JPH0762036B2 - 大きな構造遺伝子の製造および発現 - Google Patents

大きな構造遺伝子の製造および発現

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JPH0762036B2 JP58501977A JP50197783A JPH0762036B2 JP H0762036 B2 JPH0762036 B2 JP H0762036B2 JP 58501977 A JP58501977 A JP 58501977A JP 50197783 A JP50197783 A JP 50197783A JP H0762036 B2 JPH0762036 B2 JP H0762036B2
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Description

【発明の詳細な説明】 これは,1982年５月６日出願の同時継続合衆国特許出願
番号375,494の一部継続出願である。
本発明は一般に遺伝物質の操作に，より具体的には，望
みの蛋白質の生産を確保する組み替え手順に有用な特定
のDNA配列の製造に関する。
遺伝物質は概括的に，細胞およびウイルスの組成分の製
造をプログラムし誘導し且つ細胞およびウイルスの反応
を制御する化学物質として定義することができる。デオ
キシリボ核酸（DNA）として知られる長鎖重合体物質
は，リボ核酸（RNA）によってプログラムされるある種
のウイルスを除いて，あらゆる生細胞およびウイルスの
遺伝物質を構成する。DNAポリマーの反復単位は４つの
異なるヌクレオチドであり，それらは各々燐酸塩群がく
っついたデオキシリボース糖類に結合したプリン（アデ
ニンあるいはグアニン）あるいはピリミジン（チミンあ
るいはシトシン）から成る。直線状ポリマー内のヌクレ
オチドの接合は,1つのヌクレオチドの５′−燐酸の別の
ヌクレオチドの３′ヒドロキシル基への融合による。機
能DNAはヌクレオチドの一本鎖（デオキシオリゴヌクレ
オチドとして知られる）の安定した二本鎖会合の形で生
じ，この会合はプリン塩基およびプリミジン塩基の間の
水素結合によって生じる〔即ち，アデニン（Ａ）とチミ
ン（Ｔ）との間あるいはグアニン（Ｇ）とシトシン
（Ｃ）との間に存在する『相補的』対合〕。慣習によ
り，ヌクレオチドはそれらを形成するプリン塩基あるい
はピリミジン塩基の名前で呼ばれ，二本鎖DNAの相補的
対合（即ち,A−ＴおよびＧ−Ｃ）は『塩基対』と呼ばれ
る。リボ核酸は，ポリヌクレオチドであり，アデニン，
グアニン，シトシン，および，チミンの代わりにウラシ
ル（Ｕ）から成り，これらはリボースおよび燐酸群に結
合している。
最も簡潔に云うと,DNAのプログラム機能は一般に，特定
のDNAヌクレオチド配列（遺伝子）が比較的に不安定な
メッセンジャーRNA（mRNA）ポリマーに『転写』される
プロセスによって達成される。mRNAは，一方，アミノ酸
から構造，調整および触媒蛋白質を生成する鋳型として
役立つ。この翻訳プロセスには，小さなRNA鎖（tRNA）
の働きが関連し,tRNAは個々のアミノ酸を送り込んでmRN
Aに沿って整列させて，適切なアミノ酸配列のポリペプ
チドの生成を可能にする。DNAから得られ,tRNAの供給と
20のアミノ酸の定位の基礎を定めてポリペプチドの『発
現』をもたらすmRNAの『メッセージ』は，トリプレット
『コドン』の形態−３つのヌクレオチド塩基の配列的な
グループ化をとる。ある意味では，蛋白質の形成は，遺
伝子のヌクレオチド配列によってもたらされるプログラ
ムされた遺伝メッセージの『発現』の究極的な姿であ
る。
DNAポリマー内で普通遺伝子の『先に来る』あるDNA配列
は,mRNAへの転写の開始部位をもたらす。これらは『プ
ロモーター』配列と呼ばれる。DNAポリマー内で通常遺
伝子の『上流』（即ち，先行）にあるその他のDNA配列
は，転写開始の頻度（あるいは速度）を決定する蛋白質
を結合する。これらその他の配列は『レギュレーター』
配列と呼ばれる。このように，機能DNAポリマーのなか
で選択された遺伝子１つ（あるいは複数の遺伝子の配
列）に先立ち，且つ遺伝子の転写（およびその後の発
現）が起きるか否かを決定する配列は，『プロモーター
／レギュレーター』あるいは『制御』DNA配列と総称さ
れる。DNAポリマー内で遺伝子に『続き』且つmRNAへの
転写の終了の信号をもたらすDNA配列は『ターミネイタ
ー』配列と呼ばれる。
過去10年近くの間，微生物学的プロセスの焦点は，望ま
しい生成物に関する遺伝コード情報をもともとDNAに持
たない生物を用いて産業に，そして製薬に有用な物質を
製造することに向けられてきた。簡単に云うと，生成物
の構造を定める遺伝子は，『供与』生物から分離される
か，あるいは，化学的に合成され，そして，安定的に別
の生物に導入され，前述の別の生物は自己複製単細胞微
生物であることが望ましい。これが達成されれば，『ト
ランスフォームされた』宿主細胞内の遺伝子発現の既存
の機序が働いて望みの生成物を作り上げる。
この技術分野には，選択された宿主生物のトランスフォ
ーメイションに使用する遺伝物質の分離，合成，精製，
および増幅のための『組み替えDNA』方法論に関する数
多くの特許および文献がある。例えば,Cohen等の特許番
号4,237,224は，選択された外来性のDNA配列を含む『ハ
イブリッド』ウイルスDNAあるいは環状プラスミドDNAを
用いた原核単細胞宿主生物のトランスフォーメイション
に関連する。Cohen等の特許の手順は，まず酵素的にウ
イルスDNAあるいは環状プラスミドDNAを切断して直線状
DNA鎖を形成することによるトランスフォーメイション
・ベクターの製造に関する。選択された外来性DNA鎖
は，同様な酵素の使用することによって直線状に調製さ
れる。直線状のウイルスDNAあるいはプラスミドDNAは，
外来性DNAと共に結合酵素の存在のもとでインキュベー
トされ，前述の酵素は修復プロセスを行う能力があり，
『ハイブリッド』ベクターが形成され，前述のベクター
はウイルスDNAあるいは環状DNAプラスミドに『スプライ
スされた』外来性DNA断片を含む。
和合性のある単細胞宿主生物のハイブリッド・ベクター
によるトランスフォーメイションは，宿主細胞ポピュレ
ーション内に外来性DNAの多数のコピーを生じる。場合
によっては，目的は単に外来性DNAの増幅であり，収穫
される『生成物』はDNAである。もっと多くの場合に，
トランスフォーメイションの目標は，外来性のDNAの宿
主細胞による発現であり，外来性DNAによってコードが
示された商業的に有用な蛋白質あるいはポリペプチド断
片を分離可能なほどの量だけ大規模に合成する形をと
る。例えば，合衆国特許番号4,269,731（Shine）,4,27
3,875（Manis）および4,293,652（Cohen）を参照のこ
と。
Cohen等の特許に記載されたような手順の成功は，主に
『制限エンドヌクレアーゼ』酵素が容易に入手できるこ
とによるものであり，前述の酵素はハイブリッド化され
ないDNAベクター，および重要な外来性配列を含む真核
生物のDNA鎖等の特定の部位の切断を促進する。二本鎖
直線状DNA鎖に一本鎖相補性『末端』を形成する切断の
仕方は，『結合』酵素の処理を受けたときの外来性DNA
のベクターへの機能的組み込みの蓋然性を非常に高め
る。このような多数の制限エンドヌクレアーゼ酵素が現
在商業的に入手可能である〔例えば，ベエセツダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ,Inc.,ガイザーズバーグ，メアリ
ランド州の『1981/1982カタログ』に載った『BRL制限エ
ンドヌクレアーゼ参照表』を参照のこと。〕ハイブリッ
ドの形成の確認は，クロマトグラフの手法によって容易
なものとなり，前述の手法は，例えば，分子量に基づい
て非ハイブリッド・プラスミドとハイブリッド・プラス
ミドとを別けることができる。その他の有用な手法は放
射性DNAハイブリッド形成に関連するものである。
原核細胞のトランスフォーメイションの成功に大いに寄
与した別の操作『道具』は，選択可能な『標識』遺伝子
配列の使用である。簡潔に言うと，望ましい外来性DNA
に加えて，トランスフォームされた宿主細胞をトランス
フォームされない宿主細胞から区別することの出来る形
質特性を発現するコードをもつ１つあるいはそれ以上の
DNA配列を含むハイブリッド・ベクターが使用される。
典型的な標識遺伝子配列は，トランスフォームされた原
核細胞が，トランスフォームされない宿主細胞を殺すか
あるいはその増殖を甚だしく阻止する金属，抗生物質，
および同様のものを含む培地の中で生存し増植すること
を可能とするものである。
トランスフォームされた宿主微生物内において外来性遺
伝子が首尾よく発現するか否かは主に，前述の遺伝子
を，前述の遺伝子のmRNAへの転写を確実に行う適切なプ
ロモーター／レギュレーター領域がありmRNAのメッセー
ジの蛋白質への翻訳を確実にするその他の信号（例え
ば，リボゾーム結合部位）がある状態で，トランスフォ
ーメイション・ベクターに組み込めるか否かによって決
まる。遺伝子の『元の』プロモーター／レギュレーター
領域が新しい宿主において高レベルの発現を許すことは
珍しい。従って，挿入しようとする遺伝子には，挿入に
先立って新しい宿主に合わせた転写および翻訳調節DNA
配列をくっつけるか，あるいは，前述の遺伝子はベクタ
ーDNAの中で現在の転写および翻訳信号に制御される部
位に挿入する必要がある。
外来性遺伝子の例えば環状DNAプラスミド・ベクターへ
の挿入は，しばしば，現存する転写および翻訳信号の直
後の部位において，あるいは宿主内で発現の程度が高い
比較的に大きな蛋白質のコードを持つ現存プラスミド遺
伝子内でおこなわれる。後者の場合は，このようにして
形成された『融合遺伝子』の宿主における発現は，望み
の蛋白質配列（例えば，大きな蛋白質の化学的な切断に
よって分離出来る中間断片として）を含む『融合蛋白
質』の高レベルの生成となる。前述の手順は単に望みの
調節と外来性遺伝子生成物の高レベルの発現を確実にす
るにとどまらず，望みの蛋白質生成物を宿主に内在する
プロテアーゼの攻撃からある程度防御する。さらに，宿
主生物によって異なるが，前述の手順は，望みの蛋白質
の宿主細胞から細胞培地への一種の『ピギーバック』輸
送を可能として，望みの生成物を分離するために宿主細
胞を破壊する必要をなくす。
公表された組み替えDNA方法に関してこれまでに一般化
して述べたことから，これらプロセスはどちらかという
と単純な，容易に実施でき且つ簡単に検証できるものの
ように見えるかも知れないが，実際には，必要なDNA配
列の操作の実施は非常に骨折りな困難なもので，望みの
生成物の収率は殆ど例外なく，非常に低いことを特徴と
する。
一例を挙げると，宿主微生物のトランスフォーメイショ
ンに使用されるベクターに挿入するための遺伝子の最初
の『調製』は非常に難しいプロセスである場合がある
が，発現させようとする遺伝子がヒトのような高等な生
物に内在性のものである場合は特にそうである。この技
術において行われる１つの手間の掛かる手順は，『供
与』細胞の全DNAゲノムの組み替えプラスミドへの体系
的なクローニングであり，前述のクローニングは，ラン
ダムなDNA配列断片をもつトランスフォームされた細胞
の膨大な『ライブラリー』を生み出すが，前述のDNA配
列断片を個々に試験して望みの生成物が発現するかどう
かを調べる必要がある。別の手順によると，全mRNAは高
発現供与細胞（望みの生成物のためのコードを持つmRNA
の多数のコピーを含むもの）から分離され，最初に逆転
写酵素によって一本鎖cDNAに『複写』され，それからポ
リメラーゼによって二本鎖に転写され，そしてクローニ
ングされる。この手順も，トランスフォームされた細胞
のライブラリーを生み出すが，このライブラリーは全ゲ
ノム・ライブラリーよりも幾分が小さく，望みの遺伝子
のコピーを含み且つ宿主微生物による発現に大きく干渉
するトランスフォームされない『イントロン』を持たな
い可能性がある。上記の時間のかかる遺伝子分離手順は
実際に幾つかの蛋白質を微生物に発現させるのに公表さ
れた組み替えDNA手順で使用されたものであり，前述の
蛋白質はラット・プロインシュリン〔Ullrich等，Scien
ce，196,pp.1313−1318（1977）〕，ヒト繊維芽細胞イ
ンターフェロン〔Goedell等，Nucleic Acids Researc
h，８,pp.4087−4094（1980）〕，マウスβ−エンドル
フィン〔Shine等，Nature，285,pp.456−461（198
0）〕，およびヒト白血球インターフェロン〔Goedell
等，Nature，287,pp.411−416（1980）；およびGoedell
等，Nature，290,pp.20−26（1981）〕を含む。
可能な場合は必ず，ヌクレオチド塩基を用いて望みの遺
伝子の部分的なあるいは全部の製造は，組替えDNA方法
で使用する遺伝子の調製のもっと望ましい手順を持つ。
そのような製造に必要なものは，当然のことながら，望
みのポリペプチドの正確なアミノ酸配列の知識である。
この情報があれば，蛋白質を生み出すDNA配列コード
（即ち，適切に配列された塩基トリプレット・ゴドン）
を計画することが可能となり，対応する合成二本鎖DNA
配列を作ることができる。製造方法とcDNA合成方法との
組合せがヒト成長ホルモン用の遺伝子を作り出すのに使
用されたと報告されている。特に，製造された72ヌクレ
オチド塩基対の直線状二本鎖DNA配列（望みの191アミノ
酸ポリペプチドの最初の21アミノ酸を決めるコドンを持
つもの）が，アミノ酸番号25−191用のコードを持つcDN
A誘導二本鎖に結合されて，変性pBR322プラスミドのラ
ック・プロモーター／レギュレーター配列が制御する遺
伝子座に挿入された〔Goedell等，Nature，281,pp.544
−548（1981）〕。
比較的に『短い』生物学的に機能するポリペプチド，例
えば，ヒト・ソマトスタチン（14アミノ酸）およびヒト
・インシュリン（21アミノ酸および30アミノ酸の２ポリ
ペプチド鎖）用のコードを持つ遺伝子の製造には完全な
合成手順が使用されている。
ソマトスタチン遺伝子調製手順〔Itakura等，Science，
198,pp.1056−1063（1977）〕においては,52塩基対遺伝
子が作られ，この遺伝子では,42塩基対が必要な14アミ
ノ酸を定めるコドンであり，そして,10塩基対が追加さ
れて，構造遺伝子を微生物トランスフォーメイション・
ベクターに結合するのに用いられる『付着末端』一本鎖
終末領域の形成を可能としている。特に，この遺伝子は
βガラクトシダーゼ酵素遺伝子の末端近くに挿入され，
その結果生じる融合遺伝子は融合蛋白質として発現さ
れ，この蛋白質から臭化シアン切断によってソマトスタ
チンが分離された。ヒト・インシュリン遺伝子の製造
は，先に述べたように,21アミノ酸鎖と30アミノ酸鎖の
コードを持つ遺伝子の調製を伴った。18デオキシオリゴ
ヌクレオチド断片を結合して長い方の鎖用の遺伝子が作
られ,11断片を結合して短い方の鎖の遺伝子が作られ
た。各遺伝子はβガラクトシダーゼ遺伝子とともに融合
遺伝子を形成するのに使用され，個々に発現したポリペ
プチド鎖は酵素的に分離され結合されて完全なインシュ
リン分子を形成した。〔Goedell等，Proc.Nat.Acad.Sc
i.U.S.A.,，76,pp.106−110（1979）〕。
上記の各手順において，デオキシオリゴヌクレオチド断
片は調製され，そして，下記の一般手順に従って順次結
合された。〔例えば,Agarwal等，Nature，227,pp.1−７
（1970）およびKhorana,Science, 203,pp.614−675（1
979）を参照のこと。〕最初の『頭』（即ち,5′−３′
極性）デオキシオリゴヌクレオチド断片は，酵素的に第
２の『頭』断片に結合された。これら２つの『頭』鎖の
整列は，第１頭鎖の半分と第２頭鎖の半分とに相補性を
持つ塩基配列を持つ『尾』（即ち,3′から５′極性）鎖
を使用することで可能になった。結合した後で，頭鎖の
補体非結合の塩基は，形成された二重部分から『突き出
す』。第２の底鎖が加えられるが，この鎖は，突き出し
た頭鎖の５乃至６塩基補体を含み，さらに追加の５乃至
６塩基が加わるが，これは尾一本鎖部分として突き出
る。そして,2つの尾鎖は一緒になる。このような逐次的
な付加は完全な遺伝子配列が形成されるまで続けられ，
全手順は非常に時間が掛かり且つ非常に不能率である。
全遺伝子合成の前述の方法の時間が掛かるという特徴
は，先に言及した２つの『短い』インシュリン遺伝子の
組み立てを行うのに少なくとも４人の研究者による３ヵ
月に渡る作業が必要であったという報告に良く例示され
ている。さらに，ベクターの挿入に成功するには比較的
に少量の製造された遺伝子が必要なだけであるが，上記
の合成手順は総収率が非常に低く（１結合当たり20％の
オーダー），処方の細心の注意を払って従っても選択さ
れた短い遺伝子のごく少量の分離さえも保証されるもの
ではない。合成可能な最大長の遺伝子は，個々の短い断
片を接合する効率によって明らか限度がある。そのよう
な結合反応がｎほど必要であり，前述の各反応の収率が
ｙであるとすると，得られる正しく合成された遺伝物質
の量はynに比例する。この関係は指数関数的であるの
で,1結合反応当たりの収率の僅かな増加でも，合成でき
る最大遺伝子の長さは大幅に増加することになる。
上記の方法の不能率さは，主に望ましくない中間生成物
の形成によるものである。一例を挙げると，尾の『鋳
型』鎖を伴うアニールされた頭鎖を形成する最初の反応
においては，望ましい反応は， であろうが，実際に得られる生成物は あるいは， あるいは同様のものであるかも知れない。さらに，個々
のデオキシオリゴヌクレオチドが長くなればなるほど，
それらが熱力学的に安定した自己会合，例えば『ヘアピ
ン』あるいは集団を形成する可能性が高まる。
合成効率を高めるための提案はこれまですぐに出てくる
状態ではなく，最近に『現在得られる方法によっては，
約30ユニットのアミノ酸よりも長いペプチドを合成する
ことは経済的に不可能であり，多くの臨床的に重要な蛋
白質はもっと長いものである』と報告された。〔（Ahar
onowitz等。Scientific American，245,No.3,pp.140−1
52,p.151（1981）。〕 大きな遺伝子の合成にかかわる『経済的実行可能性』の
例が，ヒト白血球インターフェロンの全合成の努力の
『成功』の最近の発表にみることができる。〔Edge等，
Nature，292,pp.756−782（1981）。〕簡潔に要約する
と，約15塩基を含む異なるデオキシオリゴヌクレオチド
が合成され，上記の種類の『50％重なり』手順によって
接合されて11の短い二重型を形成した。次ぎに，これら
は４つのもっと長い二重型に組み立てられ，前述の二重
型は最後に接合されて,166アミノ酸蛋白質のコードを持
つ514塩基対遺伝子をもたらした。この手順は，著者等
が『迅速』と特徴付けたものであるが,5人の研究者の約
１ヵ年に渡る努力を要したものと確実に推定され，組み
立て計画の効率は明らかに非常に低い。一例として，出
発点となった67のデオキシオリゴヌクレオチドはそれぞ
れ40pモルが用意され,11の中間サイズの二重型を形成す
るのに使用されたが,4つの大きな二重型の組み立てが達
成された頃には，全遺伝子を最終的に組み立てるのに使
用できる長い二重型の収量は僅かに約0.01pモルだけで
あったことを指摘することができよう。
産業におよび製薬に重要な蛋白質の微生物による発現の
ための組み替えDNA技術の実施の別の一面は，『コドン
の優先性』の現象である。遺伝的にトランスフォームさ
れた宿主細胞内の遺伝子の発現の現存する機構が『働い
て』望みの生成物を作り上げることは既に述べたが，微
生物内で達成される発現のレベルは大きく異なる可能性
があり，部分的には挿入された外来性遺伝子内に存在す
るアミノ酸仕様遺伝コードの特定の代替形によって変わ
る。４つの可能なヌクレオチド塩基の『トリプレット』
・コドンは,64の異なる形をとりうる。これらの形が僅
か20の異なるアミノ酸（さらに転写の開始および終了）
のメッセージをもたらすということは，アミノ酸によっ
ては２つ以上のコドンによってコードを決めることが出
来ることを意味する。実際のところ，アミノ酸によって
は６つもの『冗長な』代替コドンを持つものもあり,1つ
の必要なコドンしか持たないものもある。いまだ完全に
は理解されていない理由によって，代替コドンは異なる
種類の細胞の内在性DNA内にいささかも均一に存在して
おらず，ある種の細胞内のある種のコドンには異なる自
然の階層性，即ち，『優先性』が存在するように思われ
る。
一例として，アミノ酸ロイシンは,CTA,CTC,CTG,CTT,TTA
およびTTG（それぞれmRNAコドン,CUA,CUC,CUG,CUU,UUA
およびUUGに対応する）を含む6DNAコドンの何れによて
も仕様が決まる。微生物のゲノム・コドン頻度の徹底的
な解析によって，Ｅ．Coli細菌の内在性DNAはCTGロイシ
ン仕様コドンを最も普通に含むことが判明し，酵母およ
び変形菌種のDNAはTTAロイシン仕様コドンを最も普通に
含むことが判明した。この階層性にかんがみて，Ｅ．Co
li宿主によってロイシンに富んだポリペプチドの高レベ
ルの発現を得る可能性は，ある程度までコドンの使用の
頻度によって決まると一般に考えられている。例えば,T
TAコドンの豊富な遺伝子は，まず間違いなくＥ．Coliに
おいては発現が少ないが,CTGの豊富な遺伝子はポリペプ
チドをおそらく多く発現するであろう。同様に，酵母細
胞がロイシンの豊富なポリペプチドの発現のためのトラ
ンスフォーメイション宿主細胞である場合は，挿入され
たDNAで使用するのが望ましいコドンはTTAであろう。例
えば,Grantham等，Nucleic Acids Research，８,pp.r49
−r62（1980）;Grantham等，Nucleic Acids Research，
８,pp.1893−1912（1980）；及びGrantham等，Nucleic
Acids Research，９,pp.r43−r74（1981）を参照のこ
と。
組み替えDNA手法にコドンの優先性現象が意味するもの
は明白であり，そして，この現象は首尾よくトランスフ
ォームされた宿主生物において外来性遺伝子の高い発現
を達成するのに失敗した過去の多くの例を説明するのに
役立つ可能性がある。即ち，『優先性』の低いコドンが
挿入された遺伝子に繰り返し存在して，発現のための宿
主細胞の機構が効率的に働かないのではないか。この現
象は，予定の宿主細胞が優先するコドンを含むように設
計された完全に製造された遺伝子は組み替えDNA手法を
実施するための外来性遺伝物質の望ましい形態をもたら
すという結論に導く。このような関係において，コドン
の選択を可能とする迅速且つ能率的な全遺伝子製造手順
が存在しないことは，この技術における進歩のよい深刻
な障害を成しているように思われる。
本発明の背景にすくなからず関係するのは，生物学的に
活性のある物質の種類，インターフェロン（IFN）の調
製および使用に関する技術である。インターフェロンは
分泌される蛋白質であり，かなりよく確定された抗ウイ
ルス性，抗腫瘍性，および免疫調節性を持つ。例えば,G
ray等，Nature，295,pp.503−508（1982）およびEdge
等，前掲，およびそれに示された参照文献を参照のこ
と。
抗原性および生物学的および化学的性質に基づいて，ヒ
ト・インターフェロンは３つの大きなクラス，即ち,IFN
−α（白血球）,IFN−β（繊維芽細胞）およびIFN−γ
（免疫）に分類されている。ウイルス誘導酸安定性イン
ターフェロン（IFN−αおよびIFN−β）の構造および性
質についてはかなりの情報が蓄積されている。これらは
均質になるまで純化され，少なくとも部分的なアミノ酸
配列が確認されている。IFN−β1およびIFN−α複遺伝
子ファミリーのクローニングされたcDNAおよび遺伝子配
列の解析によって，多くのインターフェロンの完全なア
ミノ酸配列を演繹することが可能となった。さらに，
Ｅ．ColiにおけるIFN−β1および幾つかのIFN−αの，
そして酵母におけるIFN−α1の効率の高い合成が，これ
らの蛋白質を大量に生物学的に活性のある形態で精製す
ることを可能とした。
種々の分裂促進刺激を受けたリンパ球の培養内で一般に
生成されるインターフェロンであるIFN−γの構造およ
び性質に関する情報はもっと少ない。IFN−γは酸に不
安定で,IFN−αあるいはIFN−βに対して調製された抗
血清とは交差反応しない。IFN−γは広範な生物学的作
用があるものと考えられ，それらにはIFN−のおよびIFN
−βの抗ウイルス作用の増強も含まれ,IFN−γはウイル
スおよび細胞の特異性および誘導される抗ウイルス性機
序の点でIFN−αおよびIFN−βとは異なっている。粗調
製したものを用いての試験管内の研究は,IFN−γの主な
機能は免疫調節因子としての機能であることを示唆して
いる。トランスフォームされた細胞に対するIFN−γの
抗増殖効果は,IFN−αあるいはIFN−βの10倍から100倍
であると報告されており，新形成の治療に用いる可能性
があることを示している。ネズミIFN−γ製剤は，マウ
ス肉腫に対して優れた抗腫瘍作用を持つことが示されて
いる。
ヒトIFN−γのコードを持つcDNA配列を含む組み替えプ
ラスミドが分離され特性が確認されたと最近報告された
（Gray等，前掲）。Ｅ．Coliおよび培養モンキー細胞内
のこの配列の発現は，本当のヒトのIFN−γの性質を持
つポリペプチドを生じたと報告されている。発表による
と,cDNA配列および『成熟』ポリペプチドの推論された1
46アミノ酸配列は，推定されるリーダー配列を除いて，
下記の通りである。
以前に発表された配列では，グルタミンではなくアルギ
ニンが配列の位置140に示された。（従って，別に示さ
ない限り，『ヒト免疫インターフェロン』あるいは簡単
に，『IFN−γ』は〔Arg140〕および〔Gln140〕の両形
態を包含するものとする。） 上述した種々のインターフェロンの広範な生物学的作用
の故に，インターフェロンの合成ポリペプチド類似体を
作り出すことは，このクラスの化合物の治療上の可能性
の完全な具現化に非常に大きな意義がある。組み替えDN
A手法によって今日までにもたらされた大量のインター
フェロンの分離の利点にもかかわらず，この分野の専門
家はインターフェロンの合成ポリペプチド類似体の調製
にこれという成果を収めていない。
言い替えると,Gray等，前掲のIFN−γのコードを持つ遺
伝子の分離の研究，およびEdge等，前掲の完全に製造さ
れたIFN−α1遺伝子をもたらすための多大な努力は，単
一の非常に精密に定められたポリペプチド配列の発現の
ための遺伝物質のみをもたらした。『正真の』ポリペプ
チドとたとえ１つのアミノ酸の種類あるいは位置でも異
なるヒトIFN−γ類似体の大量の微生物による発現を可
能にする手順（特定の部位の突然変異生成の手段は別と
して）は全く存在しない。同様に,Edge等，前掲によっ
て調製されたポリペプチドとアミノ酸が１つ異なるIFN
−α1類似体の調製では,1つのトリプレット・コドンが
異なる全く新しい遺伝子を作り出すのに更に１年の期間
が必要になると思われる。対象遺伝子の断片を切出して
変種のポリペプチド配列のコーディング情報を含む断片
で置き換えるためのあつらえの手段は存在しない。さら
に，報告されたcDNAから誘導され製造されたDNA配列を
変えてコドンの用法を変えることは，選択可能な『オプ
ション』ではない。
実際，組み替えDNA手法による変種インターフェロン・
ポリペプチド類の調製の報告は,IFN−α1およびIFN−α
2のためのヒト遺伝子の『ハイブリッド』の調製および
発現に関連するもののみである〔Weck等，Nucleic Acid
s Research，９,pp.6153−6168（1981）およびStreuli
等，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，78,pp.2848−2852（19
81）〕。得られたハイブリッドは,8つのヒト（cDNA誘
導）遺伝子の２つが偶然に配列のなかに１度だけ含まれ
ていることを知って作られた遺伝子断片の４つの可能な
組合せから成り，塩基配列は細菌エンドヌクレアーゼの
制限エンドヌクレアーゼ切断部位PvuIIおよびBglIIに対
応する。
従って，本技術分野において，ヌクレオチド塩基からイ
ンターフェロン等の大きなポリペプチドのコードを持つ
製造されたDNA配列の完全な合成のもっと効率のよい手
順が切望されている。さらに，自然に生じる形態のもの
から１つあるいはもっと多くの選択されたアミノ酸の種
類および／あるいは位置が異なる合成ポリペプチドの微
生物発現を可能とするような，変種形態の合成配列の迅
速な作成のための合成方法が必要である。
要約 本発明は，長さが約200ヌクレオチド塩基対を超える直
線状二本鎖DNA配列の完全な合成のための新規な，迅速
な且つ効率の高い手順を提供するものであり，前述の配
列は望みのポリペプチドの広範な異種の合成を司る構造
遺伝子で全て出来ている場合がある。
本発明によると，長さが約200塩基対を超え，且つ，ア
ミノ酸の事前に決定された連続配列の発現をこの配列を
含む選択されたDNAベクターによってトランスフォーム
された選択された宿主微生物の中でおこなわせるための
コードを持つ直線状二本鎖DNA配列は，下記から成る方
法によって合成される； （ａ）長さが約100塩基対あるいはそれ以上の２つ以上
の異なるサブユニット直線状二本鎖DNA配列を，選択さ
れたアッセンブリー・ベクターの内部で組み立てるため
に調製し， 調製された各々の異なるサブユニットDNA配列は，発現
されるべき前述の事前に定められたアミノ酸配列の異な
る連続部分のコードを持つ一連のヌクレオチド塩基コド
ンから成り， 前述のサブユニットの第１のものの１つの終末領域は，
塩基配列の一部分から成り，それは第１の制限エンドヌ
クレアーゼによる切断の認識部位をもたらし，前述の認
識部位は前述の選択されたアッセンブリー・ベクターに
サブユニットが挿入されたのちにこのベクターのなかに
１度あるかあるいは全く無いかどちらかであり， 前述のサブユニットの第２のものの１つの終末領域は，
塩基配列の一部分から成り，それは前述の第１のエンド
ヌクレアーゼ以外の第２の制限エンドヌクレアーゼによ
る切断の認識部位をもたらし，この認識部位は前述の選
択されたアッセンブリー・ベクターにサブユニットが挿
入されたのちにこのベクターのなかに１度あるかあるい
は全く無いかどちらかであり， サブユニットの残りの終末領域全部の少なくとも半分
は，前述の第１および第２のエンドヌクレアーゼ以外の
制限エンドヌクレアーゼによる切断の認識部位部分（望
ましくはパリンドロームの６塩基対認識部位）を成し，
この認識部位は前述の選択されたアッセンブリー・ベク
ターにすべてのサブユニットが挿入されたのちにこのベ
クターのなかに１度そしてただ１度だけ存在し；且つ （ｂ）ステップ（ａ）で調製された前述の各サブユニッ
トDNA配列を順次に選択されたアッセンブリー・ベクタ
ーに挿入し，各挿入に続いてアッセンブリー・ベクター
配列の生物学的増幅を行い，それによって，事前に定め
られた連続アミノ酸配列のコードを持つ望みのDNA配列
を含むDNAベクターを形成し，そして，組み立てられる
望みのDNA配列は，その中間位置に，制限エンドヌクレ
アーゼによる切断のための少なくとも１つのユニーク
な，望ましくはパリンドロームの６塩基の認識部位を含
む。
上記の一般的な方法は，望ましくは，さらに望みのDNA
配列をアッセンブリー・ベクターから分離するステップ
を含み，望ましくは，新規に製造されたDNA配列のクラ
スの１つをもたらすもので，前述の新規の配列はその中
間位置に制限エンドヌクレアーゼによる切断のための少
なくとも１つのユニークなパリンドロームの６塩基認識
分を持つ。このようにして分離された配列は，次ぎに別
の『発現』ベクターに挿入され，アッセンブリー・ベク
ターが増幅されたものと同じ或いは異なる微生物によっ
て望みのポリペプチドが直接に発現される。この方法の
その他の望ましい実施例においては，少なくとも３つの
異なるサブユニットDNA発現がステップ（ａ）によって
調製され順次に前述の選択されたアッセンブリー・ベク
ターにステップ（ｂ）によって挿入され，そして得られ
た望みの製造されたDNA配列は，その中間位置に制限エ
ンドヌクレアーゼによる切断のための少なくとも２つの
ユニークなパリンドロームの６塩基認識部位を含み，合
成されたDNA配列は，生物学的に活性のポリペプチドの
コードを持つ前述の構造遺伝子から成り，そして，製造
されたDNA配列においては，ヌクレオチド塩基の配列
は，前述の選択された宿主微生物におけるコドンの優先
的発現特性に基づいて同じアミノ酸を指定する代替コド
ンのなかから選択された１つあるいはその以上のコドン
を含む。
本発明の新規な生成物は，長さが約200塩基対を超える
製造された直線状二本鎖DNA配列で，この配列を含む選
択されたDNAベクターによってトランスフォームされた
選択された宿主微生物による事前に定められた連続アミ
ノ酸配列の発現のためのコードを持つもので，その中間
位置に制限エンドヌクレアーゼによる切断のための少な
くとも１つのユニークなパリンドロームの６塩基認識部
位を持つことを特徴とするものを含む。前述の製造され
た配列の生物による発現のポリペプチド生成物も含まれ
る。
実例として，本発明により，ヒト免疫インターフェロン
（IFN−γ）およびヒト免疫インターフェロンとは１つ
あるいはそれ以上のアミノ酸の種類および／あるいは位
置が異なる新規の生物学的機能類似体ポリペプチドを合
成するためのコードを持つ新規の製造された遺伝子がも
たらされる。Ｆサブタイプ（『LeIFN−Ｆ』あるいは『I
FN−αＦ』）のヒト白血球インターフェロンおよびその
類似体，および共働ヒト白血球インターフェロンの合成
のためのコードを持つ製造された遺伝子ももたらされ
る。
本発明の方法の実施に使用するDNAサブユニット配列
は，望ましくはヌクレオチド塩基から，共同所有の同時
出願された合衆国特許出願番号375,493にYitzhak Stabi
nskyに開示され『構造遺伝子の製造および発現』（代理
人の整理番号6250）と名前をつけた方法に従って合成さ
れる。端的に要約すると一般的な方法は下記のステップ
から成る。
（１）２つあるいはもっと多くの異なる直線状の二重型
DNA鎖を調製し，各二重型鎖は12あるいはもっと多くの
選択された相補性塩基対の二本鎖領域を含み，さらに鎖
の一端に３つから７つの選択された塩基の頭一本鎖終末
配列および／あるいは鎖のもう１つの端に３つから７つ
の選択された塩基の尾一本鎖終末配列を含み，各二重型
DNA鎖の各一本鎖終末配列は，調製されたその他の二重
型DNA鎖の何れかの多くて１つの一本鎖終末配列の線塩
基相補性からなるものであり，そして （２）ステップ（１）で調製された各二重型DNA鎖を，
ステップ（１）で調製され相補性一本鎖終末配列を持つ
１つあるいは２つのことなる二重型鎖にアニーリング
し，それによって１つの連続した二本鎖DNA配列を形成
し，この二本鎖DNA配列は少なくとも27の選択された塩
基対の二重型領域を持ち，前述の塩基対はステップ
（１）で調製された二重型DNA鎖の一本鎖終末配列の相
補性会合によって形成された少なくとも３つの塩基対を
含み，さらに前述の二本鎖DNA配列は３つから７つの塩
基の一本鎖頭あるいは尾終末領域を０から２つ持つ。
サブユニットの構造の望ましい一般プロセスにおいて
は，少なくとも３つの異なる二重型DNA鎖がステップ
（１）によって調製され，そのようにして調製された鎖
は全て１つのアニーリング反応混合物のなかで同時にア
ニールされて単一の連続二重型鎖DNA配列を形成し，こ
の配列は少なくとも42の選択された塩基対の二重型領域
を持ち，前述の選択された基対はステップ（１）で調製
された二重型鎖の一本鎖終末配列の相補性会合により形
成された３つあるいはもっと多くの塩基対の少なくとも
２つの近接しないセットを含む。
望ましいサブユニット製造プロセスの二重型DNA鎖調製
ステップ（１）は，望ましくは下記のステップから成
る。
（ａ）選択された直線状配列内に15以上の塩基を持つ第
１および第２の直線状デオキシオリゴヌクレオチド断片
を作り，第２の断片の塩基の直線状配列は第１断片の塩
基の配列の全相補体から成るが，但し，第２の断片が少
なくとも一端は，第１の断片を完全に相補するものに続
いて３つから７つの選択された塩基の追加直線状配列を
含むか，あるいは第１の断片の終末配列に相補的な３つ
から７つの塩基の直線状の配列を欠くかのいずれかであ
るが，しかしながら，第２の断片は追加の塩基配列を持
つことも，その両端に塩基配列を欠くこともあってはな
らず；そして （ｂ）第１および第２の断片を断片間の相補的会合を促
進するような条件において組み合わせて１つの直線状二
重型DNA鎖を形成する。
形成された二本鎖DNAサブユニット配列内の塩基の配列
は，望ましくは予定された宿主微生物，例えば，酵母細
胞あるいは細菌，特にＥ．Coli細菌内でのコドンの優先
的発現特性に基づき同じアミノ酸を指定する代替えコド
ンのなかから選択された１つあるいはもっと多くのトリ
プレット・コドンを含む。
本発明によって，Ｅ．Coli宿主細胞内での選択された外
来性遺伝子の発現のレベルを上げるための方法および材
料の改善ももたらされる。端的に述べると，発現ベクタ
ーは，ポリペプチド・コーディング領域の上流の選択さ
れたDNA配列を含むように構成され，この選択された配
列は，高く発現された内在性ポリペプチドに伴うゲノム
のＥ．Coli DNAに存在するリボソーム結合部位の複製で
ある。現在望ましい選択された配列は，アウター・メン
ブレイン蛋白Ｆ（『OMP−Ｆ』）のＥ．Coli発現に伴う
リボソーム結合部位配列の複製である。
本発明のその他の特徴および長所は，下記の本発明の詳
細な説明を考察すれば明らかになろう。
詳細な説明 本明細書で用いる場合は,DNA配列あるいは遺伝子に使わ
れる『製造された』の用語は，ヌクレオチド塩基の組み
立てにより完全に化学的に合成される生成物か，あるい
はそのように化学的に合成された生成物の生物学的反復
複製から得られる生成物を意味する。そのようなもので
あるので，この用語は生物学的起原の開始材料を用いる
cDNA方法あるいはゲノムのクローニング方法論によって
『合成』された生成物を除外する。下記の第１表は，本
明細書においてアミノ酸を示すのに使用される略称を示
し,IUPACの推奨する１文字呼称を含む。
下記の略称はヌクレオチド塩基に用いるものとする:A―
アデニン;G―グアニン;T―チミン;U―ウラシル；そして
Ｃ―シトシン。本発明の理解を容易にするために，下記
の第II表および第III表は,DNAの64のトリプレット・ヌ
クレオチド塩基コドンと20のアミノ酸との相関関係表，
およびそこに指定される転写終了（『停止』）機能を示
す。RNAの相対する相関を決定するには，これらの表の
ＴをＵに置き換える。
二本鎖DNAの制限エンドヌクレアーゼ切断の『パリンド
ロームの』認識部位は，頭と尾の塩基相補体との間に左
から右および右から左への対称性を示すもの，即ち,5′
から３′末端までの認識部位の相補性塩基配列の『読
み』が同一であるものである。制限エンドヌクレアーゼ
による切断のためのパリンドロームの６塩基認識部位の
例としては,HindIIIによる切断の部位があるが，その頭
および尾鎖の５′から３′はAAGCTTである。非パリンド
ロームの６塩基制限部位の例としては,EcoP15による切
断部位があり，この頭鎖はCAGCAGと繰り返しを示す。尾
鎖塩基相補体の５′から３′はCTGCTGである。定義によ
って本質的に，奇数（例えば5,7）の塩基からなる制限
部位は非パリンドロームである。エンドヌクレアーゼに
よっては１つの部位のいくつかの変形部位で切断するも
のもあり，この部位はパリンドロームの場合もあればそ
うでない場合もある。１例を挙げると,Xho IIは（いず
れかのプリン）GATC（いずれかのピリミジン）を読み，
これにはパリンドロームの配列AGATCTおよび非パリンド
ロームの配列GGATCTも含まれる。先に述べた『BRL制限
エンドヌクレアーゼの一覧表』を参照すると，エンドヌ
クレアーゼを認識する６塩基配列のパリンドローム的部
位は,BbrI,ChuI,Hin173,Ein91R,HinbIII,HinbIII,HindI
II,HinfII,HsuI,BglII,StuI,RruI,ClaI,AvaIII,PvuII,S
maI,XmaI,EccI,SacII,SboI,SbrI,ShyI,Sst II,TglI,Avr
II,PvuI,RshI,RspI,XniI,XorII,XmaIII,BluI,MsiI,Scu
I,SexI,SgoI,SlaI,SluI,SpaI,XhoI,XpaI,Bce170,Bsu124
7,PstI,SalPI,XmaII,XorI,EcoRI,Rsh630I,SacI,SstI,Sp
hI,BamHI,BamKI,BamNI,BamFI,BstI,KpnI,SalI,XamI,Hpa
I,XbaI,AtuCI,BclI,CpeI,SstIV,AosI,MstI,BalI,AsuII,
およびMlaIに限られる。非パリンドロームの６塩基配列
のみを認識するエンドヌクレアーゼは,Tth111II,Ecop1
5,AvaI,およびAvrIに限られる。パリンドロームと非パ
リンドロームの６塩基配列の両方を認識するエンドヌク
レアーゼには,HaeI,HgiAI,AcyI,AosII,AsuIII,AccI,Chu
II,HincII,HindII,MnnI,XhoII,HaeII,HinHI,NgoI,およ
びEcoRI′がある。
これから生成する望みのポリペプチドの構造が決まる
と，本発明の実施は下記を必要とする。長さが100塩基
対以上の２つあるいはもっと多くの異なる特定の連続二
本鎖DNAサブユニット配列で適切な構成の末端部分をも
つものを調製すること。選択された宿主生物のなかでハ
イブリッド・ベクターの中間増幅を行いながら選択され
たアッセンブリー・ベクターにサブユニットを順次挿入
すること；アッセンブリー・ベクター（あるいはサブユ
ニットから製造されたDNA配列を含む別の選択された
『発現』ベクター）を用いて適切な選択された宿主をト
ランスフォームすること。および，宿主生物に発現され
たポリペプチド発現を分離することである。その最も効
率の良い形態においては，本発明の実施は，製造された
配列のアッセンブリーとポリペプチドの大量発現とに同
じベクターを用いる。同様に，発現に利用する宿主微生
物は通常は，サブユニット・アッセンブリー・プロセス
で実施される増幅に用いられるものと同じである。
製造されたDNA配列は，発現の自律的な制御のためのプ
ロモーター／レギュレーター領域を備えることが可能で
あり，あるいはベクター内に存在するプロモーター／レ
ギュレーター配列による発現の制御が可能となるような
仕方でベクターに取り込まれることが可能である。本発
明の製造されたDNA配列は，プラスミド内に存在する遺
伝子（例えばβガラクトシダーゼ）に適切に取り込まれ
て製造されたDNA配列によってコードが定まる望みのア
ッセンブリー配列を含む融合ポリペプチド生成物のコー
ドを持つ融合遺伝子を形成することができる。
本発明の望ましい実施形態においては，製造されたポリ
ペプチドのサイズは，約65あるいは75アミノ酸から約20
0あるいはそれ以上のアミノ酸の範囲である。選択され
たトランスフォームされた宿主生物による望みのポリペ
プチドの高いレベルの発現は，宿主によって優先的に発
現される１つあるいはもっと多くの代替コドンを含むDN
A配列の製造によって促進される。
長さが100から200塩基対の二本鎖サブユニットDNA配列
の製造は，先に言及した先行技術アッセンプリー方法に
従って進めることも出来るが，望ましくは上述したStab
inskyによる合衆国特許出願番号375,493に開示され且つ
本発明の実施の下記の例の幾つかに使用された迅速な能
率的な手順によって達成される。端的に云うと，これら
手順は，デオキシオリゴヌクレオチドから２つ以上の異
なる直線状二重型DNA鎖を組み立てることを含み，前述
のDNA鎖はそれぞれ比較的に長い二本鎖領域を二本鎖の
一端あるいは両端の比較的に短い一本鎖領域とともに含
む。二本鎖領域は，望みのポリペプチドの前述のアミノ
酸配列の始めの，終末の，あるいは中間部分のアッセン
ブリーを指定するのに必要なコドンを含む。可能な場合
は，予定される宿主（例えば，Ｅ．Coli）によって優先
的に発現される代替コドンが使用される。最終的に組み
立てられるサブユニットDNA配列において占めるべき相
対的位置によって異なるが，二重型鎖の一本鎖領域は塩
基配列を含み，これは，他の二重型鎖の塩基によって相
補されると，望みのポリペプチド配列内のアミノ酸を指
定するコドンをもたらす。
この手順に従って形成された二重型鎖は，次に相補性の
短い一本鎖領域を持つ１つあるいは２つの異なる二重型
鎖に酵素的にアニールされて，望みのポリペプチド断片
のコードを持つ望みの連続二本鎖サブユニットDNA配列
を形成する。
全配列の組み立ての高効率および迅速さは，前述の手順
においては,3つ以上の二重型鎖の１つのアニーリング反
応を実施することによって強化されるが，前述の二重型
鎖の短い一本鎖領域は，その他の二重型鎖のせいぜい１
つの他の一本鎖領域の塩基の相補体となる。その他の二
重型の一本鎖領域１つだけを特定的に相補する短い一本
鎖領域を形成された全ての二重型鎖を用意することは，
遺伝コードの冗長性の範囲内で，そして望ましくは，予
定される宿主生物のコドンの優先性を考慮して代替コド
ンを選択することによって達成される。
仮想のポリペプチドのコードを持つ仮想の長いDNA配列
の構造の下記の説明は，本発明の実施を，取分けサブユ
ニットDNA配列の適切な終末配列の形成に関連して写実
的に説明する役にたつと思われる。
望みの生物学的に活性のあるポリペプチドを分離し，そ
のアミノ酸を順番に配列して，連続する配列の100のア
ミノ酸残基の構成を明らかにする。ポリペプチドの微生
物学的発現のための製造された遺伝子の形成は，選択さ
れた宿主生物のトランスフォーメイションに使用される
選択されたウイルスあるいは環状プラスミドDNAベクタ
ーへ挿入するための少なくとも300塩基対のアッセンブ
リーを必要とする。
製造された遺伝子を構成する前に，予定される微生物宿
主の種類を考慮する必要があるが，それは，宿主が先に
分かっていれば宿主種のコドンの優先性を考慮してコド
ンを選択できるからである。この議論においてはＥ．Co
li細菌宿主を選択するものと仮定する。
製造された遺伝子の構成において考慮すべき第２の点
は，アッセンブリー・プロセスで用いられる予定のDNA
ベクターの種類である。適切なベクターの選択は，制限
エンドヌクレアーゼ酵素によるベクターの切断部位に関
する現在の知識に基づく。もっと具体的には，アッセン
ブリー・ベクターは，サブユニットの容易な挿入を許す
エンドヌクレアーゼ切断部位をもたらすDNA配列を含む
かどうかに基づいて選択される。この点に関しては，選
択されたアッセンブリー・ベクターは，望ましくは少な
くとも２つの制限部位を持ち，前述の制限部位はサブユ
ニット挿入プロセスの実施の前にはベクター内で１度し
か（即ち， −GAATTC− 『ユニーク』である）起きない。この説明においては,1
つのEcoRI制限部位，−CTTAAG− −CAGCTG− ，および１つのPvuII制限部位，−GTCGAC−を持つ仮想
環状DNAプラスミドを仮定する。
次に，アミノ酸の代替コドンが得られるかどうかを考慮
するために望みのポリペプチドのアミノ酸配列を解析す
る（望ましくは，予定されるＥ．Coli宿主のコドンの優
先性を考慮する）。この情報を得てから,2つのサブユニ
ットDNA配列を設計するが，望ましくは前述の配列は約1
50対のオーダーの長さを持つものとし，各配列はそれぞ
れ望みのポリペプチドの全アミノ酸配列の約半分のコー
ドを持つ。この説明においては，製造された２つのサブ
ユニットは『Ａ』および『Ｂ』で呼ぶ。
本発明の方法は，前述の２つのサブユニットに適用され
ると，一般に下記を必要とする。即ち，サブユニットの
１つをアッセンブリー・ベクターに挿入すること。形成
されたハイブリッド・ベクターの増幅。および第２のサ
ブユニットを挿入して適切な配列に組み立てられたサブ
ユニットを含む第２のハイブリッドを形成することであ
る。この方法は,2つのサブユニットを接合して接合され
た末端が連続した事前に選択された塩基配列をもたらし
て連続的な事前に選択されたアミノ酸配列のコードを持
つようにすることを要するので，もう一方のサブユニッ
トに接合される製造されたサブユニットの終末領域を構
成する塩基の種類および配列に関する必要事項が幾つか
ある。この方法はサブユニットをアッセンブリー・ベク
ターに接合することを要するので，アッセンブリー・ベ
クターに接合される製造されたサブユニットの終末領域
を構成する塩基の種類および配列に関するその他の必要
事項がある。サブユニットは，同時的にではなく，順次
にアッセンブリー・ベクターに挿入されるので，（且
つ，サブユニットを組み立てられた形態から選択的に切
り出してその中の製造された塩基配列に変更を加えるこ
とができれば本方法は最も有利に実施できるので），製
造されたサブユニットの終末領域の塩基の種類に関する
必要事項がさらにある。分かり易いように，下記の終末
領域の性格に関する検討においては，サブユニットＡお
よびＢの両端の終末領域はそれぞれＡ−１とＡ−2,およ
びＢ−１とＢ−２と呼ぶ。即ち， サブユニットＡをpBR3000に最初に挿入し，終末領域Ａ
−１をEcoRI制限部位でベクターに結合するアッセンブ
リーの計画を想定する。最も簡単な場合は，終末領域は
単にEcoRI『付着末端』，即ち,4塩基の一本鎖（−AATT
−あるいは−TTAA−）を備え，それがpBR3000のEcoRI分
解で形成される一本鎖配列を相補する。これによってリ
ガーゼ酵素処理をすれば終末領域Ａ−１をベクターに結
合することが出来る。終末領域Ａ−１の末端の一本鎖に
適切 ５′−Ｇ− な塩基対（例えば,3′−CTTAA−）が先行していない
と，完全な認識部位はベクターへの結合によって再構成
されない。結合によってEcoRI認識部位が再構成される
か否かは（即ち，サブユニットＡをベクターに挿入した
後に残ったEcoRi認識部位が０か１つかは），計画を考
案するものの裁量にゆだねられる。別法としては，サブ
ユニットＡの終末領域Ａ−１を，仮想的に『XXX』と呼
ぶなにか他のエンドヌクレアーゼのための認識部位をも
たらす塩基の完全な一揃いを含むように構成し，そして
上述したようにEcoRI認識部位の部分を付加してEcoRI
『リンカー』を備えてもよい。組み立てられた配列から
サブユニットＡを切り出すのに実際に用いることができ
るためには，『XXX』部位は挿入によって形成されたハ
イブリッド・プラスミドの中の他のどこにもあってはな
らない。終末領域Ａ−１の構成の必要事項は，従って，
それが制限エンドヌクレアーゼによる切断のための認識
部位をもたらす塩基配列の部分（即ち，全部あるいは一
部）を成すことであり，前述の認識部位がサブユニット
の挿入後にアッセンブリー・ベクターの中に１度起きる
か全く起きないかのいずれかであることである。
サブユニットＢの終末領域Ｂ−２もアッセンブリー・ベ
クターに接合する必要があると想定しよう（例えば,pBR
3000に存在するPvuII切断の単一の認識部位におい
て）。終末領域Ｂ−２の構成の必要事項はＡ−１の構成
のものと同じであるが，但し,B−２を構成する際に参照
する第２のエンドヌクレアーゼ酵素はＡ−１を構成する
際に参照されるものとは異なっていなければならない。
もし認識部位が同じであれば，完全に組み立てられた配
列から断片ＡおよびＢを別々に切り出すことは出来な
い。
上記の想定から，終末領域Ａ−２は最終のpBR3000ハイ
ブリッドにおいて終末領域Ｂ−１に結合する必要があ
る。終末領域Ａ−２あるいは終末領域Ｂ−１のいずれか
は，仮想の第３のエンドヌクレアーゼ『YYY』による制
限エンドヌクレアーゼ切断の認識部位の部分（望ましく
はパリンドロームの６塩基）を持つように構成され，前
述の認識部位は，全てのサブユニットを発現ベクターに
挿入した後に発現ベクターの中にただ１つだけ，即ち，
サブユニットのアッセンブリーの中間位置に，存在する
ことになる。この結果を得るための計画は幾つかある。
１つの選択可能な計画においては，『YYY』の全認識部
位は終末領域Ａ−２に含まれ，この領域は（１）増幅の
ためにサブユニットＡのアッセンブリー・ベクターへの
挿入を完了し（２）その後のサブユニットＡのサブユニ
ットＢへの接合を可能にするのに必要なエンドヌクレア
ーゼ切断のためのその他の認識部位の１つあるいは２つ
も持つ。この場合は，終末領域Ｂ−１の末端にはそれを
終末領域Ａ−２に繋ぐのに必要な塩基があるだけであ
る。別の代替計画においては，全『YYY』認識部位は終
末領域Ｂ−１に含まれ,B−１はさらにその末端に，サブ
ユニットＡをサブユニットＢに接合するのに役立つエン
ドヌクレアーゼ切断の認識部位の部分を持つ。
別の代替計画として，終末領域Ｂ−１はその末端に『YY
Y』認識部位を含んでもよい。終末領域Ａ−２はそうす
ると全『YYY』認識部位を含み，さらにその末端に，サ
ブユニットの増幅の前にアッセンブリー・ベクターにＡ
−２を接合する適切な『リンカー』を含むことになる
（例えば,PvuII『付着末端』）。サブユニットＡを含む
ハイブリッドの増幅の後に，ハイブリッドは『YYY』に
よって切断され（Ａ−２の末端に『YYY』認識部位の付
着末端部分が露出し），サブユニットＢを挿入すること
が可能となり，その終末領域Ｂ−１は終末領域Ａ−２の
末端と接合して全『YYY』認識部位を再構成する。全て
の断片（Ａ−１およびＢ−２を除く）の終末領域の構成
に関して必要なことは,1つあるいはもう一方あるいは両
方（即ち，『少なくとも半分』）が第３のエンドヌクレ
アーゼ切断の認識部位の部分を持つことであり，この認
識部位は全てのサブユニットが前述のアッセンブリー・
ベクターに挿入されたのちに前述のベクターにただ１つ
だけ存在する（即ち，『ユニークな』）。本発明の新規
なDNA配列のクラスのものを生み出すには，第３のエン
ドヌクレアーゼの認識部位は６塩基のパリンドロームな
認識部位でなければならない。
上に延べたサブユニット『認識部位』は，サブユニット
末端からサブユニットにそってその中心にまで延びると
も考えられるが，実際の問題として，先に述べた構成は
通常は最後の10あるいは20塩基で行われる。同様に,2つ
のサブユニット・アッセンブリー内のユニークな『中
間』認識部位は製造さた配列の一方の末端へ他方の末端
へよりも３倍ほど近づいてもよいが，この認識部位は通
常は配列の中央近くにおかれる。上記の説明において，
接合する３つのサブユニットを調製する必要がある合成
計画が立てられた場合は，製造された遺伝子は中間位置
に２つのユニークな制限エンドヌクレアーゼ切断部位を
含むことになり，そのうち少なくとも１つは本発明の新
規のDNA配列のクラスのパリンドロームな６塩基認識部
位を持つ。
上記のプロセスの素晴らしい長所は明白である。製造さ
れた遺伝子がその長さの中間位置に１つ以上のユニーク
な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むので，切断部
位で接合される２つのサブユニットのコドン配列の変更
は，容易に，そして製造された遺伝子全部を再合成する
ことなしに行うことが出来る。
下記は，ヒト免疫インターフェロン（IFN γ）およびそ
の類似体,Fサブタイプのヒト白血球インターフェロン
（INF−αＦ）およびその類似体，および,IFN−αＦと
の同族関係からIFN−αＦ類似体と呼ぶことの出来る多
種の共働白血球インターフェロンの合成を司る能力のあ
る製造された遺伝子の形成における本発明の実施の実例
である。これらの例から，本発明の遺伝子製造方法論
は，非常に柔軟性のある枠組みのなかで200塩基対を超
える長さの遺伝子の本当に迅速且つ効率的な合成および
発現のための総合的な合成計画をもたらすものであり，
組み替えDNA手法を用いる研究者たちがこれまで実現し
えなかった生成物の構造の変種の発現を可能とするもの
であることは明白である。
第１例 ヒトIFNγの発現のための合成遺伝子を構成する手順に
おいて，最初に行った選択は，望みのポリペプチドの発
現の微生物宿主としてＥ．Coliを選択したことであっ
た。したがって，コドンの選択手順は,Granthamの論
文，前掲で列挙されたＥ．Coliの示すコドンに対する優
先性を考慮してなされた。第２の選択は,pBR322を発現
ベクターとして，そして，重要なことには，サブユニッ
ト発現の増幅に用いるアッセンブリー・ベクターとして
選択したことである。後者の要素についてはプラスミド
が選択されたが，それはプラスミドが単一のBamHI,Hind
III,およびSalI制限部位を含むことが分かっているから
である。これらの制限部位とヒト免疫インターフェロン
内の既知のアミノ酸配列を考えながら,3つの『大』サブ
ユニットDNA配列（IF−3,IF−2,およびIF−１）および
１つの『小』サブユニットDNA配列（IF−４）を形成す
る計画が策定された。この計画は下記の第IV表に示され
る。
『小』配列（IF−４）は４番から１番の（５′−TGT TA
C TGC CAG）アミノ酸のためのコドンおよび開始メチオ
ニン〔Met-1〕を含んでいるのが分かる。この構成にお
いては，『小』配列は追加の塩基を含んでおり，後に説
明するpBR322からの発現ベクター・アッセンブリーに関
連する制御子の部分をもたらす。
〔Arg 140〕IFN γのための製造された遺伝子の合成に
使用するサブユニットIFN−１の代替形態は，第140番の
アミノ酸を指定するコドン部位に５′−CAG（〔Gln 14
0〕のためのもの）の代わりにコドン５′−CGTを含ん
だ。
合成されたポリペプチド指定部分全DNA発現の頭鎖用の
コドン配列計画は下記の通りであった。
５′−TGT−TAC−TGC−CAG−GAT−CCG−TAC−GTT−AAG
−GAA−GCA−GAA−AAC−CTG−AAA−AAA−TAC−TTC−AAC
−GCA−GGC−CAC−TCC−GAC−GTA−GCT−GAT−AAC−GGC
−ACC−CTG−TTC−CTG−GGT−ATC−CTA−AAA−AAC−TGG
−AAA−GAG−GAA−TCC−GAC−CTG−AAG−ATC−ATG−CAG
−TCT−CAA−ATT−GTA−AGC−TTC−TAC−TTC−AAA−CTG
−TTC−AAG−AAC−TTC−AAA−GAC−GAT−CAA−TCC−ATC
−CAG−AAG−AGC−GTA−GAA−ACT−ATT−AAG−GAG−GAC
−ATC−AAC−GTA−AAA−TCC−TTT−AAC−AGC−AAC−AAG
−AAG−AAA−CGC−GAT−GAC−TTC−GAG−AAA−CTG−ACT
−AAC−TAC−TCT−GTT−ACA−GAT−CTG−AAC−GTG−CAG
−CGT−AAA−GCT−ATT−CAC−GAA−CTG−ATC−CAA−GTT
−ATG−GCT−GAA−CTG−TCT−CCT−GCG−GCA−AAG−ACT
−GGC−AAA−CGC−AAG−CGT−AGC−CAG−ATG−CTG−TTT
−CAG−〔or CGT〕−CGT−CGC−CGT−GCT−TCT−CAG. 上記の配列においては，制御配列塩基および始めのメチ
オニン指定コドンは図示されておらず，終末配列あるい
は終末SalI制限部位をもたらす配列も図示されていな
い。縦線が各サブユニット配列に帰する頭鎖部分を分け
ている。
下記の例は本発明のDNA配列の製造に使用するためのデ
オキシオリゴヌクレオチドの調製のための望ましい一般
手順を示すものである。
第２例 オリゴヌクレオチド断片は,4段階手順と途中での何度か
の洗いを用いて合成された。半融ガラス漏斗に入れられ
たポリマー結合ジメトキシトリチルに保護されたヌクレ
オシドは，最初にジクロロメタンの中で３％三塩化酢酸
を用いて1 1/2分の間５′−保護群を除去された。ポリ
マーはそれからメタノール，テトラヒドロフランおよび
アセトニトリルを用いて洗われた。洗われたポリマーは
それから乾燥アセトニトリルで洗われ，アルゴンの中に
置かれ，それから，下記のような凝縮処理を受けた。ア
セトニトリルに10mgのテトラゾールを溶かした溶液0.5m
lがポリマーを入れた反応容器に加えられた。それから
アセトニトリルに溶かした30mgの保護されたヌクレオシ
ド0.5mlが加えられた。この反応液は攪拌され，反応時
間は２分であった。反応体は吸引によって除去され，ポ
リマーはアセトニトリルで洗われた。この後に酸化段階
が続き,2−６−ルチジン／H2O/THF,1:2:2に0.1モルI2を
含む溶液1mlが２分間のあいだポリマーに結合したオリ
ゴヌクレオチド鎖と反応させられた。THFによってすす
いだ後に，ジメチルアミノピリジン（100mlのTHF中に6.
5g）および無水酢酸の４対１溶液の中で２分間に渡って
キャッピングが行われた。その後に，メタノールによる
洗い，およびTHFによる洗いが続いた。それからCH2Cl2
中の三塩化酢酸による処理で再びサイクルが始まった。
このサイクルは望みのオリゴヌクレオチド配列が得られ
るまで繰り返された。
最終的なオリゴヌクレオチド鎖は，室温で45分間に渡っ
てチオフェノール，ジオキサン，トリエチルアミン1:2:
2によって処理された。ジオキサン，メタノールおよび
ジエチルエーテルで洗った後に，オリゴヌクレオチドは
ポリマーから水酸化アンモニウムを用いて室温で切り出
された。溶液をポリマーからデカントした後に，濃縮水
酸化アンモニウム溶液はシールした試験管の中で60℃で
16時間に渡って加熱された。
それから,1−ブタノールを用いてオリゴヌクレオチド溶
液が４度抽出された。溶液は20％ポリアクリルアミド7M
尿素電気泳動ゲルに充填され，泳動を行った後に，適切
なDNAバンドが分離された。
そして，サブユニット1F−１の組み立ての一般手順に従
ってデオキシオリゴヌクレオチドからサブユニットが組
み立てられた。
望みの14DNA配列の分離の後に，サブユニットIF−１は
下記の仕方で構成された。
1.5′接着末端を含む断片13および断片２を除く，各DNA
断片１ナノモルが５′燐酸化された。
2.DNAの相補性鎖，断片13と14,11と12,9と10,7と8,5と
6,3と4,および１と２が組み合わされ,90℃まで加熱され
たのちに,25℃まで徐冷された。
3.得られたアニーリングされたDNA対は順次組み合わせ
られ,37℃まで加熱されたのちに,25℃まで徐冷された。
4.断片１から断片14までをすべて含む最終の試験管内の
ATPおよびDTTの濃度はそれぞれ150μＭおよび18μＭに
調製された。この溶液に20ユニットのＴ−4 DNAリガー
ゼが加えられ，反応物質は４℃で18時間に渡ってインキ
ュベートされた。
5.得られた粗生成物は90℃まで２分間に渡って加熱さ
れ,10mMトリエチル重炭酸アンモニウムを溶離剤として
用いてセファデックスG50/40の上でゲル濾過された。
6.望みの生成物は,5′燐酸化の後に,8％ポリアクリルア
ミド−TBEゲルを用いて精製された。
サブユニットIF−2,IF−３およびIF−４は同様な仕方で
構成された。
下記の例は次の物に関連する。即ち，サブユニットIF−
1,IF−2,IF−3,およびIF−４からのヒト免疫インターフ
ェロンの組み立て。および，適切な栄養状態におけるト
ランスフォームされたＥ．Coli細胞の培養，細胞からの
ヒト免疫インターフェロンの分離，およびそうして分離
されたインターフェロンの生物学的活性の試験の各手
順。
第３例 完全なヒトIFN γを仕様する遺伝子をサブユニットIF−
1,IF−２およびIF−３から組み立てる一般的手順の主要
なステップが第１図に示されている。
136塩基対サブユニットIF−１はゲルから電気溶出さ
れ，エタノールで沈澱させたのちに再び水に0.05pモル
／μｌの濃度で懸濁された。プラスミドpBR322（2.0pモ
ル）は,EcoRIおよびSalIによって消化され，ホスファタ
ーゼで処理され，フェノールで抽出され，エタノールで
沈澱され，再び水に0.1pモル／μｌで懸濁された。結合
は0.1モルのプラスミドと0.2pモルのサブユニットIF−
１とを用いて,T−4 DNAリガーゼによって行われハイブ
リッド・プラスミドpINTlが形成された。Ｅ．Coliがト
ランスフォームされそれから多数のpINTlのコピーが分
離された。
上記の手順は,153塩基対サブユニットIF−２を挿入して
pINF2を形成するために繰り返されたが，但しプラスミ
ドはEcoRIおよびBglIIで消化された。153塩基対IF−３
サブユニットは,pINT3の製造の際に同様にpINT2に挿入
されたが，但しプラスミドの消化にはEcoRIおよびHindI
IIが使用された。
IF−４サブユニットは最終の発現ベクターの構成の再に
下記のように使用された。まずプラスミドPVvIはカルフ
ォルニア州，バロ・アルトのスタンフォード大学から購
入され,Pvu IIで消化された。標準プロセスを用いて,Ec
oRI認識部位がプラスミドのPvu II部位に挿入された。
このハイブリッドのコピーはEcoRIおよびHpaIによって
消化され,trpプロモーター／オペレーター領域の部分を
含む245塩基対配列をもたらした。標準プロセスを用い
て，免疫インターフェロンの始めの４アミノ酸（Cys−T
yr−Cys−Gln）用のコドンをもたらす全trp翻訳開始信
号および塩基の残りの37塩基対を取り込むためにIF−４
がHpaI部位に付加された。得られたアッセンブリーは,E
coRIおよびBamHIによって消化されたpINT3に挿入され
て,pINTγ−TRP17と呼ばれるプラスミドを生み出した。
pINTγ−TRP17を含むＥ．Coli細胞は,0.D.600 of 1まで
トリプトファンが存在しない状態でＫ培地で培養され
た。インドールアクリルIIIが20μg/mlの濃度で加えら
れ，細胞はさらに２時間に渡って37℃で培養された。細
胞は遠心分離によって収穫され，細胞のペレットはHEPE
S緩衝ウシ新生児血清（pH8.0）中に再懸濁された。細胞
は10,000psiでフレンチ・プレスに１度掛けて溶解され
た。細胞溶解産物は遠心分離によってデブリスを除か
れ，上澄液はCPE検定によって抗ウイルス性を調べられ
た〔『インターフェロン・システム』,Springer−Verla
g編,N.Y.,N.Y.（1981）〕。分離された発現生成物はγ
−１と呼ばれた。
この例は，プラスミドpINTγ−trp17のDNA配列の変更に
関するもので，この変更は例えばIFN−γおよびIFN−α
Ｆの類似体のコードを持つ構造遺伝子のtrpプロモータ
ー制御発現におけるベクターの使用を容易にした。
第４例 すでに述べたように，断片IF−４は，始めのメチオニン
のコードの塩基，およびIFN−γの最初の４アミノ酸お
よび37塩基対（HpaI平滑末端を持つその５′末端から始
まる）を含むように構成され，前述の37塩基対はtrpプ
ロモーター／オペレーター発現の３′末端で完了し，シ
ャイン・デルガルノ・リボゾーム結合配列を含む。IFN
−γ類似体およびIFN−γ以外のポリペプチドのコード
を持つ配列に関連する操作は，全trpプロモーター／オ
ペレーター領域に制限部位３′が設けられたら容易にな
ることは明らかであった。例を挙げると，その他の遺伝
子用のIF−４に対応する配列は,trpプロモーター／オペ
レーターを再構成するのに必要な全37塩基対を再び組み
立てずとも，組み立てることができ，完全なプロモータ
ー／オペレーターを持つ適切なリーディング・フレーム
のなかへの挿入を容易にするような塩基を５′末端に必
要とするだけである。
この目的にかなうように，配列IF−４は,trpプロモータ
ー／オペレーターを完成する塩基対にXbaI制限部位３′
を組み込んで再組み立てされた。この構成は下の第Ｖ表
に示されている。
断片IF−４のこの変種はpINTγ−trp17（HpaIおよびBam
HIで消化されたもの）に挿入されプラスミドpINTγ−TX
b4が生み出され，このプラスミドのIFN−γを仕様する
遺伝子はXbaIおよびSalIで消化することが可能であり，
そして全trpプロモーター／オペレーターは大きな断片
に留まる。
下記の例はIFN−γの構造類似体の組み立てに関するも
ので，そのポリペプチド構造は１つ以上のアミノ酸の種
類あるいは位置がIFN−γとは異なる。
第５例 IFN−γの類似体の第１のクラスが形成されたが，それ
は位置81にアスパラギンの代わりにリジン残基を含ん
だ。この類似体を生み出すのに必要な単一の塩基配列の
変更は，第IV表のサブユニットIF−２の断片35および36
であった。アスパラギンを定めるコドンAACは，リシン
を定めるコドンAAGによって置き換えられた。前述の変
更されたDNA配列〔Lys81〕IFN−γの発現生成物は分離
されてγ−10と名付けられた。
IFN γ類似体の別のクラスは，アミノ酸発現に存在する
１つ以上の潜在的なグリコシレーション部位が削除され
たポリペプチドから成る。より具体的に云うと，それら
は〔Arg140〕IFN γあるいは〔Glu140〕IFN γから成
り，これらにおいてはポリペプチド配列は１つ以上の自
然に生じる配列〔（AsnあるいはGln）−（なんでもよ
い）−（SerあるいはThr）〕を含むことが出来ず，前述
の配列はポリペプチドのグリコシレーションの部位をも
たらすことが分かっている。前述の配列の１つは,IFNγ
において，位置28から位置30を占め（Asn−Gly−Th
r），別のものは位置101から103を占める（Asn−Tyr−S
er）。位置28〜30の変更を伴う本発明による類似体の調
製においては,4つの全てのIFN−γサブユニットを含む
プラスミドをBamHIおよびHindIIIによって切断してサブ
ユニットIF−３を除去し，続いてサブユニットIF−３の
変種を挿入するが，この変種においてはアスパラギンの
AACコドンはグルタミンのコドンCAGによって置き換えら
れる。（前述の置換は，デオキシオリゴヌクレオチド断
片37を変更してAACではなくCAGを含むようにし，されに
断片38を変更してTTGではなくGTCを含むようにすること
によって達成される。第IV表を参照のこと。）前述の変
更されたDNA配列〔Gln28〕IFN−γの発現生成物は分離
されてγ−12と名付られた。このタイプのポリペプチド
類似体は，酵母細胞で発現されてもグリコシレートされ
ないように思われる。このようにして生成されたポリペ
プチド類似体は，自然に生じるIFN γとは，自然の形態
の抗体との反応性において，あるいは抗増殖あるいは免
疫調節薬理学的効果において，あきらかな違いがあると
は考えられないが，ある形であるいは幾つかの形で優れ
た薬効を示す可能性がある。
IFN γのその他のクラスは，〔Trp39〕残基が〔Phe39〕
に置き換えられ，および／あるいはアミノ酸位置48,80,
120および137でメチオニンが例えばロイシンによって置
き換えられ，および／あるいは，アミノ酸位置１および
３でシステインが例えばセリンによって置き換えられる
か或いは完全に除去されたポリペプチドから成る。これ
らの最後に述べた類似体は，分子間のジスルフィド・ブ
リッジ形成能力がないので微生物によって発現するとも
っと容易に分離出来る可能性がある。
位置39のトタプトファンのフェニルアラニンによる置換
は，サブユニットIF−３のTGGコドンをTTC（TTTも使用
できた）で置き換えることを必要とし，これはデオキシ
オリゴヌクレオチド断片33の変更（TGGからTTCへ）およ
びIF−３を製造するのに使用された重複断片36の変更
（TGAからTAC）によって成された。〔Phe39,Lys81〕IFN
−γは，前述の変更されたDNN配列（上記の位置81のア
スパラギンをリジンに置き換えることも含む）の発現生
成物を分離したものであるが，γ−５と名付られた。
同様に，位置48,80,120,および137のそれぞれの１つ以
上のメチオニンの置換は，サブユニットIF−３（デオキ
シオリゴヌクレオチド31,32および33の再構成と共
に），サブユニットIF−２（デオキシオリゴヌクレオチ
ド断片21および22の再構成と共に），そしてサブユニッ
トIF−１（デオキシオリゴヌクレオチド断片７と10およ
び／あるいは３と４と共に）の変換に関係する。位置48
でトレオニンがメチオニンに代わったIFN−γの類似体
は，サブユニットIF−３内の断片31を変換してメチオニ
ン仕様コドンATGを抹消しACTコドンで置換することによ
って得られた。この変化を起こすためには，断片34の変
換（TACからTGA）も必要であった。〔Thr48,Lys81〕IFN
−γは，前述の変換されたDNA配列（位置81にリジン仕
様コドンをも含む）の発現生成物を分離したものである
が，γ−６と名付けられた。
位置１および３のシステインの置換あるいは削除は，サ
ブユニットIF−４の変換のみに関係する。第１の例とし
て，サブユニットIF−４の構成を変換して位置１および
３の両システイン仕様コドン（それぞれTGTおよびTGC）
をセリン仕様コドンTCTで置き換えるには,2つの断片の
再構成を必要とするだけであった（第IV表のｅとｆ）。
〔Ser1,Ser3,Lys81〕IFN−γは，前述のように変換され
た（Lys81〕IFN−γDNA配列の発現の生成物から分離さ
れたものであるが，γ−２と名付られた。別の例とし
て，〔Lys1,Lys2,Gln3,Lys81〕IFN−γはγ−３と名付
けられたが，サブユニットIF−４の変換構成の発現生成
物として得られたが，そこではコドンAAA,AAAおよびCAA
がそれぞれTTG,TACおよびTGCに代わった。最後に，〔de
s−Cys1,des−Tyr2,des−Cys3,Lys81〕IFN−γはγ−４
と名付けられたが， ５′−ATC CAG−３′
アミノ酸仕様領域のサブユニットIF−４断片を３′−TA
C GTC−５′に変換することによって得られた。遺伝子
の始めのアミノ酸コーディング領域の上述した変換は第
４例のpINTγ−TXb4の構成によって多いに促進された
が，それはアミノ・ターミナル蛋白質コーディング配列
を完成して遺伝子を完全なtrpプロモーターに結合する
のに,BbaIおよびBamHI付着末端を持つ短い配列を作るだ
けで済んだからである。
本発明によってもたらされるIFN−γ類似体ポリペプチ
ドのその他のクラスには，以前からポリペプチドの第２
および第３の立体配置に関連すると見なされてきたアミ
ノ酸がIFN−γと異なるものが含まれる。一例を挙げる
と,IFN−γポリペプチド内の中間位置にシステイン残基
をもたらすと,IFN−αに見られるようなアミノ・ターミ
ナル残基と中間のシステイン残基との間に分子間ジスル
フェィド・ブリッジの形成を促進する構造を持つポリペ
プチドの種類を生み出す。さらに，本発明に従うポリペ
プチドにプロリンを挿入するかあるいは欠失させると，
直線状の曲がった立体配置に変化が生じて生物学的活性
にも影響があると考えられる。〔Lys81,Cys95〕IFN−γ
は，γ−９と名付けられたが，サブユニットIF−２の断
片17 ５′−TTC−３′ ５′−TCG−
３′ および18の３′−AAG−５′に代わる３′−AGC−５′で
変形したDNA配列の発現から分離された。〔Cys95〕IFN
−γ（γ−11と名付られる）を仕様するDNA発現が同じ
一般的手順によって現在作られている最中である。同様
に，〔Cys95,Pro104〕IFN−γのコードを持つ遺伝子
も，トレオニン仕様コドンACA（IF−２の断片15）をプ
ロリン仕様コドンCCAに変えることによって作られてい
る最中である。
〔Glu5〕IFN−γは，γ−13と名付られるが，サブユニ
ットIF−３の断片43を変換して，アスパラギン酸仕様コ
ドンGATではなくグルタミン酸塩仕様コドンGAAを含むよ
うにすることによって得られるであろう。前述の変更
は，その遺伝子座にBamHI認識部位を存在することを許
なさいと考えられるので，サブユニットIF−３は複合サ
ブユニットとしてサブユニットIF−４のアミノ酸仕様部
分を含むものとして作られる必要があり，組み立てられ
た遺伝子のXbaIとHindIIIの間には制限部位は無くな
る。このIFN−γ類似体は自然に生じる形態のものより
も酸に対して安定していると考えられる。
上述したトリプトファンおよび／あるいはメチオニンお
よび／あるいはシステイン置換を持つ上記の類似体は，
自然に生じるIFN−γと比較して，自然形態のものに対
する抗体との反応度あるいは抗増殖薬効あるいは免疫調
節作用の点において異なるとは考えられないが，薬理学
的効果はより長いものと期待されている。
さらに別の類似体のクラスには，『ハイブリッド』ある
いは『融合した』タイプのポリペプチドがあり，こられ
は定められた配列の末端に１つ以上の追加のアミノ酸を
含む。これらは,IFN γのコードを持つ全配列に，別の
製造されたDNA配列，例えば，後に述べるLeIFN−Conに
特有のポリペプチドの配列のコードを持つサブユニット
の１つを追加することによって形成される遺伝子によっ
て発現されるであろう。発現されるポリペプチドは，自
然に生じるIFN γの抗体反応を幾分か残し，そして,LeI
FNの抗体反応を幾分か示すと考えられる。その薬理学的
な作用は，作用の薬効および持続期間の２つの点におい
て自然に生じるIFN−γに優るものと考えられている。
下の第VI表は，本発明に従って調製されたIFN−γの抗
ウイルス作用と試験された類似体の幾つかのものの抗ウ
イルス作用の研究の結果をまとめたものである。相対的
な抗ウイルス作用は，脳心筋炎ウイルス（EMCV）に感染
したヒト・ヒーラ細胞において検定されたが，イミュノ
アブソーバントアッセイにおいて決定されたIFN−γに
対するモノクローンの抗体に結合する単位当たりのもの
である。
第VI表 インターフェロン 相対的な抗ウイルス作用 γ−１ 1.00 γ−４ 0.60 γ−５ 0.10 γ−６ 0.06 γ−10 0.51 下記の例は，これまでの例のDNA配列内のポリペプチド
・コーディング領域内の変換に関するもので，前述の変
換は望みの生成物の発現を促進するものである。
第６例 IFN−γおよびIFN−γの類似体のコードを持つ製造され
たDNA配列の微生物による発現のポリペプチド生成物に
行われた分析の暫定的結果から,2つの主な蛋白質が大体
同じ量だけ製造されたことが明らかになった。１つは完
全な146アミノ酸配列に対応する17K形態のもので，いま
１つはアミノ・ターミナルの約50アミノ酸を失ったイン
ターフェロン断片に対応する12K形態のものである。製
造された遺伝子におけるコドンの使用を検討した結果，
短い種類のものは，塩基配列13′がシャイン−デルガル
ロ・リボソーム結合配列に類似しているために生じたMe
t48残基における微生物翻訳開始の結果形成された可能
性が高いことが明らかになった。このように，転写され
たmRNAの約半分は始めのメチオニンに先行する遺伝子座
においてのみリボソームと結合したが，残りの半分はMe
t48コドンに先立つ遺伝子座で結合されたように思われ
た。ポリペプチド・コーディング領域内でリボソーム結
合が生じる可能性を減らすために，サブユニットの断片
33および34は再構成された。もっと具体的にいうと，位
置41にグルタミン酸塩残基を仕様するのに用いられたGA
Gコドンは別のGAAコドンに変えられ，位置45にアルギニ
ンを仕様するのに用いられたCGTコドンは別のCGCコドン
に変えられた。これらの変更は,IFN−γのγ−６類似体
を仕様する遺伝子を作る際に実施され，適切な長さの単
一の優勢な種類のポリペプチドが生じた。
下記の第７例および第８例は，ヒト白血球インターフェ
ロンのＦサブタイプ（『LeuIFN−Ｆ』あるいは『IFN−
αＦ』）およびそのポリペプチド類似体を仕様する製造
されたIFN−αを生み出す本発明の手順に関連する。
第７例 Ｆサブタイプのヒト白血球インターフェロン用のアミノ
酸配列は,cDNAクローンの配列を調べて演繹されてい
る。例えば,Goedell等，Nature，200,pp.20−26（198
1）を参照のこと。先の第１例，第２例および第３例の
一般手順が,pBR322誘導発現ベクターを用いてIFN−αＦ
をＥ．coli内で微生物的に発現するために使用する製造
されたDNA配列の設計および組み立てに使用された。３
つの『大』サブユニットDNA配列（LeuIFN−F,LeuIFN−F
IIおよびLeuIFN−FIII）および１つの『小』サブユニッ
トDNA配列（LeuIFN−F IV）を構成するための一般計画
が策定されたが，その計画を下の第VII表に示す。
第IV表に示した遺伝子製造計画の場合と同様に，第VII
表の計画は，デオキシリボヌクレオチド断片構成に支障
のない限り微生物の優先するコドンの使用と関連する。
サブユニットを用いる発現ベクターの作成は,IFN−γ仕
様遺伝子に関連するものと似通っており，使用される制
限酵素に僅かな違いがあるだけである。サブユニットＩ
は,EcoRIおよびSalIによって切断されたpBR322に結合さ
れる。（サブユニット終末部分は一本鎖SalI『付着末
端』を含むが，相補が行われると,SalI認識部位は再構
成されないことを注意。しかしながら，全BamHI認識部
位は残り，その後のサブユニットの切出しを可能として
いる。）この第１の中間プラスミドは増幅され，サブユ
ニットIIは，再びEcoRIおよびSalIによる切断の後に増
幅されたプラスミドに挿入される。このようにして形成
された第２の中間プラスミドは増幅され，そしてサブユ
ニットIIIはEcoRIおよびHindIIIで切断された増幅され
たプラスミドに挿入される。このようにして形成さた第
３の中間プラスミドは増幅される。サブユニットIVは，
第４例のpINT γ−TXb4から分離されたEcoRIおよびXbaI
断片に結合され，この結合生成物（EcoRIおよびBstEII
付着末端を持つ）はEcoRIおよびBstEIIによって切断さ
れた増幅された中間プラスミドに挿入されて，最終の発
現ベクターを生み出す。
最終発現ベクターに挿入された第VII表の製造されたDNA
配列のtrpプロモーター／オペレーターに制御された
Ｅ．coliによる発現から分離された生成物はIFN−αF1
と名付られた。
第８例 後に協働白血球インターフェロンに関して述べるよう
に，位置14にトレオニン残基および位置16にメチオニン
残基を持つヒト白血球インターフェロン・サブタイプ
は,Ala14およびIle16残基を持つサブタイプよりも高い
抗ウイルス作用を示すことが良く知られている。従っ
て，ヒト白血球インターフェロン・サブタイプＦの類似
体が第７例のDNA配列の微生物による発現によって製造
されたが，前述の配列は残基14および16にトレオニンお
よびメチオニンをそれぞれ仕様するように変更された。
より具体的に云うと，〔Thr14,Met16〕IFN−αＦは,IFN
−αF2と名付られたが,SalI及びHindIIIで切断された上
で変更されたサブユニットII（第VII表のもの）を挿入
された第VII表のベクターでトランスフォームされた
Ｅ．coli内で発現された。サブユニットIIの上記の変換
は，アラニン仕様コドンGCTをトレオニン仕様ACTコドン
で置き換え且つイソロイシン仕様コドンATTをATGコドン
で置き換えることによって変換された断片39の組み立て
を必要とした。相補性塩基の対応する変更はサブユニッ
トLeuIFN−FIIの断片40内で行われた。
下記の第９例および第10例は，ヒト白血球インターフェ
ロン・サブタイプＦの類似体と名付けることの出来る協
働ヒト白血球インターフェロン・ポリペプチドの微生物
による合成における本発明の実施に関する。
第９例 本明細書においては，『協働ヒト白血球インターフェロ
ン』（『IFN−Con』，『LeuIFN−Con』）は，自然に生
じないポリペプチドを意味し，前述のポリペプチドは全
ての自然に生じるヒト白血球インターフェロン・サブタ
イプ配列に共通なアミノ酸残基を優勢的に含み，且つ全
てのサブタイプに共通のアミノ酸の存在しない位置にそ
の位置に優勢に生じるアミノ酸を含み，どんな場合にも
少なくとも１つの自然に生じるサブタイプに存在しない
アミノ酸残基は含まない。（この定義においては，サブ
タイプＡは他のサブタイプと位置を整列され，位置44に
『欠けている』アミノ酸があることが明らかになる。）
このように定義されると，協働ヒト白血球インターフェ
ロンは通常は全てのサブタイプの全ての知られた共通ア
ミノ酸残基を含むことになる。自然に生じるサブタイプ
配列に関する知識は常に伸展していることはお分りであ
ろう。特定の位置の特定の残基の『共通性』を否定する
新しいサブタイプが発見されるかも知れない。１つある
いはもっと多くの位置の後に改訂された共通性の決定に
基づいて構造が予測されるポリペプチドにもこの定義が
適用できると思われる。なぜなら，それらは共通のアミ
ノ酸を優勢的に含み，さらに，もはや共通とは考えられ
なくなったアミノ酸は該位置の優勢なアミノ酸であると
考えられるからである。何れかの位置において共通のあ
るいは優勢なアミノ酸を含まないポリペプチドでも，そ
の位置の残基が少なくとも１つのサブタイプで生じれば
定義に当てはまる。協働ヒト白血球インターフェロンの
１つ以上の内部のあるいは終末の残基を欠くか，あるい
は，いずれのサブタイプにも仲間のない内部のあるいは
終末の残基を持つポリペプチドは，ヒト協働白血球イン
ターフェロンの類似体と見なされるであろう。
８つのcDNA誘導ヒト白血球インターフェロン・サブタイ
プの発表された予測アミノ酸配列は,166残基の配列内の
アミノ酸の種類に関して解析された。一般に,Goedell
等，Nature，290,pp.20−26（1981）を参照のこと。前
述の論文はLeIFN−ＡからLeIFN−Ｈまでを比較し,79の
アミノ酸だけが８つの全てのインターフェロン形態の同
一位置にあり,Eサブタイプ（cDNA偽遺伝子から得られた
もの）を無視すると99のアミノ酸が同じ位置にあると指
摘した。残りの位置については，それぞれのアミノ酸の
相対的な存在頻度が分析され,1つのアミノ酸が８つの形
態のうち少なくとも５つ形態の同じ位置にある場合は，
そのアミノ酸はその位置の優勢なアミノ酸であるとされ
た。166アミノ酸の『協働』ポリペプチド配列が図示さ
れ,8つの個々の配列と比較された。その結果,LeIFN−Ｆ
のその『自然に生じる』形態を僅かに変えるだけで協働
配列に従うことが判明した。
製造されたIFN−ConDNA配列を作る計画が策定された。
この計画は下の第VIII表にしめされている。この表にお
いては,LeIFN−Con1を生み出すのに，即ち,IFN−αＦの
〔Arg22,Ala76,Asp78,Glu79,Tyr90,Leu96,Thr156,Asn15
7,Leu158〕類似体を生み出すのにIFN−αＦに加える必
要のある変更が星印で示されている。図示された頭鎖配
列は，可能な場合は必ず，Ｅ．coli内の優先的発現の対
象となるコドンを含む。この配列は，配列の中間の位置
にSal,HindIII,およびBstE2の認識部位をもたらす塩基
を，そして配列の両末端にはXBaIおよびBamHIの認識部
位をもたらす塩基をも含む。後者の部位は,IFN−αＦお
よびその類似体用に作られた配列の場合と同様に，この
配列をpBR322ベクターに組み込む際に使用するために選
択された。
次の第IX表は,IFN−Con1の製造に使用する４サブユニッ
トDNA配列の調製のための特定の二本鎖DNA配列を示して
いる。サブユニットLeuIFN−ConIVは，第VIII表のLeuIF
N−FIVの複製である。IFN−αＦ遺伝子を作るのに用い
られたものと異なるサブユニットの断片は『プライム記
号』で示されている（例えば,37′および38′は位置22
においてグリシンではなくアルギニンをもたらす必要の
ある37および38の変形されたものである）。
第IX表の４つのサブユニットは，第７例の手順に従って
順次に発現ベクターに挿入され,trpプロモーター／オペ
レーターの制御を受ける第VIII表のコーディングリボソ
ームを持つベクターを生み出した。このベクターのＥ．
coli内における発現の生成物はIFN−Con1と名付られ
た。このポリペプチドはGoedell等，前掲に示された全
ての共通の残基を含んでおり，さらに,Ser80,Glu83,Val
114およびLys121を除外して，参照文献の配列の要約の
分析によって示された優勢なアミノ酸も含んでいる。上
記の４つの残基はサブユニットの形成と発現ベクター内
への組み込みとを容易にするために天然のIFN−αＦ配
列から保持された。（例えば，セリーンは位置80に保持
されて,HindIII部位の形成を可能とした。） Goedell等のIFN−αサブタイプの要約の発表の後に，幾
つかの追加のサブタイプが確認された。第２図は，現在
知られている13のサブタイプ（知られている５つのcDNA
偽遺伝子により明らかになったものは除く）の演繹され
た配列を表の形で示しており，別の研究所が同じIFN−
αサブタイプに付けた別の名称は括弧内に示されている
（例えば,IFN−α６およびIFN−αＫ）。例えば,Goedel
l等，前掲,Stebbing等，組み替えDNA生成物，インシュ
リン，インターフェロンおよび成長ホルモン（A.Bollon
編）,CRCプレス（1983），およびWeissman等，U.C.L.A.
Symp.Mol.CellBiol.,25,pp.295−326（1982）を参照の
こと。共通のアミノ酸の無い位置は肉太活字で示されて
いる。IFN−αサブタイプは大まかにアミノ酸残基に基
づいてグループ分けされている。７つの位置で（14,16,
71,78,79,83および160），種々のサブタイプは僅か２つ
の代替アミノ酸を示し,7つの位置のどれが同じアミノ酸
残基に占められているかに基づいてサブタイプを２つの
サブグループ（ＩおよびII）に分類することを可能とし
ている。３つのIFN−αサブタイプ（H,FおよびＢ）は，
位置の区別でグループＩあるいはグループIIに分類する
ことが出来ず，これら具体的に云うと,IFN−Con1の発現
ベクターはBstEIIおよびHindIIIで処理され，サブユニ
ットLeuIFNConIIIを除去された。変更されたサブユニッ
トが挿入されたが，このサブユニットにおいては，位置
39および40のアラニン仕様コドンGCTがトレオニン仕様
コドンACTで置換され，イソロイシン・コドンCTGはATG
に変えられた。変更された製造された遺伝子の発現の生
成物である〔Thr14,Met16,Arg22,Ala76,Asp78,Glu79,Ty
r86,ットにおいては，位置39および40のアラニン仕様コ
ドンGCTがトレオニン仕様コドンACTで置換され，イソロ
イシン・コドンCTGはATGに変えられた。変更された製造
された遺伝子の発現の生成物である〔Thr14,Met16,Arg2
2,Ala76,Asp78,Glu79,Tyr86,Tyr90,Leu96,Thr156,Asn15
7,Leu158〕IFN−αＦはIFN−Con2と名付られた。
現在，位置114および121の残基の種類の点でIFN−Con1
と異なる協働ヒト白血球インターフェロン・ポリペプチ
ドのための遺伝子が作られている。より具体的に云う
と,IFN−αＦサブタイプ残基を複製するが優勢なアミノ
酸ではないVal114およびLys121残基は，それぞれ優勢な
Glu114およびArg121残基に変えられる。コドンをVal114
からArg114に（即ち,GTCからGAAに）変更すると，サブ
ユニットLeuIFNConI（第IX表）の終末部分にSalI部位が
存在できなくなるので，サブユニットＩおよびIIは単一
のサブユニットとして作られる必要が生じると思われ
る。断片11および12のAAA,即ち，リジン・コドンをCTG
に変えると，位置121にアルギニンが存在することが出
来る。製造された遺伝子Tyr90,Leu96,Thr156,Asn157,Le
u158〕IFN−αＦはIFN−Con2と名付られた。
現在，位置114および121の残基の種類の点でIFN−Con1
と異なる協働ヒト白血球インターフェロン・ポリペプチ
ドのための遺伝子が作られている。より具体的に云う
と,IFN−αＦサブタイプ残基を複製するが優勢なアミノ
酸ではないVal114およびLys121残基は，それぞれ優勢な
Glu114およびArg121残基に変えられる。コドンをVal114
からArg114に（即ち,GTCからGAAに）変更すると，サブ
ユニットLeuIFNConI（第IX表）の終末部分にSalI部位が
存在できなくなるので，サブユニットＩおよびIIは単一
のサブユニットとして作られる必要が生じると思われ
る。断片11および12のAAA,即ち，リジン・コドンをCTG
に変えると，位置121にアルギニンが存在することが出
来る。製造された遺伝子の微生物による発現の生成物で
ある〔Arg22,Ala76,Asp78,Glu79,Tyr86,Tyr90,Leu96,Gl
u114,Arg121,Thr156,Asn157,Leu158〕IFN−αＦはIFN−
Con3と名付られた。
下記の例は，細菌において，特にＥ．coliにおいて外来
性遺伝子の発現のレベルを高める手順に関する。
第11例 上記の諸例の発現ベクターの形成において,trpプロモー
ター／オペレーターDNA配列が用いられたが，前述の配
列は始めの転写開始（Met−1,ATG）の直前の位置にリボ
ソーム結合部位（RBS）配列を含んだ。発現性の高い細
胞蛋白質に関連するゲノムＥ．coliDNA配列に存在する
推定RBS配列の部分の複製のDNA配列を組み込むことによ
って，Ｅ．coli内での種々の外来性遺伝子の発現のレベ
ルを増加するための試みが成された。前述の蛋白質コー
ディング遺伝子の,Inokuchi等，Nuc.Acids.Res.，10,p
p.6957−6968（1982）,Gold等，Ann.Rev.Microbiol.，3
5,pp.365−403（1981）およびAlton等，Nature，282,p
p.864−869（1979）において報告されたリボソーム結合
部位配列が検討され，Ｅ．coli蛋白質OMP−Ｆ（アウタ
ー・メンブレイン蛋白質）,CROおよびCAM（クロラムフ
ェニコール・トランスアセチラーゼ）に関連するものの
部分的な複製の配列を用いること決まった。
例を挙げると,OMP−FRBS配列の部分を複製するために，
下記の配列がMet−１コドンの前に挿入される。
５′−AACCATGAGGGTAATAAATA−３′ ３′−TTGGTACTCCCATTATTTAT−５′ この配列を，例えばIFN−Con1あるいはIFN−αF1のコー
ドを持つ製造されたIFN−αの蛋白質コーディング領域
の前に組み込むために，発現ベクターのサブユニットIV
は削除され（ベクターをXbaIおよびBstEIIで切断するこ
とにより），変更された断片41Aおよび42Aおよび断片43
および44を新断片RB1およびRB2で置換した変更済みサブ
ユニットIVが代わった。変更された配列の構造は下の第
Ｘ表に示す通りである。
下の第XI表は，再構成された遺伝子の蛋白質コーディン
グ領域に先立つ領域の前述のDNA配列を示し,trpプロモ
ーター／オペレーター内のHpaI部位で始まる（第IV表の
サブユニットIF−４と比較のこと）。
CROおよびCAM遺伝子のRBS配列の複製の配列を組み込む
のに同様な手順が取られ,Met−１コドンの直前に下記の
配列が生じた。
全てのRBS配列の挿入部は，シャイン−デルガルノ配列
に良く相似しており，アデニンが豊富で，通常『停止』
コドンをもたらす配列を含むことが分かる。
IFN−Con1のＥ．coli発現レベルは,3つのRBS挿入部（完
全なtrpプロモーター／オペレーター内に存在するRBS配
列に加えて）を持つtrpに制御された発現ベクターを用
いて定量された。OMP−FRBS複製配列を用いた望みのポ
リペプチドの発現は，培養１当たり150〜300mgであ
り，全蛋白質の10〜20％に当たった。CAMRBS複製配列を
組み込んだベクターの発現レベルは,PMP−Ｆ変種の約半
分であった。CRORBS複製発現を含んだベクターは,OMP−
Ｆ変種の約1/10のレベルの望みの蛋白質を生み出した。
下記の例は，これまで述べた例によりもたらされたヒト
白血球インターフェロンおよびポリペプチドの抗ウイル
ス作用のスクリーニングに関する。
第12例 下の第XII表は，種々の細胞系における自然の（バフィ
コート）インターフェロンおよび分離され微生物に発現
されたポリペプチドを仕様されたIFN−αF1,IFN−αF2,
IFN−Con1，およびIFN−Con2の抗ウイルス作用の試験の
結果を示す。使用されたウイルスはVSV（水疱性口内ウ
イルス）およびEMCV（脳心筋炎ウイルス）であった。細
胞系は種々の哺乳類からであり，ヒト（WISH,HeLa）ウ
シ（MDBK），マウス（MLV−６）およびサル（Vero）が
含まれた。抗ウイルス作用は,Weck等，J.Gen.Virol.，5
7,pp.233−237（1981）およびCampbell等，Can.J.Micro
biol.21,pp.1247−1253（1975）に報告された終点細胞
変性効果検定によって測定された。ここに示すデータは
WISH細胞における抗ウイルス作用に正規化してある。
上述した諸例から，本発明は，始めて，完全に新奇な種
類の合成された，生物学的に活性のある蛋白様の生成物
をもたらすものであり，前述の生成物は自然に生じる形
態のものとは１つ以上のアミノ酸の種類および／あるい
は位置の点で，および１つ以上の生物学的（例えば抗体
反応性）および薬理学的（例えば薬効あるいは効果の持
続期間）な点で異なるものであるが，その他の前述の性
質を実質的に保持するものであることは明白である。
本発明の生成物は適切な『標識を付ける』ことが可能で
あり，例えば，酵素に接合した放射性標識（例えばI125
を用いて）を付けるか，蛍光色素で標識を付けるかし
て，体液サンプル内の前述の生成物および／あるいは前
述の抗体の存在量を定性的におよび／あるいは定量的に
測定するための検定および／あるいは診断検査キットに
有用な試薬材料を提供することが出来る。前述の抗体は
１つ以上の動物種（例えば，マウス，ラビット，ヤギ，
ヒト等）に接種を行うかあるいはモノクローン抗体源か
ら得ることが出来る。前述の試薬材料は単独で，あるい
は適切な基質，例えばガラスあるいはプラスチックのビ
ーズに塗布して使用することが出来る。
これまで述べた具体的を考慮すれば本技術に熟達された
方々は本発明の実施の数多くの改善あるいは変更を思い
つかれるものと思われる。従って，本発明は添付する請
求の範囲に反映される範囲においてのみ限定されるもの
と見なされるものとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/21 ＡＢＨ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 スタビンスキイ・イツア−ク アメリカ合衆国80303コロラド・ボ−ルダ −・ハイデルバ−グ・ドライブ3415 (72)発明者 スニトマン・デイヴイツド・エル アメリカ合衆国80303コロラド・ボ−ルダ −・イシニカ・ドライブ1475 (56)参考文献 特開 昭56−21596（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，1982〔295〕 Ｐ．503− 508 Ｎａｔｕｒｅ，1981〔290〕 Ｐ．20− 26 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1981〔78〕 Ｐ．2848−2852 Ｎａｔｕｒｅ，1981〔294〕 Ｐ．563− 565 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，1979〔254〕 Ｐ．4132−4143

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記A.のアミノ酸配列のタンパク質及び下
    記B.のアミノ酸配列のタンパク質からなるグループから
    選択されるタンパク質。 A.Cys−Asp−Leu−Pro−Gln−Thr−His−Ser−Leu−Gly
    −Asn−Arg−Arg−Ala−Leu−Ile−Leu−Leu−Ala−Gln
    −Met−Arg−Arg−Ile−Ser−Pro−Phe−Ser−Cys−Leu
    −Lys−Asp−Arg−His−Asp−Phe−Gly−Phe−Pro−Gln
    −Glu−Glu−Phe−Asp−Gly−Asn−Gln−Phe−Gln−Lys
    −Ala−Gln−Ala−Ile−Ser−Val−Leu−His−Glu−Met
    −Ile−Gln−Gln−Thr−Phe−Asn−Leu−Phe−Ser−Thr
    −Lys−Asp−Ser−Ser−Ala−Ala−Trp−Asp−Glu−Ser
    −Leu−Leu−Glu−Lys−Phe−Tyr−Thr−Glu−Leu−Tyr
    −Gln−Gln−Leu−Asn−Asp−Leu−Glu−Ala−Cys−Val
    −Ile−Gln−Glu−Val−Gly−Val−Glu−Glu−Thr−Pro
    −Leu−Met−Asn−Val−Asp−Ser−Ile−Leu−Ala−Val
    −Lys−Lys−Tyr−Phe−Gln−Arg−Ile−Thr−Leu−Tyr
    −Leu−Thr−Glu−Lys−Lys−Tyr−Ser−Pro−Cys−Ala
    −Trp−Glu−Val−Val−Arg−Ala−Glu−Ile−Met−Arg
    −Ser−Phe−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu
    −Arg−Leu−Arg−Arg−Lys−Glu−；および B.Cys−Asp−Leu−Pro−Gln−Thr−His−Ser−Leu−Gly
    −Asn−Arg−Arg−Thr−Leu−Met−Leu−Leu−Ala−Gln
    −Met−Arg−Arg−Ile−Ser−Pro−Phe−Ser−Cys−Leu
    −Lys−Asp−Arg−His−Asp−Phe−Gly−Phe−Pro−Gln
    −Glu−Glu−Phe−Asp−Gly−Asn−Gln−Phe−Gln−Lys
    −Ala−Gln−Ala−Ile−Ser−Val−Leu−His−Glu−Met
    −Ile−Gln−Gln−Thr−Phe−Asn−Leu−Phe−Ser−Thr
    −Lys−Asp−Ser−Ser−Ala−Ala−Trp−Asp−Glu−Ser
    −Leu−Leu−Glu−Lys−Phe−Tyr−Thr−Glu−Leu−Tyr
    −Gln−Gln−Leu−Asn−Asp−Leu−Glu−Ala−Cys−Val
    −Ile−Gln−Glu−Val−Gly−Val−Glu−Glu−Thr−Pro
    −Leu−Met−Asn−Val−Asp−Ser−Ile−Leu−Ala−Val
    −Lys−Lys−Tyr−Phe−Gln−Arg−Ile−Thr−Leu−Tyr
    −Leu−Thr−Glu−Lys−Lys−Tyr−Ser−Pro−Cys−Ala
    −Trp−Glu−Val−Val−Arg−Ala−Glu−Ile−Met−Arg
    −Ser−Phe−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu
    −Arg−Leu−Arg−Arg−Lys−Glu。
  2. 【請求項２】適当な栄養条件下で、下記A.のアミノ酸配
    列のタンパク質および下記B.のアミノ酸配列のタンパク
    質からなるグループから選択されるタンパク質をコード
    するDNAを保持する細菌細胞を培養し、そこで発現され
    るタンパク質を単離することを含む、下記A.のアミノ酸
    配列のタンパク質および下記B.のアミノ酸配列のタンパ
    ク質からなるグループから選択されるタンパク質の製造
    方法。 A.Cys−Asp−Leu−Pro−Gln−Thr−His−Ser−Leu−Gly
    −Asn−Arg−Arg−Ala−Leu−Ile−Leu−Leu−Ala−Gln
    −Met−Arg−Arg−Ile−Ser−Pro−Phe−Ser−Cys−Leu
    −Lys−Asp−Arg−His−Asp−Phe−Gly−Phe−Pro−Gln
    −Glu−Glu−Phe−Asp−Gly−Asn−Gln−Phe−Gln−Lys
    −Ala−Gln−Ala−Ile−Ser−Val−Leu−His−Glu−Met
    −Ile−Gln−Gln−Thr−Phe−Asn−Leu−Phe−Ser−Thr
    −Lys−Asp−Ser−Ser−Ala−Ala−Trp−Asp−Glu−Ser
    −Leu−Leu−Glu−Lys−Phe−Tyr−Thr−Glu−Leu−Tyr
    −Gln−Gln−Leu−Asn−Asp−Leu−Glu−Ala−Cys−Val
    −Ile−Gln−Glu−Val−Gly−Val−Glu−Glu−Thr−Pro
    −Leu−Met−Asn−Val−Asp−Ser−Ile−Leu−Ala−Val
    −Lys−Lys−Tyr−Phe−Gln−Arg−Ile−Thr−Leu−Tyr
    −Leu−Thr−Glu−Lys−Lys−Tyr−Ser−Pro−Cys−Ala
    −Trp−Glu−Val−Val−Arg−Ala−Glu−Ile−Met−Arg
    −Ser−Phe−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu
    −Arg−Leu−Arg−Arg−Lys−Glu;および B.Cys−Asp−Leu−Pro−Gln−Thr−His−Ser−Leu−Gly
    −Asn−Arg−Arg−Thr−Leu−Met−Leu−Leu−Ala−Gln
    −Met−Arg−Arg−Ile−Ser−Pro−Phe−Ser−Cys−Leu
    −Lys−Asp−Arg−His−Asp−Phe−Gly−Phe−Pro−Gln
    −Glu−Glu−Phe−Asp−Gly−Asn−Gln−Phe−Gln−Lys
    −Ala−Gln−Ala−Ile−Ser−Val−Leu−His−Glu−Met
    −Ile−Gln−Gln−Thr−Phe−Asn−Leu−Phe−Ser−Thr
    −Lys−Asp−Ser−Ser−Ala−Ala−Trp−Asp−Glu−Ser
    −Leu−Leu−Glu−Lys−Phe−Tyr−Thr−Glu−Leu−Tyr
    −Gln−Gln−Leu−Asn−Asp−Leu−Glu−Ala−Cys−Val
    −Ile−Gln−Glu−Val−Gly−Val−Glu−Glu−Thr−Pro
    −Leu−Met−Asn−Val−Asp−Ser−Ile−Leu−Ala−Val
    −Lys−Lys−Tyr−Phe−Gln−Arg−Ile−Thr−Leu−Tyr
    −Leu−Thr−Glu−Lys−Lys−Tyr−Ser−Pro−Cys−Ala
    −Trp−Glu−Val−Val−Arg−Ala−Glu−Ile−Met−Arg
    −Ser−Phe−Ser−Leu−Ser−Thr−Asn−Leu−Gln−Glu
    −Arg−Leu−Arg−Arg−Lys−Glu。
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