JPH0767620A

JPH0767620A - ユーグレナの流加培養法

Info

Publication number: JPH0767620A
Application number: JP31098192A
Authority: JP
Inventors: Takashi Fujita; 孝藤田; Taisuke Iwasaki; 泰介岩崎; Norio Minagawa; 憲夫皆川
Original assignee: SHOKUHIN SANGYO HIGH SEPAREESHIYON SYST GIJUTSU KENKYU KUMIAI
Current assignee: SHOKUHIN SANGYO HIGH SEPAREESHIYON SYST GIJUTSU KENKYU KUMIAI
Priority date: 1992-10-26
Filing date: 1992-10-26
Publication date: 1995-03-14

Abstract

(57)【要約】【構成】ユーグレナを、炭素源及び窒素源を含む培地
で培養を開始し、培養の途中において炭素源及び窒素源
を流加基質として添加しながら流加培養することよりな
るユーグレナの培養法。【効果】ユーグレナの収率及びその中のリン脂質含量
を高めることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ユーグレナの培養方法
に関する。本発明の方法によると、ユーグレナの収率を
増大させ、その中のリン脂質含量を向上することができ
る。

【０００２】

【従来の技術】ユーグレナは、単細胞の真核生物であっ
て、生物分類学上はミドリムシ植物門に分類される植物
であると共に、原生動物門に分類される動物でもあると
いう特異な生物である。このユーグレナは、淡水中に広
く分布しており、多くは池や沼などのような静水中に生
棲するが、海水中、あるいは汚水中でも生育することが
知られている。そして、ユーグレナは、比較栄養学の材
料生物として有用であって、その生理について多くの研
究がなされている〔ユーグレナ−生理と生化学、北岡正
三郎編、学会出版センター、１９８９年〕。また、ユー
グレナは、アラキドン酸やエイコサペンタエン酸などの
高度不飽和脂肪酸、あるいはビタミンＣ、Ｅ、β−カロ
チンなどのビタミン類、さらには良質の蛋白質や多糖類
などの有用物質を生産することも知られている。

【０００３】近年、ユーグレナの生産するそれらの成分
を利用する目的で、多くの研究者がユーグレナの培養法
について種々の検討を行っている。例えば、高濃度の酸
素を通気することにより、蝋質物や粘質物などの生成、
分泌を抑制し、不飽和脂肪酸やビタミンＥなどの生産を
促進させる培養方法（特公平４−４８６５号公報）や従
来の回分培養法に比べて同一培養時間で１．５〜１０倍
量のユーグレナを得ることのできる連続培養方法（特開
昭６１−３７０９１号公報）などが知られており、さら
には、閉鎖系暗黒下での培養と開放系光照射下での培養
を組み合わせた培養方法（特開昭６１−４０７８５号公
報）も提案されている。本発明者らも、先にシェア・ス
トレスを軽減し，攪拌力に優れたユーグレナ培養装置
（特開平３−９８５７４号公報）を開発している経緯が
ある。

【０００４】従来、ユーグレナを培養する方法として、
回分培養法が用いられている。この方法では、培養に必
要な栄養分を溶解した発酵槽を滅菌した後、あらかじめ
前培養した細胞を接種し、細胞数及び細胞収率が所定の
水準に到達するまでユーグレナを培養する（特公平４−
４８６５号公報、特開昭６１−４０７８５号公報）。し
かし、この方法で培養した場合、通常の培養期間に得ら
れる細胞収率は、多くても１０ｇ／ｌ程度で非常に少な
いという問題がある。また、滅菌した栄養分を連続的に
発酵槽内に送液して発酵槽内に一定時間滞留させると共
に、細胞懸濁液の一部を回収する連続培養法も提案され
ている（特開昭６１−３７０９１号公報）。しかし、こ
の方法を用いると培養中に細胞の生理状態が変化するた
め、目的の生産物を高含量で得ることが難しく、さらに
は、培養が長期間にわたるため、雑菌に汚染される危険
性が増加するという問題がある。そして、有用物質の回
収が数回にわたって煩雑であること、あるいはそれを避
けるためにまとめて回収作業を行った場合は、保存中に
細胞成分の変化が生じるなどの問題もある。

【０００５】一方、リン脂質は生体膜の構成成分であっ
て、通常は食品から摂取される量で十分であることが知
られている。また、生物は必要量に見合ったリン脂質を
生合成することができることも明らかになってきてい
る。しかしながら、近年、生体内の膜リン脂質が、血清
コレステロールの低下作用、血圧降下作用、神経伝達系
の活性化作用など、種々の役割を果たしていることが明
らかとなり、リン脂質の生理活性が見直されつつある現
状にある。そのような中で、ユーグレナが生産するリン
脂質量は、総脂質量の７０％以上を占める場合もあるこ
とが知られている。そして、脂肪酸の大部分がこのリン
脂質画分に含まれ、特に高度不飽和脂肪酸はその傾向が
顕著であることから、高度不飽和脂肪酸含量が高く、特
異的な生理活性を有するリン脂質をユーグレナが生産す
ることも期待される。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上述の
問題点を鑑み、ユーグレナの収率を増大させると共に、
リン脂質含量の高いユーグレナを培養すべく、その方法
について鋭意検討を行ったところ、回分培養法と同様の
方法で培養を開始した発酵槽内に、培養途中の任意の時
期に栄養成分を添加し、一定の細胞数および細胞収量に
なるまで培養を行うことにより、ユーグレナの収率を増
大させると共に、リン脂質含量の高いユーグレナを得ら
れることができることを見出し、本発明を完成するに至
った。したがって、本発明は、ユーグレナの収率を増大
させると共に、その中のリン脂質含量を高めるユーグレ
ナ培養方法を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ユーグレナを
流加基質として炭素源及び窒素源を添加しながら流加培
養を行なうことよりなるユーグレナの流加培養法に関す
る。本発明における炭素源及び窒素源としては特に限定
はないが、通常のユーグレナその他の微生物、細胞等の
培養に用いられる炭素源及び窒素源が用いられる。この
ような炭素源としては、糖類、例えばグルコース、フル
クトース、ガラクトース、キシロース等を、窒素源とし
てはアンモニウム塩、アミノ酸等を挙げることができ
る。アンモニウム塩としてはリン酸アンモニウム、リン
酸水素一アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム等が
あり、このうち特にリン酸水素二アンモニウムが好適で
ある。またアミノ酸には、イソロイシン、リジン、バリ
ン、アスパラギン酸、グルタミン酸等、通常のアミノ酸
を挙げることができるが、このうち特に酸性アミノ酸、
就中グルタミン酸が好適である。また、本発明ではこれ
らのアミノ酸のナトリウム塩等の水溶性塩を用いること
もできる。特に窒素源としてグルタミン酸及びリン酸水
素二アンモニウムを併用することがユーグレナの収率や
リン脂質含量の面からみて望ましい。以下、本発明で
は、炭素源としてグルコースを、窒素源としてグルタミ
ン酸及びリン酸水素二アンモニウムを用いた場合につい
て主として説明するが、本発明の炭素源及び窒素源は上
記のように広範囲のものから選択することができ、これ
らに限定解釈されるべきではない。本発明は、先に挙げ
た種々の従来法に比較して、ユーグレナの収率を増大さ
せることができると共に、リン脂質含量の高いユーグレ
ナを得ることができる。本発明の流加培養法は、従来の
回分培養法と同様の方法で培養を開始した発酵槽内に、
培養途中の任意の時期に栄養成分を添加し、一定の細胞
数および細胞収量になるまで培養を行うことにより、ユ
ーグレナの収率を増大させると共に、リン脂質含量の高
いユーグレナを培養できるものである。

【０００８】本発明は、ユーグレナ属に属する全ての種
に対して適用することができる。代表的なユーグレナと
しては、Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌ
ｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓｖａｒ．ｂａｃｉｌｌａｒ
ｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａｖｉｒｉｄｉｓなどが知られて
おり、これらの変異種も用いることができる。

【０００９】本発明において、ユーグレナを培養する際
に用いる培地は、特に限定されるものではなく、通常、
ユーグレナの培養に用いられている組成のもので良い。
また、文献上知られている公知の培地組成を含め、炭素
源、窒素源、無機化合物及びビタミン類など、種々の組
成を組み合わせたものでも良い。例えば、ハトナー培地
〔ジャーナル・オブ・プロトズーオロジー、第６巻、２
３ページ、１９５９年〕、コレン−ハトナー培地〔ジャ
ーナル・オブ・プロトズーオロジー、第１４巻、１７ペ
ージ、１９６７年〕など、公知の培地を用いることがで
きる。なお、ハトナー培地は、培地１ｌ当たり、リンゴ
酸２ｇ、グルタミン酸ナトリウム５ｇ、リン酸二水素カ
リウム０．４ｇ、リン酸水素二アンモニウム０．２ｇ、
硫酸マグネシウム０．５ｇ、炭酸カルシウム０．２ｇ、
硫酸亜鉛２２ｍｇ、硫酸マンガン５．８ｍｇ、硫酸第一
鉄アンモニウム５．７ｍｇ、モリブデン酸アンモニウム
１．５ｍｇ、硫酸銅１．６ｍｇ、硫酸コバルト１．９ｍ
ｇ、ホウ酸１１．４ｍｇ、ＥＤＴＡ・２ナトリウム５０
ｍｇ及びビタミンＢ₁２．５ｍｇ、ビタミンＢ₁₂０．０
２ｍｇを含み、ｐＨは３．３である。

【００１０】本発明では、培養開始時の培地に、炭素源
としてグルコースを１０〜２５ｇ／ｌ、好ましくは１３
〜２０ｇ／ｌ、窒素源としてグルタミン酸及びリン酸水
素二アンモニウムをそれぞれ１〜１０ｇ／ｌ及び０．１
〜５ｇ／ｌ、好ましくは２〜７ｇ／ｌ及び０．２〜３ｇ
／ｌ添加し、培養を開始する。この際、培地のｐＨは
２．５〜８．０、好ましくは３．０〜４．５、培養温度
は１０〜３５℃、好ましくは２５〜３２℃に調整し、光
照射下あるいは暗黒下に、２〜１０日間、好ましくは５
〜７日間培養を行う。なお、培養に用いる装置について
は、培養中に流加基質を無菌的に添加できる構造のもの
であれば特に問題はないが、本発明者らの提案したユー
グレナの培養に適した装置（特開平３−９８５７４号公
報）を用いることが好ましい。流加基質は、培養中の任
意の時期、好ましくは培養３日目〜５日目に、炭素源及
び窒素源がほぼ消費されるのでその時期に、炭素源とし
てグルコースを５〜２０ｇ／ｌ、好ましくは８〜１３ｇ
／ｌ、窒素源としてグルタミン酸及びリン酸水素二アン
モニウムをそれぞれ１〜８ｇ／ｌ及び０．５〜５ｇ／
ｌ、好ましくは３〜５ｇ／ｌ及び０．７〜２ｇ／ｌ添加
し、培養を継続する。なお、流加基質にその他の微量無
機化合物を添加する必要は特にない。炭素源及び窒素源
を添加した直後、培地中の溶存酸素濃度が著しく低下す
るので、通気量を高めることが望ましい。本発明の流加
培養法では、通常の回分培養法の培養３日目頃に培地か
ら消失するグルコース及びグルタミン酸を流加基質とし
て補うことにより、ユーグレナの収率を増大させること
ができると共に、リン脂質含量の高いユーグレナを得る
ことが可能となる。

【００１１】このようにして培養されたユーグレナは、
遠心分離などの手法を用い、培養液から回収することが
できる。培養されたユーグレナは、そのままあるいは凍
結乾燥、通気乾燥等の乾燥手段をほどこして脂質を抽出
する。脂質の抽出はヘキサン、クロロホルム、ジエチル
エーテル、アセトン、メタノール、エタノールなどの通
常脂質の抽出に用いられている有機溶媒を用い、回収し
たユーグレナから脂質を抽出する。抽出操作は、浸漬、
振盪、あるいは攪拌などで十分である。脂質抽出後、減
圧し、含有成分が分解しない程度の温度で抽出液から溶
媒を留去する。そして、抽出した脂質をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーなどの方法によって分画し、リン
脂質画分を回収することができる。

【００１２】次に実施例を示し、本発明を詳しく説明す
る。

【実施例１】容量２ｌの発酵槽に、リンゴ酸に代えてグ
ルコース１８ｇ／ｌ、グルタミン酸３ｇ／ｌ、リン酸水
素二アンモニウム２．５ｇ／ｌを含む改変ハトナー培地
１．３ｌを入れ、同様の培地で前培養したＥｕｇｌｅｎ
ａｇｒａｃｉｌｉｓＳＭ−ＺＫ株５％を接種して
流加培養を行った。なお、培養装置は、特開平３−９８
５７４号公報に開示されているものを用いた。培養
は、、２５℃、６０ｒｐｍで攪拌下に、培養０〜３日は
通気速度０．３２ｌ／ｍｉｎ．、３〜５日は１．３ｌ／
ｍｉｎ．、５〜７日は１．９５ｌ／ｍｉｎ．で通気し、
通気攪拌培養を行なった。そして、流加基質として、培
養３日目及び５日目にグルコース１３ｇ／ｌ、グルタミ
ン酸３ｇ／ｌ、リン酸水素二アンモニウム１．５ｇ／ｌ
をそれぞれ添加した。培養後、遠心分離（３，０００×
ｇ、１０分間）を行ってユーグレナを回収し、凍結乾燥
を行った。得られたユーグレナの収率は３０ｇ／ｌであ
った。

【００１３】一方、容量２ｌの発酵槽に、グルコース３
０ｇ／ｌ、グルタミン酸５ｇ／ｌを含む改変ハトナー培
地１．３ｌを充填し、同様の培地で前培養したＥｕｇｌ
ｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓＳＭ−ＺＫ株５％を接種
して回分培養を行った。なお、培養装置は、同様に特開
平３−９８５７４号公報に開示されているものを用い、
２５℃、６０ｒｐｍの条件で、通気速度は、培養０〜４
日が０．３２ｌ／ｍｉｎ．、４〜７日が０．６５ｌ／ｍ
ｉｎ．とした。培養後、遠心分離（３，０００×ｇ、１
０分間）を行ってユーグレナを回収し、凍結乾燥を行っ
た。得られたユーグレナの収率は１６．７ｇ／ｌであっ
た。

【００１４】

【実施例２】実施例１で得られたそれぞれのユーグレナ
からリン脂質を抽出した。溶媒としてクロロホルム：メ
タノール＝２：１を用い、振盪抽出の操作を１０回行っ
た後、得られた抽出液を減圧下３５℃に保持して溶媒を
留去した。次に、溶媒を留去した抽出液をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーに吸着させた後、１０％ジエチ
ルエーテル（ｎ−ヘキサン）、２０％ジエチルエーテル
（ｎ−ヘキサン）、１％メタノール（クロロホルム）、
１０％メタノール（クロロホルム）及び１００％メタノ
ールの溶媒で順次溶出し、それぞれの溶出で得られた画
分をワックスエステル画分、トリグリセリド画分、遊離
脂肪酸画分、少量のリン脂質を含むその他の画分及びリ
ン脂質画分とした。そして、得られたリン脂質画分を薄
層クロマトグラフィー〔吸着剤：ＨＰＴＬＣプレート、
シリカゲル（メルク社製）、展開溶媒：クロロホルム：
ｎ−プロパノール：酢酸エチル：メタノール：０．２５
％塩化カリウム水溶液＝２３：２５：２５：１５：９〕
に供し、Ｄｉｔｔｍｅｒ−Ｌｅｓｔｅｒ試薬陽性のスポ
ットを二波長クロマトスキャナ（（株）島津製作所製）
で定量した。なお、各リン脂質については、標準品と同
じＲｆ値を示すものをその物質として同定し、標準品と
一致しないスポットについては、未知のリン脂質として
定量した。定量の結果、流加培養で得られたユーグレナ
では凍結乾燥物１ｇ当たり３７．９８μｍｏｌの総リン
脂質量であったのに対し、回分培養で得られたユーグレ
ナでは凍結乾燥物１ｇ当たり１８．５８μｍｏｌの総リ
ン脂質量であった。

【００１５】

【発明の効果】本発明の流加培養法を用いてユーグレナ
を培養することにより、従来の回分培養法に比べ、ユー
グレナの収率を増大させることができると共に、リン脂
質含量の高いユーグレナを得ることができる。ユーグレ
ナが生産するリン脂質は、高度不飽和脂肪酸の含量も高
く、特異的な生理活性を有することも期待されるので、
医薬や食品などの素材として有用であるが、本発明によ
ってその素材を大量に提供することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ユーグレナを培養するに当り、流加基質
として炭素源及び窒素源を添加しながら流加培養を行っ
てユーグレナの収率及びその中のリン脂質含量を増大せ
しめることを特徴とするユーグレナの流加培養法。
【請求項２】炭素源としてグルコース、フルクトー
ス、ガラクトース及びキシロースからなる群から選ばれ
る一種以上を、窒素源として酸性アミノ酸及びリン酸ア
ンモニウム塩を用いる請求項１記載の流加培養法。