JPH09268190A - マイトマイシンｃ誘導体及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤 - Google Patents
マイトマイシンｃ誘導体及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤Info
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- JPH09268190A JPH09268190A JP8079969A JP7996996A JPH09268190A JP H09268190 A JPH09268190 A JP H09268190A JP 8079969 A JP8079969 A JP 8079969A JP 7996996 A JP7996996 A JP 7996996A JP H09268190 A JPH09268190 A JP H09268190A
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- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
- C07D487/14—Ortho-condensed systems
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は癌、免疫疾患に関与するとされる非
受容体型チロシンキナーゼに対して優れた阻害活性を示
し、かつ他のプロテインキナーゼに対して選択性が低い
物質及びそれを有効成分とする医薬を提供することを目
的とする。 【解決手段】 一般式 【化１】 （式中、ＲＣＯはｎ−３系高度不飽和脂肪酸のアシル残
基を表す。）で表される高度不飽和脂肪酸残基を有する
マイトマイシンＣ誘導体及びそれを有効成分とする医
薬、特に非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤。
受容体型チロシンキナーゼに対して優れた阻害活性を示
し、かつ他のプロテインキナーゼに対して選択性が低い
物質及びそれを有効成分とする医薬を提供することを目
的とする。 【解決手段】 一般式 【化１】 （式中、ＲＣＯはｎ−３系高度不飽和脂肪酸のアシル残
基を表す。）で表される高度不飽和脂肪酸残基を有する
マイトマイシンＣ誘導体及びそれを有効成分とする医
薬、特に非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はｎ−３系高度不飽和
脂肪酸残基を有するマイトマイシンＣ及びそれを有効成
分とする医薬、特に非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤
に関するものである。
脂肪酸残基を有するマイトマイシンＣ及びそれを有効成
分とする医薬、特に非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】細胞が何らかの刺激を受けて、物質生
産、分化、増殖等の反応を引き起こすに至るまでの細胞
内情報伝達系には、不活性型蛋白がリン酸化されて活性
型となり、その機能を発揮する場合が数多く存在するこ
とが知られている。その反応に関わるプロテインキナー
ゼとしては、サイクリックAMP依存性プロテインキナー
ゼ、プロテインキナーゼC、カルモジュリン依存性プロ
テインキナーゼ、また増殖因子受容体に見られる受容体
型チロシンキナーゼ等が知られている。インターフェロ
ンやインターロイキン類等の各種サイトカインの細胞内
情報伝達経路にも、細胞内タンパク質のチロシンリン酸
化が関与することが知られていた。しかしサイトカイン
の受容体はキナーゼ活性を持たず、上記プロテインキナ
ーゼのいずれもこの経路に関与しないことから、サイト
カイン刺激により活性化されるチロシンキナーゼについ
ては、長い間不明であった。1993年終盤に至って、サイ
トカイン受容体に会合して活性化される非受容体型チロ
シンキナーゼが発見され、その後一連の非受容体型チロ
シンキナーゼが次々に同定されている。その中には、最
も良く知られている発癌遺伝子の一つであるsrc遺伝子
産物や、srcに相同性の高い遺伝子群産物が含まれるこ
とが明かとなった。従来、遺伝子配列の変異等によって
発癌遺伝子産物が異常に発現したり異常に活性化すると
癌化につながることが知られていたが、その生体内での
本来の役割はほとんど明らかにされていなかった。最近
の非受容体型チロシンキナーゼ研究の進展により、src
遺伝子異常による癌化は、サイトカイン刺激により伝わ
るはずの細胞の分化、増殖に関わるシグナルのうち、増
殖のみが異常に昂進したことによることが示唆された。
従って、これらの非受容体型チロシンキナーゼを阻害す
る物質は、新しい作用機序に基づく免疫疾患や癌の治療
薬として期待される。実際、src遺伝子産物のチロシン
キナーゼ活性を特異的に阻害するハービマイシンＡ（J.
Antibiotics, 32, 255,1975）は、ウイルス型src遺伝
子（v-src）を持つラウス肉腫ウイルスにより癌化した
細胞を脱癌化することが報告されている（Cancer Resea
rch, 49, 780-785, 1989）が、毒性が強いため臨床応用
されるに至っていない。また、ハービマイシンＡは、カ
ルモジュリン依存性キナーゼも阻害し選択性が低い。さ
らにＨ-７、スタウロスポリン等、既知のプロテインキ
ナーゼ阻害剤も複数の種類のプロテインキナーゼを阻害
するため、臨床応用が困難である。即ちより選択性が高
く、毒性の低い非受容体型プロテインキナーゼ阻害剤の
開発が望まれている。
産、分化、増殖等の反応を引き起こすに至るまでの細胞
内情報伝達系には、不活性型蛋白がリン酸化されて活性
型となり、その機能を発揮する場合が数多く存在するこ
とが知られている。その反応に関わるプロテインキナー
ゼとしては、サイクリックAMP依存性プロテインキナー
ゼ、プロテインキナーゼC、カルモジュリン依存性プロ
テインキナーゼ、また増殖因子受容体に見られる受容体
型チロシンキナーゼ等が知られている。インターフェロ
ンやインターロイキン類等の各種サイトカインの細胞内
情報伝達経路にも、細胞内タンパク質のチロシンリン酸
化が関与することが知られていた。しかしサイトカイン
の受容体はキナーゼ活性を持たず、上記プロテインキナ
ーゼのいずれもこの経路に関与しないことから、サイト
カイン刺激により活性化されるチロシンキナーゼについ
ては、長い間不明であった。1993年終盤に至って、サイ
トカイン受容体に会合して活性化される非受容体型チロ
シンキナーゼが発見され、その後一連の非受容体型チロ
シンキナーゼが次々に同定されている。その中には、最
も良く知られている発癌遺伝子の一つであるsrc遺伝子
産物や、srcに相同性の高い遺伝子群産物が含まれるこ
とが明かとなった。従来、遺伝子配列の変異等によって
発癌遺伝子産物が異常に発現したり異常に活性化すると
癌化につながることが知られていたが、その生体内での
本来の役割はほとんど明らかにされていなかった。最近
の非受容体型チロシンキナーゼ研究の進展により、src
遺伝子異常による癌化は、サイトカイン刺激により伝わ
るはずの細胞の分化、増殖に関わるシグナルのうち、増
殖のみが異常に昂進したことによることが示唆された。
従って、これらの非受容体型チロシンキナーゼを阻害す
る物質は、新しい作用機序に基づく免疫疾患や癌の治療
薬として期待される。実際、src遺伝子産物のチロシン
キナーゼ活性を特異的に阻害するハービマイシンＡ（J.
Antibiotics, 32, 255,1975）は、ウイルス型src遺伝
子（v-src）を持つラウス肉腫ウイルスにより癌化した
細胞を脱癌化することが報告されている（Cancer Resea
rch, 49, 780-785, 1989）が、毒性が強いため臨床応用
されるに至っていない。また、ハービマイシンＡは、カ
ルモジュリン依存性キナーゼも阻害し選択性が低い。さ
らにＨ-７、スタウロスポリン等、既知のプロテインキ
ナーゼ阻害剤も複数の種類のプロテインキナーゼを阻害
するため、臨床応用が困難である。即ちより選択性が高
く、毒性の低い非受容体型プロテインキナーゼ阻害剤の
開発が望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は癌、免疫疾患
に関与するとされる非受容体型チロシンキナーゼに対し
て優れた阻害活性を示し、かつ他のプロテインキナーゼ
に対して選択性が高い物質及びそれを有効成分とする医
薬を提供することを目的とする。
に関与するとされる非受容体型チロシンキナーゼに対し
て優れた阻害活性を示し、かつ他のプロテインキナーゼ
に対して選択性が高い物質及びそれを有効成分とする医
薬を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、下記一般
式（Ｉ）で表されるマイトマイシン誘導体が、非受容体
型チロシンキナーゼ、例えば、src遺伝子産物に対して
優れた阻害活性を有しているという新しい知見に基づき
本発明を完成した。
式（Ｉ）で表されるマイトマイシン誘導体が、非受容体
型チロシンキナーゼ、例えば、src遺伝子産物に対して
優れた阻害活性を有しているという新しい知見に基づき
本発明を完成した。
【０００５】すなわち、本発明は一般式（I）
【０００６】
【化２】
【０００７】（式中、ＲＣＯはｎ−３系高度不飽和脂肪
酸のアシル残基を表す。）で表されるｎ−３系高度不飽
和脂肪酸残基を有するマイトマイシンＣ及びそれを有効
成分とする医薬、特に非受容体型チロシンキナーゼ阻害
剤を提供する。
酸のアシル残基を表す。）で表されるｎ−３系高度不飽
和脂肪酸残基を有するマイトマイシンＣ及びそれを有効
成分とする医薬、特に非受容体型チロシンキナーゼ阻害
剤を提供する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明において、ＲＣＯで表され
るｎ−３系高度不飽和脂肪酸のアシル残基としては、イ
コサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基、ドコ
サペンタエノイル基、α−リノレノイル基等を挙げるこ
とができる。
るｎ−３系高度不飽和脂肪酸のアシル残基としては、イ
コサペンタエノイル基、ドコサヘキサエノイル基、ドコ
サペンタエノイル基、α−リノレノイル基等を挙げるこ
とができる。
【０００９】本発明の上記一般（I）で表される高度不
飽和脂肪酸残基を有するマイトマイシンＣ誘導体は、例
えばマイトマイシンＣと対応する高度不飽和脂肪酸とを
溶媒中、ジイソプロピルカルボジイミド等の脱水縮合剤
の存在下に反応させることにより製造することができ
る。
飽和脂肪酸残基を有するマイトマイシンＣ誘導体は、例
えばマイトマイシンＣと対応する高度不飽和脂肪酸とを
溶媒中、ジイソプロピルカルボジイミド等の脱水縮合剤
の存在下に反応させることにより製造することができ
る。
【００１０】本発明の高度不飽和脂肪酸残基を有するマ
イトマイシンＣ誘導体の投与量は、年齢、性別、体重、
症状、あるいは投与形態により異なるが、一般には、１
日あたり約１〜１００ｍｇであり、１回あるいは数回に
分けて服用されうる。
イトマイシンＣ誘導体の投与量は、年齢、性別、体重、
症状、あるいは投与形態により異なるが、一般には、１
日あたり約１〜１００ｍｇであり、１回あるいは数回に
分けて服用されうる。
【００１１】本発明の阻害剤は経口的あるいは非経口的
に投与することができる。経口投与剤としては散剤、顆
粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロッ
プ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができ
る。また、非経口投与剤として注射剤とすることができ
る。これらの製剤は有効成分に薬学的に認容である製造
助剤を加えることにより常法に従って製造される。更に
公知の技術により持続性製剤とすることも可能である。
に投与することができる。経口投与剤としては散剤、顆
粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロッ
プ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができ
る。また、非経口投与剤として注射剤とすることができ
る。これらの製剤は有効成分に薬学的に認容である製造
助剤を加えることにより常法に従って製造される。更に
公知の技術により持続性製剤とすることも可能である。
【００１２】経口投与用の固形製剤を製造するには、有
効成分と賦形剤例えば乳糖、デンプン、結晶セルロー
ス、乳糖カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウ
ム、無水ケイ酸などとを混合して散剤とするか、さらに
必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポ
リビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど
の崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とす
る。錠剤を製造するにはこれらの散剤及び顆粒剤をその
ままあるいはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの
滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤
はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メ
タアクリル酸、メタアクリル酸メチルコポリマーなどの
腸溶性基剤で被覆して腸溶性製剤、あるいはエチルセル
ロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性
製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造する
には散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成
分をグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オ
リーブ油などに溶解したのちゼラチン膜で被覆し軟カプ
セル剤とすることができる。
効成分と賦形剤例えば乳糖、デンプン、結晶セルロー
ス、乳糖カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウ
ム、無水ケイ酸などとを混合して散剤とするか、さらに
必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポ
リビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど
の崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とす
る。錠剤を製造するにはこれらの散剤及び顆粒剤をその
ままあるいはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの
滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤
はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メ
タアクリル酸、メタアクリル酸メチルコポリマーなどの
腸溶性基剤で被覆して腸溶性製剤、あるいはエチルセル
ロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性
製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造する
には散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成
分をグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オ
リーブ油などに溶解したのちゼラチン膜で被覆し軟カプ
セル剤とすることができる。
【００１３】経口投与用の液状製剤を製造するには、有
効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤
とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノ
ールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴ
ム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤と
してもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、
着色剤、保存剤などを加えてもよい。
効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤
とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノ
ールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴ
ム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤と
してもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、
着色剤、保存剤などを加えてもよい。
【００１４】注射剤を製造するには、有効成分を必要に
応じ塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸ナトリウム、
リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど
のｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化
剤とともに注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプ
ルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シ
クロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空下凍結乾
燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成
分にレシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレ
ン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射用乳
剤とすることもできる。
応じ塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸ナトリウム、
リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど
のｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化
剤とともに注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプ
ルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シ
クロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空下凍結乾
燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成
分にレシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレ
ン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射用乳
剤とすることもできる。
【００１５】これらの製剤は公知の製造法、例えば日本
薬局方第１０版製剤総則記載の方法ないし適当な改良を
加えた方法によって製造することができる。
薬局方第１０版製剤総則記載の方法ないし適当な改良を
加えた方法によって製造することができる。
【００１６】
【実施例】以下、本発明を合成例、試験例によりさらに
詳細に説明する。
詳細に説明する。
【００１７】合成例１ 1α-ドコサヘキサエノイルマイ
トマイシンＣ誘導体の合成 ジイソプロピルカルボジイミド (19 mg, 0.15 mmol) の
酢酸エチル溶液 (1.0mL) にドコサヘキサエン酸 (49 m
g, 0.15 mmol) の酢酸エチル (1.0 mL) 溶液を０℃で加
え、０℃で30分撹拌した後、マイトマイシンＣ (10 mg,
0.03 mmol,を加え、さらに室温で24時間撹拌した（反
応の終了はTLCにて確認した）。析出した結晶を濾別
し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグ
ラフィーに付し（クロロホルム:アセトン=8/1）、1α-
ドコサヘキサエノイルマイトマイシンＣ(21 mg, 0.03 m
mol) を得た。
トマイシンＣ誘導体の合成 ジイソプロピルカルボジイミド (19 mg, 0.15 mmol) の
酢酸エチル溶液 (1.0mL) にドコサヘキサエン酸 (49 m
g, 0.15 mmol) の酢酸エチル (1.0 mL) 溶液を０℃で加
え、０℃で30分撹拌した後、マイトマイシンＣ (10 mg,
0.03 mmol,を加え、さらに室温で24時間撹拌した（反
応の終了はTLCにて確認した）。析出した結晶を濾別
し、溶媒を減圧留去した。残渣をシリカゲルクロマトグ
ラフィーに付し（クロロホルム:アセトン=8/1）、1α-
ドコサヘキサエノイルマイトマイシンＣ(21 mg, 0.03 m
mol) を得た。
【００１８】1H NMR (CDCl3) 400 MHz δ 0.97 (3H, t,
J = 7.5 Hz, CH3), 1.78 (3H, s, 6-Me), 2.08 (2H,
m, CH2), 2.30 - 2.52 (4H, m, CH2CH2), 2.76 - 2.90
(10H, m, CH2 x 10), 3.20 (3H, s, 9a-OMe), 3.22 (1
H, dd, J = 1.8, 4.5 Hz, 2-H),3.50 (1H, d, 4.5 Hz,
1-H), 3.52 (1H, 1H, dd, J = 1.8, 13.4 Hz, 3-H), 3.
69 (1H, dd, J = 4.7, 10.9 Hz, 9-H), 4.07 (1H, dd,
J = 10.9, 10.9 Hz, 10-H), 4.46 (1H, d, J = 13.4 H
z, 3-H), 4.83 (2H, br, CONH2), 4.86 (1H, dd,J =
4.7, 10.9 Hz, 10-H), 5.26 - 5.43 (14H, m, CH=CH, 7
-NH2)13 C NMR (CDCl3) δ 7.90, 14.29, 20.57, 22.48, 25.5
5, 25.59, 25.64, 36.40, 39.55, 41.97, 42.36, 48.6
2, 49.78, 62.01, 105.06, 105.46, 110.42, 127.04, 1
27.82, 127.91, 128.00, 128.11, 128.30, 128.37, 12
8.60, 129.51, 132.07, 147.29, 154.06, 156.41, 175.
75, 178.46, 183.01 IR (neat) 3441, 3333, 3013, 2964, 1709, 1651, 156
0, 1442, 1385, 1340, 1230, 1145, 1062, 709 cm-1 Mass 644 (M+)
J = 7.5 Hz, CH3), 1.78 (3H, s, 6-Me), 2.08 (2H,
m, CH2), 2.30 - 2.52 (4H, m, CH2CH2), 2.76 - 2.90
(10H, m, CH2 x 10), 3.20 (3H, s, 9a-OMe), 3.22 (1
H, dd, J = 1.8, 4.5 Hz, 2-H),3.50 (1H, d, 4.5 Hz,
1-H), 3.52 (1H, 1H, dd, J = 1.8, 13.4 Hz, 3-H), 3.
69 (1H, dd, J = 4.7, 10.9 Hz, 9-H), 4.07 (1H, dd,
J = 10.9, 10.9 Hz, 10-H), 4.46 (1H, d, J = 13.4 H
z, 3-H), 4.83 (2H, br, CONH2), 4.86 (1H, dd,J =
4.7, 10.9 Hz, 10-H), 5.26 - 5.43 (14H, m, CH=CH, 7
-NH2)13 C NMR (CDCl3) δ 7.90, 14.29, 20.57, 22.48, 25.5
5, 25.59, 25.64, 36.40, 39.55, 41.97, 42.36, 48.6
2, 49.78, 62.01, 105.06, 105.46, 110.42, 127.04, 1
27.82, 127.91, 128.00, 128.11, 128.30, 128.37, 12
8.60, 129.51, 132.07, 147.29, 154.06, 156.41, 175.
75, 178.46, 183.01 IR (neat) 3441, 3333, 3013, 2964, 1709, 1651, 156
0, 1442, 1385, 1340, 1230, 1145, 1062, 709 cm-1 Mass 644 (M+)
【００１９】プロテインキナーゼ活性阻害の試験方法 試験は深澤らの方法（Analytical Biochemistry, 13, 1
957-1964, 1993）により行った。すなわち、cAMP依存性
プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼC、カルモジ
ュリン依存性キナーゼ、EGF受容体チロシンキナーゼを
持つNIH-3T3細胞をv-src遺伝子で形質転換してさらに非
受容体型プロテインチロシンキナーゼを導入した。この
細胞を、5mM MgCl2, 及びアンチパイン、ロイペプチ
ン、ペプスタインＡ各25μg/mlを含む1mMヘペス緩衝液
(pH 7.4)中、氷上10分間反応させた。さらに室温でボル
テックスミキサーを用いて2分間撹拌して細胞を破砕
し、20mMヘペス緩衝液を添加して500×ｇ、5分間遠心す
ることで核を沈降させた。上清を回収し、蛋白濃度2.5m
g/mlとなるよう、10mM MgCl2 / 0.1mM Na3VO4 / 10mMβ
-グリセロリン酸 / 1mM NaF / 20mMヘペス (pH 7.4)に
希釈した。この上清20μlに、最終濃度で1μMホルボー
ル12-ミリステート-13-アセテート、10μM CaCl 2、20μ
M cAMPおよび被験物質のジメチルスルホキシド溶液を添
加し、[γ-32Ｐ]-ATP（12.5μM、10μCi）を加えてキナ
ーゼ反応を開始した。25℃、15分間の反応後、4倍濃度
のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプル緩衝
液10μlを加えて反応を停止して、その反応混合物を9％
（w/v）SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、
オートラジオグラフィーでリン酸化された蛋白を検出し
た。各プロテインキナーゼの基質となる蛋白質に対応す
るバンドの濃さにより、プロテインキナーゼ活性を評価
した。表１中、基質蛋白質のリン酸化を完全に阻害して
いる場合は＋＋、部分阻害の場合は＋、阻害しない場合
には−で結果を示す。
957-1964, 1993）により行った。すなわち、cAMP依存性
プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼC、カルモジ
ュリン依存性キナーゼ、EGF受容体チロシンキナーゼを
持つNIH-3T3細胞をv-src遺伝子で形質転換してさらに非
受容体型プロテインチロシンキナーゼを導入した。この
細胞を、5mM MgCl2, 及びアンチパイン、ロイペプチ
ン、ペプスタインＡ各25μg/mlを含む1mMヘペス緩衝液
(pH 7.4)中、氷上10分間反応させた。さらに室温でボル
テックスミキサーを用いて2分間撹拌して細胞を破砕
し、20mMヘペス緩衝液を添加して500×ｇ、5分間遠心す
ることで核を沈降させた。上清を回収し、蛋白濃度2.5m
g/mlとなるよう、10mM MgCl2 / 0.1mM Na3VO4 / 10mMβ
-グリセロリン酸 / 1mM NaF / 20mMヘペス (pH 7.4)に
希釈した。この上清20μlに、最終濃度で1μMホルボー
ル12-ミリステート-13-アセテート、10μM CaCl 2、20μ
M cAMPおよび被験物質のジメチルスルホキシド溶液を添
加し、[γ-32Ｐ]-ATP（12.5μM、10μCi）を加えてキナ
ーゼ反応を開始した。25℃、15分間の反応後、4倍濃度
のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプル緩衝
液10μlを加えて反応を停止して、その反応混合物を9％
（w/v）SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、
オートラジオグラフィーでリン酸化された蛋白を検出し
た。各プロテインキナーゼの基質となる蛋白質に対応す
るバンドの濃さにより、プロテインキナーゼ活性を評価
した。表１中、基質蛋白質のリン酸化を完全に阻害して
いる場合は＋＋、部分阻害の場合は＋、阻害しない場合
には−で結果を示す。
【００２０】マウス白血病細胞Ｐ３８８に対する毒性試
験 細胞を96穴プレートに継代して24時間培養後、被験物質
を添加してさらに48時間培養した。生存細胞をスルホロ
ーダミンＢ染色により比色定量し、細胞数を測定した。
被験物質の代わりに溶媒のジメチルスルホキシドを添加
した場合の細胞数を100％とし、細胞数が50％となる被
験物質濃度をＩＣ50として求めた。
験 細胞を96穴プレートに継代して24時間培養後、被験物質
を添加してさらに48時間培養した。生存細胞をスルホロ
ーダミンＢ染色により比色定量し、細胞数を測定した。
被験物質の代わりに溶媒のジメチルスルホキシドを添加
した場合の細胞数を100％とし、細胞数が50％となる被
験物質濃度をＩＣ50として求めた。
【００２１】試験例１ 被験物質として、ドコサヘキサエノイルマイトマイシン
Ｃ（DHA-MMC）を用い、前記試験方法に従いプロテイン
キナーゼ阻害活性を測定した。結果を表１に示す。
Ｃ（DHA-MMC）を用い、前記試験方法に従いプロテイン
キナーゼ阻害活性を測定した。結果を表１に示す。
【００２２】比較試験例１ 被験物質として、ハービマイシンＡを用い、前記試験方
法に従いプロテインキナーゼ阻害活性を測定した。結果
を表１に示す。
法に従いプロテインキナーゼ阻害活性を測定した。結果
を表１に示す。
【００２３】比較試験例２ 被験物質として、マイトマイシンＣを用い、前記試験方
法に従いプロテインキナーゼ阻害活性を測定した。結果
を表１に示す。
法に従いプロテインキナーゼ阻害活性を測定した。結果
を表１に示す。
【００２４】
【表１】 表１ プロテインキナーゼ阻害活性 ─────────────────────────── 被験物質 濃度 阻害効果 μg/ml PTK PKA PKC CAMK EGFR ─────────────────────────── DHA-MMC 100 ++ + + + + 31.6 + - - + - 10 + - - - - ─────────────────────────── マイトマイシンC 100 - - - - - ─────────────────────────── ハーヒ゛マイシンA 100 ++ - - ++ - 31.6 + - - + 10 + - - - ─────────────────────────── PTK=非受容体型プロテインチロシンキナーゼ、PKA=cAMP
依存性プロテインキナーゼ、PKC=プロテインキナーゼ
Ｃ、CAMK=カルモジュリン依存性キナーゼ、EGFR=EGF受
容体チロシンキナーゼ
依存性プロテインキナーゼ、PKC=プロテインキナーゼ
Ｃ、CAMK=カルモジュリン依存性キナーゼ、EGFR=EGF受
容体チロシンキナーゼ
【００２５】試験例２ 被験物質として、ドコサヘキサエノイルマイトマイシン
Ｃ（DHA-MMC）を用い、前記試験方法に従いＰ３８８細
胞毒性を測定した。結果を表２に示す。
Ｃ（DHA-MMC）を用い、前記試験方法に従いＰ３８８細
胞毒性を測定した。結果を表２に示す。
【００２６】
【表２】 表２ Ｐ３８８細胞毒性 ────────────────── 被験物質 ＩＣ50（μg/ml） ────────────────── DHA-MMC 21.0マイトマイシン C 1.9 ──────────────────
【００２７】
【発明の効果】本発明の化合物は、非受容体型チロシン
キナーゼに対して優れた阻害活性を有するため、医薬、
特に制癌剤や免疫疾患の治療薬としての用途が期待でき
る。
キナーゼに対して優れた阻害活性を有するため、医薬、
特に制癌剤や免疫疾患の治療薬としての用途が期待でき
る。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年３月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】1H NMR (CDCl3) 400 MHz δ 0.97 (3H, t,
J = 7.5 Hz, CH3), 1.78 (3H, s, 6-Me), 2.08 (2H,
m, CH2), 2.30 - 2.52 (4H, m, CH2CH2), 2.76 - 2.90
(10H, m, CH2 x 5), 3.20 (3H, s, 9a-OMe), 3.22 (1H,
dd, J = 1.8, 4.5 Hz, 2-H), 3.50 (1H, d, 4.5 Hz, 1
-H), 3.52 (1H, dd, J = 1.8, 13.4 Hz, 3-H), 3.69 (1
H, dd, J = 4.7, 10.9 Hz, 9-H), 4.07 (1H, dd, J = 1
0.9, 10.9 Hz, 10-H), 4.46 (1H, d, J = 13.4 Hz, 3-
H), 4.83 (2H, br, CONH2), 4.86 (1H, dd, J = 4.7, 1
0.9 Hz, 10-H), 5.26 - 5.43 (14H, m, CH=CH, 7-NH2)13 C NMR (CDCl3) δ 7.90, 14.29, 20.57, 22.48, 25.5
5, 25.59, 25.64, 36.40, 39.55, 41.97, 42.36, 48.6
2, 49.78, 62.01, 105.06, 105.46, 110.42, 127.04, 1
27.82, 127.91, 128.00, 128.11, 128.30, 128.37, 12
8.60, 129.51, 132.07, 147.29, 154.06, 156.41, 175.
75, 178.46, 183.01 IR (neat) 3441, 3333, 3013, 2964, 1709, 1651, 156
0, 1442, 1385, 1340, 1230, 1145, 1062, 709 cm-1 Mass 644 (M+)
J = 7.5 Hz, CH3), 1.78 (3H, s, 6-Me), 2.08 (2H,
m, CH2), 2.30 - 2.52 (4H, m, CH2CH2), 2.76 - 2.90
(10H, m, CH2 x 5), 3.20 (3H, s, 9a-OMe), 3.22 (1H,
dd, J = 1.8, 4.5 Hz, 2-H), 3.50 (1H, d, 4.5 Hz, 1
-H), 3.52 (1H, dd, J = 1.8, 13.4 Hz, 3-H), 3.69 (1
H, dd, J = 4.7, 10.9 Hz, 9-H), 4.07 (1H, dd, J = 1
0.9, 10.9 Hz, 10-H), 4.46 (1H, d, J = 13.4 Hz, 3-
H), 4.83 (2H, br, CONH2), 4.86 (1H, dd, J = 4.7, 1
0.9 Hz, 10-H), 5.26 - 5.43 (14H, m, CH=CH, 7-NH2)13 C NMR (CDCl3) δ 7.90, 14.29, 20.57, 22.48, 25.5
5, 25.59, 25.64, 36.40, 39.55, 41.97, 42.36, 48.6
2, 49.78, 62.01, 105.06, 105.46, 110.42, 127.04, 1
27.82, 127.91, 128.00, 128.11, 128.30, 128.37, 12
8.60, 129.51, 132.07, 147.29, 154.06, 156.41, 175.
75, 178.46, 183.01 IR (neat) 3441, 3333, 3013, 2964, 1709, 1651, 156
0, 1442, 1385, 1340, 1230, 1145, 1062, 709 cm-1 Mass 644 (M+)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１９】プロテインキナーゼ活性阻害の試験方法 試験は深澤らの方法（Analytical Biochemistry, 13, 1
957-1964, 1993）により行った。すなわち、cAMP依存性
プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼC、カルモジ
ュリン依存性キナーゼ、EGF受容体チロシンキナーゼを
持つNIH-3T3細胞をv-src遺伝子で形質転換してさらに非
受容体型プロテインチロシンキナーゼを導入した。この
細胞を、5mM MgCl2, 及びアンチパイン、ロイペプチ
ン、ペプスタチンＡ各25μg/mlを含む1mMヘペス緩衝液
(pH 7.4)中、氷上10分間反応させた。さらに室温でボル
テックスミキサーを用いて2分間撹拌して細胞を破砕
し、20mMヘペス緩衝液を添加して500×ｇ、5分間遠心す
ることで核を沈降させた。上清を回収し、蛋白濃度2.5m
g/mlとなるよう、10mM MgCl2 / 0.1mM Na3VO4 / 10mMβ
-グリセロリン酸 / 1mM NaF / 20mMヘペス (pH 7.4)に
希釈した。この上清20μlに、最終濃度で1μMホルボー
ル12-ミリステート-13-アセテート、10μM CaCl 2、20μ
M cAMPおよび被験物質のジメチルスルホキシド溶液を添
加し、[γ-32Ｐ]-ATP（12.5μM、10μCi）を加えてキナ
ーゼ反応を開始した。25℃、15分間の反応後、4倍濃度
のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプル緩衝
液10μlを加えて反応を停止して、その反応混合物を9％
（w/v）SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、
オートラジオグラフィーでリン酸化された蛋白を検出し
た。各プロテインキナーゼの基質となる蛋白質に対応す
るバンドの濃さにより、プロテインキナーゼ活性を評価
した。表１中、基質蛋白質のリン酸化を完全に阻害して
いる場合は＋＋、部分阻害の場合は＋、阻害しない場合
には−で結果を示す。
957-1964, 1993）により行った。すなわち、cAMP依存性
プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼC、カルモジ
ュリン依存性キナーゼ、EGF受容体チロシンキナーゼを
持つNIH-3T3細胞をv-src遺伝子で形質転換してさらに非
受容体型プロテインチロシンキナーゼを導入した。この
細胞を、5mM MgCl2, 及びアンチパイン、ロイペプチ
ン、ペプスタチンＡ各25μg/mlを含む1mMヘペス緩衝液
(pH 7.4)中、氷上10分間反応させた。さらに室温でボル
テックスミキサーを用いて2分間撹拌して細胞を破砕
し、20mMヘペス緩衝液を添加して500×ｇ、5分間遠心す
ることで核を沈降させた。上清を回収し、蛋白濃度2.5m
g/mlとなるよう、10mM MgCl2 / 0.1mM Na3VO4 / 10mMβ
-グリセロリン酸 / 1mM NaF / 20mMヘペス (pH 7.4)に
希釈した。この上清20μlに、最終濃度で1μMホルボー
ル12-ミリステート-13-アセテート、10μM CaCl 2、20μ
M cAMPおよび被験物質のジメチルスルホキシド溶液を添
加し、[γ-32Ｐ]-ATP（12.5μM、10μCi）を加えてキナ
ーゼ反応を開始した。25℃、15分間の反応後、4倍濃度
のSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプル緩衝
液10μlを加えて反応を停止して、その反応混合物を9％
（w/v）SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、
オートラジオグラフィーでリン酸化された蛋白を検出し
た。各プロテインキナーゼの基質となる蛋白質に対応す
るバンドの濃さにより、プロテインキナーゼ活性を評価
した。表１中、基質蛋白質のリン酸化を完全に阻害して
いる場合は＋＋、部分阻害の場合は＋、阻害しない場合
には−で結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｍ 7:00
Claims (3)
- 【請求項１】 一般式 【化１】 （式中、ＲＣＯはｎ−３系高度不飽和脂肪酸のアシル残
基を表す。）で表される高度不飽和脂肪酸残基を有する
マイトマイシンＣ誘導体。 - 【請求項２】 請求項１に記載の高度不飽和脂肪酸残基
を有するマイトマイシンＣ誘導体を有効成分として含有
する医薬。 - 【請求項３】 請求項１に記載の高度不飽和脂肪酸残基
を有するマイトマイシンＣ誘導体を有効成分として含有
する非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8079969A JPH09268190A (ja) | 1996-04-02 | 1996-04-02 | マイトマイシンｃ誘導体及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤 |
| PCT/JP1997/001109 WO1997036904A1 (en) | 1996-04-02 | 1997-03-31 | Mitomycin c derivative and non-receptor tyrosine kinase inhibitor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8079969A JPH09268190A (ja) | 1996-04-02 | 1996-04-02 | マイトマイシンｃ誘導体及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09268190A true JPH09268190A (ja) | 1997-10-14 |
Family
ID=13705158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8079969A Pending JPH09268190A (ja) | 1996-04-02 | 1996-04-02 | マイトマイシンｃ誘導体及び非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09268190A (ja) |
| WO (1) | WO1997036904A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6495348B1 (en) | 1993-10-07 | 2002-12-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Mitomycin biosynthetic gene cluster |
| US6524812B1 (en) | 1993-10-07 | 2003-02-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Genes encoding resistance to DNA alkylating agents |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7238368B2 (en) | 1999-04-23 | 2007-07-03 | Alza Corporation | Releasable linkage and compositions containing same |
| US7303760B2 (en) | 1999-04-23 | 2007-12-04 | Alza Corporation | Method for treating multi-drug resistant tumors |
| KR100669053B1 (ko) | 1999-04-23 | 2007-01-15 | 알자 코포레이션 | 리포좀에 사용하기 위한 절단가능 결합을 갖는 콘쥬게이트 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01113391A (ja) * | 1987-10-24 | 1989-05-02 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | マイトマイシン誘導体 |
| JPH0762020B2 (ja) * | 1987-12-18 | 1995-07-05 | 日本油脂株式会社 | ドコサヘキサエノイルジアシルグリセロールの製造法 |
| JPH01203322A (ja) * | 1988-02-05 | 1989-08-16 | Rikagaku Kenkyusho | 制癌剤 |
-
1996
- 1996-04-02 JP JP8079969A patent/JPH09268190A/ja active Pending
-
1997
- 1997-03-31 WO PCT/JP1997/001109 patent/WO1997036904A1/ja not_active Ceased
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6495348B1 (en) | 1993-10-07 | 2002-12-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Mitomycin biosynthetic gene cluster |
| US6524812B1 (en) | 1993-10-07 | 2003-02-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Genes encoding resistance to DNA alkylating agents |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1997036904A1 (en) | 1997-10-09 |
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