JPH0762020B2 - ドコサヘキサエノイルジアシルグリセロールの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は癌細胞に対して強い分化誘導活性を示すドコサ
ヘキサエン酸を含有するジアシルグリセロールの製造法
に関し、更に詳細にはSn−２位にドコサヘキサエン酸を
結合しているSn−1,2−ジアシルグリセロールを水産動
物の卵から分画したホスファチジルコリンから製造する
方法に関する。

（従来の技術） ω−３系高度不飽和脂肪酸の１つであるドコサヘキサエ
ン酸はエイコサペンタエン酸同様、血中のコレステロー
ルやトリグリセリド濃度を低下させ血小板凝集を抑制す
る作用が知られている。一方、細胞膜を構成する脂質二
重層の流動性は、脂質の構成脂肪酸に支配されている。
そのため、ドコサヘキサエン酸の様な高度不飽和脂肪酸
の取込みは、細胞膜脂質の流動性を変化させ、細胞膜の
修飾を経て細胞内に情報を伝達させるために利用されて
いる。

特に細胞のホルモン作用発現機構とリン脂質代謝の関係
から細胞膜中のホスファチジルコリン、ホスファチジル
エタノールアミン、およびジアシルグリセロールに存在
するドコサヘキサエン酸は細胞膜脂質中に立体規則的に
分布していることが知られており、ドコサヘキサエン酸
は細胞機能の発現に大きく関与していると思われる。

本発明者らはsn−２位にドコサヘキサエン酸を有するホ
スファチジルコリンにフレンド白血病細胞、マウス骨髄
性白血病細胞、マウス奇形腫細胞を正常細胞へ分化誘導
する作用を先に見出した（特開昭59−46226号）。一
方、アール・カンナギら（Biochimica et Biophysica A
cta,712,161〜168,1982）はネズミ骨髄性白血病細胞の
分化誘導前後に細胞膜リン脂質のホスファチジルコリン
のドコサヘキサエン酸含量が1/10に減少することを報告
している。さらに本発明者らはsn−２位にドコサヘキサ
エン酸を有するホスファチジルコリンを強力な発生およ
び分化の場となる受精卵に含まれる分化誘導物質として
見出した際に、このホスファチジルコリン以外の脂質に
も分化誘導活性を認めた。その活性物質はパルミチン酸
−ドコサヘキサエン酸およびオレイン酸−ドコサヘキサ
エン酸のジアシルグリセロールの混合物であった（日本
農芸化学会、昭和58年度大会講演要旨集、118頁,2H−2:
特開昭60−58917号）。以上の如くドコサヘキサエン酸
を含むジアシルグリセロールの生化学的な重要性が発見
されるようになったが、これらの製造に関してはこれま
で開発されていないのが現状である。

（発明が解決しようとする問題点） ドコサヘキサエン酸は水産動物の脂肪組織中ではトリア
シルグリセロールとして存在し、動物の生体組織中では
細胞膜構成成分の極性脂質中に見出される。特に動物に
おいてドコサヘキサエン酸に富む部位は脳の髄鞘、視神
経の桿体および肝臓等が知られているが、主としてリン
脂質に局在している。また比較的人手が容易な血球や卵
黄のリン脂質や、水産動物のリン脂質にもドコサヘキサ
エン酸は豊富である。

グリセロールのsn−１位とsn−２位に特定脂肪酸を組み
込んでsn−1,2−ジアシルグリセロールを合成する方法
は既に知られている。これらの合成法では合成過程にお
いてsn−1,2−ジアシルグリセロールが非常に高い比率
でsn−1,3−ジアシルグリセロールにマイグレーション
（転移）する。そのためsn−1,2位に異なる脂肪酸を組
み込む事は難しい。化学合成法ではsn−１位とsn−３位
を区別して反応する事は非常に難しく、さらにsn−1,2
−ジアシルグリセロールとsn−2,3−ジアシルグリセロ
ールの分離が困難である。

グリセロールのsn−２位にドコサヘキサエン酸を結合さ
せた混酸基ジアシルグリセロールの合成を従来法で実施
すると、α−モノクロルヒドリンの一級水酸基にドコサ
ヘキサエン酸以外の脂肪酸クロライドでアシル化し、さ
らにドコサヘキサエン酸クロライドでsn−２位をアシル
化し、硝酸銀処理、希酸処理と複雑な工程を軽由するこ
とになる。

この従来法では、脱クロライドで生成する水酸基がsn
−２位に転位し、多量のsn−1,3−ジアシルグリセロー
ルを生成する、合成物にsn−1,2−ジアシルグリセロ
ールとsn−2,3−ジアシルグリセロールが混在すると両
者を識別出来ない、ドコサヘキサエン酸のクロライド
化の際、二重結合マイグレーションが生じ易い等の欠点
を有している。

そのため得られるジアシルグリセロールは細胞レベルの
実験で、厳しい立体構造の識別を行う酵素やレセプター
に対して正確に認識されない。例えばビー・ジェー・ホ
ルブらは血小板に対してその酵素反応系を活性化するジ
アシルグリセロールは、イノシトールリン脂質の加水分
解物と同一の立体構造を示すsn−２位に高度不飽和脂肪
酸を有するsn−1,2−型ジアシルグリセロールである事
を証明している（J.Lipid Res.11,558〜564,1981）。

上述のように現在まで、sn−２位にドコサヘキサエン酸
を有するジアシルグリセロールを天然原料から直接分取
したり、化学合成のみで製造する事は非常に困難であっ
た。

従って、本発明の目的は、経済的、且つ高収率にて、出
来るだけ簡単な工程によりsn−２位にドコサヘキサエン
酸を有するジアシルグリセロールを製造することにあ
る。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、水産動物の卵を原料としてホスファチジルコ
リンを分離し、次いで逆相分配カラムクロマト処理した
後にホスホリパーゼＣで加水分解することを特徴とす
る。本発明方法を行うことによりsn−１位に飽和酸又は
モノエン酸を結合し、sn−２位にドコサヘキサエン酸を
結合したsn−1,2−ジアシルグリセロールが容易に得ら
れる。

以下本発明につき更に詳細に説明する。

本発明者らは、先に低毒性で制癌性を有する物質を動
物、植物、微生物界の広い生物範囲から探索し、その結
果、強力な発生および分化の場となる受精卵について、
水産動物の一種であるニジマス（Salmo gairdneri）の
胚を用いて、この胚中の総脂質中に活性があることを示
した（旭健一：癌細胞の分化誘導と制癌（穂積本男、高
久史麿編）、261〜278頁、ソフトサイエンス社、東京、
1985）。これらの物質は未分化培養癌細胞に対する分化
誘導能を指標として検索された。このバイオアッセイで
見出されたコリン含有リン脂質は、動物の腫瘍細胞に対
して分化誘導活性を有する他に、著しく低毒性で優れた
制癌活性を持っていた。コリン含有リン脂質にはスフィ
ンゴリン脂質とグリセロリン脂質の二つの大群が知られ
ているが、前者に属するスフィンゴミエリンのアミド結
合が見出されないことから後者に属することが推定され
た。後者にはモノアシルモノエーテル型、ジアシルエス
テル型、モノアシル−１−モノアルケニルエーテル（プ
ラズマロゲン）型、モノアシル（リゾ）型が存在する
が、質量分析より求めた分子量Ｍ、ホスホリパーゼA
₁（sn−１位のエステル結合を特異的に加水分解す
る）、ホスホリパーゼA₂（sn−２位のエステル結合を特
異的に加水分解する）の加水分解によって脂肪酸が別々
に得られることからジアシルエステル型のグリセロリン
脂質、即ちホスファチジルコリンと判断した。

さらに単離されたホスファチジルコリンを逆相分配カラ
ムを装着した高速液体クロマトグラフィーで各分子種ご
とに分画して、個々の分画をバイオアッセイで検討した
ところ特定の分子種のみに分化誘導活性が認められた。
活性が認められた分子種は高速液体クロマトグラフィー
で求められたクロマトグラム上の大部分を占めるメイン
ピークであった。メインピークから回収されたホスファ
チジルコリンの分子種を決定するため、このホスファチ
ジルコリンを三弗化ホウ素メタノール法で脂肪酸をメチ
ルエステル化した。脂肪酸メチルの同定はキャピラリー
カラムガスクロマトグラフィー（液相：カーボワックス
20M、25m）における標準体との保持時間の同一性で行っ
た。

その結果、C_22:6ω３（即ちドコサヘキサエン酸）が主
成分で、その他にC_16:0（パルミチン酸）、C_18:0（ステ
アリン酸）、C_18:1（オクタデセン酸）が同定された。
同定された脂肪酸のホスファチジルコリンのsn位置を決
定するため前述のホスホリパーゼで測定した。メインピ
ークから回収されたホスファチジルコリンをホスホリパ
ーゼA₁により加水分解し、三弗化ホウ素メタノール法で
脂肪酸をメチルエステル化した。ガスクロマトグラフィ
ーで分析した結果、C_16:0とC_18:1が主成分でその他にC
_18:0が同定された。次に、このホスファチジルコリンを
ホスホリパーゼA₂により加水分解し、三弗化ホウ素メタ
ノール法で脂肪酸をメチルエステル化した。ガスクロマ
トグラフィーで分析した結果、ドコサヘキサエン酸がメ
イン成分として同定された。このホスファチジルコリン
の推定される分子種を分析するため質量分析計FAB−MS
（Pos.）への直接導入法による分子イオンに相当する質
量スペクトルm/zを測定した。その結果、m/z806（C_16:0
−ドコサヘキサエノイルホスファチジルコリンに相
当）、m/z832（C_18:1−ドコサヘキサエノイルホスファ
チジルコリンに相当）、m/z834（C_18:0−ドコサヘキサ
エノイルホスファチジルコリンに相当）に高い強度を示
した。

このホスファチジルコリンは水産動物の卵から下記の様
に高収率で得られる。卵中の総脂質は約１割でその半分
はリン脂質である。詳細には、総脂質に対するホスファ
チジルコリン量は30％でリン脂質に対してホスファチジ
ルコリン量は70％である。しかも、分化誘導活性を示す
sn−２位にドコサヘキサエン酸を結合するホスファチジ
ルコリンは卵ホスファチジルコリンの主成分である。ま
た、ドコサヘキサエン酸含有ホスファチジルコリンは逆
相分配クロマトグラフィーにおいては最初に溶離する成
分であり、使用する溶離液もメタノール単独で十分であ
る点から分取しやすい材料である。

水産動物の卵から得られる総脂質中のホスファチジルコ
リンは上述したように30％以上もあり、さらに活性を示
す分子種はクロマトグラム上のメインピークである点か
ら、活性を示す分子種のジアシルグリセロールを分取す
る原料に適している。

また、ドコサヘキサエン酸は、植物性原料からは見出し
難く、動物性原料でも陸上動物よりも水産動物から見出
されるので、これらの動物の卵が原料として好ましい。
天然原料にはシャケやニシン等の水産動物の卵が入手容
易であり、また、養殖が盛んなハマチ、コイ、ウナギ、
ニジマス、クルマエビ等の卵も原料として好ましい。

これらの原料は、可能な限り新鮮であることが望まし
く、採卵後直ちに冷凍、凍結乾燥または真空乾燥処理し
た原料を使用すると、原料中の酸価の上昇、得られる目
的物の過酸化物価の上昇による品質低下を避けることが
でき、良質な目的物を得ることができる。

従って、本発明では、まず、水産動物の卵を原料として
ホスファチジルコリンを分離する。ホスファチジルコリ
ンの分離は、常法により例えば溶剤抽出後に行うことが
できる。その際、材料に対して例えば蒸留水およびメタ
ノール−クロロホルム系溶媒、アセトン、エーテル、ヘ
キサン等の溶剤を加え、必要に応じて、その混合物をロ
ウルデス・ホモジナイザー、ソルバール・オムニミキサ
ー、ワーリングブレンダー、ポッター・エルベージェ
ム、ガラスホモミキサー等によってホモジナイズする。
無酸素状態下として、例えば真空下、窒素気流下および
二酸化炭素気流下に、０℃〜60℃、10〜180分溶剤抽出
することができる。溶剤は魚卵１部に対して１〜５部添
加するのが普通である。

溶剤抽出した総脂質からホスファチジルコリンを分離す
る方法としては、例えば次のような方法がある。総脂質
を冷アセトン処理してリン脂質を分画してからカラムク
ロマト法で分離する方法、総脂質を直接シリカゲルクロ
マトグラフィーに付し、ヘキサン→クロロホルム→メタ
ノールと溶媒の混合比率を無極性溶媒から極性へ変化さ
せながら分離する方法等である。

次に、総脂質中のホスファチジルコリンより逆相分配カ
ラム、例えば高速液体クロマトグラフィー、好ましくは
全自動分取型高性能液体クロマトグラフィーによって分
取し、次いで活性を示す分子種のホスファチジルコリン
を、ホスホリパーゼＣで処理する。ホスファチジルコリ
ンをホスホリパーゼＣで処理すると目的のジアシルグリ
セロールとコリンホスフェートに加水分解される。

本発明に用いることができるホスホリパーゼＣは、一種
のホスホジエステラーゼで、グリセロリン脂質やスフィ
ンゴミエリンのリン酸ジエステル結合を加水分解し、ジ
アシルグリセロールやセラミドとリン酸モノエステルを
生成する一群の酵素の総称である。ホスホリパーゼＣ
は、クロストリジウム属の細菌やバチルス・セレウス等
の培養濾液から得られるものを用いることができる。反
応生成物は、エチルエーテル等の溶媒で抽出して分析す
ることができる。

反応生成物のジアシルグリセロールの立体特異性を測定
するには、例えばシリカゲル薄層クロマトグラフィーに
付し、クロロホルム／アセトン／メタノール（90/9/1,v
ol/vol/vol）を展開溶媒とし、未蒸留モノグリセリドを
標準物質として展開し、ヨウ素蒸気で発色させる。その
結果、この反応生成物はsn−１位、２位ジアシルグリセ
ロールであると同定される。また、この反応生成物の推
定される分子種を分析するには、例えばFAB−MS（Po
s.）への直接導入法により分子イオンに相当するm/zを
測定する。その結果m/z663（Ｍ＋Na;C_16:0−ドコサヘキ
サエン酸・ジアシルグリセロールに相当）、m/z689（Ｍ
＋Na;C_18:1−ドコサヘキサエン酸・ジアシルグリセロー
ルに相当）、m/z671（Ｍ＋Na;C_18:0−ドコサヘキサエン
酸・ジアシルグリセロールに相当）に高い強度が見られ
る。

このホスファチジルコリンから得られたジアシルグリセ
ロールは原料ホスファチジルコリンのホスホリパーゼA₂
の加水分解によりsn−２位にドコサヘキサエン酸が結合
していたことは証明されている。即ち、この反応生成物
はドコサヘキサエン酸をsn−２位に結合しているsn−１
位、２位ジアシルグリセロールである。このジアシルグ
リセロールは総脂質中のジアシルグリセロールから分取
された活性を示す分子種群のジアシルグリセロールと同
等の分化誘導活性を示す。

（発明の効果） 本発明の方法によれば、水産動物の卵を原料として精製
処理することにより、植物細胞、受精卵および癌細胞、
例えば奇形腫細胞、白血病細胞等の如き未分化細胞を正
常細胞に分化誘導する作用（腫瘍細胞や癌細胞に対して
は制癌作用）を有するドコサヘキサエン酸をsn−２位に
結合しているジアシルグリセロールを、簡単な方法で、
しかも天然の立体特異性を維持したまま、高収率で得る
ことが出来る。

（実施例） 以下、本発明を実施例および試験例によって更に詳細に
説明する。

実施例１ 採卵後直ちに冷凍したニジマスの受精卵を窒素気流下で
解凍した。この原料1300gをアセトン2lに入れ、窒素気
流下、T.H.ホモミキサー（特殊機工工業製）で荒くホモ
ゲナイズしてからエクセル・オート・ホモゲナイザー
（日本精器製作所製）で氷冷状態下30分ホモゲナイズし
た。

懸濁液をブッフナー漏斗で濾過し、濾液と湿ケーキに分
けた。濾液からアセトン抽出物10gを得た。乳灰色の湿
ケーキ830gをエチルエーテル3lに入れ、スリーワンモー
タータイプ600GM（新東科学製）で200rpmで回転しなが
ら30分間抽出した。懸濁液をブッフナー漏斗で濾過し、
濾液と湿ケーキに分けた。濾液からエチルエーテル抽出
物48gを得た。乳灰色の湿ケーキ770gをクロロホルム−
メタノール（1/1,vol/vol）混液１で２回、分液漏斗
中で抽出した。懸濁液をブッフナー漏斗で濾過し、濾液
と乳灰色の湿ケーキに分けた。濾液からクロロホルム−
メタモノール抽出物55gを得た。乳灰色の湿ケーキ60gに
クロロホルム−メタノール（2/1,vol/vol）混液1.5lで
２回、分液漏斗中で抽出した。懸濁液をブッフナー漏斗
で濾過し、濾液と湿ケーキに分けた。濾液からクロロホ
ルム−メタノール抽出物を5g得た。各脂質抽出物を一緒
にした。総脂質量118gであった（対原料収率9.1％）。

総脂質の全量をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
（シリカ60、和光純薬製:8φ×40cmカラムに2l）に付し
た後、ヘキサン中にクロロホルムの比率を上げていく溶
離液系で中性脂質を除去した。中性脂質の回収量69g
で、組成は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサ
ン−エチルエーテル−酢酸50/50/1,vol/vol/vol）分析
でトリアシルグリセロールが主体であった。

中性脂質を除いたカラムに、クロロホルム中にメタノー
ルの比率を上げていく溶離液系を流した。クロロホルム
対メタノールの比率が35:65〜25:75の範囲にホスファチ
ジルコリンを主成分とする区分が溶出し、脱溶媒後、28
gのホスファチジルコリンを得た。ホスファチジルコリ
ン区分の判定は、薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：
クロロホルム−メタノール−水65/25/4,vol/vol/vol）
で行った。この分画の内、薄層クロマトグラフィーでRf
値0.20〜0.30（ホスファチジルコリン）にシングルスポ
ットのみが認められる分画を集めて、窒素気流下で脱溶
媒を行い、純ホスファチジルコリンを16.7g得た。

次いで、得られたホスファチジルコリンを167mlのベン
ゼンに溶解してクロマトグラフィー用サンプル溶液とし
た。サンプル溶液は、全自動分取型液体クロマトグラフ
ィー（東洋曹逹工業製、HLC−837）にODS（オクタデシ
ルシリル基を化学結合させたシリカゲル）充填カラム
（ODS−120T、φ55mm×60cm）を装着し、溶離液として
メタノールを40ml/minの速度で流しながら、6mlを自動
注入し、目的物のメインピーク部を連続28回分取した。
分取区分を窒素気流下で脱溶媒して目的物のホスファチ
ジルコリンを12.2g得た。

分取されたホスファチジルコリンを三弗化ホウ素メタノ
ール法でメチルエステル化し、キャピラリーカラムガス
クロマトグラフィー（液相：カーボワックス−20M、25
m、170℃）で脂肪酸組成を測定した。その結果、ドコサ
ヘキサエン酸は41％で、パルミチン酸、ステアリン酸、
オレイン酸が各約10％を占めていた。

このホスファチジルコリンをホスホリパーゼA₂で加水分
解し、三弗化ホウ素メタノール法でメチルエステル化
し、キャピラリーカラムガスクロマトグラフィーでsn−
２位の脂肪酸組成を測定した。その結果、ドコサヘキサ
エン酸は82％であり、その他に数本の微小ピークが認め
られた。

また、ホスファチジルコリンの過酸化脂質量は、電位差
滴定法（自動滴定装置GT−05、三菱化成工業（株）製）
で測定した結果、27.5meq./kgであった。

分取されたホスファチジルコリンの一部500mgを600μｌ
のメタノールに溶解し、ホスホリパーゼＣ（シグマ社
製、No.EC3.1.4.3;バチルス・セレウス（Bacillus cere
us）起源）を300unit、0.2Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.
4）を5ml、0.05M塩化カルシウムを3ml、エチルエーテル
を3ml加えた。反応混合物をスクリューキャップ付20ml
の試験管中にテフロンスターラーバーと共に加えて、35
℃で１時間激しく撹拌しながらインキュベーションし
た。

反応混合物にエチルエーテル10mlを加えてから分液漏斗
に移し、抽出後、窒素気流下で濃縮した。エチルエーテ
ルで抽出された反応混合物中の未反応のホスファチジル
コリンを除去するため、アセトンを1ml加え、ホスファ
チジルコリンを沈殿させた。エチルエーテル層を硫酸ナ
トリウムで脱水し、さらに、窒素気流下で脱溶媒して目
的のコリン基が切除されたジアシルグリセロールが420m
g得られた。

得られたジアシルグリセロールは油状であり、クロロホ
ルム、ヘキサンに可溶で水に不溶であった。

薄層クロマトグラフィーのクロロホルム／メタノール／
水系（65/25/4,vol/vol/vol）展開溶媒で反応前後の成
分を測定した。

反応後の成分のRf値は、反応前の0.3から0.8に変化し、
ドラーゲンドルフ試薬とディトマー・レスター試薬に対
する発色が陽性から陰性に変化した。クロロホルム／ア
セトン／メタノール系（90/9/1,vol/vol/vol）展開溶媒
で標準体として未蒸留モノグリセリドと共に反応後の成
分を測定した。

反応後の成分はRf値が0.65で、標準体のsn−１位、２位
ジアシルグリセロールの位置に相当していた。本成分は
FAB−MSによって、分子量640（〔M+Na〕⁺663）、分子量
666（〔M+Na〕⁺689）および分子量668（〔M+Na〕⁺691）
が認められた（第１図）。

実施例２ 採卵後直ちに冷凍したニジマスの受精卵を窒素気流下で
解凍した。この原料1500gをクロロホルム／メタノール
（2/1,vol/vol）混液6lに入れ、窒素気流下、T.H.ホモ
ミキサー（特殊機工工業製）で高速で剪断抽出しながら
氷冷状態下30分間ホモゲナイズした。

懸濁液をブッフナー漏斗で濾過し、濾液と乳灰色の湿ケ
ーキに分けた。乳灰色の湿ケーキ910gを上記溶媒2lに入
れ、上記と同一の条件で処理した。同様に懸濁液から濾
液を湿ケーキに分けた。乳灰色の湿ケーキ780gを上記溶
媒2lに入れ同一条件で処理した。さらに３回目の懸濁液
から濾液と湿ケーキの濾別を行った。全濾液を集めて遠
心分離し、上澄液にクロロホルム3lと蒸留水3lを加え
て、よく水洗した後、遠心分離で二層に分離した。

下層のクロロホルム層を集めて、窒素気流下、ロータリ
ーエバポレーターを用い、30℃で濃縮し、溶媒留去の最
後にベンゼン100mlを加えて脱水を行いながら脱溶媒し
た。溶媒を留去した抽出物を真空デシケーターで一昼夜
乾燥して得られた全脂質の重量は、127g（対原料収率8.
5％）であった。

得られた全脂質を氷冷アセトン1.3l中に入れ、窒素気流
下、スリーワンモータータイプ600GM（新東科学製）で2
00rpmで回転しながら10分間抽出した。アセトン懸濁液
を冷却したブッフナー漏斗で濾過し、沈殿を回収した。
この沈殿に、上記同様の冷アセトン処理を４回繰り返し
て、完全に中性脂質を除いたリン脂質分画57g（総脂質
中45.2％）を得た。リン脂質全量をシリカゲルカラムク
ロマトグラフィー（富士ゲルCG−３、水戸化学製、５φ
×40cmカラムに700cc）に付した後、クロロホルム−メ
タノール（4/1,vol/vol）混液の溶離液系でホスファチ
ジルコリン以前に溶出するホスファチジルエタノールア
ミン等のリン脂質を除去した。

さらに純粋なホスファチジルコリンを分画するためクロ
ロホルム−メタノール（3/2,vol/vol）混液の溶離液系
で溶出させた。溶離液500mlずつ分画し、各分画を薄層
クロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム−メタノ
ール−水65/25/4,vol/vol/vol）で測定した。薄層クロ
マトグラフィー上のRf値0.20〜0.30（ホスファチジルコ
リン）にシングルスポットのみが認められる分画を集め
て、窒素気流下に脱溶媒を行い、純ホスファチジルコリ
ンを19g得た。

次いで、得られたホスファチジルコリンを190mlのベン
ゼンに溶解してクロマトグラフィー用サンプル溶液とし
た。サンプル溶液は、全自動分取型液体クロマトグラフ
ィー（東洋曹逹工業製、HLC−837）にODS充填カラム（O
DS−120T、φ55mm×60cm）を装着し、溶離液としてメタ
ノールを40ml/minの速度で流しながら、6mlを自動注入
し、目的物のメインピーク部を連続32回分取した。分取
区分を窒素気流下で脱溶媒して目的物のホスファチジル
コリンを13.9g得た。

このホスファチジルコリンを実施例１と同様に分析した
ところ、脂肪酸組成としてドコサヘキサエン酸を40％含
有しており、またホスホリパーゼA₂で加水分解して得た
sn−２位の脂肪酸組成は、ドコサヘキサエン酸を83％含
有していた。また、過酸化脂質量は、23.8meq./kgであ
った。

分取されたホスファチジルコリンの一部700mgを800μｌ
のメタノールに溶解し、ホスホリパーゼＣ（シグマ社
製、No.EC3.1.4.3;クロストリジウム・ペルフリンゲン
ス（Clostridium perfringens）起源）を400unit、0.2M
トリス−塩酸緩衝液（pH7.4）を6ml、0.05M塩化カルシ
ウムを3.5ml、エチルエーテルを4ml加えた。反応混合物
をスクリューキャップ付20mlの試験管中にテフロンスタ
ーラーバーと共に加えて、35℃で１時間激しく撹拌しな
がらインキュベーションした。

反応混合物にエチルエーテル12mlを加えてから分液漏斗
に移し、抽出後、窒素気流下で濃縮した。エチルエーテ
ルで抽出した反応混合物中の未反応のホスファチジルコ
リンを除去するため、氷冷アセトンを1ml加え、ホスフ
ァチジルコリンを沈殿させた。エチルエーテル層を硫酸
ナトリウムで脱水し、さらに、窒素気流下で脱溶媒して
目的のジアシルグリセロールが598mg得られた。

得られたジアシルグリセロールは油状であり、クロロホ
ルム、ヘキサンに可溶で水に不溶であった。

薄層クロマトグラフィー（展開溶媒；クロロホルム／メ
タノール／水系（65/25/4,vol/vol/vol）で反応前後の
成分を測定した。

反応後の成分のRf値は、反応前の0.3から0.8に変化し、
ドラーゲンドルフ試薬とディトマー・レスター試薬に対
する発色が陽性から陰性に変化した。さらに、薄層クロ
マトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム／アセトン・
メタノール系（90/9/1,vol/vol/vol）で標準体として未
蒸留モノグリセリドと共に反応後の成分を測定した。

反応後の成分はRf値が0.65で、標準体のsn−１位、２位
ジアシルグリセロール（一般名β−ジアシルグリセロー
ル）の位置に相当していた。本成分は、FAB−MSによっ
て分子量640（〔Ｍ＋Na〕^＋663）、分子量666（〔Ｍ＋N
a〕^＋689）および分子量668（〔Ｍ＋Na〕^＋691）が認め
られた。

実施例３ タラの卵500gを実施例１と同様に溶剤処理して、脂質14
g（対原料収率2.8％）を得た。この脂質の全量を実施例
１と同様にシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し
て同様に処理し、薄層クロマトグラフィーでRf値0.20〜
0.35のシングルスポットを示す純ホスファチジルコリン
分画4.8gを得た。

次いで、この純ホスファチジルコリンを実施例１と同様
に全自動大量分取液体クロマトグラフィーに付して、連
続14回自動分取を繰り返し、メインピークを分取して、
目的のホスファチジルコリン3.3gを得た。

このホスファチジルコリンを実施例１と同様に分析した
ところ、脂肪酸組成としてドコサヘキサエン酸を40％含
有しており、また、ホスホリパーゼA₂で加水分解して得
たsn−２位の脂肪酸組成は、ドコサヘキサエン酸を82％
含有していた。また、過酸化脂質量は15.6meq./kgであ
った。

次いで、分取されたホスファチジルコリンの一部500mg
を、実施例１と同じホスホリパーゼＣを用いて同様に処
理し、コリン基が切断された目的のジアシルグリセロー
ル370mgを得た。このジアシルグリセロールは、実施例
１と同じ試験をした結果、同様の性状と特性値を示した
ので、sn−２位にドコサヘキサエン酸を含有するドコサ
ヘキサエニルジアシルグリセロールであると認められ
た。

実施例４ ニシンの卵500gを実施例１と同様に溶剤処理して、脂質
13.5g（対原料収率2.7％）を得た。この脂質の全量を実
施例２と同様にシリカゲルカラムクロマトグラフィーに
付して同様に処理し、薄層クロマトグラフィーでRf値0.
20〜0.35のシングルスポットを示す純ホスファチジルコ
リン分画5.3gを得た。

次いで、この純ホスファチジルコリンを実施例１と同様
に全自動大量分取液体クロマトグラフィーに付して、連
続11回自動分取を繰り返し、メインピークを分取して、
目的のホスファチジルコリン3.9gを得た。

このホスファチジルコリンを実施例１と同様に分析した
ところ、脂肪酸組成としてドコサヘキサエン酸を42％含
有しており、また、ホスホリパーゼA₂で加水分解して得
たsn−２位の脂肪酸組成は、ドコサヘキサエン酸を85％
含有していた。また、過酸化脂質量は9.8meq./kgであっ
た。

次いで、分取されたホスファチジルコリンの一部700mg
を、実施例２と同じホスホリパーゼＣを用いて同様に処
理し、コリン基が切断された目的のジアシルグリセロー
ル512mgを得た。このジアシルグリセロールは、実施例
１と同じ試験をした結果、同様の性状と特性値を示した
ので、sn−２位にドコサヘキサエン酸を含有するドコサ
ヘキサエニルジアシルグリセロールであると認められ
た。

実施例５ 採卵後直ちに冷凍したクルマエビの卵を窒素気流下で解
凍した。この原料1000gをアセトン1.5lに入れ、窒素気
流下、T.H.ホモミキサー（特殊機工工業製）で荒くホモ
ゲナイズしてからエクセル・オート・ホモゲナイザー
（日本精器製作所製）で氷冷状態下30分ホモゲナイズし
た。

懸濁液をブッフナー漏斗で濾過し、濾液と湿ケーキに分
けた。濾液からアセトン抽出物7gを得た。乳灰色の湿ケ
ーキ630gをエチルエーテル2.5lに入れ、スリーワンモー
タータイプ600GM（新東科学製）で200rpmで回転しなが
ら30分間抽出した。懸濁液をブッフナー漏斗で濾過し、
濾液と湿ケーキに分けた。濾液からエチルエーテル抽出
物35gを得た。乳灰色の湿ケーキ580gをクロロホルム−
メタノール（1/1,vol/vol）混液１で２回、分液漏斗
中で抽出した。懸濁液をブッフナー漏斗で濾過し、濾液
と乳灰色の湿ケーキに分けた。濾液からクロロホルム−
メタノール抽出物40gを得た。乳灰色の湿ケーキ535gに
クロロホルム−メタノール（2/1,vol/vol）混液1.5lで
２回、分液漏斗中で抽出した。懸濁液をブッフナー漏斗
で濾過し、濾液と湿ケーキに分けた。濾液からクロロホ
ルム−メタノール抽出物を4g得た。各脂質抽出物を一緒
にした。総脂質量86gであった（対原料収率8.6％）。

総脂質の全量をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
（シリカ60、和光純薬製:8φ×40cmカラムに2l）に付し
た後、ヘキサン中にクロロホルムの比率を上げていく溶
離液系で中性脂質を除去した。中性脂質の回収量54g
で、組成は薄層クロマトグラフィー（展開溶媒：ヘキサ
ン−エチルエーテル−酢酸50/50/1,vol/vol/vol）分析
でトリアシルグリセロールが主体であった。

中性脂質を除いたカラムに、クロロホルム中にメタノー
ルの比率を上げていく溶離液系を流した。クロロホルム
対メタノールの比率が35:65〜25:75の範囲にホスファチ
ジルコリンを主成分とする区分が溶出し、脱溶媒後、2
4.7gのホスファチジルコリンを得た。ホスファチジルコ
リン区分の判定は、薄層クロマトグラフィー（展開溶
媒：クロロホルム−メタノール−水65/25/4,vol/vol/vo
l）で行った。この分画の内、薄層クロマトグラフィー
でRf値0.20〜0.30（ホスファチジルコリン）にシングル
スポットのみが認められる分画を集めて、窒素気流下で
脱溶媒を行い、純ホスファチジルコリンを15.1g得た。

このホスファチジルコリンをホスホリパーゼA₂で加水分
解し、三弗化ホウ素メタノール法でメチルエステル化
し、キャピラリーカラムガスクロマトグラフィーでsn−
２位の脂肪酸組成を測定した。その結果、ドコサヘキサ
エン酸は61％であり、その他にオレイン酸30％と数本の
微小ピークが認められた。

また、ホスファチジルコリンの過酸化脂質量は、電位差
滴定法（自動滴定装置GT−05、三菱化成工業（株）製）
で測定した結果、27.5meq./kgであった。

分取されたホスファチジルコリンの一部500mgを600μｌ
のメタノールに溶解し、ホスホリパーゼＣ（シグマ社
製、No.EC3.1.4.3;バチルス・セレウス（Bacillus cere
us）起源）を300unit、0.2Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.
4）を5ml、0.05M塩化カルシウムを3ml、エチルエーテル
を3ml加えた。反応混合物をスクリューキャップ付20ml
の試験管中にテフロンスターラーバーと共に加えて、35
℃で１時間激しく撹拌しながらインキュベーションし
た。

反応混合物にエチルエーテル10mlを加えてから分液漏斗
に移し、抽出後、窒素気流下で濃縮した。エチルエーテ
ルで抽出された反応混合物中の未反応のホスファチジル
コリンを除去するため、アセトンを1ml加え、ホスファ
チジルコリンを沈殿させた。エチルエーテル層を硫酸ナ
トリウムで脱水し、さらに、窒素気流下で脱溶媒して目
的のコリン基が切除されたジアシルグリセロールが410m
g得られた。

得られたジアシルグリセロールは油状であり、クロロホ
ルム、ヘキサンに可溶で水に不溶であった。

薄層クロマトグラフィーのクロロホルム／メタノール／
水系（65/25/4,vol/vol/vol）展開溶媒で反応前後の成
分を測定した。

反応後の成分のRf値は、反応前の0.3から0.8に変化し、
ドラーゲンドルフ試薬とディトマー・レスター試薬に対
する発色が陽性から陰性に変化した。クロロホルム／ア
セトン／メタノール系（90/9/1,vol/vol/vol）展開溶媒
で標準体として未蒸留モノグリセリドと共に反応後の成
分を測定した。

反応後の成分はRf値が0.65で、標準体のsn−１位、２位
ジアシルグリセロールの位置に相当していた。本成分は
FAB−MSによって、分子量640（〔Ｍ＋Na〕^＋663）、分
子量666（〔Ｍ＋Na〕^＋689）および分子量668（〔Ｍ＋N
a〕^＋691）が認められた。

試験例 実施例で得られた化合物を用いて、フレンド白血病細胞
（マウス赤芽球性白血病（B8）細胞）に対する制癌活性
を確認した。HAMのＦ−12培地（GIBCO製）に、15％の牛
胎児血清および60mg/lのカナマイシンを加えたものに、
2.5×10⁴cells/mlとなるようにB8細胞を接種し、これに
各実施例で得られた化合物を250μｇ加えた。この際、
最終容量は5mlであった。

8.0％炭酸ガス中、37℃で７日間培養した後、オルキン
のベンチジン染色法により染色し、染色された細胞数、
即ち、赤血球への分化によりヘモグロビンを産生するよ
うになった細胞数を測定し、全細胞数に対する染色され
た細胞数の百分率から、分化誘導率（％）を求めた。実
施例で得られた化合物は50μg/mlの濃度で80％の分化誘
導率があった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例１で得られたジアシルグリセ
ロールの質量分析計FAB−MS（Pos.）による質量スペク
トルである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 旭 健一 埼玉県和光市諏訪原団地１―４―108 (72)発明者 高橋 信孝 東京都杉並区荻窪４丁目27番２号

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ドコサヘキサエン酸をsn−２位に結合して
   いるsn−1,2−ジアシルグリセロールの製造にあたり、
   水産動物の卵を原料として、無酸素状態下に溶剤抽出し
   総脂質とし、得られた総脂質を冷溶剤で処理後、又は溶
   剤抽出で得られた総脂質をそのままカラムクロマト法に
   よりホスファチジルコリンを分離し、次いで逆相分配カ
   ラムクロマト処理した後にホスホリパーゼＣで加水分解
   することを特徴とするドコサヘキサエノイルジアシルグ
   リセロールの製造法。