JPH0759598A - ナトリウムイオンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 正確、簡便かつ安定でナトリウムイオンの測
定濃度領域も広いナトリウムイオンの定量方法を提供す
る。 【構成】 試料中のナトリウムイオンをβ−ガラクトシ
ダーゼを用いて定量する方法において、１，２−シクロ
ヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、エチ
レンジアミン四酢酸、トリエチレンテトラミン六酢酸、
ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五
酢酸、１，３−ジアミノプロパン−２−オール−Ｎ，
Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′
−二プロピオン酸二塩酸塩、エチレンジアミンテトラキ
ス（メチレンスルホン酸）、イミノ二酢酸、ヒドロキシ
イミノ二酢酸およびニトリロ三酢酸からなる群から選ば
れる少なくとも一種のキレート剤の存在下にβ−ガラク
トシダーゼ反応を行うことを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、キレート剤の存在下に
β−ガラクトシダーゼ反応を用いるナトリウムイオンの
定量方法に関する。本発明は臨床検査等に用いられる。

【０００２】

【従来の技術】生体試料中のナトリウムイオンを、ナト
リウムイオン量と比例して活性が増加するβ−ガラクト
シダーゼ反応を用いて定量する方法において、該酵素反
応が過剰のナトリウムで飽和するのを防止するため、
０．２〜５ｍＭのクリプトフィクス２２１（商標名）を
添加して用いる定量法が知られている〔クリニカルケミ
ストリー，３４巻，２２９５頁，１９８８年〕。β−ガ
ラクトシダーゼ反応を用いる該定量法において、クリプ
トフィクス２２１の代わりにリチウムイオンまたは少量
のエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテ
ル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＥＧＴＡ）のリチ
ウム塩を用いる方法が示されている（特表平１−５０３
５９６号公報）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】β−ガラクトシダーゼ
を用いるナトリウムイオンの定量法で、従来用いられる
結合試薬のクリプタンド、クラウンエーテル等は高価で
あるうえ、β−ガラクトシダーゼの安定性を損なうこと
が指摘されている。さらにクリプタンドについては、ナ
トリウムイオンとの反応速度が小さいため定常状態に到
達する時間が長く、迅速な測定が難しいこともあって、
分析の精度が低いことが指摘されている。さらにこれら
公知の結合試薬およびリチウムイオンを用いる方法は、
ナトリウムイオンの定量可能濃度範囲がせまく、検量線
の直線性も非常に悪いため特殊な演算が可能な分析装置
を必要とする。

【０００４】本発明は、エチレンジアミン四酢酸等のキ
レート剤を用いることにより、安定性および精度が優れ
たナトリウムイオンの定量法を提供する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】一般に、酵素反応におい
てエチレンジアミン四酢酸等のキレート剤が多量に存在
すると、酵素反応の阻害、酵素の安定性の低下、定量値
の再現性の低下が生じることが知られており、酵素反応
を用いた定量法に多量のキレート剤を添加することは、
定量精度の低下を招くものとされていた。本発明は、β
−ガラクトシダーゼを用いる酵素反応においては多量の
キレート剤を共存させても、酵素反応の阻害あるいは酵
素の安定性の低下が生ぜず、検量線の直線性が良好にな
り定量の精度が向上するとの、従来の当業者の常識とは
異なる新たな知見のもとに見いだされた。

【０００６】すなわち、本発明により、試料中のナトリ
ウムイオンをβ−ガラクトシダーゼを用いて定量する方
法において、特定のキレート剤の存在下にβ−ガラクト
シダーゼ反応を行うことを特徴とする方法を提供するこ
とができる。

【０００７】本発明においてキレート剤としては、１，
２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四
酢酸（ＣｙＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴ
Ａ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、ジ
エチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″−五酢
酸（ＤＴＰＡ）、１，３−ジアミノプロパン−２−オー
ル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、
エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ′−二プロピオン酸二塩酸塩
（ＥＤＤＰ）、エチレンジアミンテトラキス（メチレン
スルホン酸）〔ＥＤＴＰＯ〕、イミノ二酢酸（ＩＤ
Ａ）、ヒドロキシイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ニトリロ
三酢酸（ＮＴＰ）およびこれらの組み合わせから選ばれ
る少なくとも一種のキレート剤を示し、通常１〜５００
ｍＭの濃度で用いられる。より好ましくは、ＣｙＤＴＡ
を２〜４００ｍＭ、ＥＤＴＡを２５〜４００ｍＭ、ＴＴ
ＨＡを２５〜４００ｍＭ、ＤＴＰＡを１０〜４００ｍＭ
の濃度で用いることができる。

【０００８】ナトリウムイオンを含む試料とは、水性媒
体に混和する試料であればどのようなものでもよいが、
全血、細胞等、原子吸光法、炎光光度法等では測定しに
くい生体中の試料についても測定できる。

【０００９】本発明におけるβ−ガラクトシダーゼを用
いてナトリウムイオンを定量する方法とは、固相および
液相、好ましくは水性媒体中でβ−ガラクトシダーゼと
β−ガラクトシダーゼの基質を反応させ、反応液中で減
少するβ−ガラクトシダーゼの基質量、又は増加するβ
−ガラクトシダーゼ反応の生成物量を測定することによ
りβ−ガラクトシダーゼ活性を測定し、該活性に対応す
るナトリウムイオン量を算出する方法である。

【００１０】水性媒体とは、緩衝液、生理食塩水等水を
含有する液体を示し、緩衝液としては、トリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液、リン酸緩衝
液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、シュウ酸緩衝液、フ
タル酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、バルビ
タール緩衝液またはグッド（ＧＯＯＤ）の緩衝液等があ
げられる。

【００１１】本発明におけるβ−ガラクトシダーゼとは
酵素番号〔ＥＣ．３．２．１．２３〕に属する酵素であ
ればよく、動物、微生物または植物から採取したβ−ガ
ラクトシダーゼあるいはそれらを遺伝子工学により改変
し製造した酵素が含まれる。

【００１２】β−ガラクトシダーゼの基質とは、合成品
あるいは天然物のいずれでもよく、例えば、β−Ｄ−ガ
ラクトシド、アリール−β−Ｄ−ガラクトシド、アルキ
ル−β−Ｄ−ガラクトシド、３，６−ジヒドロキシフル
オラン−β−Ｄ−ガラクトシド、ニトロフェニル−β−
Ｄ−ピラノグリコシド、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラ
クトシド、２−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシ
ド、ラクチノール、ラクトース、４−メチルウムベリフ
ェリル−β−Ｄ−ガラクトシド等があげられる。またβ
−ガラクトシダーゼの活性化剤として、硫酸マグネシウ
ム、塩化マグネシウム、硝酸マグネシウム等を用いても
よい。

【００１３】反応液中で減少するβ−ガラクトシダーゼ
の基質量の変化は、前述の例えば、ニトロフェニルエス
テル等の基質の減少を吸光光度法等で測定することによ
り求めることができる。

【００１４】反応液中で生成するβ−ガラクトシダーゼ
反応生成物の量は、例えば前述の基質から、β−ガラク
トシダーゼ反応により生成するガラクトース、アグリコ
ン部、３，６−ジヒドロキシフルオラン、ニトロフェノ
ール等を比色法、吸光光度法、蛍光光度法、酸化還元測
定法、高速液体クロマトグラフィー法等で測定すること
により求めることができる。また、該酵素反応をガラク
トースデヒドロゲナーゼ等と共役させて、生成する還元
型補酵素量を定量してもよい。

【００１５】以下に本発明の測定法を説明する。好まし
くは、ｐＨ５．０〜１０．０に調整された緩衝液（５０
〜１０００ｍＭ溶液）中に、キレート剤および試料を加
える。該反応液にβ−ガラクトシダーゼの基質およびβ
−ガラクトシダーゼを添加してβ−ガラクトシダーゼ反
応を行うが、β−ガラクトシダーゼおよびβ−ガラクト
シダーゼの基質の添加方法は任意である。例えば、最初
から上述のβ−ガラクトシダーゼの基質（２５０μＭ〜
６０ｍＭ）を加えているときは、後から上述のβ−ガラ
クトシダーゼ（２５Ｕ／ｌ〜３０ＫＵ／ｌ）を添加し、
最初からβ−ガラクトシダーゼ（２５０Ｕ／ｌ〜６０Ｋ
Ｕ／ｌ）を加えているときは、後からβ−ガラクトシダ
ーゼの基質（２５０μＭ〜６０ｍＭ）を添加する。β−
ガラクトシダーゼ反応は８〜５０℃で行う。反応液中で
減少するβ−ガラクトシダーゼの基質量を上述の方法に
より測定するかまたは、反応液中で増加するβ−ガラク
トシダーゼ反応の生成物量を上述の方法により測定し、
β−ガラクトシダーゼ反応で消費された基質量を測定す
る。当該酵素反応においては、反応で消費された基質量
と試料中のナトリウム量が対応するので、当該測定法に
よりナトリウムの定量を行うことができる。

【００１６】本発明方法を実施する際、反応液の濁りの
発生防止等のため、必要に応じてトリトンＸ−１００等
の界面活性剤を加えることができる。また必要に応じ
て、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミ
ン（ＨＳＡ）、ヒト免疫グロブリン、卵白アルブミン等
のタンパク質、ジメチルスルホキシド等の可溶化剤、ジ
チオスレイトール等の抗酸化剤、硫酸マグネシウム等の
活性化剤を添加することも可能である。

【００１７】以下に本発明の実施例を示すが本発明はこ
れに限定されるものではない。

【００１８】

【実施例】

実施例１ （１）ナトリウム検量線用標準液の作成 塩化ナトリウム（和光純薬工業製）を蒸留水で希釈し、
０，１０，２０，２５，５０，７５，１００，１１５，
１２０，１２５，１３０，１３５，１４０，１４５，１
５０，１５５，１６０，１６５，１７０，１７５，１８
０，２００ｍＭのナトリウム検量線標準液を調製した。 （２）ナトリウムの定量 サンプルカップにナトリウム検量線標準液又は、血清を
添加（１回測定につき４μｌ）した後、第１試薬とし
て、ＤＬ−ジチオスレイトール（シグマ社製）５ｍＭ、
硫酸マグネシウム（関東化学製）１１ｍＭ、β−ガラク
トシダーゼ（シグマ社製）４０００Ｕ／ｌ、ＥＤＴＡ・
４Ｈ（同仁化学製）３０．７ｍＭを含むトリス塩酸緩衝
液（ＰＨ７．７５）４４０ｍＭ（１回測定につき、３０
０μｌ）を加え３７℃で５分間反応させた。次に第２試
薬として、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド（東京化成製）１５ｍＭを含む蒸留水（１回測定
につき、１００μｌ）を加え、３７℃で反応させた。１
分間に生成するｐ−ニトロフェニル量を、４０５ｎｍの
可視部の吸光度を測定（日立７２５０自動分析装置）す
ることにより求めた。得られた検量線を図１に示す。

【００１９】実施例２ （２）ＥＤＴＡを用いたナトリウムイオンの定量 １０、２０、２５、５０、１００、２００、３００、４
００、４１０、４５０ｍＭの各種濃度のＥＤＴＡを用い
る以外は、実施例１と同様の方法により、ナトリウムイ
オンの検量線を得た。得られた検量線の１次関数の回帰
式による相関係数を求め第１表に示した。

【００２０】

【表１】

【００２１】第１表によれば、２５〜４００ｍＭのＥＤ
ＴＡを用いたときに相関係数が０．９５を越え信頼でき
る定量値が得られることが示された。

【００２２】実施例３ （３）ＣｙＤＴＡを用いたナトリウムイオンの定量 １、２、１０、５０、１００、２００、３００、４０
０、４１０、４５０ｍＭの各種濃度のＣｙＤＴＡを用い
る以外は実施例２と同様の方法により、ナトリウムイオ
ンの検量線の１次関数の回帰式による相関係数を求め第
２表に示した。

【００２３】

【表２】

【００２４】第２表によれば、２〜４００ｍＭのＣｙＤ
ＴＡを用いたときに相関係数が０．９５を越え、信頼で
きる定量値が得られることが示された。

【００２５】実施例４ （２）ＴＴＨＡを用いたナトリウムイオンの定量 １０、２０、２５、５０、１００、２００、３００、４
００、４１０、４５０ｍＭの各種濃度のＴＴＨＡを用い
る以外は、実施例２と同様の方法により、ナトリウムイ
オンの検量線の１次関数の回帰式による相関係数を求め
第３表に示した。

【００２６】

【表３】

【００２７】第３表によれば、２５〜４００ｍＭのＴＴ
ＨＡを用いたときに相関係数が０．９５を越え、信頼で
きる定量値が得られることが示された。

【００２８】実施例５ ＤＴＰＡ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＥＤＤＰ、ＥＤＴＰＯ、Ｉ
ＤＡ、ＨＩＤＡ、ＮＴＰまたは比較対照としてのＥＧＴ
Ａ各３０ｍＭをＥＤＴＡの代わりに用いる以外は実施例
２と同様の方法にして、各キレート剤のナトリウムイオ
ンの検量線の１次関数の回帰式による相関係数を求め
た。結果を第４表に示した。

【００２９】

【表４】

【００３０】第４表によれば、上記キレート剤を用いた
ナトリウムイオンの検量線の相関係数は、対照と比較す
ると高い値を示した。

【００３１】

【発明の効果】本発明の、特定のキレート剤を用いるこ
とにより、正確、簡便かつ安定でナトリウムイオンの測
定濃度領域も広いナトリウムイオンの定量方法が提供さ
れる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ナトリウムイオンの検量線。

【符号の説明】

─●─ ＥＤＴＡ添加 ─○─ ＥＤＴＡ無添加

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 試料中のナトリウムイオンをβ−ガラク
   トシダーゼを用いて定量する方法において、１，２−シ
   クロヘキサンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、
   エチレンジアミン四酢酸、トリエチレンテトラミン六酢
   酸、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ″，Ｎ″
   −五酢酸、１，３−ジアミノプロパン−２−オール−
   Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、エチレンジアミン−Ｎ，
   Ｎ′−二プロピオン酸二塩酸塩、エチレンジアミンテト
   ラキス（メチレンスルホン酸）、イミノ二酢酸、ヒドロ
   キシイミノ二酢酸およびニトリロ三酢酸からなる群から
   選ばれる少なくとも一種のキレート剤の存在下にβ−ガ
   ラクトシダーゼ反応を行うことを特徴とする方法。