JPS62215564A - トリプトフアンの精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、インドールを原料に用いて酵素法により得ら
れる１〜リブトフアンから未反応インドールを分離して
、トリプトファン中のインドール含有量が１０　ｐｐｍ
以内に抑制されたトリプトファンの精製方法に関する。

１−リプドアアン、特にＬ−１−リプドアアンは必須ア
ミノ酸の一つであり医薬品、健康食品、飼料などに使用
される有用な化合物である。

Ｌ−１−リプドアアンの製造方法としては、グルコース
等を原料とする発酵法、アンスラニル酸等を原料とする
半発酵法の外に、インドールを原料としてＬ−セリンと
酵素的縮合反応させてＬ−トリプトファンを得る方法、
あるいはインドールとピルビン酸及びアンモニアに酵素
を作用させてＬ−１−リブ１−ファンを得る方法などが
知られている。

〔従来の技術及び発明が解決しようとする問題点〕イン
ドールを原料として酵素作用によりトリプＩ・ファンを
得る方法において問題となるのは、得られたＩ〜リブト
ファン酵素反応液中の未反応インドールの分離である。

通常反応液中にはインドールが１００　ｐｐｍ、または
それ以上含有されており、インドールは微量でも特有の
悪臭を発する。そのため、最終製品中の含量を少なくと
も１０　ｐｐｍ程度以内、特に飼料用の場合は３　ｐｐ
ｍ程度までにする必要がある。

しかしながらインドール、トリブ１−ファンともインド
ール骨格を有し、その化学１１ζ造が似ているためイン
ドールはトリプトファンに対して付着力が強く、最終的
な結晶洗浄などの手段では許容できる量まで除去できな
い。

また、インドールは単価の高い原料であり、これを回収
できないとニス１−アップにつながる。

従って、インドールを用いたトリプトファン製造におい
ては、反応終了後の未反応インドールを含むトリプトフ
ァン精製工程 １　　　　　　　　　　においては、他の夾雑物の完全
な除去と同時に、インドールとトリプトファンを効率よ
く分離回収できる方法でなくてはならない。

通常、酵素法による１−リフトファンの製造法は、中性
付近の水性媒体中で、１−リプ１−ファンシンターゼの
作用を有する酵素や菌体の存在下で、例えばインドール
とセリンとを反応させて得られているが、得られた反応
液中に含有されている菌体や酵素を除去せねばならず、
これらの菌体や酵素の除去には、通常のアミノ酸処理方
法に準じて活性炭、吸着シリカゲルなどの固体物質に吸
着分離させる方法や、遠心分離器などにより沈降分離す
る方法、さらにはイオン交換樹脂や、非極性多孔性樹脂
を用いてこれらの夾雑物を除去したアミノ酸を精製する
方法が採用されている。

例えば特開昭５６−７３０５０号公報には、マクロポー
ラス型の強酸性イオン交換樹脂を用いてＬ−１−リプド
アアンを精製単離する方法が記載されている。

しかしながら、これらの方法ではインドールとトリブＩ
〜ファンの分離は不可能である。

インドール及び１−リプ１〜フアンは水に難溶性であり
、例えば反応終了後のスラリー液を精製工程の途中で多
量の水希釈して１−リフトファンを水溶液となし、活性
炭処理により未反応インドールを吸着除去させようとす
ればインドールとともに多量のトリプトファンも吸着さ
れる。

また、上記公報記載方法のように１通常のゲル型陽イオ
ン交換樹脂を用いて芳香族またはへテロ芳香族アミノ酸
を吸着させた場合比較的溶離しずらいので、溶離しやす
いポーラス型の陽イオン交換樹脂を用いて、トリプトフ
ァンの吸着、溶離のき４製を行った場合、当然のことな
がら、インドールも同時に溶離液中に含有されることが
考えられる。この場合インドールを分離するためには溶
離したトリブ１〜ファン水溶液中に、ベンゼン、トルエ
ンなどの水と混和しない有機溶媒を添加してインドール
を有機溶媒側へ抽出して分離する必要があり、溶媒回収
操作など煩雑となったり、インドール含有ｊｌｔを３　
ｐｐｍ程度の許容範囲まで減少させることは困テＩＣで
ある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、簡単な操作でインドールが殆んど含まれ
ないトリプトファンの精製方法を鋭意検討している中、
インドールを含むトリジ１〜フフ２反応液を、ポーラス
型陽イオン交換樹脂層へ通液した場合、インドールは樹
脂と親和性があり驚くべきことに、インドールはポーラ
ス部分のみに選択的に吸着され、しかもイオン交換部に
吸着されたトリプトファンを溶離しても溶離液中にはイ
ンドールは殆んど含まれないことを見出した。またイン
ドールの溶離に際しては含水有機溶媒を用いられるので
、インドールの溶離後は樹脂を水洗するだけで容易に樹
脂の再生もできて１−リフトファンの分離に再使用でき
ることがわかり、本発明に到達したものである。

即ち、本発明方法は、インドールを原料に用いて酵素作
用により得られた未反応インドールを含む１−リプ１−
ファン反応液を、ポーラス型陽イオン交換樹ＷＩ后へ通
液して、樹脂のイオン交換部に吸着させたトリプトファ
ンをアルカリまたは酸の水溶液を用いて溶離した後、樹
脂のポーラス部に吸着されたインドールを、水と混合す
る含水有機溶媒を用いて溶離させることを特徴とするｌ
−リフトファンの精製方法である。

本発明において、使用されるｌ−リフトファン反応液と
は、例えばインドールとＬ−セリンとを水媒体中１−リ
フトファンシンターゼの存在下酵素的に縮合させて得ら
れる反応液、あるいはインドールとピルビン酸及びアン
モニアとをトルプトファナーゼ存在下に作用させた反応
液などであり、菌体タンパクの除去など前処理を施した
後のものでももちろん差しつかえない。また、有効成分
であるＬ−１−リプドアアン及び、インドールを分離す
る目的であれば反応液でなくても精製工程中で排出され
る液、例えばヂ洗液などに適用しても勿論差しつかえな
い。

これらの反応液や炉洗液などの有効成分を含む液は、実
際に使用する前に樹脂塔閉塞の厚因となる固を物類は好
ましくは除去しておくのが良い。

本発明方法において、用いるイオン交換樹脂としては、
ポーラス型の陽イオン交換樹脂であればいずれでも良い
が％　（５’ｌｌえはレバチツ１〜（Ｌｅｗａ　ｔ　ｉ
　ｔＳｌ）−１１２＞、アンバライｌ−（Ａｍｂｅｒｌ
ｉｔｅ　２００Ｃ）、ダイアイオン（Ｄｉａｉｏｎ　Ｐ
Ｋ−２２０）など強酸性カチオン交換樹ｌ頂のマクロポ
ラス型が好ましく１強酸性カチオン交換ｔｊｌ　ｊｌｌ
でもゲル型は本発明方法には使用できない。

樹脂の使用量は、被処理液中の総力千オン量、すなわち
Ｌ−）−リプドアアンの他に通常の反応液中に含まれて
いる夾雑物アミノ酸、アンモニウムイオン、ナトリウム
イオンなどの総′モル肖量が樹脂の総交換容量以内とな
る様にする。

本発明における、Ｉ−リブドアアン反応後のインドール
を含む反応液を処理する場合の好ましい態様は以下のと
おりである。

未反応インドールを含む反応液ｐ液は、ポーラス型の陽
イオン交換樹脂層へ通液される。

通液時の被処理液のＰ）Ｉは中性〜酸性が好ましく、温
度は９０℃以下で通液は５Ｖ＝１〜１０で行う。

トリプトファンのイオン交換部での吸着、溶離、及びイ
ンドールのポーラス部分へ吸着された溶離は交互に行っ
てもよいが、反応液被処理液中に含まれるｌ−リプドア
アンとインドールの濃度比率に大きな差があり、また吸
着機構が異るため、吸着さ社たインドールの溶離は、　
ｌ−リフトファンの吸着、溶離、再生の分離処理を何回
も繰返した後、インドールの吸着容量にほぼ達した時点
で実施するのが好ましい。

さもなければその後の溶離液からのインドールを単離回
収しようとすれば困難をきたす。したがって通常は、イ
ンドールの含有比率にもよるが、１−リプ１〜７アンの
吸着、溶離、再生を少くとも５回以上繰返した後インド
ールの溶離を行うのがよい。トリプトファンはワンパス
で完全に吸着されこれの分離操作の繰返し処理を行われ
ている間、インドールは樹脂中のポーラス部分に吸着さ
れ蓄ｈ′！されるので、一定濃度になった時点でインド
ール溶ｊ雅剤を通液して溶４Ｅさせればよい。このよう
な処理をすれば高ｔｌＢ　Ｉｆのインドール溶液が得ら
れ−これより濃縮、晶析などの常法にしたがい分離すれ
ば、容易に高純度のインドールも回収できる。

しかもこの間の１〜リブトフアン溶離液中には、インド
ールは殆んど含まれない。

本発明における１〜リプトフアンの溶離は、吸着通液終
了後その都度常法にしたがい水を通液し、樹１ｒ６を十
分洗浄後溶離させる。溶離液としては通常使用されてい
るアルカリ、または酸水溶液が用いられるが、アンモニ
ア水が好ましく、アンモニア水で溶離する場合は、５〜
３０ｗｔ％のアンモニア水をカラム上部より５Ｖ＝１〜
１０で溶離させる方法もしくはカラム内の水を循環させ
そこへガス状アンモニアを吹き込む方法など、いずれで
も良く、少なくともカラム内のｐＨを１０以上とするの
がよい。また該操作によりＬ−１〜リブｌ〜フアンはほ
ぼ完全に溶離されるが、カラム内の残留分を回収するた
めに、さらに水で押し出しを実施すると良い。

このような通常の繰返し操作により、被処理液中に含有
の１−リフトファンの９５係が処理液へ回収される。ま
た被処理液中に含有するインドールのご＜微量の数ｐｐ
ｍが処理液中へリークされるが。

さらに精製が必要ならばＬ−１−リブドアアン溶離液は
、公知の単離方法、すなわち濃縮、晶出、固液分離、乾
燥などの単位操作により、所望の許容以下のインドール
を含有する高品質のＬ−１−リブ１−ファンを単離する
ことができる。

１〜リプドアアン溶離後の樹脂は充分水洗し、樹脂は常
法により塩酸、硫酸などにより再生し、反復使用される
。

また、本発明においてはインドールを溶離する場合は、
溶離液としては、含水有機溶媒を用いる。

有機溶媒だけではインドールへの親和性に乏しく完全な
溶離ができない。好ましい有機溶媒としては低級脂肪族
アルコールであり、メタノール、エタノール、ｎ−プロ
パツール、イソプロパツールなどが挙げられ、特にイソ
プロパツールが好ましい。これらを１０壬以上、望まし
くは７０壬以上含むアルコール水溶液に調整し、カラム
上部より５Ｖ−１〜１０の速度で樹脂量の１倍以上、好
ましくは２倍程度用いて通液溶離する。

得られたインドール溶離液は常法に従い、濃縮、溶媒回
収後、１−ルエン、ヘキサンなどの非水系有機溶媒で逆
抽出１分液後冷却晶出などの常套手段により固体となし
ｐ過分離して回収できる。

またインドール溶離後のカラムは充分水洗して溶媒を除
去した後、トリプトファンの分離に再使用される。

以下参考例、実施例を示すが、憾は重量係である。

〔実施例−１〕 大腸菌を培養して生産された酵素トップ１−ファンシン
ターゼの存在下、水性媒体中でインドールとＬ−セリン
を縮合させて得たＬ−１−リブｌ−７アンを含む反応液
に、活性炭及び水を添加し、硫酸にてＰ）Ｉ４として９
５〜１００℃で１時間加熱して菌体をフロック化後、活
性炭に吸着された菌体をそのまま濾過により除去した。

このようにして前処理して得られたＬ−）−リフトファ
ン３８係（０，１９Ｍ）、インドールを０．１俤、Ｌ−
セリンを０．２％（０，０２Ｍ）、アンモニウムイオン
を０．８％（０，４４Ｍ）、ナ１〜リウムイオンを０．
２　’！　（ｏ、　ｎ　９　Ｍ　）含む水溶液２５８０
ｇ（アミノ酸及びカチオン総モル当量が１９）をレバチ
ット５Ｐ−１１２（バイエル社品、交換容ｆｉ　１．９
　ｍｏｌ／ｌ　）１．０１を充填したカラムにコンディ
ショニング再生をして上部より５Ｖ＝５で通液させた。

通液終了時の留下液を、高速液体クロマトグラフィーで
Ｌ−１−リプトファンの検出を行なったが検出されなか
った。

つぎに水２１％５ｖ＝１０で洗浄後１０％ＮＨ３水６０
０ｆ、５Ｖ＝２で溶離、さ６に水１ｏｏ。

ｇで押し出しを行ない、溶離液１６００７９を得た。

溶離液中には、Ｌ−１−リブ１−ファン５．９係（９４
１ｇ相当、吸着原液中のＬ−１−リブ１〜フアンに対し
て９６．０係の回収率）、インドールｔ　ｐｐｍ以下（
インドール除去率はぼ１００％）を含有していた。

該溶離液を減圧下に濃縮して約４７００とし、５°Ｃテ
２１１’、’？　ＩＨＩ　晶出ａ　行ナイ１　’／　：
Ｆ−Ｚ　１ｍ　上Ａ　１！４　＄　石過後、さらに水１
００ｇで洗浄しｗｅｔ、ケーキ１３６．８ｇを得て、こ
れを乾燥し黄白色鮪片状の結晶８０．４．ｌＦを得た＠ 通算収率８２．０％／吸着原液、製品品質は純度９９６
係、旋光度−３１３°、インドール含有量１．２ｐｐｍ
とインドールをほとんど含まず、インドール臭はまった
く感じられなかった。これはもちろん国内飼料用添加物
規格を十分満足する品質である。

また、Ｌ−）−リブトファン溶離後の樹脂は、さらに２
１の水で水洗後、８０％イソプロピルアルコール水２０
００．９でカラム上部より５Ｖ＝２□で流出させ、イン
ドール溶離液２０００．９を得た。

該溶離液中にはインドールがｏ、　１２　％　（吸着原
液中のインドールに対して９２．０チの回収率）含有さ
れていた。

〔実施例−２〕 実施例−１と同様にして、インドールの溶離を行なわな
いで、Ｌ−１−リブトファンの吸着、溶離、再生のみを
８回繰り返した。その間、Ｌ−１−リブ１−ファン溶離
時の流下液中のインドール含有量をチェクし、インドー
ルは検出されなかった。

９回目のＬ−トリプトファン溶離液において若干のイン
ドールが検出されたため、９回目のＬ−１−リプ１−フ
ァン溶離後水洗を付した後、カラム上部より８０多イソ
プロピルアルコール水２０００Ｉを５Ｖ＝２で流し、イ
ンドールの溶離を行ないインドール溶離液２０００．９
を得た。

該溶離液中には、インドールが３．２係含有されていた
。該溶１１１ｉ液を５００ｇまで濃縮後、６０℃にてｎ
−ヘキサン２００ｇを加えて混合抽出、分液後ｎ−ヘキ
サン層を冷却して、５℃／　２　Ｈｒ晶出、ヌツチェで
渥過して、得られたｗｅＬケーキを屹燥して、インドー
ル３９．０．１Ｆを得た。（回収率６１，０％、ガスク
ロマトグラフィー純度１００φ）該回収インドールは、
Ｌ−１−リブトファン酵素反応の原料として再使用した
が、反応には全く形容ないことが確認された。

なお、このようにインドールの溶離終了後、水洗を付し
て再び再生後、Ｌ−１−リブ１−ファンの吸着、溶離を
繰り返し、Ｌ−１〜リブトフアン溶離液中にインドール
が検出されると、イソプロピルアルコール水によりイン
ドールの溶離回収を行なうことを繰り返しても、得られ
たいずれのＬ−１−リプミーファン溶離液からも５．−
　　　　　　　　　・操作を行っても、得られたものは
国内飼Ｌ１用添加物規格を十分に満足する無臭の品質で
あった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　インドールを原料に用いて酵素作用により得られた
   未反応インドールを含むトリプトファン反応液を、ポー
   ラス型陽イオン交換樹脂層へ通液して、樹脂のイオン交
   換部に吸着させたトリプトファンをアルカリまたは酸の
   水溶液を用いて溶離した後、樹脂のポーラス部に吸着さ
   れたインドールを、水と混合する含水有機溶媒を用いて
   溶離させることを特徴とするトリプトファンの精製方法
   。 ２　トリプトファンの溶離液に用いるアルカリ水溶液が
   、アンモニア水である特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３　インドールの溶離に用いる水と混合する含水有機溶
   媒が、低級脂肪族アルコール水溶液である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。