JPH0761996B2

JPH0761996B2 - トリプトフアンの精製方法

Info

Publication number: JPH0761996B2
Application number: JP61058404A
Authority: JP
Inventors: 匠一郎宮原; 俊男松本; 徹宮原; 一成新田
Original assignee: 三井東圧化学株式会社
Priority date: 1986-03-18
Filing date: 1986-03-18
Publication date: 1995-07-05
Anticipated expiration: 2010-07-05
Also published as: JPS62215564A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、インドールを原料に用いて酵素法により得ら
れるトリプトファンから未反応インドールを分離して、
トリプトファン中のインドール含有量が10ppm以内に抑
制されたトリプトファンを得る、トリプトファンの精製
方法に関する。

トリプトファン、特にＬ−トリプトファンは必須アミノ
酸の一つであり、医薬品、健康食品、飼料などに使用さ
れる有用な化合物である。

Ｌ−トリプトファンの製造方法としては、グルコース等
を原料とする発酵法、アンスラニル酸等を原料とする半
発酵法の他に、インドールを原料としてＬ−セリンと酵
素的縮合反応させてＬ−トリプトファンを得る方法、あ
るいはインドールとピルビン酸及びアンモニアに酵素を
作用させてＬ−トリプトファンを得る方法などが知られ
ている。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕

インドールを原料として酵素作用によりトリプトファン
を得る方法において問題となるのは、得られたトリプト
ファン酵素反応液中の未反応インドールの分離である。

通常反応液中にはインドールが100ppm、またはそれ以上
含有されており、インドールは微量でも特優の悪臭を発
する。そのため、最終製品中の含量を少なくとも10ppm
程度以内、特に飼料用の場合は3ppm程度までにする必要
がある。

しかしながら、インドール、トリプトファンともインド
ール骨格を有し、その化学構造が似ているため、インド
ールはトリプトファンに対して付着力が強く、最終的な
結晶洗浄などの手段では許容できる量まで除去出来な
い。

また、インドールは単価の高い原料であり、これを回収
できないとコストアップにつながる。

従って、インドールを用いたトリプトファン製造におい
ては、反応終了後の未反応インドールを含むトリプトフ
ァンの精製工程は、他の夾雑物の完全な除去と同時に、
インドールとトリプトファンを効率よく分離回収できる
方法でなくてはならない。

酵素法によるトリプトファンの製造法は、例えば中性付
近の水性媒体中で、トリプトファンシンターゼの作用を
有する酵素や菌体の存在下で、インドールとセリンとを
反応させるというものであるが、得られた反応液中に
は、菌体や酵素あるいは未反応インドールが含有されて
おり、これらの除去には、通常のアミノ酸処理方法に準
じて活性炭、吸着シリカゲルなどの固体物質に吸着分離
させる方法や、遠心分離器などにより沈降分離する方
法、さらにはイオン交換樹脂や非極性多孔性樹脂を用い
てこれらの夾雑物を除去し、アミノ酸を精製する方法が
採用されている。

活性炭による方法としては、例えば、反応終了後のスラ
リー液を精製工程の途中で多量の水で希釈してトリプト
ファンを水溶液となし、活性炭処理により未反応インド
ールを吸着除去するという方法があるが、インドール及
びトリプトファンは共に水に難溶性であるので、インド
ールと共に多量のトリプトファンも吸着され、両者の分
離は困難である。

また、特開昭56−73050号公報には、マクロポーラス型
の強酸性イオン交換樹脂を用いて、Ｌ−トリプトファン
を精製単離する方法が記載されているが、トリプトファ
ン溶離後の樹脂の処理方法に関しては、特に限定した記
載はない。しかしながら、トリプトファン反応液が未反
応インドールを含有する場合、これは非常に重要な要素
である。というのは、水での洗浄などではインドールは
樹脂から溶離せず、反応液の吸着、溶離を繰り返してイ
ンドールの吸着容量に達した後は、通液中にインドール
が含有されてくるからである。

この場合、溶離液からインドールを分離するためには溶
離したトリプトファン水溶液中にベンゼン、トルエンな
どの水と混和しない有機溶媒を添加してインドールを有
機溶媒側へ抽出して分離する必要があり、溶媒回収操作
など煩雑となったりインドール含有量を3ppm程度の許容
範囲まで減、少させることは困難である等の問題があ
る。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、ポーラス型陽イオン交換樹脂を用い、イ
ンドールが殆ど含まれないトリプトファンを得るための
精製方法を鋭意検討した結果、樹脂のイオン交換部に吸
着したトリプトファンをアルカリ又は酸の水溶液を用い
て溶離した後、樹脂のポーラス部に吸着されたインドー
ルを、含水有機溶媒を用いて溶離させることによりトリ
プトファンとインドールの分離が可能であることを見出
した。

即ち本発明は、インドールを原料に用いて酵素作用によ
り得られた未反応インドールを含むトリプトファン反応
液をポーラス型陽イオン交換樹脂層へ通液して、樹脂の
イオン交換部に吸着させたトリプトファンをアリカリま
たは酸の水溶液を用いて溶離した後、樹脂のポーラス部
に吸着されたインドールを含水有機溶媒を用いて溶離さ
せることを特徴とするトリプトファンの精製方法である以下、本発明について更に詳しく説明する。。

本発明において、使用されるトリプトファン反応液と
は、例えばインドールとＬ−スリンを水性媒体中トリプ
トファンシンターゼの存在下酵素的に縮合させて得られ
る反応液、あるいはインドールとピルビン酸及びアンモ
ニアとをトリプトファナーゼ存在下に作用させた反応液
などであり、菌体タンパクの除去など前処理を施した後
のものでも勿論差し支えない。また、有効成分であるＬ
−トリプトファン及びインドールを分離する目的であれ
ば、反応液でなくても精製工程中で排出される液、例え
ば濾洗液などに適用しても勿論差し支えない。

これらの反応液や濾洗液などの有効成分を含む液は、実
際に使用する前に樹脂塔閉塞の原因となる固型物類は好
ましくは除去しておくのが良い。

本発明方法において、用いるイオン交換樹脂としては、
ポーラス型の陽イオン交換樹脂であればいずれでも良い
が、例えばレバチット（Lewatit SP−112）、アンバ
ライト（Amberlite 200−Ｃ）、ダイアイオン（Dia
ion PK−220）など強酸性陽イオン交換樹脂のマクロポ
ーラス型が好ましく、強酸性陽イオン交換樹脂でもゲル
型は本発明方法には使用できない。

樹脂の使用量は、被処理液中の総カチオン量、すなわち
Ｌ−トリプトファンの他に通常の反応液中に含まれてい
る夾雑物アミノ酸、アンモニウムイオン、ナトリウムイ
オンなどの総モル当量が樹脂の総交換容量以内となるよ
うにする。

本発明における、トリプトファン合成反応後のインドー
ルを含む反応液を処理する場合の好ましい太陽は以下の
とおりである。

未反応インドールを含む反応液や濾洗液は、ポーラス型
の陽イオン交換樹脂層へ通液される。通液時の被処理液
のpHは中性〜酸性が好ましく、温度は90℃以下で通液は
SV＝１〜10が好ましい。

イオン交換部に吸着されたトリプトファンの溶離及びポ
ーラス部に吸着されたインドールの溶離は交互に行って
もよいが、被処理液中に含まれるトリプトファンとイン
ドールの濃度に大きな差があり、また吸着機構が異なる
ため、吸着されたインドールの溶離は、トリプトファン
の吸着、溶離、樹脂の交換基の再生の分離処理を何回も
繰り返した後、インドールの吸着容量にほぼ達した時点
で実施するのが好ましい。

さもなければ、その後の溶離液からインドールを単離回
収しようとすれば困難をきたす。従って通常は、インド
ールの含有比率にもよるが、トリプトファンの吸着、溶
離、樹脂の交換基の再生を少なくとも５回以上繰り返し
た後、インドールの溶離を行うのがよい。トリプトファ
ンは一度の通液で完全に吸着され、これの分離操作の繰
り返し処理が行われている間、インドールは樹脂中のポ
ーラス部に吸着され蓄積されるので、一定吸着量になっ
た時点でインドール溶離剤を通液して溶離させればよ
い。このような処理をすれば高濃度のインドール溶液が
得られ、これより濃縮、晶析などの常法に従い分離すれ
ば容易に高純度のインドールも回収できる。しかも、こ
の操作で得られるトリプトファン溶離液中には、インド
ールは殆ど含まれない。

本発明におけるトリプトファンの溶離は、吸着通液終了
後、その都度常法に従い水を通液し、樹脂を十分洗浄後
溶離させる。溶離液としては通常使用されているアルカ
リ、または酸水溶液が用いられるが、アンモニア水が好
ましく、アンモニア水で溶離する場合は、５〜30重量％
のアンモニア水をカラム上部よりSV＝１〜10で溶離させ
る方法、もしくはカラム内の水を循環させ、そこへガス
状アンモニアを吹き込む方法など、いずれでも良く、少
なくともカラム内のpHを10以上とするのが好ましい。ま
た該操作によりＬ−トリプトファンはほぼ完全に溶離さ
れるが、カラム内の残留分を回収するために、さらに水
で押し出しを実施すると良い。

このような通常の繰り返し操作により、被処理液中に含
有のトリプトファンの95％が処理液へ回収される。また
被処理液中に含有するインドールのごく微量の数ppmが
処理液中へリークされるが、さらに精製が必要ならばＬ
−トリプトファン溶離液は、公知の単離方法、すなわち
濃縮、晶析、固液分離、乾燥などの単位操作により、所
望の許容以下のインドールを含有する高品質のＬ−トリ
プトファンを単離することができる。

トリプトファン溶離後の樹脂は充分水洗し、樹脂は常法
により塩酸、硫酸などにより再生し、反復使用される。

また、本発明においてはインドールを溶離する場合は、
溶離液としては含水有機溶媒を用いる。ここで、「含水
有機溶媒」とは、水と混合する有機溶媒と水との混合物
である。有機溶媒だけでは樹脂のポーラス部への親和性
に乏しく、細孔に吸着しているインドールを完全に溶離
できない。好ましい有機溶媒としては低級脂肪族アルコ
ールであり、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノー
ル、イソプロパノールなどが挙げられ、特にイソプロパ
ノールが好ましい。これらを10％以上、好ましくは70％
以上含むアルコール水溶液を調整し、カラム上部よりSV
＝１〜10の速度で、樹脂量の１倍以上、好ましくは２倍
程度用いて通液溶離する。

得られたインドール溶離液は常法に従い、濃縮、溶媒回
収後、トルエン、ヘキサンなどの非水系有機溶媒で逆抽
出、分液後、冷却晶析などの常套手段により固体のなし
濾過分離して回収できる。

またインドール溶離後のカラムは充分水洗して溶媒を除
去した後、トリプトファンの分離に再使用される。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明を具体的に説明する。

但し、「％」は重量％、「Ｍ」はmol/lを表す。

実施例１大腸菌を培養して生産された酵素トリプトファンシンタ
ーゼの存在下、水性溶媒中でインドールとＬ−セリンを
縮合させて得たＬ−トリプトファンを含む反応液に、活
性炭及び水を添加し、硫酸にてpH4として95〜100℃で１
時間加熱して菌体をフロック化後、活性炭に吸着された
菌体をそのまま濾過により除去した。このようにして前
処理して得られた、Ｌ−トリプトファンを3.8％（0.19
M）、インドールを0.1％（0.008M）、Ｌ−セリンを0.2
％（0.02M）、アンモニウムイオンを0.8％（0.44M）、
ナトリウムイオンを0.2％（0.09M）含む水溶液2580g
（アミノ酸及びカチオン総モル当量が1.9）をレバチッ
トSP−112（バイエル社品、交換容量1.9mol/l）1.0
を充填したカラムにコンディショニング再生をして上部
よりSV＝５で通液させた。通液終了時の留下液を高速液
体クロマトグラフィーでＬ−トリプトファンの検出を行
ったが、検出されなかった。

次に、水２、SV＝10で洗浄後、10％NH₃水600g、SV＝
２で溶離、さらに水1000gで押し出しを行い、溶離液160
0gを得た。溶離液中にはＬ−トリプトファン5.9％（94.
1g相当、吸着原液中Ｌ−トリプトファンに対して96.0％
の回収率）、インドール1ppm以下（インドール除去率ほ
ぼ100％）を含有していた。

該溶離液を減圧下に濃縮して約470gとし、５℃で２時間
晶析を行いヌッチェによる真空濾過後、さらに水100gで
洗浄し、wet.ケーキ136.8gを得て、これ乾燥し黄白色鱗
片状の結晶80.4gを得た。

通算収率82.0％／吸着原液、製品品質は純度99.6％、施
光度−31.3゜、インドール含有量1.2ppmとインドールを
殆ど含まず、インドール臭は全く感じられなかった。こ
れは勿論国内飼料用添加物規格を十分満足する品質であ
る。

また、Ｌ−トリプトファン溶離後の樹脂は、さらに２
の水で洗浄後、80％イソプロピルアルコール水2000gで
カラム上部よりSV＝２で流出させ、インドール溶離液20
00gを得た。該溶離液中にはインドールが0.12％（吸着
原液中のインドールに対して93.0％の回収率）含有され
ていた。

実施例２実施例１と同様にして、インドールの溶離を行わない
で、続けてトリプトファン含有反応液を通液し、Ｌ−ト
リプトファンの吸着、溶離、交換基の再生のみを９回繰
り返した。含有されるインドールの量は反応液ごとに異
なり、供給されたインドールの総量は64gであった。そ
の間、Ｌ−トリプトファン溶離時の流下液中のインドー
ル含有量をチェックした。８回目までは溶離液中にイン
ドールは検出されなかったが、９目の溶離液において若
干のインドールが検出されたため、９回目のＬ−トリプ
トファン溶離後水洗を付した後、カラム上部より80％イ
ソプロピルアルコール水2000gをSV＝２で流し、インド
ールの溶離を行い、インドール溶離液2000gを得た。該
溶離液中にはインドールが3.2％含有されていた。即
ち、樹脂へのインドールの吸着容量は樹脂の種類によっ
て異なるが、レバチットSP−112を1.0使用した場合
の吸着容量は64gであり、限界に達した後は溶離液中に
インドーが含有されてくるということが明らかとなっ
た。

該溶離液を500gまで濃縮後、60℃にてｎ−ヘキサン200g
を加えて混合抽出、分液後ｎ−ヘキサン層を冷却して、
５℃/2Hr晶析、ヌッチェで濾過して、得られたwet.ケー
キを乾燥してインドール39.0gを得た（回収率61.0％、
ガスクロマトグラフィー純度100％）。該回収インドー
ルは、Ｌ−トリプトファン酵素反応の原料として再使用
したが、反応には全く影響ないことが確認された。

なお、このようにインドールの溶離終了後、水洗を付し
て再び再生後、Ｌ−トリプトファンの吸着、溶離を繰り
返し、Ｌ−トリプトファン溶離液中にインドールが検出
されると、イソプロピルアルコール水によりインドール
の溶離回収を行うという操作を繰り返しても、得られた
いずれのＬ−トリプトファン溶離液からもインドール含
量は3ppm以下であり、Ｌ−トリプトファンの通算収率
は、78.0〜84.0％／吸着原液であった。

このように、長時間の連続操作を行っても、得られたも
のは国内飼料用添加物規格を十分に満足する無臭の品質
であった。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インドールを原料に用いて酵素作用により
得られた未反応インドールを含むトリプトファン反応液
を、ポーラス型陽イオン交換樹脂層へ通液して、樹脂の
イオン交換部に吸着させたトリプトファンをアルカリま
たは酸の水溶液を用いて溶離した後、樹脂のポーラス部
に吸着されたインドールを、含水有機溶媒を用いて溶離
させることを特徴とするトリプトファンの精製方法。
【請求項２】トリフトファンの溶離液に用いるアルカリ
水溶液が、アンモニア水である特許請求の範囲第１項記
載の方法。
【請求項３】インドールの溶離に用いる含水有機溶媒
が、低級脂肪族アルコール水溶液である特許請求の範囲
第１項記載の方法。