JPH0759598B2 - ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法 - Google Patents
ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法Info
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- JPH0759598B2 JPH0759598B2 JP61031512A JP3151286A JPH0759598B2 JP H0759598 B2 JPH0759598 B2 JP H0759598B2 JP 61031512 A JP61031512 A JP 61031512A JP 3151286 A JP3151286 A JP 3151286A JP H0759598 B2 JPH0759598 B2 JP H0759598B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ この発明は医薬として有用なヒトインスリン様成長因子
Ｉ（以下、IGF−Ｉと称する）の新規な製造法に関す
る。
Ｉ（以下、IGF−Ｉと称する）の新規な製造法に関す
る。
［従来の技術］ IGF−Ｉは公知の化合物であり、その一次構造はハンベ
ル（R.E.Humbel）らによって下記の通りであると報告さ
れている。［ティ・エル・ブリュンデル、エス・ベダル
カル、イー・リンデルクネヒトおよびアール・イー・ハ
ンベル：プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエー、
第75巻、第180頁〜第184頁（1978年発行）（T.L.Blunde
ll,S.Bedarkar,E.Rinderknecht and R.E.Humbel:Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,75,180-184（1978））、およびイー
・リンデルクネヒトおよびアール・イー・ハンベル：ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第25
3巻、第2769頁（1978年発行）（E.Rinderknecht and R.
E.Humbel:J.Biol.Chem.253,2769（1978）］ （式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラ
ギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇ
はグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｋはリシン、Ｌはロイ
シン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリ
ン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔ
はトレオニン、Ｖはバリン、Ｙはチロシンをそれぞれ意
味し、ＣとＣを結ぶ３本の実線は−Ｓ−Ｓ−結合を意味
する） ハンベルらはヒトの血液から上記の一次構造を有するIG
F−Ｉを単離し、その構造を決定したが、この発明の発
明者らは遺伝子組換え法により得たIGF−Ｉをアミノ酸
配列： （式中、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、
Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹは前と同じ意味で
ある） を有する還元型IGF−Ｉとして単離し、得られた還元型I
GF−Ｉを酸化して酸化型IGF−Ｉを得た。すなわち、還
元型IGF−ＩとはIGF−Ｉ内の３対のシステイン相互の−
Ｓ−Ｓ−結合が切断されて、直鎖状のIGF−Ｉとなった
ものであるが、この還元型IGF−Ｉを酸化して酸化型IGF
−Ｉ、すなわち３対の−Ｓ−Ｓ−結合を有するIGF−Ｉ
に導く過程で、この発明の発明者らは、ハンベルらとは
異なった一次構造を有するIGF−Ｉを見出した。
ル（R.E.Humbel）らによって下記の通りであると報告さ
れている。［ティ・エル・ブリュンデル、エス・ベダル
カル、イー・リンデルクネヒトおよびアール・イー・ハ
ンベル：プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユーエスエー、
第75巻、第180頁〜第184頁（1978年発行）（T.L.Blunde
ll,S.Bedarkar,E.Rinderknecht and R.E.Humbel:Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,75,180-184（1978））、およびイー
・リンデルクネヒトおよびアール・イー・ハンベル：ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第25
3巻、第2769頁（1978年発行）（E.Rinderknecht and R.
E.Humbel:J.Biol.Chem.253,2769（1978）］ （式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラ
ギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇ
はグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｋはリシン、Ｌはロイ
シン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリ
ン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔ
はトレオニン、Ｖはバリン、Ｙはチロシンをそれぞれ意
味し、ＣとＣを結ぶ３本の実線は−Ｓ−Ｓ−結合を意味
する） ハンベルらはヒトの血液から上記の一次構造を有するIG
F−Ｉを単離し、その構造を決定したが、この発明の発
明者らは遺伝子組換え法により得たIGF−Ｉをアミノ酸
配列： （式中、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、
Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹは前と同じ意味で
ある） を有する還元型IGF−Ｉとして単離し、得られた還元型I
GF−Ｉを酸化して酸化型IGF−Ｉを得た。すなわち、還
元型IGF−ＩとはIGF−Ｉ内の３対のシステイン相互の−
Ｓ−Ｓ−結合が切断されて、直鎖状のIGF−Ｉとなった
ものであるが、この還元型IGF−Ｉを酸化して酸化型IGF
−Ｉ、すなわち３対の−Ｓ−Ｓ−結合を有するIGF−Ｉ
に導く過程で、この発明の発明者らは、ハンベルらとは
異なった一次構造を有するIGF−Ｉを見出した。
その一次構造は、式 （式中、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、
Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹならびにＣとＣを
結ぶ３本の実線はそれぞれ前と同じ意味である。） で表わされ、その生物学的性質もハンベルらによって単
離されたものと異なることが判明した。
Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹならびにＣとＣを
結ぶ３本の実線はそれぞれ前と同じ意味である。） で表わされ、その生物学的性質もハンベルらによって単
離されたものと異なることが判明した。
この明細書では、ハンベルらが単離した式（Ｉ−ａ）で
表わされる一次構造を有するIGF−Ｉを酸化型IGF−Ｉ
（Ａ型）と称し、この発明の発明者らが新しく見出した
式（Ｉ−ｂ）で表わされる一次構造を有するIGF−Ｉを
酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）と称することにする。
表わされる一次構造を有するIGF−Ｉを酸化型IGF−Ｉ
（Ａ型）と称し、この発明の発明者らが新しく見出した
式（Ｉ−ｂ）で表わされる一次構造を有するIGF−Ｉを
酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）と称することにする。
この発明は、遺伝子組換え法などにより得られる還元型
IGF−Ｉを酸化して酸化型IGF−Ｉに導く際に、ヒトの血
液由来のIGF−Ｉと同じ一次構造を持ち、ヒトに投与す
る際により自然に受け入れられると思われる酸化型IGF
−Ｉ（Ａ型）をより多く、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）をよ
り少く得るIGF−Ｉの製造法を確立することを目的とし
て、この発明の発明者らが鋭意研究した結果完成された
ものである。
IGF−Ｉを酸化して酸化型IGF−Ｉに導く際に、ヒトの血
液由来のIGF−Ｉと同じ一次構造を持ち、ヒトに投与す
る際により自然に受け入れられると思われる酸化型IGF
−Ｉ（Ａ型）をより多く、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）をよ
り少く得るIGF−Ｉの製造法を確立することを目的とし
て、この発明の発明者らが鋭意研究した結果完成された
ものである。
［問題点を解決するための手段］ この発明は還元型IGF−Ｉを緩衝液中で酸化する際に該
緩衝液に溶解性を有する有機溶媒を共存させることを特
徴とするが、さらに詳細には、還元型IGF−Ｉを緩衝液
中に溶解放置し、緩衝液中に存在する酸素にて酸化させ
る際に、該緩衝液に溶解性を有する有機溶媒を共存させ
ることを特徴とするものである。
緩衝液に溶解性を有する有機溶媒を共存させることを特
徴とするが、さらに詳細には、還元型IGF−Ｉを緩衝液
中に溶解放置し、緩衝液中に存在する酸素にて酸化させ
る際に、該緩衝液に溶解性を有する有機溶媒を共存させ
ることを特徴とするものである。
この発明の方法を実施するには、還元型IGF−Ｉを緩衝
液中に溶解させる必要があり、そのためには還元型IGF
−Ｉをまずグアニジン溶液に溶解させるなど、この分野
で通常行われている常套手段を用いることができる。
液中に溶解させる必要があり、そのためには還元型IGF
−Ｉをまずグアニジン溶液に溶解させるなど、この分野
で通常行われている常套手段を用いることができる。
かくして得られたIGF−Ｉの溶液は、次いで例えばトリ
ス・塩酸緩衝液のような通常用いられる緩衝液で希釈さ
れるが、その際にこの発明の方法では該緩衝液に溶解性
を有する有機溶媒を共存させる。
ス・塩酸緩衝液のような通常用いられる緩衝液で希釈さ
れるが、その際にこの発明の方法では該緩衝液に溶解性
を有する有機溶媒を共存させる。
ここで用いられる有機溶媒としては該緩衝液に溶解する
ものであれば特に限定されず、例えばメタノール、エタ
ノール、プロパノール、イソプロピルアルコールなどの
水溶性の高い低級アルコール、アセトニトリル、ジメチ
ルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどがその好ま
しい例として挙げられる。
ものであれば特に限定されず、例えばメタノール、エタ
ノール、プロパノール、イソプロピルアルコールなどの
水溶性の高い低級アルコール、アセトニトリル、ジメチ
ルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどがその好ま
しい例として挙げられる。
なお、還元型IGF−Ｉを溶解する際も緩衝液を添加する
のが好ましい。また還元型IGF−Ｉを溶解希釈するため
の緩衝液のpHは好ましくは７以上、さらに好ましくは７
〜９である。反応系に共存させる有機溶媒の量は特に限
定されず、好ましくは20〜60％、より好ましくは30〜46
％である。
のが好ましい。また還元型IGF−Ｉを溶解希釈するため
の緩衝液のpHは好ましくは７以上、さらに好ましくは７
〜９である。反応系に共存させる有機溶媒の量は特に限
定されず、好ましくは20〜60％、より好ましくは30〜46
％である。
酸化反応は、かくして得られた還元型IGF−Ｉの希釈液
を冷却下ないし室温下、場合によっては約40℃以下の加
温下で放置することによって、緩衝液中に溶解している
酸素による酸化反応として進行する。また、酸化−還元
グルタチオン系のようなこの分野で通常用いられる適当
な酸化系を用いてもよい。
を冷却下ないし室温下、場合によっては約40℃以下の加
温下で放置することによって、緩衝液中に溶解している
酸素による酸化反応として進行する。また、酸化−還元
グルタチオン系のようなこの分野で通常用いられる適当
な酸化系を用いてもよい。
かくして得られた酸化型IGF−Ｉは、有機溶媒を共存さ
せない系を用いて同様に酸化型IGF−Ｉを製造した場合
と比較して、IGF−Ｉ（Ａ型）の含量がはるかに多く、
したがってこの発明のIGF−Ｉの製造法は血液中から単
離したIGF−Ｉ（Ａ型）と同型のものをより多く得よう
という目的に合致するものである。
せない系を用いて同様に酸化型IGF−Ｉを製造した場合
と比較して、IGF−Ｉ（Ａ型）の含量がはるかに多く、
したがってこの発明のIGF−Ｉの製造法は血液中から単
離したIGF−Ｉ（Ａ型）と同型のものをより多く得よう
という目的に合致するものである。
反応生成物から酸化型IGF−Ｉ（Ａ型）を単離するに
は、この分野で常用されるクロマトグラフィー、特に高
速液体クロマトグラフィー（以下、HPLC）を用いる方法
が好ましい。
は、この分野で常用されるクロマトグラフィー、特に高
速液体クロマトグラフィー（以下、HPLC）を用いる方法
が好ましい。
［実施例］ 以下、製造例、比較例および実施例によりこの発明をさ
らに詳しく説明する。
らに詳しく説明する。
製造例 還元型IGF−Ｉの製造E.coli F−６（プラスミドpLHSdM mtrp含有E.coli HB10
1）（本株は工業技術院微生物工業技術研究所にブタペ
スト条約に基づいて寄託されている。寄託番号:FERMBP-
729、寄託日:1984年９月17日）をアンピシリン50μg/ml
含有Ｌブロス中で一晩培養し、0.2％グルコース、0.5％
カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、50μg/mlビタミン
B1および25μg/mlアンピシリン含有Ｍ−９培地に1:20の
割合で希釈した。β−インドールアクリル酸を加えた最
終濃度10μg/mlとした。この時のA600は0.5であった。
次に、２時間培養し、遠心分離（5Krpm、４℃、５分
間）により菌体を収集した。
1）（本株は工業技術院微生物工業技術研究所にブタペ
スト条約に基づいて寄託されている。寄託番号:FERMBP-
729、寄託日:1984年９月17日）をアンピシリン50μg/ml
含有Ｌブロス中で一晩培養し、0.2％グルコース、0.5％
カザミノ酸（酸加水分解カゼイン）、50μg/mlビタミン
B1および25μg/mlアンピシリン含有Ｍ−９培地に1:20の
割合で希釈した。β−インドールアクリル酸を加えた最
終濃度10μg/mlとした。この時のA600は0.5であった。
次に、２時間培養し、遠心分離（5Krpm、４℃、５分
間）により菌体を収集した。
湿潤細胞ペースト（60g）を10mMPBS-EDTA（pH8.0）150m
lに懸濁し、菌体を超音波処理により破壊した。菌体残
屑を18000rpmで30分間遠心分離してペレット化した。得
られたペレットを0.1M Tris-HCl（pH8.0）/8M尿素−0.1
Mジチオスレイトール（50ml）に溶かし、35,000rpm、25
℃で30分間遠心分離した。上清を取り、0.1M Tris-HCl
（pH8.0）/8M尿素および10mM2−メルカプトエタノール
で平衡化したセファクリルS300スーパーファインカラム
（商標：ファルマシア社製）（5.0×86.6cm、1700ml樹
脂）にかけた。溶出は４℃で平衡緩衝液を用い、流速0.
6ml/分で行った。セファクリルS300クロマトグラフィを
行い、画分17mlを集めた。定量は全クロマトグラフィ段
階について画分後直ちに行った。活性画分を集め、合わ
せた画分255mlを1M酢酸水溶液8lを用い室温で３時間透
析し、次いで新たに1M酢酸水溶液8lを用い一晩透析し
た。透析画分は凍結乾燥し、所望の成分を含有する融合
IGF−I 450mgを得た。この融合IGF−Ｉは、15％ SDS PA
GEにて分子量15,500の位置にバンドを示す。
lに懸濁し、菌体を超音波処理により破壊した。菌体残
屑を18000rpmで30分間遠心分離してペレット化した。得
られたペレットを0.1M Tris-HCl（pH8.0）/8M尿素−0.1
Mジチオスレイトール（50ml）に溶かし、35,000rpm、25
℃で30分間遠心分離した。上清を取り、0.1M Tris-HCl
（pH8.0）/8M尿素および10mM2−メルカプトエタノール
で平衡化したセファクリルS300スーパーファインカラム
（商標：ファルマシア社製）（5.0×86.6cm、1700ml樹
脂）にかけた。溶出は４℃で平衡緩衝液を用い、流速0.
6ml/分で行った。セファクリルS300クロマトグラフィを
行い、画分17mlを集めた。定量は全クロマトグラフィ段
階について画分後直ちに行った。活性画分を集め、合わ
せた画分255mlを1M酢酸水溶液8lを用い室温で３時間透
析し、次いで新たに1M酢酸水溶液8lを用い一晩透析し
た。透析画分は凍結乾燥し、所望の成分を含有する融合
IGF−I 450mgを得た。この融合IGF−Ｉは、15％ SDS PA
GEにて分子量15,500の位置にバンドを示す。
融合IGF−Ｉ（225mg）を60％ギ酸36mlに溶解した。臭化
シアン（36mg）を加え、25℃以下で３時間攪拌下に反応
させた。蒸留水234mlを加えた後、ギ酸および臭化シア
ンを凍結乾燥により除去した。残渣を1M Tris-HCl（pH
8.0）/8M尿素−50mM2−メルカプトエタノール36mlに溶
かした。この溶液を0.01M酢酸アンモニウム（pH4.6）/8
M尿素−50mM2−メルカプトエタノール（以下、バッファ
ーＡと称する）400mlを用い室温で３時間、２回透析
し、次いで新しいバッファーA 400mlを用い一晩透析し
た。
シアン（36mg）を加え、25℃以下で３時間攪拌下に反応
させた。蒸留水234mlを加えた後、ギ酸および臭化シア
ンを凍結乾燥により除去した。残渣を1M Tris-HCl（pH
8.0）/8M尿素−50mM2−メルカプトエタノール36mlに溶
かした。この溶液を0.01M酢酸アンモニウム（pH4.6）/8
M尿素−50mM2−メルカプトエタノール（以下、バッファ
ーＡと称する）400mlを用い室温で３時間、２回透析
し、次いで新しいバッファーA 400mlを用い一晩透析し
た。
透析溶液はバッファーＡで平衡化したカチオン交換樹脂
CM52カラム（1.6×7.5cm 15ml樹脂）にかけた。カラム
はバッファーＡ（60ml）を用い、室温にて流速0.25ml/
分で洗浄し、バッファーＡ（120ml）から0.2M酢酸アン
モニウム/8M尿素−50mM2−メルカプトエタノール（120m
l）までの直線勾配で溶出した。画分（No.56〜No.61）
2.9ml/画分を集めた。
CM52カラム（1.6×7.5cm 15ml樹脂）にかけた。カラム
はバッファーＡ（60ml）を用い、室温にて流速0.25ml/
分で洗浄し、バッファーＡ（120ml）から0.2M酢酸アン
モニウム/8M尿素−50mM2−メルカプトエタノール（120m
l）までの直線勾配で溶出した。画分（No.56〜No.61）
2.9ml/画分を集めた。
集めた画分を次の条件でHPLCにかけた。
カラム：ウルトラポアRPSC（4.6×75mm）（商標：ベッ
クマン社製） 流速:1ml/分 溶出:0.1Mトリフルオロ酢酸中10％から60％までのアセ
トニトリルの直線勾配;50分間 クロマトグラフィーは15回繰返して還元型IGF−Ｉ含有
画分を集めた。保持時間29.32分の主ピークは還元型IGF
−Ｉに相当する。前述の操作により得た還元型IGF−Ｉ
を凍結乾燥し粉末として約2.4mgを得た。
クマン社製） 流速:1ml/分 溶出:0.1Mトリフルオロ酢酸中10％から60％までのアセ
トニトリルの直線勾配;50分間 クロマトグラフィーは15回繰返して還元型IGF−Ｉ含有
画分を集めた。保持時間29.32分の主ピークは還元型IGF
−Ｉに相当する。前述の操作により得た還元型IGF−Ｉ
を凍結乾燥し粉末として約2.4mgを得た。
比較例 前記の製造例と同様にして得た還元型IGF−Ｉを6Mグア
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに、0.05Mトリス・
塩酸緩衝液（pH8.0）11mlを加えて希釈した後、室温下7
2時間放置した。不溶物を0.45μｍのフイルターで除去
した後、下記条件によりHPLCにより測定した結果、酸化
型IGF−Ｉ（Ａ型）0.93mg、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）0.35
mgをそれぞれ含有していることが判明した。
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに、0.05Mトリス・
塩酸緩衝液（pH8.0）11mlを加えて希釈した後、室温下7
2時間放置した。不溶物を0.45μｍのフイルターで除去
した後、下記条件によりHPLCにより測定した結果、酸化
型IGF−Ｉ（Ａ型）0.93mg、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）0.35
mgをそれぞれ含有していることが判明した。
［HPLC−１］ カラム：ウルトラポア（Ultrapore）RPSC（4.6×75mm）
（商標：ベックマン社製） 検出方法:214nmの吸収による 溶出方法:0.1Mトリフルオロ酢酸中10％から60％までの
アセトニトリルの直線勾配をつけた溶出（50分） 流速:1.0ml/min 保持時間：酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）17.2分 酸化型IGF−Ｉ（Ａ型）18.2分 上記の反応液を1M酢酸水溶液１に対し透析（分子量カ
ットオフ3500）した後、凍結乾燥した。得られた粉末を
0.1Mトリフルオロ酢酸1mlに溶解後、下記条件によりHPL
Cを用いて精製して、IGF−Ｉ（Ａ型）0.53mgを得た。
（収率16.2％） ［HPLC−２］ カラム:AP-343-10（Ｓ−10、200Å ODS） （20×250mm）（YMC社製） 検出方法:230nmの吸収による 溶出：下記のバッファーａおよびバッファーｂの組み合
わせによるアセトニトリルで勾配をつけた溶出。
（商標：ベックマン社製） 検出方法:214nmの吸収による 溶出方法:0.1Mトリフルオロ酢酸中10％から60％までの
アセトニトリルの直線勾配をつけた溶出（50分） 流速:1.0ml/min 保持時間：酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）17.2分 酸化型IGF−Ｉ（Ａ型）18.2分 上記の反応液を1M酢酸水溶液１に対し透析（分子量カ
ットオフ3500）した後、凍結乾燥した。得られた粉末を
0.1Mトリフルオロ酢酸1mlに溶解後、下記条件によりHPL
Cを用いて精製して、IGF−Ｉ（Ａ型）0.53mgを得た。
（収率16.2％） ［HPLC−２］ カラム:AP-343-10（Ｓ−10、200Å ODS） （20×250mm）（YMC社製） 検出方法:230nmの吸収による 溶出：下記のバッファーａおよびバッファーｂの組み合
わせによるアセトニトリルで勾配をつけた溶出。
保持時間:IGF−I B型 15.0分 IGF−I A型 17.5分 実施例 １ 前記の製造例と同様にして得た還元型IGF−Ｉを6Mグア
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.0）7.4mlおよびアセトニトリル3.6mlを
加え、最終有機溶媒濃度を30％としたのち、室温下72時
間放置した。不溶物を0.45μｍのフィルターで除去した
後、前記の比較例と同様にHPLCで分析した結果、酸化型
IGF−Ｉ（Ａ型）1.60mg、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）0.22mg
をそれぞれ含有していることが判明した。
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.0）7.4mlおよびアセトニトリル3.6mlを
加え、最終有機溶媒濃度を30％としたのち、室温下72時
間放置した。不溶物を0.45μｍのフィルターで除去した
後、前記の比較例と同様にHPLCで分析した結果、酸化型
IGF−Ｉ（Ａ型）1.60mg、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）0.22mg
をそれぞれ含有していることが判明した。
反応液を1M酢酸で２倍に希釈した後、反応液中のアセト
ニトリルを除く目的で1M酢酸に対して透析（分子量カッ
トオフ3,500）し、凍結乾燥した。得られた粉末に0.01M
トリフルオロ酢酸水溶液1mlを加えて溶解し、HPLCで前
記の比較例と同様の条件で精製し、酸化型IGF−Ｉ（Ａ
型）0.94mgを得た。（収率28.4％） 実施例 ２ 前記の製造例と同様にして得た還元型IGF−Ｉを6Mグア
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.0）5.6mlおよびアセトニトリル5.4mlを
加え、最終有機溶媒濃度を46％としたのち、室温下72時
間放置した。不溶物を0.45μｍのフィルターで除去した
後、前記の比較例と同様にHPLCで分析した結果、酸化型
IGF−Ｉ（Ａ型）1.94mg、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）0.32mg
をそれぞれ含有していることが判明した。
ニトリルを除く目的で1M酢酸に対して透析（分子量カッ
トオフ3,500）し、凍結乾燥した。得られた粉末に0.01M
トリフルオロ酢酸水溶液1mlを加えて溶解し、HPLCで前
記の比較例と同様の条件で精製し、酸化型IGF−Ｉ（Ａ
型）0.94mgを得た。（収率28.4％） 実施例 ２ 前記の製造例と同様にして得た還元型IGF−Ｉを6Mグア
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.0）5.6mlおよびアセトニトリル5.4mlを
加え、最終有機溶媒濃度を46％としたのち、室温下72時
間放置した。不溶物を0.45μｍのフィルターで除去した
後、前記の比較例と同様にHPLCで分析した結果、酸化型
IGF−Ｉ（Ａ型）1.94mg、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）0.32mg
をそれぞれ含有していることが判明した。
反応液を1M酢酸で２倍に希釈した後、反応液中のアセト
ニトリルを除く目的で1M酢酸に対して透析（分子量カッ
トオフ3,500）し、凍結乾燥した。得られた粉末に0.01M
トリフルオロ酢酸水溶液1mlを加えて溶解し、HPLCで前
記の比較例と同様の条件で精製し、酸化型IGF−Ｉ（Ａ
型）1.14mgを得た。（収率34.3％） 実施例 ３ 前記の製造例と同様にして得た還元型IGF−Ｉを6Mグア
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.0）5.6mlおよびメタノール5.4mlを加
え、最終有機溶媒濃度を46％としたのち、室温下72時間
放置した。不溶物を0.45μｍのフィルターで除去した
後、前記の比較例と同様にHPLCで分析した結果、酸化型
IGF−Ｉ（Ａ型）1.74mg、酸化型（Ｂ型）0.19mgをそれ
ぞれ含有していることが判明した。
ニトリルを除く目的で1M酢酸に対して透析（分子量カッ
トオフ3,500）し、凍結乾燥した。得られた粉末に0.01M
トリフルオロ酢酸水溶液1mlを加えて溶解し、HPLCで前
記の比較例と同様の条件で精製し、酸化型IGF−Ｉ（Ａ
型）1.14mgを得た。（収率34.3％） 実施例 ３ 前記の製造例と同様にして得た還元型IGF−Ｉを6Mグア
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.0）5.6mlおよびメタノール5.4mlを加
え、最終有機溶媒濃度を46％としたのち、室温下72時間
放置した。不溶物を0.45μｍのフィルターで除去した
後、前記の比較例と同様にHPLCで分析した結果、酸化型
IGF−Ｉ（Ａ型）1.74mg、酸化型（Ｂ型）0.19mgをそれ
ぞれ含有していることが判明した。
実施例 ４ 前記の製造例と同様にして得た還元型IGF−Ｉを6Mグア
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.0）7.4mlおよびジメチルスルホキシド3.
6mlを加え、最終有機溶媒濃度を30％としたのち、室温
下72時間放置した。不溶物を0.45μｍのフィルターで除
去した後、前記の比較例と同様にHPLCで分析した結果、
酸化型IGF−Ｉ（Ａ型）1.14mg、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）
0.18mgをそれぞれ含有していることが判明した。
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.0）7.4mlおよびジメチルスルホキシド3.
6mlを加え、最終有機溶媒濃度を30％としたのち、室温
下72時間放置した。不溶物を0.45μｍのフィルターで除
去した後、前記の比較例と同様にHPLCで分析した結果、
酸化型IGF−Ｉ（Ａ型）1.14mg、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）
0.18mgをそれぞれ含有していることが判明した。
実施例 ５ 前記の製造例と同様にして得た還元型IGF−Ｉを6Mグア
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.0）5.6mlおよびジメチルスルホキシド5.
4mlを加え、最終有機溶媒濃度を45％としたのち、室温
下72時間放置した。不溶物を0.45μｍのフィルターで除
去した後、前記の比較例と同様にHPLCで分析した結果、
酸化型IGF−Ｉ（Ａ型）2.03mg、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）
0.23mgをそれぞれ含有していることが判明した。
ニジン/0.05Mトリス・塩酸緩衝液（pH8.0）に溶解し、
濃度を3.3mg/mlとした。この溶液1mlに0.05Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.0）5.6mlおよびジメチルスルホキシド5.
4mlを加え、最終有機溶媒濃度を45％としたのち、室温
下72時間放置した。不溶物を0.45μｍのフィルターで除
去した後、前記の比較例と同様にHPLCで分析した結果、
酸化型IGF−Ｉ（Ａ型）2.03mg、酸化型IGF−Ｉ（Ｂ型）
0.23mgをそれぞれ含有していることが判明した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 1/02 1/14 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (1)
- 【請求項１】アミノ酸配列： （式中、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラ
ギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇ
はグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｋはリシン、Ｌはロイ
シン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリ
ン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔ
はトレオニン、Ｖはバリン、Ｙはチロシンをそれぞれ意
味する） を有する還元型ヒトインスリン様成長因子Ｉを緩衝液中
で酸化し、得られる反応液から一次構造 （式中、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、
Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、ＶおよびＹはそれぞれ前と同
じ意味であり、ＣとＣを結ぶ３本の実線は−Ｓ−Ｓ−結
合を意味する） を有する酸化型ヒトインスリン様成長因子Ｉ（Ａ型）を
分離採取するに際し、該緩衝液に水溶性の高い有機溶媒
を該反応系に20から60％溶解させることを特徴とする酸
化型ヒトインスリン様成長因子Ｉ（Ａ型）の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61031512A JPH0759598B2 (ja) | 1986-02-14 | 1986-02-14 | ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61031512A JPH0759598B2 (ja) | 1986-02-14 | 1986-02-14 | ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62190199A JPS62190199A (ja) | 1987-08-20 |
| JPH0759598B2 true JPH0759598B2 (ja) | 1995-06-28 |
Family
ID=12333262
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61031512A Expired - Fee Related JPH0759598B2 (ja) | 1986-02-14 | 1986-02-14 | ヒトインスリン様成長因子▲ｉ▼の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0759598B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
| US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
| TW517059B (en) * | 1994-07-25 | 2003-01-11 | Ciba Geigy Ag | New process for the production of biologically active protein |
| TW440566B (en) * | 1994-07-25 | 2001-06-16 | Novartis Ag | Novel process for the production of biologically active dimeric protein |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8407044D0 (en) * | 1984-03-19 | 1984-04-26 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Producing human insulin |
-
1986
- 1986-02-14 JP JP61031512A patent/JPH0759598B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62190199A (ja) | 1987-08-20 |
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