JPS611393A - Ｉｌ−２の回収及び精製方法 - Google Patents
Ｉｌ−２の回収及び精製方法Info
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- JPS611393A JPS611393A JP60062195A JP6219585A JPS611393A JP S611393 A JPS611393 A JP S611393A JP 60062195 A JP60062195 A JP 60062195A JP 6219585 A JP6219585 A JP 6219585A JP S611393 A JPS611393 A JP S611393A
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- C07K14/54—Interleukins [IL]
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は生化学工学の分野に属す。さらに詳シくハ、
この発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を産生
ずるために形質転換させられた微生物からＩＬ−２を分
離しまたは回収する生化学的分離又は回収の方法に関す
るものである。
この発明は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）を産生
ずるために形質転換させられた微生物からＩＬ−２を分
離しまたは回収する生化学的分離又は回収の方法に関す
るものである。
天然のヒ）ＩＬ−２は、抗原、マイトジン、及び同種抗
原により刺激された赤血球ロゼツト陽性Ｔ細胞によって
産生される抗原−非特異な、遺伝的に制限されない不溶
性因子である。それは公表された分子量約１３，０００
〜１７，０００ダルトン及び約ＰＨ６〜８．５の範囲等
電点を有するタンパク質である。ヒ）ＩＬ−２は、人間
の末梢血液単核細胞及びマウス胞腺細胞の増殖反応を高
める事、細菌、寄生体、菌類、原生動物、及びビールス
などの感染に対するヒト及び動物の免疫反応を高める事
、並びに絶え間ないＴ−細胞系の増殖を支持する事など
を含む多くのイン−ビトロ及び・（イｆビボ効果をもっ
ている。
原により刺激された赤血球ロゼツト陽性Ｔ細胞によって
産生される抗原−非特異な、遺伝的に制限されない不溶
性因子である。それは公表された分子量約１３，０００
〜１７，０００ダルトン及び約ＰＨ６〜８．５の範囲等
電点を有するタンパク質である。ヒ）ＩＬ−２は、人間
の末梢血液単核細胞及びマウス胞腺細胞の増殖反応を高
める事、細菌、寄生体、菌類、原生動物、及びビールス
などの感染に対するヒト及び動物の免疫反応を高める事
、並びに絶え間ないＴ−細胞系の増殖を支持する事など
を含む多くのイン−ビトロ及び・（イｆビボ効果をもっ
ている。
アミノ酸１２５位のシスティン残基がセリンに置き換え
られておシそして／又は最初のアラニンが取り除かれて
いるＩＩ、−２、及びＩＬ−２ムテイン（Ｍｕｔｅｉｎ
ｓ）は遺伝子工学技法によって微生物的に製造されてい
る。微生物的に産生されたＩＬ−２はグリコジル化され
ておらず、そして微生物によって還元された状態で産生
される。精製されそして酸化された時、これらの微生物
的に産生されたＩＬ−２及びｒＬ−２ムテインは天然の
ヒ）ＩＬ−２に匹敵する活性を現す。
られておシそして／又は最初のアラニンが取り除かれて
いるＩＩ、−２、及びＩＬ−２ムテイン（Ｍｕｔｅｉｎ
ｓ）は遺伝子工学技法によって微生物的に製造されてい
る。微生物的に産生されたＩＬ−２はグリコジル化され
ておらず、そして微生物によって還元された状態で産生
される。精製されそして酸化された時、これらの微生物
的に産生されたＩＬ−２及びｒＬ−２ムテインは天然の
ヒ）ＩＬ−２に匹敵する活性を現す。
Ｔ細胞から天然のＩＬ−２を精製するだめの方法は次の
ような出版物に詳述されている；ワトソ８４９−８６１
；ギル、Ｓ、１等、ジャーナル 第１２４ ： １９
５４−１９６２ ；モチツキ、Ｄ、Ｙ、、等。
ような出版物に詳述されている；ワトソ８４９−８６１
；ギル、Ｓ、１等、ジャーナル 第１２４ ： １９
５４−１９６２ ；モチツキ、Ｄ、Ｙ、、等。
１５６ ： ４５４−４６４ ： 及びヨーロッパ特
許出願８３１０３５８２．９ （ｉ９８３年の１０月２
６日に第９２１６３号として公表された）及び８３４０
０９３８．３ （ｉ９８３年１１月１６日に第９４３１
７号として公表された）。一般的に、これらの方法は、
硫酸アンモニウムにより培養上清液からタンノやり質を
沈殿させそれからクロマトグラフィツク分別することを
含んでいる。
許出願８３１０３５８２．９ （ｉ９８３年の１０月２
６日に第９２１６３号として公表された）及び８３４０
０９３８．３ （ｉ９８３年１１月１６日に第９４３１
７号として公表された）。一般的に、これらの方法は、
硫酸アンモニウムにより培養上清液からタンノやり質を
沈殿させそれからクロマトグラフィツク分別することを
含んでいる。
１９８４年５月２２日に発行された米国特許第４．４５
０，１０３号及びグーインク、Ｒ６等。
０，１０３号及びグーインク、Ｒ６等。
ネイチュア（Ｎａｔｕｒｅ ） （ｉ９８０） ２８７
： １９３−１９７にはＩＦＮ−β生産性Ｅ、コライ
（Ｅ、Ｃｏ１１）からＩＦＮ−βを回収する為の方法が
詳述されている。
： １９３−１９７にはＩＦＮ−β生産性Ｅ、コライ
（Ｅ、Ｃｏ１１）からＩＦＮ−βを回収する為の方法が
詳述されている。
前記特許はＩＦＮ−βを２−ブタノール又は２−メチル
−２−２タノールによ多細胞物質から抽出する方法を詳
述している。
−２−２タノールによ多細胞物質から抽出する方法を詳
述している。
この発明は次のような段階によって特徴づけられた。Ｉ
Ｌ−２−生産性微生物からＩＬ−２を回収する為の方法
である。
Ｌ−２−生産性微生物からＩＬ−２を回収する為の方法
である。
（ａ） 微生物の細胞膜の破壊；
（ｂ） ケイオトロピック剤の水性溶液による破壊物
の抽出； （ｃ）ＩＬ−２と共に水溶性複合体を形成する可溶化剤
の水溶液（この溶液は還元剤を含有する）による、抽出
混合物の固相中のＩＬ−２の可溶化；及び （ｄ） 還元剤の存在下での（、）で得られる溶液か
らのＩＬ−２の分離。
の抽出； （ｃ）ＩＬ−２と共に水溶性複合体を形成する可溶化剤
の水溶液（この溶液は還元剤を含有する）による、抽出
混合物の固相中のＩＬ−２の可溶化；及び （ｄ） 還元剤の存在下での（、）で得られる溶液か
らのＩＬ−２の分離。
この方法の好ましい態様において、ケイオトロピック剤
は抽出混合物巾約３．５Ｍ〜約４．５Ｍの濃度の尿素で
あり、可溶化剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）
又はナトリウムラウリルサルコシン（サルコシル）であ
り、可溶化されたＩＬ−２は２−ブタノール又は２−メ
チル−２−ブタノールによりさらに抽出されそして最終
分離はゲルヂ過によって行なわれ、そして得られたサイ
ズ画分された生成物は酸化され、そして酸化された生成
物は逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
によって精製される。
は抽出混合物巾約３．５Ｍ〜約４．５Ｍの濃度の尿素で
あり、可溶化剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ ）
又はナトリウムラウリルサルコシン（サルコシル）であ
り、可溶化されたＩＬ−２は２−ブタノール又は２−メ
チル−２−ブタノールによりさらに抽出されそして最終
分離はゲルヂ過によって行なわれ、そして得られたサイ
ズ画分された生成物は酸化され、そして酸化された生成
物は逆相高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
によって精製される。
この明細書において“ＩＬ−２″という語はく＆）天然
のヒトインターロイキン−２の遺伝子により、又は、天
然のヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列と少なく
とも実質的に同一であるようなアミノ酸配列をもつタン
パク質をコードするヒトインターリュウキンー２遺伝子
の変形体により形質転換させられた微生物によって産生
され、そして、’ （ｂ）天然のヒトインターロイキン
−２と共通の生物学的活性をもつグリコジルされていな
いタンパク質を意味する。アミノ酸配列の実質的な同一
とは、配列が同一であるか又は合成タンパク質と天然ヒ
トインターロイキン−２との間に不都合な機能的相違を
惹起しない１個もしくは複数個のアミノ酸変化（欠失、
付加、置換）によって異なっていることを意味する。そ
のようなタンパク質の例は１９８３年２月３日に出願さ
れたヨーロッパ特許出願８３１０１０３５．０（ｉ９８
３年１０月１９日に公開第９１５３９号として公表）の
中に、及び１９８２年１２月２２日に出願されたヨーロ
ッパ特許出願８２３０７０３６．２ （ｉ９８３年９月
１４日に第８８１９５ 号として公開）の中に詳述され
ているＩＬ−２であり、１９８３年１０月１３日出願さ
れたヨーロッパ特許出願８３３０６２２１ 、９（ｉ９
８４年５月３０日第１０９７４８号として公表）の中に
詳述されているＩＬ−２であり、そ°してこの出願の例
の中に詳述されているＩＬ−２である。
のヒトインターロイキン−２の遺伝子により、又は、天
然のヒトインターロイキン−２のアミノ酸配列と少なく
とも実質的に同一であるようなアミノ酸配列をもつタン
パク質をコードするヒトインターリュウキンー２遺伝子
の変形体により形質転換させられた微生物によって産生
され、そして、’ （ｂ）天然のヒトインターロイキン
−２と共通の生物学的活性をもつグリコジルされていな
いタンパク質を意味する。アミノ酸配列の実質的な同一
とは、配列が同一であるか又は合成タンパク質と天然ヒ
トインターロイキン−２との間に不都合な機能的相違を
惹起しない１個もしくは複数個のアミノ酸変化（欠失、
付加、置換）によって異なっていることを意味する。そ
のようなタンパク質の例は１９８３年２月３日に出願さ
れたヨーロッパ特許出願８３１０１０３５．０（ｉ９８
３年１０月１９日に公開第９１５３９号として公表）の
中に、及び１９８２年１２月２２日に出願されたヨーロ
ッパ特許出願８２３０７０３６．２ （ｉ９８３年９月
１４日に第８８１９５ 号として公開）の中に詳述され
ているＩＬ−２であり、１９８３年１０月１３日出願さ
れたヨーロッパ特許出願８３３０６２２１ 、９（ｉ９
８４年５月３０日第１０９７４８号として公表）の中に
詳述されているＩＬ−２であり、そ°してこの出願の例
の中に詳述されているＩＬ−２である。
この明細書において１形質転換させられた微生物“とい
う語は天然のヒトインターロイキン−２活性をもつタン
パク質を産生ずるために遺伝学的に処理される微生物と
いう意味である。形質転換された微生物の例は前記のヨ
ーロッノや特許出願８８１９５．９１５３９．及び１０
９７４８並びにこの出願の例に詳述されている。細菌は
ＩＬ−２を生成する為の好ましい微生物である。合成Ｉ
Ｌ−２はまた適切に形質転換した酵母及び哺乳動物細胞
によっても作られる。Ｅ、フライが特別に好ましい。
う語は天然のヒトインターロイキン−２活性をもつタン
パク質を産生ずるために遺伝学的に処理される微生物と
いう意味である。形質転換された微生物の例は前記のヨ
ーロッノや特許出願８８１９５．９１５３９．及び１０
９７４８並びにこの出願の例に詳述されている。細菌は
ＩＬ−２を生成する為の好ましい微生物である。合成Ｉ
Ｌ−２はまた適切に形質転換した酵母及び哺乳動物細胞
によっても作られる。Ｅ、フライが特別に好ましい。
形質転換された微生物は、適切な増殖培地の中で、典型
的には６８０ ｎｍにおいて少なくとも約３０の光学濃
度（ＯＤ）へ、そして好ましくは６８０ｎｍにおいて約
２０〜４０の間のＯＤへ増殖する。
的には６８０ ｎｍにおいて少なくとも約３０の光学濃
度（ＯＤ）へ、そして好ましくは６８０ｎｍにおいて約
２０〜４０の間のＯＤへ増殖する。
増殖培地の組成は用いられる特定の微生物に依存するだ
ろう。培地は、微生物の栄養要求を満たす化合物を含む
ような水性培地である。増殖培地は、炭素及び窒素、エ
ネルギー源、マグネシウム、カリウム及びナトリウムイ
オン並びに場合によってはアミノ酸及びプリン及びピリ
ミジン塩基などをＢｉｏｌｏｇｙ） 、ラング メディ
カル ハプリケーション、第１４版８０−９５項（ｉ９
８０，）を参照のこと〕。ｔｒｐ−プロモーターを用い
る発現ベクターにおいては、培地中のトリプトファン濃
度は、ＩＬ−２の発現が望まれる時点で制限的になるよ
う、注意して制御されている。Ｅ、コライの為の増殖培
地は当業界においてよく知られている。
ろう。培地は、微生物の栄養要求を満たす化合物を含む
ような水性培地である。増殖培地は、炭素及び窒素、エ
ネルギー源、マグネシウム、カリウム及びナトリウムイ
オン並びに場合によってはアミノ酸及びプリン及びピリ
ミジン塩基などをＢｉｏｌｏｇｙ） 、ラング メディ
カル ハプリケーション、第１４版８０−９５項（ｉ９
８０，）を参照のこと〕。ｔｒｐ−プロモーターを用い
る発現ベクターにおいては、培地中のトリプトファン濃
度は、ＩＬ−２の発現が望まれる時点で制限的になるよ
う、注意して制御されている。Ｅ、コライの為の増殖培
地は当業界においてよく知られている。
培養物から細胞を収得した後、もし必要ならば、涙過、
遠心分離、又は他の常用の方法によって、細胞を約２０
〜１５０■／ｄに、好ましくは８０〜１００ｍ９／ｍｌ
（６８０ｎＴｎで４０〜３００のＯＤ、好ましくは１
６０〜２°００のＯＤ）に濃縮する。
遠心分離、又は他の常用の方法によって、細胞を約２０
〜１５０■／ｄに、好ましくは８０〜１００ｍ９／ｍｌ
（６８０ｎＴｎで４０〜３００のＯＤ、好ましくは１
６０〜２°００のＯＤ）に濃縮する。
濃縮に続いて微生物の細胞膜を破壊する。破壊の主目的
は次の抽出及び可溶化方法を促進する事である。工程の
この段階でボモジニゼーション、。
は次の抽出及び可溶化方法を促進する事である。工程の
この段階でボモジニゼーション、。
超音波処理、又はプレッシャーサイクリング法のような
常用の細胞破壊技法を使用する。好まれる方法はマント
ン−ガラリン ホモジナイザー（Ｍｏｎｔｏｎ−Ｇａｕ
ｌｉｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ）による超音波処理
又はホモジニゼーションである。破壊段階の終点は懸濁
液の光学濃度によって監視し、典型的には約６５％〜約
８５−低下する。いずれにしても破壊は、元のままの細
胞が次の可溶化段階へ実質的に持ち越されないように、
細胞のすべてを実質的に破壊すべきである。破壊の前、
もし必要ならば細胞の残骸中に不溶性複合体としてＩＬ
−２タンノぐり質を保持しながら、次の段階でＥ、コラ
イタンパク質の除去を促進するような水準に濃縮物の液
体相の−を調節する。声は適切な緩衝液を添加する事に
よってそのように調節する。はとんどの場合、約８〜約
８．５の範囲内の声が用いられるだろう。
常用の細胞破壊技法を使用する。好まれる方法はマント
ン−ガラリン ホモジナイザー（Ｍｏｎｔｏｎ−Ｇａｕ
ｌｉｎ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ）による超音波処理
又はホモジニゼーションである。破壊段階の終点は懸濁
液の光学濃度によって監視し、典型的には約６５％〜約
８５−低下する。いずれにしても破壊は、元のままの細
胞が次の可溶化段階へ実質的に持ち越されないように、
細胞のすべてを実質的に破壊すべきである。破壊の前、
もし必要ならば細胞の残骸中に不溶性複合体としてＩＬ
−２タンノぐり質を保持しながら、次の段階でＥ、コラ
イタンパク質の除去を促進するような水準に濃縮物の液
体相の−を調節する。声は適切な緩衝液を添加する事に
よってそのように調節する。はとんどの場合、約８〜約
８．５の範囲内の声が用いられるだろう。
破壊段階に続く回収工程中の段階は、ＩＬ−２を還元状
態で維持しながら、高収量で高レベルの純度（好ましく
は、少なくとも約９５％及びさらに好ましくは少なくと
も約９１８ ％ ）に、Ｅ、コライタンパク質からＩＬ
−２を分離するために、まず第１に計画されている。同
時に、これらの精製方法は、組合わせにおいて、最終生
成物中に発熱性物質を患者への経腸投与の為に許容しう
ると信じられている水準へ減少せしめる。
態で維持しながら、高収量で高レベルの純度（好ましく
は、少なくとも約９５％及びさらに好ましくは少なくと
も約９１８ ％ ）に、Ｅ、コライタンパク質からＩＬ
−２を分離するために、まず第１に計画されている。同
時に、これらの精製方法は、組合わせにおいて、最終生
成物中に発熱性物質を患者への経腸投与の為に許容しう
ると信じられている水準へ減少せしめる。
細胞を破壊した後、破壊物の液体相から粒状物を分離し
そして抽出の為の最適−に緩衝された水性媒体に再懸濁
することができる。場合によってはこの段階で粒状物を
緩衝液によって洗浄し、この中に存在する水溶性のＥ、
コライタン・ぐり質を除去することができる。いずれに
しても、抽出にかけられる細胞懸濁液のタン／ＩＰり質
濃度は普通、約５〜約６０ｍｙ／ｍＡ’、好ましくは２
０〜４（ｉ９／ｍ！！の範囲内にある。
そして抽出の為の最適−に緩衝された水性媒体に再懸濁
することができる。場合によってはこの段階で粒状物を
緩衝液によって洗浄し、この中に存在する水溶性のＥ、
コライタン・ぐり質を除去することができる。いずれに
しても、抽出にかけられる細胞懸濁液のタン／ＩＰり質
濃度は普通、約５〜約６０ｍｙ／ｍＡ’、好ましくは２
０〜４（ｉ９／ｍ！！の範囲内にある。
粒状の細胞性物質からのＥ、コライタンパク質の抽出は
破壊と同時に又は破壊の後に引き続いて実施することが
できる。それは破壊に次ぐ分離された方法として、実行
するのが好ましい。抽出剤はケイオトロピック剤（すな
わち水素結合を解離しそしてタンパク質の三次構造に影
響を与える緩タン・ぐり質変性剤）の水性溶液である。
破壊と同時に又は破壊の後に引き続いて実施することが
できる。それは破壊に次ぐ分離された方法として、実行
するのが好ましい。抽出剤はケイオトロピック剤（すな
わち水素結合を解離しそしてタンパク質の三次構造に影
響を与える緩タン・ぐり質変性剤）の水性溶液である。
抽出剤は、細胞残骸と関連する（それに含まれる又は結
合している）ＩＬ−２の少なくとも実質的な部分を残し
ながら細胞残骸からＥ、コライタンノ９り質の大部分を
選択的に取シ除く。選択性は、ＩＬ−２の疎水性によっ
て、そしてタンノやり質の等電点の近くの声において還
元され、不溶性の状態にそれがあるという事実によって
、促進される。この上、ＩＬ−２の実質的な部分は、イ
ン−ビデではＥ、コライの中に高いレベルで発現する他
のクローン化されたタンｉ４り質がそうであったように
有意な大きさの含有体とに存在する。抽出剤の例は、尿
素及びグアニジニウムハイドロクロライド（ＳＤＳが可
溶化剤として使用される時にはグアニジニウムハイドロ
クロライドを使用すべきでない）である。抽出混合物の
中のケイオトロピック剤の濃度は、使用される特定のケ
イオトロピック剤及び抽出混合物中の細胞性物の量に依
存する。尿素の場合、２５℃でのパッチ方法においては
約３，５Ｍ〜４．５Ｍ間の、好ましくは約４Ｍの濃度（
最終濃度）が使用されるだろう。もし抽出を長時間連続
的に基づいて行なう場合には、よシ低濃度を使用する事
が望ましいであろう。一般に抽出において２０℃＝２５
℃の範囲の温度を使用し、便オＵには室温を使用するで
あろう。典型的には溶液と粒状物質との間の接触を強化
する為に混合を使用し、そしてこのようにして細胞残骸
から非ＩＬ−２タンパク質を抽出するのに必要な時間を
短縮する。抽出工程の動力学的分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを使用しながら、上清液について実施され、そして抽
出は１５〜３０分までに本質的に完了することが見出さ
れた。
合している）ＩＬ−２の少なくとも実質的な部分を残し
ながら細胞残骸からＥ、コライタンノ９り質の大部分を
選択的に取シ除く。選択性は、ＩＬ−２の疎水性によっ
て、そしてタンノやり質の等電点の近くの声において還
元され、不溶性の状態にそれがあるという事実によって
、促進される。この上、ＩＬ−２の実質的な部分は、イ
ン−ビデではＥ、コライの中に高いレベルで発現する他
のクローン化されたタンｉ４り質がそうであったように
有意な大きさの含有体とに存在する。抽出剤の例は、尿
素及びグアニジニウムハイドロクロライド（ＳＤＳが可
溶化剤として使用される時にはグアニジニウムハイドロ
クロライドを使用すべきでない）である。抽出混合物の
中のケイオトロピック剤の濃度は、使用される特定のケ
イオトロピック剤及び抽出混合物中の細胞性物の量に依
存する。尿素の場合、２５℃でのパッチ方法においては
約３，５Ｍ〜４．５Ｍ間の、好ましくは約４Ｍの濃度（
最終濃度）が使用されるだろう。もし抽出を長時間連続
的に基づいて行なう場合には、よシ低濃度を使用する事
が望ましいであろう。一般に抽出において２０℃＝２５
℃の範囲の温度を使用し、便オＵには室温を使用するで
あろう。典型的には溶液と粒状物質との間の接触を強化
する為に混合を使用し、そしてこのようにして細胞残骸
から非ＩＬ−２タンパク質を抽出するのに必要な時間を
短縮する。抽出工程の動力学的分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅを使用しながら、上清液について実施され、そして抽
出は１５〜３０分までに本質的に完了することが見出さ
れた。
抽出に続いて、混合物を固相と液体相に分離する。次に
還元剤及び可溶化剤を含む中性の水性緩衝液と同相とを
接解せしめることにより、固相中のＩＬ−２を選択的に
可溶化する。疎水性のＩＬ−２を溶解する為に適切な疎
水性−親水性のバランスを持つ表面活性剤（洗剤）が使
用される。
還元剤及び可溶化剤を含む中性の水性緩衝液と同相とを
接解せしめることにより、固相中のＩＬ−２を選択的に
可溶化する。疎水性のＩＬ−２を溶解する為に適切な疎
水性−親水性のバランスを持つ表面活性剤（洗剤）が使
用される。
１０〜１４個の炭素原子を持つアルカリ金属の硫゛酸塩
化合物及びアルカリ金属のアルキルサルコシネートが好
ましい可溶化剤であり、８ＤＳ及びサルコシルが特に好
ましい。
化合物及びアルカリ金属のアルキルサルコシネートが好
ましい可溶化剤であり、８ＤＳ及びサルコシルが特に好
ましい。
可溶化において使用される可溶化剤の量は特定の可溶化
剤に依存するだろう。ＳＤＳ又はサルコシルを使用する
場合、ＳＤＳ／サルコシルと固相部分との好ましい割合
は約０．５：１〜１．４：１である。
剤に依存するだろう。ＳＤＳ又はサルコシルを使用する
場合、ＳＤＳ／サルコシルと固相部分との好ましい割合
は約０．５：１〜１．４：１である。
可溶化媒体はまた可溶化されたＩＬ−２が有意な程度に
酸化されるのを防ぐ為に十分な量の還元剤を含んでいる
。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及ヒ２−メルカプトエ
タノールのようなタンノやり質還元剤が使用される。培
地中でのＤＴＴのような還元剤の濃度は普通、約５〜２
０ｍＭの間の範囲である。可溶化は典型的には固相と可
溶化媒体との間の接触を増す為に混合しながら、２０℃
〜２５℃の範囲の温度において実施されるだろう。よシ
高い温度は不所望なＥ、コライタンパク質を可溶化する
。可溶化は、サンプルを１５分そのままの状態においた
とき、又は溶液が半透明に変わる時完全とみなされる。
酸化されるのを防ぐ為に十分な量の還元剤を含んでいる
。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）及ヒ２−メルカプトエ
タノールのようなタンノやり質還元剤が使用される。培
地中でのＤＴＴのような還元剤の濃度は普通、約５〜２
０ｍＭの間の範囲である。可溶化は典型的には固相と可
溶化媒体との間の接触を増す為に混合しながら、２０℃
〜２５℃の範囲の温度において実施されるだろう。よシ
高い温度は不所望なＥ、コライタンパク質を可溶化する
。可溶化は、サンプルを１５分そのままの状態においた
とき、又は溶液が半透明に変わる時完全とみなされる。
不溶性物質は、可溶化を完了にした後分離される。
ＩＬ−２が可溶化された後、場合によっては、ＩＬ−２
は分子量がＩＩ、−２へひじように近い一定の汚染物を
特に、含んでいる追加のＥ、コライタンパク質を取シ除
く為に２−ブタノール又は２−メチル−２−ブタノール
によって、還元条件下で水性溶液から抽出される。水性
溶液及びブタノールが実質的に混和しない条件下（たと
えば０，０５０．１５の範囲でのイオン強度）で行なわ
れる。有機抽出の実施において、水性溶液のタン・ぐり
質濃度は、もし必要なら、約６■／１ｎｌよりも少なく
、好ましくは約０．５〜４■／Ｔｎｌに調整するのが好
ましい。還元状態は、還元剤（たとえばＤＴＴ ）の存
在下で抽出を実施する事によって維持されている。
は分子量がＩＩ、−２へひじように近い一定の汚染物を
特に、含んでいる追加のＥ、コライタンパク質を取シ除
く為に２−ブタノール又は２−メチル−２−ブタノール
によって、還元条件下で水性溶液から抽出される。水性
溶液及びブタノールが実質的に混和しない条件下（たと
えば０，０５０．１５の範囲でのイオン強度）で行なわ
れる。有機抽出の実施において、水性溶液のタン・ぐり
質濃度は、もし必要なら、約６■／１ｎｌよりも少なく
、好ましくは約０．５〜４■／Ｔｎｌに調整するのが好
ましい。還元状態は、還元剤（たとえばＤＴＴ ）の存
在下で抽出を実施する事によって維持されている。
ブタノールは一般的に、約１＝１〜約３二１（抽出物：
水性溶液）の範囲の体積比で、好ましくは約１：１で、
可溶化されたＩ’Ｌ −２の水性溶液へ、加えられるで
あろう。抽出はパッチ又は連続の操作のもとに実施する
ことができる。温度は普通、２０℃〜１００℃の範囲内
であ′＃）また声は普通、約４〜９、好ましくは約５〜
６であるだろう。溶液とブタノールとの接触時間は臨界
的ではなく、そして数分といった程度の比較的短時間が
使用される。抽出が完了した後、水性相及びブタノール
相を分離しそしてＩＬ−２をブタノール相から分離する
。ブタノール相からＩＬ−２を分離する為の好ましい方
法は酸沈殿法である。これは、有機相が溶解されるまで
（有機相の体積に対して約２〜３緩衝液体積）、ＰＨ７
，５の水性緩衝液ヘプタツール相を加える事によって、
そしてそれから、ＩＬ−２を沈殿させる為に、声を約５
．５〜７，０、好ましくは６．０〜６．２へ下げる事に
よって行われる。
水性溶液）の範囲の体積比で、好ましくは約１：１で、
可溶化されたＩ’Ｌ −２の水性溶液へ、加えられるで
あろう。抽出はパッチ又は連続の操作のもとに実施する
ことができる。温度は普通、２０℃〜１００℃の範囲内
であ′＃）また声は普通、約４〜９、好ましくは約５〜
６であるだろう。溶液とブタノールとの接触時間は臨界
的ではなく、そして数分といった程度の比較的短時間が
使用される。抽出が完了した後、水性相及びブタノール
相を分離しそしてＩＬ−２をブタノール相から分離する
。ブタノール相からＩＬ−２を分離する為の好ましい方
法は酸沈殿法である。これは、有機相が溶解されるまで
（有機相の体積に対して約２〜３緩衝液体積）、ＰＨ７
，５の水性緩衝液ヘプタツール相を加える事によって、
そしてそれから、ＩＬ−２を沈殿させる為に、声を約５
．５〜７，０、好ましくは６．０〜６．２へ下げる事に
よって行われる。
工程の次の段階は、ｒＬ−２、及び抽出の後に残留する
、すべてのＥ、フライ汚染物を分離し、そして場合によ
っては可溶化剤から分離する事であるダル濾過クロマト
グラフ仏ＲＰ−）ＩＰＬＣ，又はダル濾過クロマトグラ
フィとＲＰ−ＨＰＬＣとの組合せが使用される。
、すべてのＥ、フライ汚染物を分離し、そして場合によ
っては可溶化剤から分離する事であるダル濾過クロマト
グラフ仏ＲＰ−）ＩＰＬＣ，又はダル濾過クロマトグラ
フィとＲＰ−ＨＰＬＣとの組合せが使用される。
ダル濾過クロマトグラフィは好ましくは、発熱性成分及
び、ＩＬ−２（ＩＬ−２は約１５．５ｋｄの分子量を持
つ）よりも高分子量もしくは低分子量９タンパク質汚染
物を取シ除く２つの段階において実施される。これらの
汚染物からのＩＬ−２の分離を可能にする為に溶液を画
分する事ができるダルは商業的に入手できる。セファク
リルＳ−２００は高分子成分を取シ除く為には好ましい
ゲルであシそしてセファデックスＧ−２５，Ｇ−７５又
はＧ−１０（ｉ”ルは低分子量汚染物を取シ除く為に好
ましい。ダル濾過は典型的には、可溶化剤約０．１チ〜
１．０チ及び還元剤約１−１０ｍＭを含む緩衝溶液（ｐ
Ｈｓ、 ５〜７．０）の中で行なわれるだろう。カラム
は、目的成分の適切な分離を許容する大きさであるだろ
う。
び、ＩＬ−２（ＩＬ−２は約１５．５ｋｄの分子量を持
つ）よりも高分子量もしくは低分子量９タンパク質汚染
物を取シ除く２つの段階において実施される。これらの
汚染物からのＩＬ−２の分離を可能にする為に溶液を画
分する事ができるダルは商業的に入手できる。セファク
リルＳ−２００は高分子成分を取シ除く為には好ましい
ゲルであシそしてセファデックスＧ−２５，Ｇ−７５又
はＧ−１０（ｉ”ルは低分子量汚染物を取シ除く為に好
ましい。ダル濾過は典型的には、可溶化剤約０．１チ〜
１．０チ及び還元剤約１−１０ｍＭを含む緩衝溶液（ｐ
Ｈｓ、 ５〜７．０）の中で行なわれるだろう。カラム
は、目的成分の適切な分離を許容する大きさであるだろ
う。
ＲＰ→伊ＬＣはダル濾過に代わるものである。またＲＰ
−ＨＰＬＣは、分子量がＩＬ−２に近く、それゆえにダ
ル濾過によって完全に取シ除く事ができないような分子
を溶液から取シ除く事ができる。
−ＨＰＬＣは、分子量がＩＬ−２に近く、それゆえにダ
ル濾過によって完全に取シ除く事ができないような分子
を溶液から取シ除く事ができる。
さらに、細菌性エンドトキシンのような汚染物もまたＲ
Ｐ−ＨＰＬＣによって有効に取シ除かれる。従って、Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣは、また、ダル濾過の後最終精製方法とし
ても用いられる。タンパク質の望ましい分離を与える支
持体（固定相）がＲＰ−ＨＰＬＣにおいて使用される。
Ｐ−ＨＰＬＣによって有効に取シ除かれる。従って、Ｒ
Ｐ−ＨＰＬＣは、また、ダル濾過の後最終精製方法とし
ても用いられる。タンパク質の望ましい分離を与える支
持体（固定相）がＲＰ−ＨＰＬＣにおいて使用される。
３００オングストロームのポアーサイズの支持体である
。Ｃ−４、Ｃ−８、もしくはＣ−１８が好まれる支持体
の例である。分離は、ＩＬ−２を溶液状態に保持する為
に約２．３以下、普通２．１〜２．３の酸性−で行なわ
れる。これに関して、可溶化（ダル濾過）からの溶液の
声をこの範囲に調整するのが好ましいだろう。溶液はＲ
Ｐ−ＨＰＬＣカラムの中へ負荷されそして固定相の上に
吸収される。酢酸又はトリフルオロ酢酸のような有機酸
及びフロパノール又はアセトニトリルのような有機溶媒
を含むグラジェント溶媒系がカラムからＩＬ−２を溶出
するのに使用される。酢酸−フロパノール、トリフルオ
ロ酢酸−プロパノール、及びトリフルオロアセチック酸
−アセトナイトレイトが好ましい溶媒系でおる。ＩＬ−
２は酢酸−プロパノール系での約４０チプロパノールに
おいて、トリフルオロ酢酸−プロパノール基での約５０
チプロパノールにおいて、そしてトリフルオロ酢酸−ア
セトナイトレイトでの約６２チアセトナイ） ＩＪルに
おいて溶出する。便宜上通常は、溶出液中の有機溶媒含
有量をＩＬ−２が溶出する溶剤濃度よシ幾分低いレベル
まで急速に上昇せしめ、そして次に約０．１〜１．０％
／分の範囲でゆるやかなグラジェント変化を行なう。Ｉ
Ｌ−２がクロマトグラフィ処理から回収されるやいなや
、それは凍結乾燥され、そして還元剤（、Ｉ Ｌ −２
を還元状態に保持する為）及び可溶化剤（それを溶液状
態に保持する為）を含む中性の水性緩衝液の中へ再懸濁
される。ＩＬ−２はこの形においては安定してい、そし
てさらにそれ以上の処理を行うため、及び利用される前
に製剤化する為に保存される。
。Ｃ−４、Ｃ−８、もしくはＣ−１８が好まれる支持体
の例である。分離は、ＩＬ−２を溶液状態に保持する為
に約２．３以下、普通２．１〜２．３の酸性−で行なわ
れる。これに関して、可溶化（ダル濾過）からの溶液の
声をこの範囲に調整するのが好ましいだろう。溶液はＲ
Ｐ−ＨＰＬＣカラムの中へ負荷されそして固定相の上に
吸収される。酢酸又はトリフルオロ酢酸のような有機酸
及びフロパノール又はアセトニトリルのような有機溶媒
を含むグラジェント溶媒系がカラムからＩＬ−２を溶出
するのに使用される。酢酸−フロパノール、トリフルオ
ロ酢酸−プロパノール、及びトリフルオロアセチック酸
−アセトナイトレイトが好ましい溶媒系でおる。ＩＬ−
２は酢酸−プロパノール系での約４０チプロパノールに
おいて、トリフルオロ酢酸−プロパノール基での約５０
チプロパノールにおいて、そしてトリフルオロ酢酸−ア
セトナイトレイトでの約６２チアセトナイ） ＩＪルに
おいて溶出する。便宜上通常は、溶出液中の有機溶媒含
有量をＩＬ−２が溶出する溶剤濃度よシ幾分低いレベル
まで急速に上昇せしめ、そして次に約０．１〜１．０％
／分の範囲でゆるやかなグラジェント変化を行なう。Ｉ
Ｌ−２がクロマトグラフィ処理から回収されるやいなや
、それは凍結乾燥され、そして還元剤（、Ｉ Ｌ −２
を還元状態に保持する為）及び可溶化剤（それを溶液状
態に保持する為）を含む中性の水性緩衝液の中へ再懸濁
される。ＩＬ−２はこの形においては安定してい、そし
てさらにそれ以上の処理を行うため、及び利用される前
に製剤化する為に保存される。
上記以外の好まれる方法は、ダル濾過によって分離した
後ＩＩ、−２を酸化しそしてその酸化された生成物をＲ
Ｐ−ＨＰＬＣによって、又はダル濾過とそれに続＜’
ＲＰ−ＨＰＬＣとによりて゛精製する方法である。
後ＩＩ、−２を酸化しそしてその酸化された生成物をＲ
Ｐ−ＨＰＬＣによって、又はダル濾過とそれに続＜’
ＲＰ−ＨＰＬＣとによりて゛精製する方法である。
この方法は、ダル濾過において残存している汚染物及び
不所望の酸化生成物の効果的な除去をもたらす。好まし
い酸化方法は、十分に還元された微生物的に産生された
合成タンノ４り質（このタンパク質は有用タンパク質と
実質的に同一のアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列
は複数のシスティンを含有し、このシスティンは該有用
なタンパク質中では分子内結合してシスチンを形成して
いる）を制御された態様で酸化し、こうしてシスティン
を酸化して選択的にシスチンを形成する方法である。こ
の方法においては、十分に還元された、微生物的に産生
された合成タンパク質を０−ヨートンベンゾエイトと反
応せしめ、このＯ−ヨードソベンゾエイトは、前記のシ
スティンのｐＫａよりも少なくとも約１／２ ｐＨユニ
ット低い声において水性媒体中で選択的にシスティンを
酸化する。この場合、反応混合物中の合成タンパク質の
濃度は約５ｍｙ／ｍｌよりも低くシ、そしてタンパク質
に対する０−ヨードソベンゾエイトのモル比は、反応の
終期におらて０−ヨートンベンゾエイトが過剰に存在す
るという条件でもって、少なくとも化学量論的にする。
不所望の酸化生成物の効果的な除去をもたらす。好まし
い酸化方法は、十分に還元された微生物的に産生された
合成タンノ４り質（このタンパク質は有用タンパク質と
実質的に同一のアミノ酸配列を有し、このアミノ酸配列
は複数のシスティンを含有し、このシスティンは該有用
なタンパク質中では分子内結合してシスチンを形成して
いる）を制御された態様で酸化し、こうしてシスティン
を酸化して選択的にシスチンを形成する方法である。こ
の方法においては、十分に還元された、微生物的に産生
された合成タンパク質を０−ヨートンベンゾエイトと反
応せしめ、このＯ−ヨードソベンゾエイトは、前記のシ
スティンのｐＫａよりも少なくとも約１／２ ｐＨユニ
ット低い声において水性媒体中で選択的にシスティンを
酸化する。この場合、反応混合物中の合成タンパク質の
濃度は約５ｍｙ／ｍｌよりも低くシ、そしてタンパク質
に対する０−ヨードソベンゾエイトのモル比は、反応の
終期におらて０−ヨートンベンゾエイトが過剰に存在す
るという条件でもって、少なくとも化学量論的にする。
酸化された生成物のＲＰ−ＨＰＬＣ精製は、還元剤の非
存在下及び上に記載したダル濾過で用いたのと等しいか
又はそれよシ低い濃度での浄剤の存在下で、上に記載し
た条件のもとで実施される。
存在下及び上に記載したダル濾過で用いたのと等しいか
又はそれよシ低い濃度での浄剤の存在下で、上に記載し
た条件のもとで実施される。
クロマトグラフィ処理の後、ＩＬ−２の純度は少なくと
も約９５チで、ｌそして普通は少なくとも約９８チであ
る。このひじょうに純粋な物質は、１００，０００ユニ
ットＩＬ−２活性につき約５ ｎｐよりも少ないエンド
トキシンを、普通約０．０１ｍｇよりも少ないエンドト
キシンを含む。
も約９５チで、ｌそして普通は少なくとも約９８チであ
る。このひじょうに純粋な物質は、１００，０００ユニ
ットＩＬ−２活性につき約５ ｎｐよりも少ないエンド
トキシンを、普通約０．０１ｍｇよりも少ないエンドト
キシンを含む。
この発明方法はさらに次の例によって詳述する。
これらの例はこの発明を限定することをなんら意図する
ものではない。
ものではない。
例Ｉ
ＩＬ−２は、プラスミドＰＬＷＩにより形質転換された
Ｅ、コライに一１２種ＭＭ２９４（ｉ９８３年８月４日
に受託番号３９，４０５としてアメリカン タイプ カ
ルチャー コレクション（Ａｍ＠ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され
ている）から次のように回収した。
Ｅ、コライに一１２種ＭＭ２９４（ｉ９８３年８月４日
に受託番号３９，４０５としてアメリカン タイプ カ
ルチャー コレクション（Ａｍ＠ｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され
ている）から次のように回収した。
Ｅ、フライを次のような増殖培地を用いて発酵器の中で
増殖せしめた。
増殖せしめた。
以下余白
（ＮＨ４）２Ｓｏ４１５０ ｍＭ
ＫＩ（２ＰＯ４２１，６ｒｒＭ
Ｃａ ｓ サイトレート １．５ｍＭ
ｚｎＳＯ４・７Ｈ２０３０１Ｍ ＭｎＳＯ４・Ｈ２０３０ｎＨ２ Ｏ３０ｎＩ”５Ｈ２０１ｒＱｙｉ −はオートクレーブ殺菌した２、５Ｎの水酸化ナトリウ
ムによりロ５に調整した。
ｚｎＳＯ４・７Ｈ２０３０１Ｍ ＭｎＳＯ４・Ｈ２０３０ｎＨ２ Ｏ３０ｎＩ”５Ｈ２０１ｒＱｙｉ −はオートクレーブ殺菌した２、５Ｎの水酸化ナトリウ
ムによりロ５に調整した。
無菌の付加物（オートクレーブの後）
Ｍｇ８０ａ”７Ｈ２０３ｒｎＭ
Ｆ＠８０４ １００ μＭＬ−トリ
プトファン １４〜／ｌサイアミンーＨｃ
ｔ ２０１ｖ／１ゲルコース
５ Ｉ／１テト２サイクリン
５１ｖ／ｌエタノール（任意に）
２ チカガミノ酸 ２ チタ
ウ コーンニング アンティ７オーム Ｂ（Ｄｏｗ
Ｃｏｒｎｉｎｇ Ａｎｌｉｆｏａｍ Ｂ ）の２０チ溶
液、ゲルコースの５０チ溶液及び５Ｎの水酸化カリウム
を必要に応じ添加した。
プトファン １４〜／ｌサイアミンーＨｃ
ｔ ２０１ｖ／１ゲルコース
５ Ｉ／１テト２サイクリン
５１ｖ／ｌエタノール（任意に）
２ チカガミノ酸 ２ チタ
ウ コーンニング アンティ７オーム Ｂ（Ｄｏｗ
Ｃｏｒｎｉｎｇ Ａｎｌｉｆｏａｍ Ｂ ）の２０チ溶
液、ゲルコースの５０チ溶液及び５Ｎの水酸化カリウム
を必要に応じ添加した。
発酵槽の声を５Ｎの水酸化カリウムで６．８に維持した
。残留ゲルコースは５〜１０９μの間に、溶存酸素は４
０チに、そして温度は３７±１℃に維持した。カガミノ
酸（２０チ貯蔵溶液）を０Ｄ６８ｏが約１０である時添
加した。０Ｄ６８ｏが約２０に達した後３時間で収得を
行なった。
。残留ゲルコースは５〜１０９μの間に、溶存酸素は４
０チに、そして温度は３７±１℃に維持した。カガミノ
酸（２０チ貯蔵溶液）を０Ｄ６８ｏが約１０である時添
加した。０Ｄ６８ｏが約２０に達した後３時間で収得を
行なった。
収得された材料を中空繊維（Ｈｏｌｌｏｗｆｉｂｅｒ
）ν過及び／又は遠心分離によって濃縮した。２０〜４
０ｇ（温重量）の濃縮物を、２０ｍＭのＴｒｉｓ及び１
ｍＭのエチレンデアミ゛ン四酢酸（ＥＤＴＡ ）（８，
１〜８．５のｐｉ（）の溶液（Ｔｒ ｉ ｓ／’ＥＤＴ
Ａ緩衝′液）２００ｄ中に再懸濁した。この懸濁液を１
０分間３．０００〜４．０００Ｘ、９で遠心分離し、上
清液を除去し、そして固形物は、４℃の２００Ｉ／ＬＩ
Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中へ再懸濁した。この懸濁液
を、音波処理機（ヒートシステム又は、モデルＷ −３
７５）の中へ入れ、そして出力設定“９″、５０チ負荷
でもってノ４ルスしながら、大探針を用いて４℃で４５
分間（終点＝約８５チの０Ｄ６８ｏの低下）音波処理し
た。これに代る破壊技法は、Ｍ−１に設定してマントン
−ガラリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ ）乳化機の
中に懸濁液を３回通すことである。細胞残骸物は、１０
分間４，５００Ｘ、９で遠心分離する事によって破壊物
から分離した。
）ν過及び／又は遠心分離によって濃縮した。２０〜４
０ｇ（温重量）の濃縮物を、２０ｍＭのＴｒｉｓ及び１
ｍＭのエチレンデアミ゛ン四酢酸（ＥＤＴＡ ）（８，
１〜８．５のｐｉ（）の溶液（Ｔｒ ｉ ｓ／’ＥＤＴ
Ａ緩衝′液）２００ｄ中に再懸濁した。この懸濁液を１
０分間３．０００〜４．０００Ｘ、９で遠心分離し、上
清液を除去し、そして固形物は、４℃の２００Ｉ／ＬＩ
Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝液中へ再懸濁した。この懸濁液
を、音波処理機（ヒートシステム又は、モデルＷ −３
７５）の中へ入れ、そして出力設定“９″、５０チ負荷
でもってノ４ルスしながら、大探針を用いて４℃で４５
分間（終点＝約８５チの０Ｄ６８ｏの低下）音波処理し
た。これに代る破壊技法は、Ｍ−１に設定してマントン
−ガラリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ ）乳化機の
中に懸濁液を３回通すことである。細胞残骸物は、１０
分間４，５００Ｘ、９で遠心分離する事によって破壊物
から分離した。
細胞残骸物を室温で６０ｍのＴｒ ｉ ｓ／′ＦＪＤＴ
Ａ緩衝液中に再懸濁しそしてＴｒｌｓｚ乍ＤＴＡ緩衝液
中８Ｍの尿素（スクワーズ／マン（Ｓｃｈｗａｒｚ／Ｍ
ａｎｎ）超純粋な）の同体積を５分以上の急速な攪拌で
もってこの懸濁液へ加えた（最終尿素濃度は４Ｍ）。１
５〜３０分間連続した低速攪拌の後、抽出された細胞残
骸物を回収する為に懸濁液を１２．ＯＯＯＸｇで１５分
間遠心分離した。もし固相が生じないなら、上清液を取
シ出しそして同体積のＴｒｉｍ／ＥＤ天Ａ緩衝液を加え
それから混合物を再遠心分離する。
Ａ緩衝液中に再懸濁しそしてＴｒｌｓｚ乍ＤＴＡ緩衝液
中８Ｍの尿素（スクワーズ／マン（Ｓｃｈｗａｒｚ／Ｍ
ａｎｎ）超純粋な）の同体積を５分以上の急速な攪拌で
もってこの懸濁液へ加えた（最終尿素濃度は４Ｍ）。１
５〜３０分間連続した低速攪拌の後、抽出された細胞残
骸物を回収する為に懸濁液を１２．ＯＯＯＸｇで１５分
間遠心分離した。もし固相が生じないなら、上清液を取
シ出しそして同体積のＴｒｉｍ／ＥＤ天Ａ緩衝液を加え
それから混合物を再遠心分離する。
次に抽出された細胞残骸物を５０ｍＭのリン酸ナトリウ
ム（ＰＨ６，８）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのＤ
ＴＴの溶液９ｄ中に２０℃で再懸濁する。２０チのＳＤ
Ｓ １ ｍ／をその懸濁液へ加え、そして懸濁液を５分
間激しく攪拌する。室温で１０分間１２．０００×ｇの
もとて遠心分離する事により懸濁液から液相を回収する
。それから溶液中のＩＬ−２が十分に還元されるのを確
実にする為に液相を１５分間４０℃に熱した。粗抽出物
のサンプルを１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し
た。図１は、その分析（方法ＩＡの生成物）の濃度記録
針走査が示される。これにより抽出物が約３７チのＩＬ
−２を含有することが示される。
ム（ＰＨ６，８）、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１０ｍＭのＤ
ＴＴの溶液９ｄ中に２０℃で再懸濁する。２０チのＳＤ
Ｓ １ ｍ／をその懸濁液へ加え、そして懸濁液を５分
間激しく攪拌する。室温で１０分間１２．０００×ｇの
もとて遠心分離する事により懸濁液から液相を回収する
。それから溶液中のＩＬ−２が十分に還元されるのを確
実にする為に液相を１５分間４０℃に熱した。粗抽出物
のサンプルを１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し
た。図１は、その分析（方法ＩＡの生成物）の濃度記録
針走査が示される。これにより抽出物が約３７チのＩＬ
−２を含有することが示される。
ＩＬ−２をゲル濾過クロマトグラフィによって溶液から
次のようにして分離した。溶液を５０ｍＭのリン酸ナト
リウム（Ｐ）（６，８５，１ｍＭのＥＤＴＡ。
次のようにして分離した。溶液を５０ｍＭのリン酸ナト
リウム（Ｐ）（６，８５，１ｍＭのＥＤＴＡ。
１ｍＭのＤＴＴ 、及び１ ％ ＳＤＳ中で使用される
２、６×１００σ８−２００カラム上へ負荷した。カラ
ム溶出液を４１ｎｌずつの画分に集め、そしてこの画分
のサンダルを１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル中でコ
マアスイ プル（ｃｏｏｍａａｓｉｏ ｂｌｕｅ）する
ことにより分析した。最も少ない汚染物（約３５ｋｄ。
２、６×１００σ８−２００カラム上へ負荷した。カラ
ム溶出液を４１ｎｌずつの画分に集め、そしてこの画分
のサンダルを１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル中でコ
マアスイ プル（ｃｏｏｍａａｓｉｏ ｂｌｕｅ）する
ことにより分析した。最も少ない汚染物（約３５ｋｄ。
１６〜１８ｋｄ、及び１２ｋｄ の汚染物を最小限にし
ながら）を含んでいる両分をプールし、そして限外濾過
（Ａｍ１ｃｏｎ ＹＭ ５限外Ｆ紙）によって５〜１０
ｄに濃縮した。この濃縮した。この濃縮物をＳＤＳ濃度
が１％ではなくむしろ０．１％である事を除いて上のよ
うに行なわれる２、６Ｘ１００ｃｎ１Ｇ−１００カラム
上に負荷した。画分をＳＤＳ −ＰＡＧＥによって分析
しそして最も純粋な両分をプールした。図はクロマドグ
９フイＫかけられた成生物の濃度記録計走査を表わして
いる。生成物は９８％の純度であり、そしてリーミュラ
ス アメボサイト シイセード（ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍ
ｓｂｏｅｙｔｅｌｙｓａｔｅ ）分析〔アソシエイト
オブ ケーグコッド、カンパニー９．ウッドホール、マ
サチュウセツク（Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐ
ｅ Ｃｏｄ、 Ｉｎｃ、。
ながら）を含んでいる両分をプールし、そして限外濾過
（Ａｍ１ｃｏｎ ＹＭ ５限外Ｆ紙）によって５〜１０
ｄに濃縮した。この濃縮した。この濃縮物をＳＤＳ濃度
が１％ではなくむしろ０．１％である事を除いて上のよ
うに行なわれる２、６Ｘ１００ｃｎ１Ｇ−１００カラム
上に負荷した。画分をＳＤＳ −ＰＡＧＥによって分析
しそして最も純粋な両分をプールした。図はクロマドグ
９フイＫかけられた成生物の濃度記録計走査を表わして
いる。生成物は９８％の純度であり、そしてリーミュラ
ス アメボサイト シイセード（ｌｉｍｕｌｕｓ ａｍ
ｓｂｏｅｙｔｅｌｙｓａｔｅ ）分析〔アソシエイト
オブ ケーグコッド、カンパニー９．ウッドホール、マ
サチュウセツク（Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ ｏｆ Ｃａｐ
ｅ Ｃｏｄ、 Ｉｎｃ、。
Ｗｏｏｄｓ Ｈｏ１ｅ、 ＭＡ） 〕によって測定した
場合、０．５％ｇのエンドトキシン／１００．０００ユ
ニツトのＩＬ−２活性を含んでいるという事を分析は示
した。このＩＬ−２ＯＮ一端アミノ酸配列は、最初のＮ
一端アラニンが足シないのを除いて生来の人間の分子と
同じである。
場合、０．５％ｇのエンドトキシン／１００．０００ユ
ニツトのＩＬ−２活性を含んでいるという事を分析は示
した。このＩＬ−２ＯＮ一端アミノ酸配列は、最初のＮ
一端アラニンが足シないのを除いて生来の人間の分子と
同じである。
以下余白
例２
可溶化剤として２％のＳＤＳの代わシに２％のサーコシ
ル（５ａｒｃｏｓｙｌ ）を用い、そしてクロマトグラ
フィのカラム中にＳＤＳＯ代わシにサーコシルを用いて
例１の方法をくシ返した。図１は、可溶化剤としてサー
コシルを使用するこの粗抽出物（方法ＩＢの粗抽出物）
についての濃度記録針走査を表わしている。示されるよ
うに、ＳＤＳＯ代わシにサーコシルの使用は、類似のＩ
Ｌ−２収量（５０チ対６０％）において数示された純度
（５８チ対３７チ）を生せしめた。
ル（５ａｒｃｏｓｙｌ ）を用い、そしてクロマトグラ
フィのカラム中にＳＤＳＯ代わシにサーコシルを用いて
例１の方法をくシ返した。図１は、可溶化剤としてサー
コシルを使用するこの粗抽出物（方法ＩＢの粗抽出物）
についての濃度記録針走査を表わしている。示されるよ
うに、ＳＤＳＯ代わシにサーコシルの使用は、類似のＩ
Ｌ−２収量（５０チ対６０％）において数示された純度
（５８チ対３７チ）を生せしめた。
魁
尿素抽出の前の段階まで例１の方法を繰シ返し、そして
次に記載されているようにして、可溶化し、そして浄化
した。
次に記載されているようにして、可溶化し、そして浄化
した。
ＩＬ−２をＲＰ−ＨＰＬＣによって次のように溶液から
分離した。溶液を０．１チのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）中に１０倍に希釈しそして０．１−のＴＦＡで平衡
化された内部直径４．６Ｗ＋で長さが５ｃｒｎのプロウ
ニリー アクウアポー） （ＢｒｏｗｎｌｅｅＡｑｕａ
ｐｏｒｔ ） ＲＰ −３００カラムへ負荷した。
分離した。溶液を０．１チのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）中に１０倍に希釈しそして０．１−のＴＦＡで平衡
化された内部直径４．６Ｗ＋で長さが５ｃｒｎのプロウ
ニリー アクウアポー） （ＢｒｏｗｎｌｅｅＡｑｕａ
ｐｏｒｔ ） ＲＰ −３００カラムへ負荷した。
ＩＬ−２を０．１チのＴＦＡを含む３０チ〜６０％のア
セトニトリルのグラジェントによ９４５分にわたって溶
出した。ＨＰＬＣ後のＩＬ−２活性の収率は８０〜１０
０％であった。図２は、この生成物の銀色に着色された
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表わしている。
セトニトリルのグラジェントによ９４５分にわたって溶
出した。ＨＰＬＣ後のＩＬ−２活性の収率は８０〜１０
０％であった。図２は、この生成物の銀色に着色された
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を表わしている。
男ま
ゲル濾過のクロマトグラフィの前の段階まで例１の方法
をくシ返した。可溶性の、浄化され、そして還元された
物質を例１に記載されたように０．１チのＳＤＳ中での
Ｇ−１００クロマトグラフイにかけた。ＩＬ−２のプー
ルされたピーク画分を、例３で記載されたようにＲＰ−
ＨＰＬＣによりてさらに精製した。得られた精製され、
還元されたＩＬ−２を酸化しそして例３で記載されたよ
うにして、ＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。
をくシ返した。可溶性の、浄化され、そして還元された
物質を例１に記載されたように０．１チのＳＤＳ中での
Ｇ−１００クロマトグラフイにかけた。ＩＬ−２のプー
ルされたピーク画分を、例３で記載されたようにＲＰ−
ＨＰＬＣによりてさらに精製した。得られた精製され、
還元されたＩＬ−２を酸化しそして例３で記載されたよ
うにして、ＲＰ−ＨＰＬＣにかけた。
男Σ
Ｇ−１００カラムの前の段階まで例１の方法をくシ返し
た。ＩＭの酢酸中ゲルパノールの溶媒系を使用して例３
の為の方法をくシ返した。３５チ〜６０チプロパノール
のグラディエンドによち２００分にわたってＩＬ−２を
溶ムした。カラムの寸法は内部直径１０簡×長さ３０ｍ
か内部直径４８■×長さ５０ｃｍのどちらかでアシそし
てこのカラムに固定相床孔シリカダルを充填した。使用
された固定相床孔シリカゲルはＶｙｄａｅ ＴＰ２１４
であった。生成物の純度及び収量は椀３のそれに匹敵し
た。
た。ＩＭの酢酸中ゲルパノールの溶媒系を使用して例３
の為の方法をくシ返した。３５チ〜６０チプロパノール
のグラディエンドによち２００分にわたってＩＬ−２を
溶ムした。カラムの寸法は内部直径１０簡×長さ３０ｍ
か内部直径４８■×長さ５０ｃｍのどちらかでアシそし
てこのカラムに固定相床孔シリカダルを充填した。使用
された固定相床孔シリカゲルはＶｙｄａｅ ＴＰ２１４
であった。生成物の純度及び収量は椀３のそれに匹敵し
た。
例６
０．１チのＴＦＡ中プロパツールの溶媒系を使用して例
３の方法をくシ返した。ＩＬ−２は、３５ｑ６〜６０チ
プロパノールのグラディエンドによ９１２０分にわたっ
て溶出した。力２ム及び支持体物質は例５でのと同じで
あった。生成物の純度及び収量は例３のそれに匹敵した
。
３の方法をくシ返した。ＩＬ−２は、３５ｑ６〜６０チ
プロパノールのグラディエンドによ９１２０分にわたっ
て溶出した。力２ム及び支持体物質は例５でのと同じで
あった。生成物の純度及び収量は例３のそれに匹敵した
。
男Ｊ
例１の方法は、Ｅ、コライ−生産性ＩＬ−２がひとつの
命名されたｄｅｓ−Ａｉｍ Ｓａｒ、２５ Ｉ Ｌ −
２である事を除いて、＜シ返された。このＩＬ−２のア
ミノ酸配列は、１２５位でのシスティンがセリンと交換
されさらに最初のＮ一端ア゛ラニン残基が足シないとい
う事において、天然の分子のアミノ酸配列と異なる。こ
のＩＬ−２を産生ずるｄｏｓ−Ａｌａｓｅｒ、２５Ｉ
Ｌ −２生産性Ｅ、コライの菌株は１９８４年の３月６
日に受託番号３９，６２６号としてアメリキャン タイ
プ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）に
寄託された。
命名されたｄｅｓ−Ａｉｍ Ｓａｒ、２５ Ｉ Ｌ −
２である事を除いて、＜シ返された。このＩＬ−２のア
ミノ酸配列は、１２５位でのシスティンがセリンと交換
されさらに最初のＮ一端ア゛ラニン残基が足シないとい
う事において、天然の分子のアミノ酸配列と異なる。こ
のＩＬ−２を産生ずるｄｏｓ−Ａｌａｓｅｒ、２５Ｉ
Ｌ −２生産性Ｅ、コライの菌株は１９８４年の３月６
日に受託番号３９，６２６号としてアメリキャン タイ
プ カルチャー コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ）に
寄託された。
例１の方法をくシ返した。但しグラスミドＰＬＷ５５に
より形質転換されたＥ、コライに一１２株（ｉ９８３年
の１１月１８日受託番号３９，５１６としてアメリキャ
ン タイプ カルチャー コレクシ目ン（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１＠ｃ−ｔｉ
ｏｎ ）に寄託された〕からＩＬ−２を回収した。
より形質転換されたＥ、コライに一１２株（ｉ９８３年
の１１月１８日受託番号３９，５１６としてアメリキャ
ン タイプ カルチャー コレクシ目ン（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１＠ｃ−ｔｉ
ｏｎ ）に寄託された〕からＩＬ−２を回収した。
この分子のアミノ酸配列は、Ｎ一端メサイオニンを持ち
さらに１２５位のシスティンがセリンに取シ換えられて
いるという点において天然の分子配列と異なっている。
さらに１２５位のシスティンがセリンに取シ換えられて
いるという点において天然の分子配列と異なっている。
例９
例１の一般的方法を使用しながらｄｐｓ−ＡｌａＳ ａ
ｒ １□５ＩＬ−２生産性Ｅ、コライを増殖せしめ細
胞を破壊し、そして細胞残骸を破壊物から回収した。細
胞残骸を、５０ｍＭのＴｒｉｓと１ｍＭのＥＤＴＡのｐ
Ｈ８，５の緩衝液中に約１ ： ４．５ ’（ｗ／ｖ
）の割合で懸濁した。最終濃度が２５ｍＭになるように
ＤＴＴを添加した。同じ緩衝液へ８Ｍの尿素を最終濃度
が４Ｍになるようにかきまぜなからゆっくシと添加し、
そして次に室温で混合しながら３０分間そのままに放置
した。３０分後、不溶性残留物を遠心分離した。生じた
ペーストを５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｉｍＭ
ＥＤＴＡ を含有、−７，６）中に再懸濁した。最
終濃度が５ ％’ （ｗ／ｖ ）になるように固形ＳＤ
Ｓを添加することによりこの懸濁液を可溶化した。
ｒ １□５ＩＬ−２生産性Ｅ、コライを増殖せしめ細
胞を破壊し、そして細胞残骸を破壊物から回収した。細
胞残骸を、５０ｍＭのＴｒｉｓと１ｍＭのＥＤＴＡのｐ
Ｈ８，５の緩衝液中に約１ ： ４．５ ’（ｗ／ｖ
）の割合で懸濁した。最終濃度が２５ｍＭになるように
ＤＴＴを添加した。同じ緩衝液へ８Ｍの尿素を最終濃度
が４Ｍになるようにかきまぜなからゆっくシと添加し、
そして次に室温で混合しながら３０分間そのままに放置
した。３０分後、不溶性残留物を遠心分離した。生じた
ペーストを５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｉｍＭ
ＥＤＴＡ を含有、−７，６）中に再懸濁した。最
終濃度が５ ％’ （ｗ／ｖ ）になるように固形ＳＤ
Ｓを添加することによりこの懸濁液を可溶化した。
５％のＳＤＳ溶液を０．ＩＭのリン酸ナトリウムにより
２％のＳＤＳになるよう薄めた。タンノぐり質濃度を決
定し、声を８．５に調整し、そして５０ｍＭになるよう
ＤＴＴ及び２ｍＭになるようＥＤＴＡ を添加した。こ
の混合物をＮ２の存在下で４０℃に加熱することにより
ＩＬ−２を還元した。この次に混合物を冷却しそして声
を５．０に調整した。
２％のＳＤＳになるよう薄めた。タンノぐり質濃度を決
定し、声を８．５に調整し、そして５０ｍＭになるよう
ＤＴＴ及び２ｍＭになるようＥＤＴＡ を添加した。こ
の混合物をＮ２の存在下で４０℃に加熱することにより
ＩＬ−２を還元した。この次に混合物を冷却しそして声
を５．０に調整した。
次にその溶液を１ｙｎＭのＤＴＴを含む２−ブタノール
により１：１の割合（ｖ／ｖ）において室温で抽出した
。滞留時間は２〜２５分であった。抽出は、２００ｍ７
／分の流速のもとに液−液相分離機で実施した。有機抽
出液を分離しそしてその声を水酸化ナトリウムにより８
．０に調整した。次に抽出液を、１０ｍＭのリン酸ナト
リウム、２ｍＭのＤＴＴＳｐＨ６中０．１チＳＤＳにゆ
っくシと加えそして１５〜２０分間攪拌した。生じた沈
殿物を分離しそして生じたペーストをＰＢＳ中５−のＳ
ＤＳに再懸濁した。その溶液を遠心分離によって透明に
しそして上のようにして還元した。還元の後、溶液、を
酢酸によりｐＨ５，５に調整した。この溶液を、Ｓ−２
００カラム及びＧ−２５カラムを使用してダル濾過によ
って精製した。これにより得られた精製され、還元され
たＩＬ−２を酸化し、そして酸化生成物を例３のように
してＧ−２５のクロマトグラフイ及びこれに続（ＲＰ−
ＨＰＬＣによって精製した。こうして得られた精製され
た組換体ＩＬ−２生成物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
によって定量した場合約９５％よりもよシ多くのＩＬ−
２を含有し、約０．１ｎ、１ｉ１７〜のＩＩ、−２より
も少ないエンドトキシンを含有しそして３．３Ｘ１０５
ｕ／ｋｇの投与量でのＵ、Ｓ、Ｐウサギの発熱物質試験
によって定量した場合実質的に発熱物質を含んでいない
。前に示された様に、エンドトキシン含有量は、１００
，０００ユニツトのＩＬ−２活性に対して約５ ｎ、９
よりも少なくそして好ましくは０．０１ｎｇよりも少
ない。
により１：１の割合（ｖ／ｖ）において室温で抽出した
。滞留時間は２〜２５分であった。抽出は、２００ｍ７
／分の流速のもとに液−液相分離機で実施した。有機抽
出液を分離しそしてその声を水酸化ナトリウムにより８
．０に調整した。次に抽出液を、１０ｍＭのリン酸ナト
リウム、２ｍＭのＤＴＴＳｐＨ６中０．１チＳＤＳにゆ
っくシと加えそして１５〜２０分間攪拌した。生じた沈
殿物を分離しそして生じたペーストをＰＢＳ中５−のＳ
ＤＳに再懸濁した。その溶液を遠心分離によって透明に
しそして上のようにして還元した。還元の後、溶液、を
酢酸によりｐＨ５，５に調整した。この溶液を、Ｓ−２
００カラム及びＧ−２５カラムを使用してダル濾過によ
って精製した。これにより得られた精製され、還元され
たＩＬ−２を酸化し、そして酸化生成物を例３のように
してＧ−２５のクロマトグラフイ及びこれに続（ＲＰ−
ＨＰＬＣによって精製した。こうして得られた精製され
た組換体ＩＬ−２生成物は、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
によって定量した場合約９５％よりもよシ多くのＩＬ−
２を含有し、約０．１ｎ、１ｉ１７〜のＩＩ、−２より
も少ないエンドトキシンを含有しそして３．３Ｘ１０５
ｕ／ｋｇの投与量でのＵ、Ｓ、Ｐウサギの発熱物質試験
によって定量した場合実質的に発熱物質を含んでいない
。前に示された様に、エンドトキシン含有量は、１００
，０００ユニツトのＩＬ−２活性に対して約５ ｎ、９
よりも少なくそして好ましくは０．０１ｎｇよりも少
ない。
典型的には、この発明の方法によって精製された組換体
ＩＬ−２生成物は上に示した様にエンドトキシン及び発
熱物質が実質的に無いという事に加えて、図３に表わさ
れているように、還元ＳＤＳ ＝’ＰＡＧＥ又はＲＰ−
ＨＰＩ、Ｃによりて決定した場合９８％よりも多くのＩ
Ｌ−２含有量を有した。
ＩＬ−２生成物は上に示した様にエンドトキシン及び発
熱物質が実質的に無いという事に加えて、図３に表わさ
れているように、還元ＳＤＳ ＝’ＰＡＧＥ又はＲＰ−
ＨＰＩ、Ｃによりて決定した場合９８％よりも多くのＩ
Ｌ−２含有量を有した。
例９に記載した方法の変法、例えば大規模にＩＬ−２を
製造するために使用されるような変法が図４に表示され
ている。図４に示された方法は、例９に記載した方法と
次のような点、すなわち（ｉ）緩衝における小変化（２
） ＲＰ−ＨＰＬＣにおける酢酸−ゾロパノール（例５
）溶媒系の使用、並びに（３）後酸化稀釈／透析濾過、
Ｓ−２００ダル濾過、及び限外濾過方法などの使用にお
いて異なる。図４に示されるような方法は、いろいろな
工夫によって修正される。たとえば２度目の１チのＳＤ
Ｓ中でのＳ−２００力ラム通過に続いて、ＩＬ−２溶液
を１＝１０の割合で薄めて０．１％のＳＤＳ濃度とし、
そして次にｐＨ７，５及び５ ｐｐｍのＳＤＳを含む１
０ｍＭのり／酸緩°衝液に対して透析濾過する。そして
この溶液を適切な使用分量のために必要であれば濃縮す
る。
製造するために使用されるような変法が図４に表示され
ている。図４に示された方法は、例９に記載した方法と
次のような点、すなわち（ｉ）緩衝における小変化（２
） ＲＰ−ＨＰＬＣにおける酢酸−ゾロパノール（例５
）溶媒系の使用、並びに（３）後酸化稀釈／透析濾過、
Ｓ−２００ダル濾過、及び限外濾過方法などの使用にお
いて異なる。図４に示されるような方法は、いろいろな
工夫によって修正される。たとえば２度目の１チのＳＤ
Ｓ中でのＳ−２００力ラム通過に続いて、ＩＬ−２溶液
を１＝１０の割合で薄めて０．１％のＳＤＳ濃度とし、
そして次にｐＨ７，５及び５ ｐｐｍのＳＤＳを含む１
０ｍＭのり／酸緩°衝液に対して透析濾過する。そして
この溶液を適切な使用分量のために必要であれば濃縮す
る。
【図面の簡単な説明】
図１は、ゲル濾過クロマトグラフィを最終精製方法とし
て使用するこの発明方法の２つの具体例の流れ図を示し
ている。方法ＩＡと表示された具体例は可溶化剤として
ＳＤＳを使用し；方法ＩＢと表示された具体例は可溶化
剤としてサーコシルを使用する。この図は、この方法に
おけるいろいろな段階での生成物のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ）分析の濃
度記録針走査を含んでいる。 図２は例３の生成物のＨＰＬＣクロマトダラム及びＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析である。 図３は例９の生成物のＨＰＬＣクロマトダラムである。 図４は微生物的に生成されるＩＬ−２を処理する為の好
ましい方法の流れ図である。
て使用するこの発明方法の２つの具体例の流れ図を示し
ている。方法ＩＡと表示された具体例は可溶化剤として
ＳＤＳを使用し；方法ＩＢと表示された具体例は可溶化
剤としてサーコシルを使用する。この図は、この方法に
おけるいろいろな段階での生成物のＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ）分析の濃
度記録針走査を含んでいる。 図２は例３の生成物のＨＰＬＣクロマトダラム及びＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析である。 図３は例９の生成物のＨＰＬＣクロマトダラムである。 図４は微生物的に生成されるＩＬ−２を処理する為の好
ましい方法の流れ図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ＩＬ−２を含んでいる形質転換された微生物からＩ
Ｌ−２を回収する為の方法であって、（ａ）微生物の細
胞膜を破壊し； （ｂ）細胞物質から選択的に非ＩＬ−２タンパク質を抽
出するケイオトロピック剤の水性溶液によって前記破壊
物を抽出し； （ｃ）ＩＬ−２と共に水溶性複合体を形成する可溶化剤
の水溶液により前記抽出混合物の固体相中のＩＬ−２を
可溶化し；そして、 （ｄ）還元剤の存在下で、得られた溶液からＩＬ−２を
分離する； ことを特徴とする方法。 ２、前記ケイオトロピック剤が尿素であり、そして可溶
化剤がドデシル硫酸ナトリウム又はナトリウムラウリル
サルコシンであることを特徴とする特許請求の範囲第１
項に記載の方法。 ３、前記の段階（ｂ）を塩基性ｐＨにおいて実施するこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項に記載
の方法。 ４、前記の段階（ｄ）をゲル濾過又は逆相高速液体クロ
マトグラフィによって実施することを特徴とする特許請
求第１項、第２項、又は第３項に記載の方法。 ５、前記の段階（ｄ）をゲル濾過によって溶液からＩＬ
−２−含有画分を分離しそして逆相高速液体クロマトグ
ラフィによって、得られたＩＬ−２を画分から精製する
ことによって実施することを特徴とする特許請求の範囲
第１項、第２項、又は第３項に記載の方法。 ６、前記の段階（ｄ）を、 （ｉ）２−ブタノール又は２−メチル−２−ブタノール
によって（ｃ）の水性溶液からＩＬ−２を抽出し； （ｉｉ）この抽出液からＩＬ−２を酸性沈殿せしめ；そ
して （ｉｉｉ）酸性沈殿したＩＬ−２をゲル濾過により精製
する； ことによって実施することを特徴とする特許請求の範囲
第１項、第２項、又は第３項に記載の方法。 ７、段階（ｄ）の後、段階（ｄ）の前記生成物を酸化し
そしてその結果生じる酸化された生成物を逆相高速液体
クロマトグラフィによって精製することを特徴とする特
許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって決定された少な
くとも約９５％のＩＬ−２含有量、約０．１ｎｇ／ｍｇ
のＩＬ−２よりも少ないエンドトキシン含有量を有しそ
して３．３×１０＾５ｕ／ｋｇの投与量でのＵ．Ｓ．Ｐ
．ウサギ発熱原試験によって決定した場合発熱物質を実
質的に含有しない精製された組換体インターロイキン−
２（ＩＬ−２）組成物。 ９、前記のＩＬ−２含有量が還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
って決定した場合約９８％よりも大であることを特徴と
する特許請求の範囲第８項に記載の精製された組換体Ｉ
Ｌ−２組成物。 １０、前記のＩＬ−２がｄｅｓ−Ａｌａ Ｓｅｒ＿１＿
２＿５ ＩＬ−２である事を特徴とする特許請求の範囲
第８項又は第９項に記載の精製された組換体ＩＬ−２組
成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/594,223 US4569790A (en) | 1984-03-28 | 1984-03-28 | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| US594223 | 1984-03-28 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8143485A Division JP2648587B2 (ja) | 1984-03-28 | 1996-05-15 | 精製された変異型インターロイキン−２組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS611393A true JPS611393A (ja) | 1986-01-07 |
| JP2599903B2 JP2599903B2 (ja) | 1997-04-16 |
Family
ID=24378044
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60062195A Expired - Lifetime JP2599903B2 (ja) | 1984-03-28 | 1985-03-28 | Ｉｌ−２の回収及び精製方法 |
| JP8143485A Expired - Lifetime JP2648587B2 (ja) | 1984-03-28 | 1996-05-15 | 精製された変異型インターロイキン−２組成物 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8143485A Expired - Lifetime JP2648587B2 (ja) | 1984-03-28 | 1996-05-15 | 精製された変異型インターロイキン−２組成物 |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US4569790A (ja) |
| EP (2) | EP0470586B1 (ja) |
| JP (2) | JP2599903B2 (ja) |
| KR (1) | KR850007083A (ja) |
| AT (1) | ATE81674T1 (ja) |
| AU (1) | AU592751B2 (ja) |
| CA (1) | CA1341083C (ja) |
| DE (2) | DE3588189T2 (ja) |
| DK (1) | DK166324C (ja) |
| ES (1) | ES8609362A1 (ja) |
| FI (1) | FI94960C (ja) |
| GR (1) | GR850741B (ja) |
| IE (1) | IE59100B1 (ja) |
| IL (1) | IL74733A (ja) |
| IN (1) | IN162903B (ja) |
| NO (1) | NO851235L (ja) |
| NZ (1) | NZ211569A (ja) |
| PH (1) | PH21012A (ja) |
| PT (1) | PT80172B (ja) |
| ZA (1) | ZA852347B (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01131195A (ja) * | 1987-08-04 | 1989-05-24 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | タンパク質の再活性化法 |
| JPH02209896A (ja) * | 1988-07-28 | 1990-08-21 | Roussel Uclaf | 還元型の非グリコシル化組換ヒトｉｌ↓２、その取得方法、及び薬物としてのその使用 |
| JPH02503384A (ja) * | 1987-05-11 | 1990-10-18 | カイロン コーポレイション | 微生物から精製され、酸化され、再生された組換えインターロイキン‐２を回収する方法 |
| JP2015519361A (ja) * | 2012-05-31 | 2015-07-09 | エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ | 正電荷有機添加剤での処理によるタンパク質製剤におけるタンパク質−不純物複合体及び凝集体のレベルを低下させるための方法 |
Families Citing this family (86)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
| US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
| US4853332A (en) * | 1982-10-19 | 1989-08-01 | Cetus Corporation | Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of biologically active proteins |
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
| NZ210634A (en) * | 1983-12-23 | 1989-05-29 | Hoffmann La Roche | Purification of recombinant human interleukin - 2; pharmaceutical compositions |
| US4656132A (en) * | 1984-03-28 | 1987-04-07 | Cetus Corporation | Method of improving the yield of heterologous protein produced by cultivating recombinant bacteria |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| EP0158487B1 (en) * | 1984-04-09 | 1991-08-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Stable composition of interleukin-2 |
| US4908434A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Process for preparing purified interleukin-2 |
| US4908433A (en) * | 1984-04-25 | 1990-03-13 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Uses of interleukin-2 |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| DE3500681A1 (de) * | 1985-01-11 | 1986-07-17 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur isolierung und reinigung von lymphokinen |
| JPH0646957B2 (ja) * | 1985-03-11 | 1994-06-22 | 武田薬品工業株式会社 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
| US5523215A (en) * | 1985-03-28 | 1996-06-04 | Chiron Corporation | Enhanced purification and expression of insoluble recombinant proteins |
| US4748234A (en) * | 1985-06-26 | 1988-05-31 | Cetus Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US5248769A (en) * | 1985-06-26 | 1993-09-28 | Cetus Oncology Corporation | Process for recovering refractile bodies containing heterologous proteins from microbial hosts |
| US4788144A (en) * | 1985-06-28 | 1988-11-29 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermentation process for the high level production of swine growth |
| US4762784A (en) * | 1985-07-15 | 1988-08-09 | International Minerals & Chemical Corp. | Fermemtation process for the high level production of bovine growth hormone |
| US4690915A (en) * | 1985-08-08 | 1987-09-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans |
| CA1297003C (en) * | 1985-09-20 | 1992-03-10 | Jack H. Nunberg | Composition and method for treating animals |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| US4933433A (en) * | 1986-01-31 | 1990-06-12 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Recombinant interleukin-2 composition and process for making it |
| US5425940A (en) * | 1986-04-09 | 1995-06-20 | Cetus Oncology Corporation | Combination therapy using interleukin-2 and tumor necrosis factor |
| US4931544A (en) * | 1986-09-04 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions |
| US4683293A (en) * | 1986-10-20 | 1987-07-28 | Phillips Petroleum Company | Purification of pichia produced lipophilic proteins |
| US4894330A (en) * | 1986-12-23 | 1990-01-16 | Cetus Corporation | Purification of recombinant beta-interferon incorporating RP-HPLC |
| US5108911A (en) * | 1987-03-13 | 1992-04-28 | Immunex Corporation | Process for preparing bovine interleukin-Iβ |
| US4879374A (en) * | 1987-03-13 | 1989-11-07 | Immunex Corporation | Bovine interleukin-1β DNA sequence |
| US4929700A (en) * | 1987-04-16 | 1990-05-29 | Cetus Corporation | Production of purified, biologically active, bacterially produced recombinant human CSF-1 |
| CA1339757C (en) * | 1987-04-16 | 1998-03-17 | Robert F. Halenbeck | Production of purified biologically active, bacterially produced recombinant human csf-1 |
| JPS6463395A (en) | 1987-05-04 | 1989-03-09 | Oncogen | Oncostatin m and novel composition having antitumor activity |
| US4931543A (en) * | 1987-05-11 | 1990-06-05 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 |
| US5162507A (en) * | 1987-05-11 | 1992-11-10 | Cetus Corporation | Process for recovering purified, oxidized, renatured recombinant interleukin-2 from microorganisms |
| US4801691A (en) * | 1987-05-15 | 1989-01-31 | International Minerals & Chemical Corp. | Method for removing sodium dodecyl sulfate from sodium dodecyl sulfate solubilized protein solutions |
| WO1989001046A1 (en) * | 1987-07-29 | 1989-02-09 | Schering Biotech Corporation | Purification of human interleukin-4 expressed in escherichia coli |
| EP0337243A1 (en) * | 1988-04-14 | 1989-10-18 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Process for purifying recombinant human interleukin-2 |
| US4923967A (en) * | 1988-09-26 | 1990-05-08 | Eli Lilly And Company | Purification and refolding of recombinant proteins |
| US5830452A (en) * | 1990-11-20 | 1998-11-03 | Chiron Corporation | Method for enhancing the anti-tumor therapeutic index of interleukin-2 |
| DE69031596T2 (de) * | 1990-11-23 | 1998-02-26 | Roussel Uclaf | Verfahren zur herstellung eines proteins gehörend zu der klasse der cytokine, das mindestens eine intramolekulare disulfidbrücke enthält, durch oxidation bei einem ph-wert kleiner als 5.0 des entsprechenden rekombinanten reduzierten proteins |
| US5939524A (en) * | 1991-12-09 | 1999-08-17 | The Scripps Research Institute | Platelet GPIII P1A1 and P1A2 epitopes, their preparation and use |
| AU648214B2 (en) * | 1991-12-31 | 1994-04-14 | Lucky Limited | Recombinant gene coding for human alpha interferon and expression vector thereof, etc. |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US20030171292A1 (en) * | 1992-06-01 | 2003-09-11 | Creasey Abla A. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| US6063764A (en) * | 1992-06-01 | 2000-05-16 | Washington University & Chiron Corp. | Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis |
| CA2147466A1 (en) * | 1992-10-20 | 1994-04-28 | Just P. J. Brakenhoff | Interleukin-6 receptor antagonists |
| CN1051092C (zh) * | 1993-05-21 | 2000-04-05 | 沈阳军区后勤部军事医学研究所 | 一种重组大肠杆菌培养液中分离和纯化重组人白细胞介素2的方法 |
| US5632983A (en) | 1994-11-17 | 1997-05-27 | University Of South Florida | Method for treating secondary immunodeficiency |
| US5912327A (en) * | 1996-09-30 | 1999-06-15 | Human Genome Sciences, Inc. | Method of purifying chemokines from inclusion bodies |
| US6632425B1 (en) | 1997-03-20 | 2003-10-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Chemokine compositions |
| EP1935431A3 (en) | 2000-05-15 | 2008-08-13 | Health Research, Inc. | Cancer treatments by using a combination of an antibody against her2 and interleukin-2 |
| HUP0400389A3 (en) | 2001-03-29 | 2008-03-28 | Schering Corp | Aryl oxime-piperazines useful as ccr5 antagonists and pharmaceutical compositions containing them |
| IL161407A0 (en) * | 2001-10-15 | 2004-09-27 | Chiron Corp | Treatment of severe pneumonia by administration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
| AU2002304965A1 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-12 | Zensun (Shanghai) Sci-Tech.Ltd | Neuregulin based methods and compositions for treating viral myocarditis and dilated cardiomyopathy |
| KR20050119652A (ko) | 2003-03-24 | 2005-12-21 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | 역전사 효소 저해제로서의 벤질-피리다진온 |
| JP4642025B2 (ja) * | 2003-09-09 | 2011-03-02 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | 治療的ポリペプチドのクロマトグラフィー分離 |
| KR20060116825A (ko) | 2003-10-23 | 2006-11-15 | 일루미겐 바이오사이언시스, 인코포레이티드 | 바이러스 감염에 대한 저항성과 관련된 유전자인ｏａｓ1에서의 돌연변이의 검출 |
| JP4746552B2 (ja) | 2003-11-04 | 2011-08-10 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド | 自己免疫疾患および炎症性疾患ならびに臓器移植拒絶の処置のためのアンタゴニスト抗ｃｄ４０抗体の使用 |
| WO2005110059A2 (en) * | 2004-03-17 | 2005-11-24 | Chiron Corporation | Treatment of severe community-acquired pneumonia by admistration of tissue factor pathway inhibitor (tfpi) |
| CU23297A1 (es) * | 2004-11-16 | 2008-07-24 | Ct De Inmunologa A Molecular | Formulaciones inmunoterapã0/00uticas para la inducciã"n de autoanticuerpos bloqueadores de la uniã"n de interleucina-2 a su receptor. su uso en el tratamiento del cã ncer |
| DE102005005542A1 (de) * | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Herstellung von Aldesleukin für die pharmazeutische Verwendung |
| EP1940781A1 (en) | 2005-10-19 | 2008-07-09 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Phenyl-acetamide nnrt inhibitors |
| RU2304586C1 (ru) * | 2006-03-27 | 2007-08-20 | Михаил Николаевич Смирнов | Препарат интерлейкина-2 и способ его получения |
| EP2057125B1 (en) | 2006-08-16 | 2011-03-30 | F. Hoffmann-La Roche AG | Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors |
| MX2009005881A (es) | 2006-12-13 | 2009-06-12 | Hoffmann La Roche | Derivados de 2-(piperidin-4-il)-4-fenoxi o fenilamino-pirimidina como inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleosida. |
| CA2687747C (en) | 2007-05-30 | 2015-11-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors |
| EP2225239B1 (en) | 2007-12-21 | 2014-10-22 | F. Hoffmann-La Roche AG | Heterocyclic antiviral compounds |
| US20120036767A1 (en) * | 2008-08-04 | 2012-02-16 | Larach Mario C | Continuous cultivation, harvesting, and extraction of photosynthetic cultures |
| KR102591732B1 (ko) | 2010-11-12 | 2023-10-19 | 넥타르 테라퓨틱스 | Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체 |
| WO2012088446A1 (en) | 2010-12-22 | 2012-06-28 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Superagonists and antagonists of interleukin-2 |
| US10781242B2 (en) | 2013-09-24 | 2020-09-22 | Medicenna Therapeutics Inc. | Interleukin-2 fusion proteins and uses thereof |
| US10150802B2 (en) | 2014-04-24 | 2018-12-11 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2 |
| US10806773B2 (en) | 2014-10-09 | 2020-10-20 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Multiple-variable IL-2 dose regimen for treating immune disorders |
| MA47290A (fr) | 2015-10-08 | 2019-11-27 | Nektar Therapeutics | Combinaison d'un agoniste sélectif de l'il-2rbeta et d'un agoniste de l'il-15 à action prolongée |
| JP7433051B2 (ja) | 2017-06-19 | 2024-02-19 | メディシナ セラピューティクス インコーポレイテッド | Ｉｌ－２スーパーアゴニスト、アゴニスト、およびそれらの融合体の使用および方法 |
| SG11202000167SA (en) | 2017-07-11 | 2020-02-27 | Synthorx Inc | Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof |
| KR20250145137A (ko) | 2017-08-03 | 2025-10-13 | 신톡스, 인크. | 자가면역 질환의 치료를 위한 사이토카인 접합체 |
| PH12020550661A1 (en) | 2017-11-21 | 2021-04-19 | Univ Leland Stanford Junior | Partial agonists of interleukin-2 |
| JP7235772B2 (ja) | 2018-05-21 | 2023-03-08 | ネクター セラピューティクス | 選択的Ｔｒｅｇ刺激因子ＲＵＲ２０ｋＤ－ＩＬ－２及び関連組成物 |
| SG11202012299SA (en) * | 2018-06-13 | 2021-01-28 | Akron Biotechnology Llc | Method to prepare therapeutically active aldesleukin highly stable in liquid pharmaceutical compositions |
| US20200246467A1 (en) | 2019-02-06 | 2020-08-06 | Synthorx, Inc. | Il-2 conjugates and methods of use thereof |
| WO2020257525A1 (en) | 2019-06-20 | 2020-12-24 | Cspc Dophen Corporation | Modified il-2 proteins, peg conjugates, and uses thereof |
| EP4090674A4 (en) | 2020-01-14 | 2024-01-24 | Synthekine, Inc. | Biased il2 muteins methods and compositions |
| CN111676261A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-18 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种高纯度重组白介素-2的制备工艺 |
| CN111793124A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-10-20 | 宁波博睿瀚达生物科技有限公司 | 一种去除重组白介素-2内毒素的方法 |
| IL313567A (en) | 2021-12-14 | 2024-08-01 | Lilly Co Eli | Dosing regimens for selective treg stimulator rur20kd-il-2 and related compositions |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
Family Cites Families (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3897309A (en) * | 1974-02-15 | 1975-07-29 | Merck & Co Inc | Process for removing pyrogenic material from aqueous solutions |
| JPS6030291B2 (ja) * | 1978-03-20 | 1985-07-16 | 森永乳業株式会社 | 人顆粒球の分化増殖を促進するｈｇｉ糖蛋白質、ｈｇｉ糖蛋白質の製造法及びｈｇｉ糖蛋白質を含有する白血球減少症治療剤 |
| IN150740B (ja) * | 1978-11-24 | 1982-12-04 | Hoffmann La Roche | |
| JPS55148098A (en) * | 1979-05-10 | 1980-11-18 | Toray Ind Inc | Concentration and purification of interferon |
| ZA803943B (en) * | 1979-07-31 | 1981-06-24 | Hoffmann La Roche | Homogeneous fibroblast interferon and method for manufacture thereof |
| US4390623A (en) * | 1980-10-02 | 1983-06-28 | Hooper Trading Company | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
| US4315852A (en) * | 1980-11-26 | 1982-02-16 | Schering Corporation | Extraction of interferon from bacteria |
| US4448879A (en) * | 1981-03-26 | 1984-05-15 | Hooper Trading Company | High yield process for in vitro production of serum-free and mitogen-free interleukin-2 |
| US4464355A (en) * | 1981-03-26 | 1984-08-07 | Hooper Trading Co. | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same |
| US4401756A (en) * | 1981-04-14 | 1983-08-30 | Immunex Corporation | Process for preparing human interleukin 2 |
| JPS58116498A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｉｌ‐２をコードする新規伝令ｒｎａの製造法 |
| US4450103A (en) * | 1982-03-01 | 1984-05-22 | Cetus Corporation | Process for recovering human IFN-β from a transformed microorganism |
| CA1341562C (en) * | 1982-03-31 | 2007-11-27 | Tadatsugu Taniguchi | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant dna, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| EP0091539B2 (en) * | 1982-03-31 | 1996-11-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| US4778879A (en) * | 1982-04-20 | 1988-10-18 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Highly purified human interleukin 2 and method |
| ATE37564T1 (de) * | 1982-04-20 | 1988-10-15 | Sloan Kettering Inst Cancer | Reinigung von interleukin-2. |
| US4925919A (en) * | 1984-04-25 | 1990-05-15 | Roland Mertelsmann | Purified interleukin 2 |
| JPS58198293A (ja) * | 1982-05-12 | 1983-11-18 | Shionogi & Co Ltd | インタ−ロイキン等免疫調節因子の製造方法 |
| US4490289A (en) * | 1982-09-16 | 1984-12-25 | Hoffmann-La Roche Inc. | Homogeneous human interleukin 2 |
| US4462940A (en) * | 1982-09-23 | 1984-07-31 | Cetus Corporation | Process for the recovery of human β-interferon-like polypeptides |
| US4992271A (en) * | 1982-09-23 | 1991-02-12 | Cetus Corporation | Formulation for lipophilic IL-2 proteins |
| DE3242851A1 (de) * | 1982-11-19 | 1984-05-24 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF), 3300 Braunschweig | Verfahren zur reinigung von menschlichen lymphokinen |
| JPS59116231A (ja) * | 1982-12-13 | 1984-07-05 | スロ−ン−ケツタリング・インステイテユ−ト・フオ−・キヤンサ−・リサ−チ | 抗−インタ−ロイキン−２単クロ−ン抗体 |
| US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4512922A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-23 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4511502A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| AU579089B2 (en) * | 1983-02-08 | 1988-11-17 | Biogen, Inc. | Human interleukin-2-like polypeptides |
| EP0119621A1 (en) * | 1983-03-21 | 1984-09-26 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Interleukin-2 |
| GB8308483D0 (en) * | 1983-03-28 | 1983-05-05 | Health Lab Service Board | Secretion of gene products |
| US4518584A (en) * | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| US4582799A (en) * | 1983-04-15 | 1986-04-15 | Damon Biotech, Inc. | Process for recovering nonsecreted substances produced by cells |
| ZA844082B (en) * | 1983-06-01 | 1985-09-25 | Hoffmann La Roche | Polypeptides having interferon activity |
| WO1985000606A1 (fr) * | 1983-07-19 | 1985-02-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Il-2 humaine et son procede de preparation |
| US4464295A (en) * | 1983-08-17 | 1984-08-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Simple and rapid method for extraction of proteins from bacteria |
| US4476049A (en) * | 1983-09-20 | 1984-10-09 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for the extraction of immune interferon |
| GB8327880D0 (en) * | 1983-10-18 | 1983-11-16 | Ajinomoto Kk | Saccharomyces cerevisiae |
| US4675383A (en) * | 1983-11-15 | 1987-06-23 | The Salk Institute For Biological Studies | Purification of T-cell growth factor |
| NZ210634A (en) * | 1983-12-23 | 1989-05-29 | Hoffmann La Roche | Purification of recombinant human interleukin - 2; pharmaceutical compositions |
| US4569790A (en) * | 1984-03-28 | 1986-02-11 | Cetus Corporation | Process for recovering microbially produced interleukin-2 and purified recombinant interleukin-2 compositions |
| US4530787A (en) * | 1984-03-28 | 1985-07-23 | Cetus Corporation | Controlled oxidation of microbially produced cysteine-containing proteins |
| JPS61500790A (ja) * | 1984-03-28 | 1986-04-24 | シタス コ−ポレイシヨン | 微生物的に製造されたインターロイキン―２を含有する組成物 |
| EP0158198A1 (en) * | 1984-03-29 | 1985-10-16 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | DNA and use thereof |
| EP0158487B1 (en) * | 1984-04-09 | 1991-08-28 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Stable composition of interleukin-2 |
| US4572798A (en) * | 1984-12-06 | 1986-02-25 | Cetus Corporation | Method for promoting disulfide bond formation in recombinant proteins |
| US4782139A (en) * | 1985-10-28 | 1988-11-01 | Eli Lilly And Company | Selective chemical removal of a protein amino-terminal residue |
| US4787658A (en) * | 1986-07-29 | 1988-11-29 | Harris Jr John | Unibody bumper system |
| US5156968A (en) * | 1988-06-24 | 1992-10-20 | Genentech, Inc. | Purified yeast ubiquitin hydrolase |
-
1984
- 1984-03-28 US US06/594,223 patent/US4569790A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-02-26 CA CA000475151A patent/CA1341083C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-25 PH PH32035A patent/PH21012A/en unknown
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-
1992
- 1992-05-06 US US07/879,753 patent/US5419899A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-25 US US08/428,895 patent/US5614185A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-05-15 JP JP8143485A patent/JP2648587B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02503384A (ja) * | 1987-05-11 | 1990-10-18 | カイロン コーポレイション | 微生物から精製され、酸化され、再生された組換えインターロイキン‐２を回収する方法 |
| JPH01131195A (ja) * | 1987-08-04 | 1989-05-24 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | タンパク質の再活性化法 |
| JPH02209896A (ja) * | 1988-07-28 | 1990-08-21 | Roussel Uclaf | 還元型の非グリコシル化組換ヒトｉｌ↓２、その取得方法、及び薬物としてのその使用 |
| JP2015519361A (ja) * | 2012-05-31 | 2015-07-09 | エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ | 正電荷有機添加剤での処理によるタンパク質製剤におけるタンパク質−不純物複合体及び凝集体のレベルを低下させるための方法 |
| JP2017222699A (ja) * | 2012-05-31 | 2017-12-21 | エイジェンシー・フォー・サイエンス，テクノロジー・アンド・リサーチ | 正電荷有機添加剤での処理によるタンパク質製剤におけるタンパク質−不純物複合体及び凝集体のレベルを低下させるための方法 |
| US10246506B2 (en) | 2012-05-31 | 2019-04-02 | Agency For Science, Technology And Research | Methods for reducing levels of protein-contaminant complexes and aggregates in protein preparations by treatment with electropositive organic additives |
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