JPH0768273B2

JPH0768273B2 - 抗ｈｉｖペプチド

Info

Publication number: JPH0768273B2
Application number: JP63303972A
Authority: JP
Inventors: 邦夫江沢; 良雄林; 和良生田; 四郎加藤; 信孝藤井
Original assignee: カルピス食品工業株式会社
Priority date: 1988-12-02
Filing date: 1988-12-02
Publication date: 1995-07-26
Anticipated expiration: 2010-07-26
Also published as: JPH02152989A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は抗HIVペプチドに関するものである。

本発明の抗HIVペプチドはヒト免疫不全ウエルス（HIV）
の感染を妨げる機能を有し、更に、HIV感染後の多該巨
細胞の形成も妨げる機能を有し、後天性ヒト免疫不全症
（エイズ）の治療または発症予防に使用することができ
るので、医療界に大きく貢献するものである。

〔従来技術〕

HIVによるエイズを治療または発症予防するための薬剤
としてはHIVが本来有し、そのウイルス粒子複製に必要
な逆転写酵素の阻害剤が実際に使用されてはいるが、正
常細胞に対する細胞毒性が強く、問題が多いとされてい
る。また、発症予防の目的にはワクチンが考えられる
が、HIVの外被蛋白質の抗原性が突然変異によって変化
するため、効果的なワクチンの開発は困難な状況にあ
る。

そこで、有効性がより高く、毒性のより低い薬剤の開発
が活発に行われているが、一群の有望な薬剤としてHIV
の細胞への結合または感染を阻害するものが考えられて
いる。

その第１はHIVの外被蛋白質であるgp120やgp41に結合す
る抗体であり、該蛋白質を適当な動物に免疫して抗血清
やモノクローナル抗体として製することができる。しか
しながら、前述のように該蛋白質の抗原性は必ずしも一
定ではないため、変異を受けないアミノ酸配列に対する
抗体を見出すことが必要である上に、通常得られる抗体
は動物由来であるため、抗体もそのものが人体に対して
免疫原性を有し反復使用が不可能となる欠点がある。

第２の試みとしては細胞上のHIV受容体であるCD4分子に
着目し、これに対する抗体を投与することにより細胞を
被覆し、HIVの感染から免れさせようとする考え方であ
る。この場合はHIVの結合を妨げることはできるが、同
時に正常細胞の機能に影響を及ぼすことは避けられな
い。

そこで、抗体を使用する上での問題点を解決するために
HIVの受容体であるCD4分子そのものを治療に応用しよう
という考えが提案された。可溶性のCD4分子はHIVのgp12
0に結合し感染の伝播を防ぐ効果を示し、クラスII特異
的なＴ細胞相互作用やマクロファージの機能など正常な
細胞機能を阻害することはないと言われている。このよ
うな可溶性CD4分子が遺伝子工学的に作成されている。
（Hussey,R.E.ら。Nature第331巻78頁、1988年）また、
CD4分子上にあってHIVのgp120と結合する部分の検索を
行われている。

（発明が解決しようとする問題点）本発明はCD4分子を構成するアミノ酸鎖のうちHIVの感染
伝播を阻害し得る、より短いアミノ酸鎖、すなわち抗HI
Vペプチドを提供するものである。

本発明は、Pro−Leu−Ile−Ile−Lys−Asn−Leu−Lys−
Ile−Glu−Asp−Ser−Asp−Thr−Tyr−Ile−Cys−Glu−
Val−Glu−Aps−Gln−Lys−Glu−Glu−Val−Gln−Leu−
Leu−Val−Phe−Gly−Leu−Thr−Ala−Asn−Ser−Asp−
Thr−His−Leu−Leu−Gln−Gly−Gln−Ser−Leu−Thr−
Leu−Thr−Leu−Glu−Ser−Pro−Pro−Gly−Ser−Ser−
Pro−Ser−Val−Gln−Cys で示されるアミノ酸鎖より成る、抗HIV活性を有するペ
プチドに関するものである。

本発明の抗HIVペプチドは完全分子型である可溶性CD4よ
りも著じるしく短いが、gp120との結合にあずかる部分
のみを有するペプチドとなっており、不必要な反応に関
わる可能性は少く、特異性が高く、より有効なものと考
えられる。

また、本発明の抗HIVペプチド用いれば、より有効な薬
剤をデザインしていく上でも、化学的方法などによる修
飾が容易となる。例えばアミノ酸の一部をＤ体にするな
どしてプロテアーゼ抵抗性とすることもできるし、適当
な薬剤を結合して、より効率的な抗HIV薬を創製するこ
とも可能となる。

次に本発明を詳細に説明する。

本発明者らはCD4分子をコードしているDNA塩基配列（Ma
ddon,P.J.et al.,Cell,47,333−348,1986）により決定
されているアミノ酸配列に基き、CD4分子の部分ペプチ
ドを合成した。合成は、Fmocアミノ酸を使用した固相法
（Sheppard,R.C.et al,J.Chem.Soc.,Chem.Comm.,165−1
66,1985）によって行った。即ち、まずそれぞれの部分
ペプチドのＣ−末端に相当するFmocアミノ酸ペンタフル
オロフェニル（Pfp）エステルをジメチルホルムアミド
中で４−ジメチルアミノピリジン存在下、ｐ−アルコキ
シベンジルアルコール樹脂に結合させ、次いで結合すべ
き別のFmocアミノ酸Pfpエステルと縮合反応により結合
させた。

また、スレオニンとセリンについては１−オキソ−２−
ヒドロキシ−ジヒドロ−ベンゾトリアジン（DHBT）エス
テルを用いて導入した。各アミノ酸のカップリング反応
終了後、ペプチドの結合した樹脂を20％ピペリジン・ジ
メチルホルムアミド混液で処理してＮ末端Fmoc基を除去
し、次いでｍ−クレゾール存在下、室温にてTFA−チオ
アニソールを作用させて脱保護をすると同時に、目的と
する部分ペプチドを樹脂より回収した、また、アルギニ
ン残基を含むペプチドはトリメチルシリルブロミド（TM
SBr）−チオアニソール/TFAで処理を行った。

本発明者らは上述の方法によりCD4分子の部分ペプチド
を合成したが、その方法はこれに限られるわけではなく
他の化学合成法、例えばBocアミノ酸を用いる方法や、
当該部分ペプチドに対応するDNAを得て、これを適当な
ベクターに挿入し、動物細胞や微生物で発現させて目的
とする部分ペプチドを得ても良いのである。

本発明者らはこのようにして得たCD4分子の部分ペプチ
ドを、HIV感受性の細胞株MT−４とHIVの感染系に添加し
て本発明でいう抗HIV活性、すなわちHIV感染による細胞
の死滅や変性を阻害する活性を有するペプチドを選択し
本発明の抗HIVペプチドを得るに至ったのである。

尚、本ペプチドはそのＮ末端、Ｃ末端にシステインが存
在する。従って本ペプチドの安定性を保つためには遊離
のSH基を保護しておく必要がある。この目的のために通
常はアセトメチル基が使用される。

実施例１ペプチドＣ末端のシステインをその誘導体Fmoc−Cys（A
cm）−opfp活性エステル（1mmol）及び触媒としてDMAP
（４−ジメチルアミノピリジン）（0.2mmol）を用い、
ジメチルホルムアミド（DMF）中、ｐ−alkoxy benzyl a
lchol Resin（0.2mmol）（0.35meq OH/g,Polystyrene 1
％ Divinyl benzene Copolymer.国産化学（株））上に
エステル結合により導入した。

使用したFmoc−アミノ酸誘導体（ミリジエン製）の側鎖
の保護は、Asp（OBu^t）、Glu（OBu^t）、Thr（Bu^t）、Se
r（Bu^t）、Lyr（Bo^t）、Lys（Boc）、His（Boc）、Arg
（Mtr）、Cys（Acm）で、ペプチド鎖伸長時の各縮合反
応は、Thr.Serを除きすべてPfp（ペンタフルオロフェニ
ル）活性エステル体（2.5eq）を用い触媒としてHOBT
（１−ハイドロキシベンゾトリアゾール）0.2mmolの存
在下DMF中で行なった。一方Ser.ThrはDHBT（3,4−ジハ
イドロ−３−ハイドロキシ−４−オキソ−1,2,3−ベン
ゾトリアジン）エステルを用いた。

各々のFmoc基の除去は、20％ピペリジのDMF溶液を用い
た。更に各々のcoupling reactionは、ニンヒドリンで
モニターした。

すべてのCouplng反応終了後、Ｎ末端に残ったFmoc基を2
0％ピペリジン/DMFにより除去し、NH_Z−基をフリーと
し、その後、すべての他の保ご基の除去と、樹脂からペ
プチドを切り出すために、TFA−thioanisoleでｍ−cres
ole存在下で室温３時間処理し、グラスフィルターでろ
過し、樹脂を除き、ろ液を室温で濃縮し、これにether
を加えpowderを得た。これを、集め、適当なBufferに溶
解し、Sephadex G−25にかけ、0.5N AcOHで溶出させ、
脱塩、精製を行なった。一方Argを含むペプチドは、TMS
Br−thioanisole/TEAでｍ−cresole存在下０℃60min処
理し、以後同様に処理した。ゲルろ過後のペプチドは更
にHPLCで精製した。

HPLCの分析条件は0.1％TFA中アセトニトリル22％→32％
の濃度勾配（40分）でYMC−PACK R−ODS−５（4.6×250
mm）を流速1ml/分で流し、230nmでモニターした、目的
とする本発明の抗HIVペプチド（部分ペプチド70−132）
はリテンション・タイム26.85分で溶出した。収率は約
4.6％であった。また、この部分ペプチドのアミノ酸分
析の結果は理論値とほぼ一致した。

実施例2.部分ペプチドの抗HIV活性 HIV−１（HTLV−III B）が既に持続感染しているMOLT−
４細胞の培養液をHIV液とし、これを10倍段階希釈した
後、合成した16個のペプチド（1mg/ml）それぞれと室温
で30分保持した。次にHIV感受性であるMT−４細胞１×1
0⁶cells−mlと1:1（v/v）で混ぜ（全量0.2ml）、RPMI−
1640−10％FCS培養液で炭酸ガス培養器中、37℃で４日
間保持した。

感染価の測定はHIVのgag蛋白質p18に対するモノクロー
ナル抗体を用いた免疫蛍光法で行った。

表１に示すように部分ペプチド70−132（CD4分子のＮ末
端より数え、70番目から132番目のアミノ酸鎖により成
るペプチド）に抗HIV活性が認められた。

尚、感染価（TCID₅₀）は値の小さいものほど抗HIV活性
が高い。

部分ペプチド感染価（TCID₅₀） Control 10^6.33 １−69 ＞10^6.50 ８−25 10^6.33 18−69 10^5.50 26−47 10^5.33 47−69 10^5.50 70−132 10^1.50 86−132 10^3.66 96−110 10^3.50 111−132 ＞10^6.50 120−161 ＞10^6.50 132−139 10^5.66 161−180 10^5.00 190−197 10^6.00 318−334 10^6.33 このCD4ペプチド70−132は、量に比例して抗HIV増殖阻
止活性が認められた（図1a）。更に、多核巨細胞形成阻
止活性が認められた（図1b）。多核巨細胞形成能は、MO
LT−４細胞と、HIVに持続感染したMOLT−４細胞を10:1
の割合で混合し、24時間、37℃保持した後判定した。

ここでいう部分ペプチドのアミノ酸配列は以下に示す通
りである。

〔部分ペプチド１−69〕Ｈ−Gln−Vly−Asn−Lys−Val−Val−Leu−Gly−Lys−L
ys−Gly−Asp−Thr−Val−Glu−Leu−Thr−Cys−Thr−A
la−Ser−Gln−Lys−Lys−Ser−Ile−Gln−Phe−His−T
rp−Lys−Asn−Ser−Asn−Gln−Ile−Lys−Ile−Leu−G
ly−Asn−Gln−Gly−Ser−Phe−Leu−Thr−Lys−Gly−P
ro−Ser−Lys−Leu−Asn−Asp−Arg−Ala−Asp−Ser−A
rg−Arg−Ser−Leu−Trp−Asp−Gln−Gly−Asn−Phe−O
H 〔部分ペプチド８−25〕Ｈ−Gly−Lys−Lys−Gly−Asp−Thr−Val−Glu−Leu−T
hr−Cys−Thr−Ala−Ser−Gln−Lys−Lys−Ser−OH 〔部分ペプチド18−69〕Ｈ−Cys−Thr−Ala−Ser−Gln−Lys−Lys−Ser−Ile−G
ln−Phe−His−Trp−Lys−Asn−Ser−Asn−Gln−Ile−L
ys−Ile−Leu−Gly−Asn−Gln−Gly−Ser−Phe−Leu−T
hr−Lys−Gly−Pro−Ser−Lys−Leu−Asn−Asp−Arg−A
la−Asp−Ser−Arg−Arg−Ser−Leu−Trp−Asp−Gln−G
ly−Asn−Phe−OH 〔部分ペプチド26−47〕Ｈ−Ile−Gln−Phe−His−Trp−Lys−Asn−Ser−Asn−G
ln−Ile−Lys−Ile−Leu−Gly−Asn−Gln−Gly−Ser−P
he−Leu−Thr−OH 〔部分ペプチド47−69〕Ｈ−Thr−Lys−Gly−Pro−Ser−Lys−Leu−Asn−Asp−A
rg−Ala−Asp−Ser−Arg−Arg−Ser−Leu−Trp−Asp−G
ln−Gly−Asn−Phe−OH 〔部分ペプチド70−132〕Ｈ−Pro−Leu−Ile−Ile−Lys−Asn−Leu−Lys−Ile−G
lu−Asp−Ser−Asp−Thr−Tyr−Ile−Cys−Glu−Val−G
lu−Asp−Gln−Lys−Glu−Glu−Val−Gln−Leu−Leu−V
al−Phe−Gly−Leu−Thr−Ala−Asn−Ser−Asp−Thr−H
is−Leu−Leu−Gln−Gly−Gln−Ser−Leu−Thr−Leu−T
hr−Leu−Thr−Leu−Glu−Ser−Pro−Pro−Gly−Ser−S
er−Pro−Ser−Val−Gln−Cys−OH 〔部分ペプチド86−132〕Ｈ−Cys−Glu−Val−Clu−Asp−Gln−Lys−Clu−Glu−V
al−Gln−Leu−Leu−Val−Phe−Gly−Leu−Thr−Ala−A
sn−Ser−Asp−Thr−His−Leu−Leu−Gln−Gly−Gln−S
er−Leu−Thr−Leu−Thu−Ler−Glu−Ser−Pro−Pro−G
ly−Ser−Ser−Pro−Ser−Val−Gln−Cys−OH 〔部分ペプチド96−110〕Ｈ−Gln−Leu−Leu−Val−Phe−Gly−Leu−Thr−Ala−A
sn−Ser−Asp−Thr−His−Leu−OH 〔部分ペプチド111−132〕Ｈ−Leu−Gln−Gly−Gln−Ser−Leu−Thr−Leu−Thr−L
eu−Glu−Ser−Pro−Pro−Gly−Ser−Ser−Pro−Ser−V
al−Gln−Cys−OH 〔部分ペプチド120−161〕Ｈ−Leu−Glu−Ser−Pro−Pro−Gly−Ser−Ser−Pro−S
er−Val−Gln−Cys−Arg−Ser−Pro−Arg−Gly−Lys−A
sn−Ile−Gln−Gly−Gly−Lys−Thr−Leu−Ser−Val−S
er−Gln−Leu−Glu−Leu−Gln−Asp−Ser−Gly−Thr−T
rp−Thr−Cys−OH 〔部分ペプチド132−139〕Ｈ−Cys−Arg−Ser−Pro−Arg−Gly−Lys−Asn−OH 〔部分ペプチド161−180〕Ｈ−Cys−Thr−Val−Leu−Gln−Asn−Gln−Lys−Lys−V
al−Glu−Phe−Lys−Ile−Asp−Ile−Val−Val−Leu−A
la−OH 〔部分ペプチド190−197〕Ｈ−Lys−Lys−Glu−Gly−Glu−Gln−Val−Glu−OH 〔部分ペプチド318−334〕Ｈ−Ser−Leu−Lys−Leu−Glu−Asn−Lys−Glu−Ala−L
ys−Val−Ser−Lys−Arg−Glu−Lys−Ala−OH

【図面の簡単な説明】

図1aは、実施例２においてCD4ペプチド70−132の量に比
例して抗HIV増殖阻止活性が認められた図で、図1bは同
じく多核巨細胞形成阻止活性が認められた図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者藤井信孝京都府京都市左京区吉田下阿達町69―29 京都大学薬学部薬品製造学教室内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Pro−Leu−Ile−Ile−Lys−Asn−Leu−Lys
−Ile−Glu−Asp−Ser−Asp−Thr−Tyr−Ile−Cys−Glu
−Val−Glu−Aps−Gln−Lys−Glu−Glu−Val−Gln−Leu
−Leu−Val−Phe−Gly−Leu−Thr−Ala−Asn−Ser−Asp
−Thr−His−Leu−Leu−Gln−Gly−Gln−Ser−Leu−Thr
−Leu−Thr−Leu−Glu−Ser−Pro−Pro−Gly−Ser−Ser
−Pro−Ser−Val−Gln−Cys で示されるアミノ酸鎖より成る、抗HIV活性を有するペ
プチド。