JPH0768265B2 - ペプチドの固相合成法 - Google Patents
ペプチドの固相合成法Info
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- JPH0768265B2 JPH0768265B2 JP1245374A JP24537489A JPH0768265B2 JP H0768265 B2 JPH0768265 B2 JP H0768265B2 JP 1245374 A JP1245374 A JP 1245374A JP 24537489 A JP24537489 A JP 24537489A JP H0768265 B2 JPH0768265 B2 JP H0768265B2
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- meth
- acryloyl
- acid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はペプチドの固相合成方法に関する。
本明細書中で使用されている略号はEur.J.Biochem,138,
9−37（1984）に掲載されるごときIUPAC−IUB Joint Co
mmission on Biochemical Nomenclatureの1983年の提唱
（Recommen dation）に従つたものである。尚、本明細
書中では以下の略号にも使用されている： TFA トリフルオル酢酸 DCM ジクロルメタン DMF ジメチルホルムアミド NMP Ｎ−メチルピロリドン DMAc ジメチルアセトアミド アミノ酸及びその残基は、特に規定されていない限り、
Ｌ−立体配置のもの、例えばAla＝Ｌ−アラニン、DAla
＝Ｄ−アラニンである。“（メタ）アクリル酸”という
用語はアクリル酸又はメタクリル酸を表わすのに使用さ
れている。
9−37（1984）に掲載されるごときIUPAC−IUB Joint Co
mmission on Biochemical Nomenclatureの1983年の提唱
（Recommen dation）に従つたものである。尚、本明細
書中では以下の略号にも使用されている： TFA トリフルオル酢酸 DCM ジクロルメタン DMF ジメチルホルムアミド NMP Ｎ−メチルピロリドン DMAc ジメチルアセトアミド アミノ酸及びその残基は、特に規定されていない限り、
Ｌ−立体配置のもの、例えばAla＝Ｌ−アラニン、DAla
＝Ｄ−アラニンである。“（メタ）アクリル酸”という
用語はアクリル酸又はメタクリル酸を表わすのに使用さ
れている。
通常の固相ペプチド合成法は下記の操作工程からなる： １−Boc基の脱保護： ２−洗浄： ３−α−位のNH2の中和： ４−洗浄： ５−カツプリング：及び ６−洗浄 脱保護工程と中和工程は樹脂−ペプチド付加物（resin
−peptide）をDCM中のTFAとジイソプロピルエチルアミ
ンの溶液で処理することにより行われる。これと同一の
溶剤は中間の洗浄工程でも使用される。どのようなカツ
プリング剤（対称的無水物、ジシクロヘキシルカルボジ
イミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール等）が使用され
た場合でも、カツプリング反応はDCM中か又はDMF中で行
われる。
−peptide）をDCM中のTFAとジイソプロピルエチルアミ
ンの溶液で処理することにより行われる。これと同一の
溶剤は中間の洗浄工程でも使用される。どのようなカツ
プリング剤（対称的無水物、ジシクロヘキシルカルボジ
イミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール等）が使用され
た場合でも、カツプリング反応はDCM中か又はDMF中で行
われる。
従つて、固相ペプチド合成法はTFAのごとき、どちらか
と云えば高価な溶剤及び薬品を多量に使用する：従つ
て、ペプチドの価格は、その合成中に使用されるDCM、N
MP、DMF、DMAc及びTFAの価格により、直接、影響を受け
る。
と云えば高価な溶剤及び薬品を多量に使用する：従つ
て、ペプチドの価格は、その合成中に使用されるDCM、N
MP、DMF、DMAc及びTFAの価格により、直接、影響を受け
る。
従つて、ペプチドの製造価格を低下させるためには、よ
り安価な溶剤と薬品を見出すことは特に興味のあること
であろう。
り安価な溶剤と薬品を見出すことは特に興味のあること
であろう。
本出願人の欧州特許第0,079842号明細書には、下記の３
種の単量体の共重合体、すなわち、 （ｉ） 共重合体のマトリツクスを提供するかつ １−（メタ）アクリロイルピロリドン １−（メタ）アクリロイルピペリジン １−（メタ）アクリロイルパ−ヒドロアゼピン １−（メタ）アクリロイル−４−メチルピペラジン ４−（メタ）アクリロイルモルホリン N,N−ジメチル−（メタ）アクリルアミド及び N,N−ジエチル−（メタ）アクリルアミド の１つである第１の単量体： （ii） 共重合体を架橋させるかつ N,N′−ジ（メタ）アクリロイルジアミノメタン及び N,N′−ジ（メタ）アクリロイル−1,2−ジアミノエタン の１つである第２の単量体：及び （iii） 共重合体を活性化するかつ下記の酸： ２−（メタ）アクリルアミド酢酸 ３−（メタ）アクリルアミドプロピオン酸 ４−（メタ）アクリルアミド酪酸 ６−（メタ）アクリルアミドヘキサン酸 Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−アラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−バリン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−ロイシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−フエニルアラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−チロシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−メチオニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−リシン及び Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−プロリン又は これらの酸の１つのメチルエステル： の１つである第３の単量体： の共重合体であるポリアクリル酸系樹脂が記載されてい
る。
種の単量体の共重合体、すなわち、 （ｉ） 共重合体のマトリツクスを提供するかつ １−（メタ）アクリロイルピロリドン １−（メタ）アクリロイルピペリジン １−（メタ）アクリロイルパ−ヒドロアゼピン １−（メタ）アクリロイル−４−メチルピペラジン ４−（メタ）アクリロイルモルホリン N,N−ジメチル−（メタ）アクリルアミド及び N,N−ジエチル−（メタ）アクリルアミド の１つである第１の単量体： （ii） 共重合体を架橋させるかつ N,N′−ジ（メタ）アクリロイルジアミノメタン及び N,N′−ジ（メタ）アクリロイル−1,2−ジアミノエタン の１つである第２の単量体：及び （iii） 共重合体を活性化するかつ下記の酸： ２−（メタ）アクリルアミド酢酸 ３−（メタ）アクリルアミドプロピオン酸 ４−（メタ）アクリルアミド酪酸 ６−（メタ）アクリルアミドヘキサン酸 Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−アラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−バリン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−ロイシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−フエニルアラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−チロシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−メチオニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−リシン及び Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−プロリン又は これらの酸の１つのメチルエステル： の１つである第３の単量体： の共重合体であるポリアクリル酸系樹脂が記載されてい
る。
これらの共重合体は第３の単量体から誘導された遊離の
カルボキシ基又はメトキシカルボニル基を有する。本出
願人の欧州特許第81408号明細書には更に、これらの基
がエチレンジアミンでアミノ化（amidify）されている
ポリアクリル酸系樹脂が記載されている。上記欧州特許
明細書には上記ポリアクリル酸系樹脂を固相ペプチド合
成に使用することも記載されているが、この場合、前記
したごとき通常ポリスチレン樹脂と併用される高価な溶
剤と組合せて使用されているに過ぎない。
カルボキシ基又はメトキシカルボニル基を有する。本出
願人の欧州特許第81408号明細書には更に、これらの基
がエチレンジアミンでアミノ化（amidify）されている
ポリアクリル酸系樹脂が記載されている。上記欧州特許
明細書には上記ポリアクリル酸系樹脂を固相ペプチド合
成に使用することも記載されているが、この場合、前記
したごとき通常ポリスチレン樹脂と併用される高価な溶
剤と組合せて使用されているに過ぎない。
本発明によれば、第１のアミノ酸残基をポリアクリル酸
系樹脂に結合させ、１種又はそれ以上の他のアミノ酸残
基をカツプリングさせて所望のペプチドを形成させつい
でかく形成されたペプチドを前記樹脂から脱離させるこ
とからなるペプチドの固相合成法において、カツプリン
グ工程 （coupling protocal）中に、前記アクリル酸系樹脂を
水及び／又は水性溶液で洗浄する工程を包含させたこと
を特徴とするペプチドの固相合成法が提供される。
系樹脂に結合させ、１種又はそれ以上の他のアミノ酸残
基をカツプリングさせて所望のペプチドを形成させつい
でかく形成されたペプチドを前記樹脂から脱離させるこ
とからなるペプチドの固相合成法において、カツプリン
グ工程 （coupling protocal）中に、前記アクリル酸系樹脂を
水及び／又は水性溶液で洗浄する工程を包含させたこと
を特徴とするペプチドの固相合成法が提供される。
本発明の方法は、ポリスチレン樹脂と異り、ポリアクリ
ル酸樹脂の有する親水性を利用している。本発明の方法
で使用するためのポリアクリル酸系樹脂は前記欧州特許
第0079842号及び同第0081408号明細書に記載されている
ものであることが好ましい。
ル酸樹脂の有する親水性を利用している。本発明の方法
で使用するためのポリアクリル酸系樹脂は前記欧州特許
第0079842号及び同第0081408号明細書に記載されている
ものであることが好ましい。
第１のアミノ酸残基はグリコールアミド部分を介してマ
トリツクス上に固定し得る（B.Calas等、Tetrahedron,1
985,41 5331 参照）。
トリツクス上に固定し得る（B.Calas等、Tetrahedron,1
985,41 5331 参照）。
（Ｘ＝Br,Cl又はOH）のごとき他の不安定な（Iabile）
バインダーを使用する以前の試みは満足すべきものでは
なかつた。
バインダーを使用する以前の試みは満足すべきものでは
なかつた。
ついで樹脂を水で洗浄し得る。形成させるべきペプチド
配列の次のアミノ酸はつぎの工程に従つて付加し得る
（保護基がBocの場合に適用可能）： １−洗浄工程：蒸留水−２〜４回、各々２分間： ２−脱保護工程：水柱のHCl（6N）を使用−１回目２分
間及び２回目30分間： ３−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間： ４−中和工程:1当量硼酸塩緩衝液12.5mM,pH＝8.5−9.0
を使用、１回目、１〜２分間及び２回目１〜２分間： ５−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々１〜２分間 ６−洗浄工程:DMF−２回、各々１〜２分間： ７−カツプリング工程：対称的無水物を使用（２当量:D
MF中で２回）： ８−洗浄工程:DMF又はNMP−２回、各々２分間：及び ９−洗浄工程：蒸留水−４回、各々２分間。
配列の次のアミノ酸はつぎの工程に従つて付加し得る
（保護基がBocの場合に適用可能）： １−洗浄工程：蒸留水−２〜４回、各々２分間： ２−脱保護工程：水柱のHCl（6N）を使用−１回目２分
間及び２回目30分間： ３−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間： ４−中和工程:1当量硼酸塩緩衝液12.5mM,pH＝8.5−9.0
を使用、１回目、１〜２分間及び２回目１〜２分間： ５−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々１〜２分間 ６−洗浄工程:DMF−２回、各々１〜２分間： ７−カツプリング工程：対称的無水物を使用（２当量:D
MF中で２回）： ８−洗浄工程:DMF又はNMP−２回、各々２分間：及び ９−洗浄工程：蒸留水−４回、各々２分間。
また、保護基がFmocである場合には、延長工程（elonga
tion protocol）はつぎのごときものであり得る： １−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間： ２−脱保護工程：水中のピペリジン又はジエチルアミン
を使用： ３−洗浄工程：イソプロパノール、２回、各々２分間：
蒸留水、４〜６回、各々、２分間： ４−洗浄工程（必要に応じて実施）:DMF−１回、２分
間： ５−カツプリング工程：対称的無水物を使用（３回、DM
F中で過剰に）：及び ６−洗浄工程:DMF−２回、各々、２分間：蒸留水−６
回、各々、２分間。
tion protocol）はつぎのごときものであり得る： １−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間： ２−脱保護工程：水中のピペリジン又はジエチルアミン
を使用： ３−洗浄工程：イソプロパノール、２回、各々２分間：
蒸留水、４〜６回、各々、２分間： ４−洗浄工程（必要に応じて実施）:DMF−１回、２分
間： ５−カツプリング工程：対称的無水物を使用（３回、DM
F中で過剰に）：及び ６−洗浄工程:DMF−２回、各々、２分間：蒸留水−６
回、各々、２分間。
合成が完了したとき、得られたグリコールアミド結合を
下記の処理： −イソプロパノール中でのNaOHによる処理： −トリフルオルエタノール、メタノール、エタノール又
はイソプロパノール中でのNH3による処理： −DMF中でのN2H4による処理： −トリエチルアミン中でのCH3OHによる処理： の一つにより、選択的破断（breaking）を行うことによ
り、ペプチドをマトリツクスから分離する。
下記の処理： −イソプロパノール中でのNaOHによる処理： −トリフルオルエタノール、メタノール、エタノール又
はイソプロパノール中でのNH3による処理： −DMF中でのN2H4による処理： −トリエチルアミン中でのCH3OHによる処理： の一つにより、選択的破断（breaking）を行うことによ
り、ペプチドをマトリツクスから分離する。
この方法を使用することにより、ドルマンの参照ペプチ
ド（reference peptide）（ロイシン、アラニン、グリ
シン、バリン）とLHRH同族体を約50％の収率で得ること
ができる。
ド（reference peptide）（ロイシン、アラニン、グリ
シン、バリン）とLHRH同族体を約50％の収率で得ること
ができる。
本発明の実施例を以下に示す。
実施例１ DTrP6−LHRH:pyro−Glu−His−TrP−Ser−Tyr−DTrP−L
eu−Arg−Pro−Glyの合成 欧州特許第0079842号明細書の実施例19に記載の方法に
従つて１−アクリロイルピロリドン、N,N′−ジアクリ
ロイル−1,2−ジアミノエタン及びメチル ２−アクリ
ルアミドアセテートを共重合させることにより調製した
ポリアクリル酸樹脂5g（0.55ミリモルNH2/g）を下記の
ごとく処理した： 1.DCMで洗浄（４回：各々、２分間） 2.DCM中で５％ジイソプロピルエチルアミンで中和（各
々、２分間）、 3.DCMで洗浄（４回、各々２分間） 5.0mlのDCM中の無水ブロム酢酸4.29g（0.0165モル）を
上記樹脂に添加した。45分間振盪後、DCM溶液を過に
より除去しついで臭素化支持体（brominated support）
（樹脂）を下記とごとく洗浄した： 1.DCM（４回：各々、２分間） 2.DMF（４回：各々、２分間） Mery等の方法（Int.J,Protein Peptide Res.1988,31,41
2参照）に従つて調製したBocGlyOHのセシウム塩（4.22
g,0.0137モル）をDMF（75ml）中に溶解し、この溶液を
樹脂に添加した。混合物を２日間、周囲温度で振盪し
た。この時点でDMCを流出させ、重合体を下記の溶剤： 1.DMF（10回、各々２分間） 2.メタノール（４回、各々２分間） 3.DCM（４回、各々２分間） 4.ジエチルエーテル（４回、各々、２分間）で洗浄し
た。
eu−Arg−Pro−Glyの合成 欧州特許第0079842号明細書の実施例19に記載の方法に
従つて１−アクリロイルピロリドン、N,N′−ジアクリ
ロイル−1,2−ジアミノエタン及びメチル ２−アクリ
ルアミドアセテートを共重合させることにより調製した
ポリアクリル酸樹脂5g（0.55ミリモルNH2/g）を下記の
ごとく処理した： 1.DCMで洗浄（４回：各々、２分間） 2.DCM中で５％ジイソプロピルエチルアミンで中和（各
々、２分間）、 3.DCMで洗浄（４回、各々２分間） 5.0mlのDCM中の無水ブロム酢酸4.29g（0.0165モル）を
上記樹脂に添加した。45分間振盪後、DCM溶液を過に
より除去しついで臭素化支持体（brominated support）
（樹脂）を下記とごとく洗浄した： 1.DCM（４回：各々、２分間） 2.DMF（４回：各々、２分間） Mery等の方法（Int.J,Protein Peptide Res.1988,31,41
2参照）に従つて調製したBocGlyOHのセシウム塩（4.22
g,0.0137モル）をDMF（75ml）中に溶解し、この溶液を
樹脂に添加した。混合物を２日間、周囲温度で振盪し
た。この時点でDMCを流出させ、重合体を下記の溶剤： 1.DMF（10回、各々２分間） 2.メタノール（４回、各々２分間） 3.DCM（４回、各々２分間） 4.ジエチルエーテル（４回、各々、２分間）で洗浄し
た。
樹脂をKOHペレットの存在下、高度の真空下で12時間乾
燥させた。混合したGlyの量は、排気しかつ密封したチ
ユーブ中でかつ110℃で24時間、6NHClを使用して加水分
解した後にアミノ酸分析により測定して0.483ミリモル/
gであつた。
燥させた。混合したGlyの量は、排気しかつ密封したチ
ユーブ中でかつ110℃で24時間、6NHClを使用して加水分
解した後にアミノ酸分析により測定して0.483ミリモル/
gであつた。
BocGly−樹脂付加物（4.47g）を水で洗浄し（４回、各
々２分間）ついでBoc基を水中の6NHClを使用して脱離さ
せた（２回、１回目２分間、２回目30分間）。HClを
過により除去しついで樹脂を水で洗浄した（６回、各
々、２分間）。
々２分間）ついでBoc基を水中の6NHClを使用して脱離さ
せた（２回、１回目２分間、２回目30分間）。HClを
過により除去しついで樹脂を水で洗浄した（６回、各
々、２分間）。
硼酸塩緩衝液（12.5ミリモル、pH9）を使用して中和を
行つた：この操作では樹脂を50mlの緩衝液で２回処理し
た（各々、１分間）。水で洗浄し（６回、各々２分
間）、更にDMFで洗浄した後（２回、各々、２分間）、D
MF（50ml）中のBocProOHの対称的無水物（symmetrical
anhydride）を樹脂に添加した。
行つた：この操作では樹脂を50mlの緩衝液で２回処理し
た（各々、１分間）。水で洗浄し（６回、各々２分
間）、更にDMFで洗浄した後（２回、各々、２分間）、D
MF（50ml）中のBocProOHの対称的無水物（symmetrical
anhydride）を樹脂に添加した。
対称物無水物の溶液は以下の方法で調製した:BocProOH
（3.55g,0.0165モル）40mlのDMFに溶解し、溶液を０℃
に冷却しついで10mlのDCM中のジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（1.69g,8.25ミリモル）を添加した。０℃で30
分間撹拌しついで過した後、溶液を加熱することなし
に高度の真空下で蒸発させ、残渣をDMF中に溶解しつい
で樹脂を添加した。混合物を30分間振盪した：この時点
でのKaiser等による定性的ニンヒドリン試験（Anal.Bio
chem.1970,34,575）の結果は負であり、カツプリング収
率は99.6％以上であることを示した。DMFを除去した
後、支持体をDMFで２回（各々、２回）及び水（４回、
各々２分間）で洗浄した。
（3.55g,0.0165モル）40mlのDMFに溶解し、溶液を０℃
に冷却しついで10mlのDCM中のジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（1.69g,8.25ミリモル）を添加した。０℃で30
分間撹拌しついで過した後、溶液を加熱することなし
に高度の真空下で蒸発させ、残渣をDMF中に溶解しつい
で樹脂を添加した。混合物を30分間振盪した：この時点
でのKaiser等による定性的ニンヒドリン試験（Anal.Bio
chem.1970,34,575）の結果は負であり、カツプリング収
率は99.6％以上であることを示した。DMFを除去した
後、支持体をDMFで２回（各々、２回）及び水（４回、
各々２分間）で洗浄した。
この操作工程をDTrp6−LHRH配列の他のアミノ酸を導入
するのに使用した。対称的無水物はつぎのものを使用し
て調製した:BocArg（Mts）OH（7.52g,0.0165モル）,Boc
LeuOH（4.11g,0.0165モル）,BocDTrpOH（5.02g,0.0165
モル）,BocTyr（2,6ジクロルベンジル）OH又はBocTyr
（2,6DCB）OH（7.26g,0.0165モル）,BocSer（Bzl）OH
（4.86g,0.0165モル）,BocTrpOH（5.02g,0.0165モル）,
BocHis（ジクロルフエニル）OH又はBocHis（Dnp）OH
（6.94g,0.0165モル）,pyro−GluOH（2.13g,0.0165モ
ル）。
するのに使用した。対称的無水物はつぎのものを使用し
て調製した:BocArg（Mts）OH（7.52g,0.0165モル）,Boc
LeuOH（4.11g,0.0165モル）,BocDTrpOH（5.02g,0.0165
モル）,BocTyr（2,6ジクロルベンジル）OH又はBocTyr
（2,6DCB）OH（7.26g,0.0165モル）,BocSer（Bzl）OH
（4.86g,0.0165モル）,BocTrpOH（5.02g,0.0165モル）,
BocHis（ジクロルフエニル）OH又はBocHis（Dnp）OH
（6.94g,0.0165モル）,pyro−GluOH（2.13g,0.0165モ
ル）。
pyro−GluOHの導入後、樹脂をメタノール（４回、各
々、２分間）及びジエチルエーテル（４回、各々、２分
間）で洗浄しついで高い真空下、周囲温度で48時間乾燥
した。
々、２分間）及びジエチルエーテル（４回、各々、２分
間）で洗浄しついで高い真空下、周囲温度で48時間乾燥
した。
ついでペプチド−樹脂付加物をDMF（50ml）中のチオフ
エノール（10ml）で処理して、ヒスチジン側鎖上のジニ
トロフエニル基を除去した。
エノール（10ml）で処理して、ヒスチジン側鎖上のジニ
トロフエニル基を除去した。
45分間振盪後、チオフエノール溶液を流出させついで樹
脂をDMF（４回、各々、２分間）、DCM（４回、各々２分
間）ついでジエチルエーテル（４回、２分間）で洗浄し
た。樹脂を高度を真空下で12時間乾燥した。ついで樹脂
を０℃で50mlのつぎの溶液の各々で２回（各々30分間）
処理した：トリフルオルメタンスルホン酸（3.6ml）、
アニソール（4ml）、チオアニソール（4ml）、メタクレ
ゾール（4ml）及びトルフルオル酢酸（40ml）。脱保護
の終了後、樹脂をDCM（２回、各々、２分間）、DCM/DMF
（50/50）（２回、各々、２分間）、DCM中の５％ジイソ
プロピルエチレンアミン（２回、各々、１分間）、DMF
（３回、各々、２分間）、イソプロパノール／水（70/3
0）（３回、各々２分間）で洗浄した。ついでペプチド
−樹脂付加物をNH3を飽和させたトリフルオルエタノー
ル溶液（250ml）に懸濁させた。
脂をDMF（４回、各々、２分間）、DCM（４回、各々２分
間）ついでジエチルエーテル（４回、２分間）で洗浄し
た。樹脂を高度を真空下で12時間乾燥した。ついで樹脂
を０℃で50mlのつぎの溶液の各々で２回（各々30分間）
処理した：トリフルオルメタンスルホン酸（3.6ml）、
アニソール（4ml）、チオアニソール（4ml）、メタクレ
ゾール（4ml）及びトルフルオル酢酸（40ml）。脱保護
の終了後、樹脂をDCM（２回、各々、２分間）、DCM/DMF
（50/50）（２回、各々、２分間）、DCM中の５％ジイソ
プロピルエチレンアミン（２回、各々、１分間）、DMF
（３回、各々、２分間）、イソプロパノール／水（70/3
0）（３回、各々２分間）で洗浄した。ついでペプチド
−樹脂付加物をNH3を飽和させたトリフルオルエタノー
ル溶液（250ml）に懸濁させた。
混合物を周囲温度で15時間振盪し、脱保護されたDTrp6
−LHRHを含有するトルフルオルエタノール溶液を捕集し
ついで支持体を水（４回、２分間）、メタノール（４
回、各々、２分間）及び水（６回、各々、２分間）で洗
浄した。液を捕集し、pHをIN塩酸でpHを約４にした：
ついで液を加熱することなしに真空下で濃縮した。残
渣をNaClの直線状勾配（10mM AcONa pH5.0〜10mM AcNa,
0.15M NaCl,pH5.0）を有するカルボキシメチルセルロー
スのカラム（Wathman CM 52,10×2cm）上で分別した。
適当なフラクシヨンを捕集し、凍結乾燥しついで10M HC
l中のSephadex G 10のカラム（100×2.5cm）上でのゲル
過により脱塩した。ついでペプチドフラクシヨンをLi
chrosorb RP 18（10μｍ）のカラム（270×20mm）上で
のHPLCにかけ、かつ水中の0.01％トリフルオル酢酸（TF
A）及びアセトニトリルを溶離剤として使用して精製し
た。
−LHRHを含有するトルフルオルエタノール溶液を捕集し
ついで支持体を水（４回、２分間）、メタノール（４
回、各々、２分間）及び水（６回、各々、２分間）で洗
浄した。液を捕集し、pHをIN塩酸でpHを約４にした：
ついで液を加熱することなしに真空下で濃縮した。残
渣をNaClの直線状勾配（10mM AcONa pH5.0〜10mM AcNa,
0.15M NaCl,pH5.0）を有するカルボキシメチルセルロー
スのカラム（Wathman CM 52,10×2cm）上で分別した。
適当なフラクシヨンを捕集し、凍結乾燥しついで10M HC
l中のSephadex G 10のカラム（100×2.5cm）上でのゲル
過により脱塩した。ついでペプチドフラクシヨンをLi
chrosorb RP 18（10μｍ）のカラム（270×20mm）上で
のHPLCにかけ、かつ水中の0.01％トリフルオル酢酸（TF
A）及びアセトニトリルを溶離剤として使用して精製し
た。
収率:51％（支持体の当初のアミノ基に基づく収率）。
アミノ酸分析:Glu 0.99（１）,Leu 1.0（１）,His 1.0
（１）,TrP 1.89（２）,Ser 0.96（１）,Tyr 0.97
（１）,PrO 0.99（１）,Gly 1.02（１）。
（１）,TrP 1.89（２）,Ser 0.96（１）,Tyr 0.97
（１）,PrO 0.99（１）,Gly 1.02（１）。
酸性条件下で不安定な幾つかのアミノ酸については、分
析値は該アミノ酸の分解のため、予期した値より低いも
のであり得る。
析値は該アミノ酸の分解のため、予期した値より低いも
のであり得る。
上記と同一の方法を使用して下記のペプチドを調製し
た： −ドルマン（Dorman）ペプチド:Leu Ala Gly ValOH 収率＝46.6％ Gly＝0.96,Ala＝0.94,Val＝1.05,Leu＝1.04 −ラミニン（Laminine）:Tyr Ile Gly Ser ArgNH2 収率＝35.6％ Ser＝0.75,Gly＝1.03,Ile＝0.99,Tyr＝1,Arg＝0.99。
た： −ドルマン（Dorman）ペプチド:Leu Ala Gly ValOH 収率＝46.6％ Gly＝0.96,Ala＝0.94,Val＝1.05,Leu＝1.04 −ラミニン（Laminine）:Tyr Ile Gly Ser ArgNH2 収率＝35.6％ Ser＝0.75,Gly＝1.03,Ile＝0.99,Tyr＝1,Arg＝0.99。
−“ポンビー”（“Pombee"）酵母の細胞周期からのCDC
28キナーゼ蛋白 収率＝44.1％（粗ペプチド） Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH Asp＝1,Gly＝1.08,Ala＝1,Leu＝1.05×2,Try＝0.99,Arg
＝0.99,Lys＝1,pro＝１。
28キナーゼ蛋白 収率＝44.1％（粗ペプチド） Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH Asp＝1,Gly＝1.08,Ala＝1,Leu＝1.05×2,Try＝0.99,Arg
＝0.99,Lys＝1,pro＝１。
−チロシン ホスフアターゼ 収率＝58.6％（粗ペプチド） Crs Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH Asp＝0.95×3,Ser＝0.58×3,Glu＝0.67, Ile＝1.1,Leu＝1.1。
−オンコゲン（Oncogene:Phe Arg Gly Thr Leu Arg 収率＝53.4％ Phe＝0.97,Arg＝２×1.1,Gly＝1.02, Thr＝0.99,Leu＝１。
実施例２ Leu−Ala−Gly−Valの合成。
実施例１で使用したポリアクリル酸樹脂を下記をごとく
処理した： 1.DCMで洗浄（４回、各々、２分間）、 2.DCM中の５％ジイソプロピルエチルアミンで中和（２
回、各々、２分間）、 3.DCMで洗浄（４回、各々２分間）。
処理した： 1.DCMで洗浄（４回、各々、２分間）、 2.DCM中の５％ジイソプロピルエチルアミンで中和（２
回、各々、２分間）、 3.DCMで洗浄（４回、各々２分間）。
10mlのDCM中の無水ブロム酢酸（0.858g,3.3ミリモル）
を上記樹脂に添加した。45分間振盪後、DCM溶液を過
により除去しついで臭素化支持体を下記のごとく洗浄し
た： 1.DCM（４回、各々、２分間） 2.DMF（４回、各々、２分間） Mery等の方法（Int.J.Peptide Protein Res.1988,31,41
2）に従つて調製したFmoc Val OHのセシウム塩（1.29g,
2.75ミリモル）をDMF（15ml）に溶解しついでこの溶液
を樹脂に添加した。懸濁液を周囲温度で３日間振盪し
た。この時点でDMFを流出させついで樹脂を下記の溶剤
で洗浄した： 1.DMF（10回、各々、２分間）、 2.メタノール（４回、各々、２分間）、 3.DCM（４回、各々、２分間）、 4.ジエチルエーテル（４回、各々、２分間）。
を上記樹脂に添加した。45分間振盪後、DCM溶液を過
により除去しついで臭素化支持体を下記のごとく洗浄し
た： 1.DCM（４回、各々、２分間） 2.DMF（４回、各々、２分間） Mery等の方法（Int.J.Peptide Protein Res.1988,31,41
2）に従つて調製したFmoc Val OHのセシウム塩（1.29g,
2.75ミリモル）をDMF（15ml）に溶解しついでこの溶液
を樹脂に添加した。懸濁液を周囲温度で３日間振盪し
た。この時点でDMFを流出させついで樹脂を下記の溶剤
で洗浄した： 1.DMF（10回、各々、２分間）、 2.メタノール（４回、各々、２分間）、 3.DCM（４回、各々、２分間）、 4.ジエチルエーテル（４回、各々、２分間）。
樹脂をKOHペレットの存在下、高度の真空下で12時間乾
燥させた。結合したValの量は、排気し、かつ密封した
チユーブ中で6NHCl中で24時間加水分解した後にアミノ
酸分析により測定して0.492ミリモル/gであつた。
燥させた。結合したValの量は、排気し、かつ密封した
チユーブ中で6NHCl中で24時間加水分解した後にアミノ
酸分析により測定して0.492ミリモル/gであつた。
Fmoc Val−樹脂付加物（1.1g）を水で洗浄し（４回、各
々、２分間）ついでFmoc基を水中の10％ピペリジン又は
ジエチルアミンを使用して脱離させた。ついで樹脂をイ
ソプロパノール（２回、各々、２分間）及び水（４回、
各々、２分間）で洗浄した。
々、２分間）ついでFmoc基を水中の10％ピペリジン又は
ジエチルアミンを使用して脱離させた。ついで樹脂をイ
ソプロパノール（２回、各々、２分間）及び水（４回、
各々、２分間）で洗浄した。
DMF（15ml）中のFmocGlyOHの対称的無水物を支持体に添
加した。対照的無水物の溶液は下記の方法で調製した： FmocGly OH（0.981g,3.3ミリモル）をDCM（15ml）に溶
解し、溶液を０℃に冷却しついでDCM（10ml）中のジシ
クロヘキシルカルボジイミド（0.339g,1.65ミリモル）
を添加した。濁つた混合物を０℃で20分間撹拌し、ジシ
クロヘキシル尿素の沈澱を過により除去しついで液
を真空下、室温で濃縮した。油状残基をDMF（15ml）中
に溶解しついで得られた溶液を樹脂に添加した。混合物
を室温で45分間振盪した：この時点でKaiser等の定量的
ニンヒドリン試験（Anal Biochem.1970,34,575参照）の
結果は負であつた。DMFを過により除去し、ついで支
持体をDMF（２回、各々、２分間）及び水（６回各々、
２分間）で洗浄した。
加した。対照的無水物の溶液は下記の方法で調製した： FmocGly OH（0.981g,3.3ミリモル）をDCM（15ml）に溶
解し、溶液を０℃に冷却しついでDCM（10ml）中のジシ
クロヘキシルカルボジイミド（0.339g,1.65ミリモル）
を添加した。濁つた混合物を０℃で20分間撹拌し、ジシ
クロヘキシル尿素の沈澱を過により除去しついで液
を真空下、室温で濃縮した。油状残基をDMF（15ml）中
に溶解しついで得られた溶液を樹脂に添加した。混合物
を室温で45分間振盪した：この時点でKaiser等の定量的
ニンヒドリン試験（Anal Biochem.1970,34,575参照）の
結果は負であつた。DMFを過により除去し、ついで支
持体をDMF（２回、各々、２分間）及び水（６回各々、
２分間）で洗浄した。
この操作工程を使用してつぎのアミノ酸:deu及びAlaを
導入した。対称的無水物は1.16g（3.3ミリモル）のFmoc
LeuOHと1.09g（3.3ミリモル）のFmocAlaOHとから調製し
た。反応の完了後、ペプチド−樹脂付加物をイソプロパ
ノール（４回、各々、２分間）、水（４回、各々、２分
間）及びイソプロパノール／水（70/30）（４回、各
々、２分間）で洗浄した。
導入した。対称的無水物は1.16g（3.3ミリモル）のFmoc
LeuOHと1.09g（3.3ミリモル）のFmocAlaOHとから調製し
た。反応の完了後、ペプチド−樹脂付加物をイソプロパ
ノール（４回、各々、２分間）、水（４回、各々、２分
間）及びイソプロパノール／水（70/30）（４回、各
々、２分間）で洗浄した。
ついでペプチド−樹脂付加物をイソプロパノール／水
（70/30）中に懸濁させ、1.1mlの1N NaOHを添加した。
混合物を周囲温度で５時間振盪し、Leu−Ala−Gly−Val
を含有するイソプロパノール／水混合溶液を捕集しつい
で支持体を水（４回、各々、２分間）、メタノール（４
回、各々、２分間）及び水（４回、各々、２分間）で洗
浄した。液を捕集し、1N HClを使用してpHを４とし、
ついで溶液を真空下、室温で濃縮した。残渣をLichroso
rb RP 18（10μｍ）のカラム（250×20mm）上でのHPLC
にかけ、水中の0.1％TFA及びアセトニトリルを溶離剤と
して使用して精製した。
（70/30）中に懸濁させ、1.1mlの1N NaOHを添加した。
混合物を周囲温度で５時間振盪し、Leu−Ala−Gly−Val
を含有するイソプロパノール／水混合溶液を捕集しつい
で支持体を水（４回、各々、２分間）、メタノール（４
回、各々、２分間）及び水（４回、各々、２分間）で洗
浄した。液を捕集し、1N HClを使用してpHを４とし、
ついで溶液を真空下、室温で濃縮した。残渣をLichroso
rb RP 18（10μｍ）のカラム（250×20mm）上でのHPLC
にかけ、水中の0.1％TFA及びアセトニトリルを溶離剤と
して使用して精製した。
収率:54％（支持体の当初のアミノ基に基づく収率）。
アミノ酸分析:Leu 1.02（１）,Ala 0.99（１）,Gly 1.1
（１）,Val 1.1（１）。
（１）,Val 1.1（１）。
上記の同一の方法を使用して下記のペプチドを合成し
た： −ドルマンペプチド:Leu Ala Gly ValOH 収率＝46.6％ Gly＝0.93,Ala＝0.91,Val＝1.01,Leu＝１。
た： −ドルマンペプチド:Leu Ala Gly ValOH 収率＝46.6％ Gly＝0.93,Ala＝0.91,Val＝1.01,Leu＝１。
−ラミニン:Tyr Ile Gly Ser ArgNH2 収率＝46.3％ Ser＝0.79,Gly＝1.01,Ile＝0.96,Tyr＝0.89,Arg＝0.9
3。
3。
−“ポンビー”酵母の細胞周期からのCDC280キナーゼ蛋
白 収率＝48.5％（粗ペプチド） Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH Asp＝0.97,Gly＝1.02,Ala＝0.98,Leu＝1.02×2,Tyr＝0.
98,Arg＝0.96,Lys＝1,Pro＝0.97。
白 収率＝48.5％（粗ペプチド） Tyr Lys Ala Leu Asp Leu Arg Pro GlyOH Asp＝0.97,Gly＝1.02,Ala＝0.98,Leu＝1.02×2,Tyr＝0.
98,Arg＝0.96,Lys＝1,Pro＝0.97。
−チロシンホスフアターゼ 収率＝61.6％（粗ペプチド） Cys Ser Asp Ser Glu Lys Leu Asn Leu Asp Ser IleOH Asp＝0.99×3,Ser＝0.63×3,Glu＝0.73,Ile＝1.03,Leu
＝１。
＝１。
−オンコゲン:Phe Arg Gly Thr Leu Arg 収率＝49.2％ Phe＝1,Arg＝２×1.04,Gly＝1,Thr＝0.96,Leu＝0.98。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/00 8318−4Ｈ // Ｃ０７Ｋ 105:00 (72)発明者 ムル・ナハリソア・ハニトラ フランス国．34075・モンペリエ．リユ・ ド・ラ・シエーネー．192．シテ・ヴエル トヴオワ
Claims (5)
- 【請求項１】第１のアミノ酸残基をポリアクリル酸系樹
脂に結合させ、１種又はそれ以上の他のアミノ酸残基を
カツプリングさせて所望のペプチドを形成させついでか
く形成されたペプチドを前記樹脂から脱離させることか
らなるペプチドの固相合成法において、カツプリング工
程中に、前記アクリル酸系樹脂を水及び／又は水性溶液
で洗浄する工程を包含させたことを特徴とするペプチド
の固相合成法。 - 【請求項２】ポリアクリル酸系樹脂は下記の３種の単量
体の共重合体、すなわち、 （ｉ） 共重合体のマトリツクスを提供するかつ １−（メタ）アクリロイルピロリドン １−（メタ）アクリロイルピペリジン １−（メタ）アクリロイルパ−ヒドロアゼピン １−（メタ）アクリロイル−４−メチルピペラジン ４−（メタ）アクリロイルモルホリン N,N−ジメチル−（メタ）アクリルアミド及びN,N−ジエ
チル−（メタ）アクリルアミド の１つである第１の単量体： （ii） 共重合体を架橋させるかつ N,N′−ジ（メタ）アクリロイルジアミノメタン及び N,N′−ジ（メタ）アクリロイル−1,2−ジアミノエタン の１つである第２の単量体：及び （iii） 共重合体を活性化するかつ下記の酸： ２−（メタ）アクリルアミド酢酸 ３−（メタ）アクリルアミドプロピオン酸 ４−（メタ）アクリルアミド酪酸 ６−（メタ）アクリルアミドヘキサン酸 Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−アラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−バリン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−ロイシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−フエニルアラニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−チロシン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−メチオニン Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−リシン及び Ｎ−（メタ）アクリロイル−Ｌ−プロリン又は これらの酸の１つのメチルエステル： の１つである第３の単量体： の共重合体である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】ポリアクリル酸系樹脂はエチレンジアミン
によりアミド化されている請求項２記載の共重合体であ
る請求項１記載の方法。 - 【請求項４】アミノ酸カツプリングで使用されるＮ−保
護基はBocでありそしてカツプリング工程は、 １−洗浄工程：蒸留水−２〜４回、各々２分間： ２−脱保護工程：水中のHCl（6N）を使用−１回目２分
間及び２回目30分間： ３−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間： ４−中和工程:1当量硼酸塩緩衝液12.5mM.pH＝8.5−9.0
を使用、１回目、１〜２分間及び２回目１〜２分間： ５−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々１〜２分間： ６−洗浄工程:DMF−２回、各々１〜２分間： ７−カツプリング工程：対称的無水物を使用（２当量:D
MF中で２回）： ８−洗浄工程:DMF又はNMP−２回、各々２分間：及び ９−洗浄工程：蒸留水−４回、各々２分間： からなる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】アミノ酸カツプリングで使用されるＮ−保
護基はFmocでありそしてカツプリング工程は、 １−洗浄工程：蒸留水−４〜６回、各々２分間： ２−脱保護工程：水中のピペリジン又はジエチルアミン
を使用： ３−洗浄工程：イソプロパノール、２回、各々２分間：
蒸留水、４〜６回、各々、２分間： ４−洗浄工程（必要に応じて実施）:DMF−１回、２分
間： ５−カツプリング工程：対称的無水物を使用（３回、DM
F中で過剰に）：及び ６−洗浄工程:DMF−２回、各々、２分間：蒸留水−６
回、各々、２分間： からなる請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
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|---|---|---|---|
| GB8822502.4 | 1988-09-24 | ||
| GB888822502A GB8822502D0 (en) | 1988-09-24 | 1988-09-24 | New peptide synthesis method |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02129200A JPH02129200A (ja) | 1990-05-17 |
| JPH0768265B2 true JPH0768265B2 (ja) | 1995-07-26 |
Family
ID=10644204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1245374A Expired - Lifetime JPH0768265B2 (ja) | 1988-09-24 | 1989-09-22 | ペプチドの固相合成法 |
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| AT (1) | AT400439B (ja) |
| AU (1) | AU622705B2 (ja) |
| BE (1) | BE1002237A3 (ja) |
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| GR (1) | GR1000564B (ja) |
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| IE (1) | IE62008B1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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