-specific membrane antigen and uses thereof |
Family Cites Families (4)
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|---|---|---|---|---|
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| CA1161432A (en) * | 1980-02-12 | 1984-01-31 | Lars G. Svendsen | Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes |
| JPS5856695A (ja) * | 1981-09-28 | 1983-04-04 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なトロンビン測定用基質 |
| JPS5863399A (ja) * | 1981-10-14 | 1983-04-15 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なプラスミン測定用基質 |
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1984
- 1984-05-16 JP JP59098355A patent/JPS60241900A/ja active Granted
-
1985
- 1985-05-09 US US06/732,396 patent/US4622389A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-15 EP EP85105988A patent/EP0170797B1/en not_active Expired
- 1985-05-15 DE DE8585105988T patent/DE3560635D1/de not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4622389A (en) | 1986-11-11 |
| JPS60241900A (ja) | 1985-11-30 |
| EP0170797A1 (en) | 1986-02-12 |
| EP0170797B1 (en) | 1987-09-16 |
| DE3560635D1 (en) | 1987-10-22 |
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