JPH0769316B2 - クロマトグラフ材料 - Google Patents

クロマトグラフ材料

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JPH0769316B2
JPH0769316B2 JP63141451A JP14145188A JPH0769316B2 JP H0769316 B2 JPH0769316 B2 JP H0769316B2 JP 63141451 A JP63141451 A JP 63141451A JP 14145188 A JP14145188 A JP 14145188A JP H0769316 B2 JPH0769316 B2 JP H0769316B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は適当な親和性配位子と共有的にカップリングし
たときに、高性能親和性クロマトグラフィー（HPAC）ま
たは他の分離もしくは検出技術によって生体物質及び他
の物質の分離及び／または検出のために用いることがで
きるクロマトグラフ材料又は吸着材料に関する。
〔従来の技術〕
報告によると種々の配位子を固体保持体にカップリング
させてクロマトグラフ試薬を形成させることは、本質的
にそのイオン的性質により親水性であるか、またはその
非イオン的及び非極性的性質により疏水性である、比較
的短い低分子量のリンカーまたは比較的長い高分子量リ
ンカーを用いることにより達成された。
Larssonらへの米国特許第4,532,232号及びGladらへの米
国特許第4,406,792号は特に配位子を短い長さのリンカ
ー、すなわちグリシドキシプロピルトリメトキシシラン
によってシリカにカップリングすることを開示してい
る。
Mosbachらへの米国特許第4,415,665号はカップリングに
先立ち2,2,2−トリフルオロエタンスルホニルクロリド
で前処理したシリカ粒子または−（CH2）３−Ｏ−CH2−
CH（OH）−CH2OH−で置換され、カップリングに先立ち
2,2,2−トリフルオロエタンスルホニルクロリドで前処
理したシリカ粒子に、置換されたアデノシン５′−モノ
ホスフェートをカップリングすることを報告している。
Mosbachはまた塩化スルホニルを用いて特異的タンパク
質及び置換されたアデノシン５′−モノホスフェートを
多糖類誘導体、例えばアガロース及びセルロースにカッ
プリングすることを報告している。
Atkinsonらへの米国特許第4,431,554号は特にグリシド
キシプロピルトリメトキシシランを単独または比較的短
い長さの２官能性脂肪族リンカー、例えば1,6−ジアミ
ノヘキサンと組合せて用いることによって種々の有機染
料をシリカにカップリングさせることを報告している。
Biebrichcrらへの米国特許第4,177,038号は低分子量ポ
リエチレングリコール200を用いて生体物質を固体保持
体にカップリングする、すなわち、有機ジイソシアネー
トを用いて該グリコールの一端を生体物質にカップリン
グし、他端をセルロース保持体にカップリングすること
を述べている。
Biebrichcrはまた多孔性ガラスペレットを含む例を報告
しており、そこではまずアミノプロピルトリメトキシシ
ランを多孔性ガラスペレットにカップリングする。つい
で該シラン処理シリかをテトラメチレンジイソシアネー
トで処理しついで３−アミノフェニルボロン酸（３−am
inophenyl boronic acid）にカップリングする。
特異的な水溶性もしくは親水性リンカーによって配位子
を固体保持体にカップリングすることがMillerへの米国
特許第3,715,278号及びNakashimaらへの米国特許第4,35
2,884号に報告されている。Millerにおいてはエチレン
とマレイン酸無水物とのコポリマーをアミノプロピルト
リメトキシシランで前処理したケイ酸カルシウム粒子に
カップリングした。ついで該カップリングされたポリマ
ーの側鎖カルボキシル基を通して酸素ズブチリシンをカ
ップリングした。
Nakashimaらにおいては、その報告によると親水性のア
クリレートまたはメタクリレートと不飽和カルボン酸と
のコポリマーを用いて固体保持体表面を塗布することに
より保持体の非特異的吸着が明らかに小さくなった。つ
いでカルボジイミド縮合によって直接にまたはε−アミ
ノカプロン酸またはジアミノヘプタンを通して間接に生
物活性物質を直性カルボキシル基またはアミノ基にカッ
プリングした。
しかしながらMiller及びNakashimaのクロマトグラフ剤
の重大な欠点は生物活性物質のカップリングの後に残り
得るコポリマーの遊離カルボン酸及びアミノ基である。
従ってこれらのクロマトグラフ用剤はかなりの残存イオ
ン交換性を有し得るので、このため望ましくない吸着が
起こったり、結合した生物活性物質がよくない影響を受
け得る。
残余のイオン交換性を有し、そのためこれらと同じ欠点
を生じ得るくせのクロマトグラフ剤はSiluerへの米国特
許第4,210,722号（β−ヒドロキシアルキルアミンを含
有するコポリマー）、Symonらへの米国特許第4,415,663
号（ポリアミン含浸保持体）、Meillerらへの米国特許
第4,132,596号（３級アミノ基または４級アンモニウム
塩を含有する架橋ポリマー）、Cleeland、Jr.らへの米
国特許第3,888,864号（ケシアルカロイドのアミノアル
キルエステルのカルボキシル化ラテックス粒子への結
合）、Schneiderらへの米国特許第4,451,568号（アクリ
ル酸またはその誘導体例えばアミノアルキルメタクリレ
ートのコポリマー）、Lantero,Jr.への米国特許第4,43
8,196号（活性粒性炭素へ吸着させたポリアミン）、Tak
agiらへの米国特許第4,610,962号（垂れ下がったカルボ
ン酸無水物を含有するポリマーで処理した再生セルロー
ス繊維）、及びFreyらへの米国特許第4,581,337号（ポ
リエーテルポリアミンリンカーを有する第２コポリマー
で処理した水不溶性コポリマーで処理してラテックス粒
子）に開示されたクロマトグラフ用剤を含む。
さらに、種々の疏水性リンカーの使用が報告されてい
る。例えばMessingらへの米国特許第4,071,409号（高分
子芳香族イソシアネートリンカー）及びSmith IIIへの
米国特許第4,007,089号（リンカーとしての非対称性（a
symmetric）二官能性飽和または不飽和炭化水素）参
照。
上記クロマトグラフ剤の多くは高線流速（例えば約0.1c
m/minより大）及び／または比較的高い圧力（例えば約2
00psi（約14kg/cm2）より大）を用いるクロマトグラフ
分離には適当でない。例えば多糖類、例えばセルロー
ス、セファロース、アガロース等の誘導体は比較的圧縮
されやすいのでかかる適用には有用でない。
さらに、かかる高速／高圧クロマトグラフィーに適用す
ることができる多くの固体保持体、例えば架橋スルホン
化ポリスチレンは望ましくない非特異的吸着を示すこと
が分かった。
〔発明が解決しようとする課題〕
従って本発明の１つの目的は可逆的な非特異的吸着が実
質上ないクロマトグラフ材料（chromatographic materi
als）及び吸着材料（sorbent materials）を提供するこ
とである。
本発明の別の目的はpH安定性が実質的に改善されたクロ
マトグラフ材料又は吸着材料を提供することである。
本発明の別の目的は改良された結合速度を有するクロマ
トグラフ材料又は吸着材料を提供することである。
本発明のさらに別の目的は約0.1cm/minより大きな高流
速において証明される実質的に非圧縮性であるクロマト
グラフ材料又は吸着材料を提供することである。以下、
吸着材料も含めてクロマトグラフ材料として説明する。
〔課題を解決するための手段〕
本発明は一般式Ｓ−Ｂ−Ｘ（式中、Ｓは非圧縮性固体保
持体、Ｂは結合基、Ｘは、骨格原子数24〜1200個の主鎖
を含み、実質的に非イオン性の親水性スペーサーであ
る）を有するクロマトグラフ材料（chromatographic ma
terial）よりなる。このクロマトグラフ材料は固体保持
体（solid support）を結合基を通してスペーサーに共
有的にカップリングすることによって形成される。
本発明はまた一般式Ｓ−Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ｌ（式中、Ｓ、Ｂ
及びＸは前記と同義であり、Ｌは親和性配位子及びＹは
カップリング基である）を有するクロマトグラフ材料よ
りなる。このクロマトグラフ材料は上記のごとくＳ−Ｂ
−Ｘを共有的にカップリングし、ついでこのスペーサー
Ｘに上記配位子をカップリング基γを通してカップリン
グすることによって形成される。
本発明はまた一般式Ｓ−Ｂ−Ｘ−Ｙ′（式中、Ｓ、Ｂ及
びＸは前記と同義であり、Ｙ′は活性化されたカップリ
ング基である）を有するクロマトグラフ材料よりなる。
このクロマトグラフ材料はＳ−Ｂ−ＸをＹ′に共有的に
カップリングすることによって形成される。このクロマ
トグラフ材料についで該活性化されたカップリング基と
反応する親和性配位子Ｌを共有的に結合して一般式Ｓ−
Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ｌを有するクロマトグラフ材料を形成する
のに用いることができる。
本発明は更にまたある物質を混合物からクロマトグラフ
的に分離する方法よりなる。この物質を含有する混合物
をまず問題の物質と親和性がある配位子を含有するここ
に述べたクロマトグラフ材料と接触させる。ついでクロ
マトグラフ材料を溶液で洗浄してクロマトグラフ材料か
ら混合物の非結合種を除き、クロマトグフ材料に溶出溶
液を通して結合物質を回収する。
本発明はまたここに述べたクロマトグラフ材料を用い
て、少なくとも１の物質を混合物から単離、検出する方
法よりなる。問題の物質を含有する混合物をまず適当な
親和性配位子を含有するクロマトグラフ材料と接触させ
る。ついで結合した物質の存在を定性的または定量的に
測定する。
生体物質の分析的及び予備的分離のためのクロマトグラ
フ試薬の固体保持体としてのシリカ及び他の金属酸化物
例えばアルミナ、チタニア等の使用は広く受け入れられ
なかった。これはかかるクロマトグラフ試薬が非特異的
吸着を受けること及び金属酸化物保持体に帰せられるア
ルカリ性媒体中で不安定であることによる。例えばCar
r,P.W.ら「Chromatographic Forum」（９、10月、198
6）31−37頁参照。かかるクロマトグラフ剤は、例えば
生体物質を治療投与のために精製する場合特に好ましく
ない。例えばシリカに共有的に付加したモノクローナル
抗体によって精製される抗原は、その結合の間に非特異
的に吸着し、ついで抗原と共に脱着されたタンパク質に
よって汚染され得る。かくして精製抗原は動物やヒトに
投与したとき汚染タンパク質からの望ましくない免疫応
答を生じ得る。ヒトの治療の場合にはFDAの許可を得る
ことが難しい結果となろう。
架橋スルホン酸化ポリスチレンのような他の固体保持体
は高いpHにも低いpHにも安定であるが、非特異的吸着に
よる斑が生ずる（are plaqued）。
これらの問題点を克服するために本発明者は可逆的な非
特異的吸着が実質上ない本発明のクロマトグラフ材料を
開発した。本クロマトグラフ材料においては実質的に非
イオン性の親和性スペーサーを固体保持体と親和性配位
子の間に置いている。
驚くべきことに、固体保持体としてシリカを含有するク
ロマトグラフ材料が酸化ケイ素を用いる試薬について今
まで知られていなかったpH安定性を有することが実証さ
れた。
加えるに、本クロマトグラフ材料は、実質的に非イオン
性の親水性スペーサーを用いない同様のクロマトグラフ
試薬に比べ、結合容量及び吸着速度定数が増加している
ことが実証された。非イオン性親水性スペーサーの使用
はクロマトグラフ材料に吸着する生体物質の量を大巾に
増加させ、空隙容量中にロスする生体物質の量を最小に
するようである。
非イオン性親水性スペーサーの使用は結合した親水性配
位子の生体高分子へのより大きな立体的接近を可能に
し、かくして固定化された親和性配位子のより大きな画
分がかかる生体分子と相互作用することを可能にするも
のと考えられる。かくして実施例12において、約45原子
の平均長さを有するポリエチレングリコール（DEG）親
水性スペーサーを用いる、シリカ（30μ）−ポリエチレ
ングリコール−プロテインＡカラムのIgG結合容量は、
７原子（３−グリシドキシプロピルリンカー）によって
シリカ（10μ、Pierce Chcmical者）に固定化したプロ
テインＡを有する市販のプロテインＡカラムのIgG結合
容量のほぼ２倍であった。同様に実施例13において、同
じシリカ−PEG−プロテインＡカラムは市販のプロテイ
ンＡカラムの約1.8倍のヒトIgG吸着速度定数を示した。
吸着速度定数における1.8倍の増加は、より大きな粒子
のシリカは、粒子直径の３乗の比に従って減ずる吸着速
度を有するという予想される結果を考慮すると特に驚く
べきことである。かくして10μPierceプロテインＡシリ
カへのIgGの結合に比して30μプロテインAPEG600−シリ
カへのIgGの結合の速度は、すべての他のパラメーター
が同じである10μPierceプロテインＡシリカへの結合速
度の1/（３）３つまり1/27であると考えられる。ゆえに
観測された1.8倍の増加は27×1.8に訂正することができ
る。これは理論的にプロテインAPEG600シリカについて
の吸着速度定数が48.6倍に増加したことを意味する。
高速クロマトグラフ親和性保持体の実際的利用の１例は
マウス細胞からのモノクローナル抗体のプロテインＡ精
製である。プロテインＡはIgG1、2a、2bイデオタイプの
マウスIgG抗体、及びヒトIgG1、IgG2及びIgG4サブクラ
スの親和性精製に用いられる。残余なことにマウス由来
の抗体は高塩基性pH条件（0.1Mトリス塩基、pH9.5）で
は別であるが中性pH域ではプロテインＡとは結合性が非
常に良くない（Johnstone,A.及びThorpe,T.,Immunochcm
istry in Practice（1982）、pp.209−212）．マウスモ
ノクローナル抗体はタンパク質類の免疫精製（immunopu
ritication）にとって商業上非常に重要である。この道
の多くの専門家によって用いられている0.1MトリスpH9.
5の条件はプロテインＡセファロース親和性保持体のた
めのものであり、その場合プロセスサイクル時間は４〜
６時間である。しかしながらこれらの条件はシリカゲル
ベースプロテインAHPACカラムには適用できない。なぜ
なら通常のシリカゲル処方物は8.5より大のpHで不安定
であるからである。ここに記述するPEGで誘導体化した
シリカの新規かつ予期せざるアルカリ性pH安定性は、プ
ロテインＡセファロース親和性保持体では達成できな
い、工業的に重要なマウスモノクローナル抗体の迅速
（サイクル時間10−20分）深夜クロマトグラフィーを可
能にする。
「クロマトグラフ材料」は実質上非イオン性の親水性ス
ペーサーであって、その一端で固体保持体単独、または
該スペーサーの他端にカップリング基を介して共有的に
付加した親和性配位子と組み合わせた固体保持体に共有
的にカップリングしたスペーサー含有する材料を意味す
る。「クロマトグラフ材料」はまた実質上非イオンの親
水性スペーサーであって、その一端で固体保持体に、他
端で該スペーサーに目的とする親和性配位子をカップリ
ングさせるために用いられる「活性化されたカップリン
グ基」に共有的にカップリングしたスペーサーを含有す
る材料に関する。固体保持体は後で定義するごとく「実
質的に非圧縮性」であってよく、または多糖類またはそ
の誘導体を含有しないものであってよい。
ここにおいて、「クロマトグラフ分離」は少なくとも１
の物質を混合物から分離するためのクロマトグラフ技術
であって、非イオン性親水性スペーサーによって固体保
持体に共有的に付加した、ある物質に対する親和性配位
子を有するクロマトグラフ材料を採用する技術を意味す
る。かかるクロマトグラフ分離は典型的には「高性能親
和性クロマトグラフィー」（HPAC）によって行われ、
（１）混合物を目的とする物質に対する適当な親和性配
位子を含有するクロマトグラフ材料と接触させる工程、
（２）クロマトグラフ材料を洗浄して非結合種を除去す
る工程、及び（３）結合した物質をクロマトグラフ材料
から溶出する工程を含む。HPACは一般的に比較的高い圧
力（例えば500psiより大）及び比較的高い線流速（例え
ば約0.1cm/minより大）を用いて行われる。
混合物中の少なくとも１つの物質の「分離及び検出」は
検出すべき特定の物質に親和性の配位子を含有するクロ
マトグラフ材料を採用する技術である。クロマトグラフ
検出は一般に（１）検出すべき物質を含有する混合物を
適当な親和性配位子を含有するクロマトグラフ材料と接
触させ、（２）クロマトグラフ材料を洗浄して非結合種
を除去し、ついで（３）検出溶液をクロマトグラフ材料
と接触させて保持された物質を検出することによって行
われる。かかる使用において親和性配位子を含有するク
ロマトグラフ材料はビーズ、浸漬棒（dipsticks）また
は他の適当な形態よりなることができ、または微量力価
プレート（microtitre plate）または試験管の内面であ
ってもよい。検出溶液は典型的には抗体またはクロマト
グラフ材料に結合した物質を認識することができる他の
分子（例えば相補鎖を検出するためのRNAもしくは一方
鎖DNA）であって、放射性標識または酸素を結合した（c
onjugated）抗体または他の分子を含有する。クロマト
グラフ材料につで第２の洗浄液と接触させてクロマトグ
ラフ材料から非反応性複合物（unreactive conjugate）
を除去する。ついで、クロマトグラフ材料に結合した物
質の量をクロマトグラフに結合した放射能を測定するこ
とによって、または結合した複合酸素（conjugate enzy
me）によって仲介される化学反応の程度によって測定す
ることができる。または、この分野の人々に知られた競
合アッセイまたは他のアッセイを本発明のクロマトグラ
フ材料を用いて行うこともできる。
「親和性配位子」はクロマトグラフ材料に共有的に付加
したときに目的とする１以上の物質と特異的に相互作用
することができる。配位子であればいずれの配位子でも
よい。クロマトグラフ分離のためのクロマトグラフ材料
として用いる場合、本発明のクロマトグラフ材料は生体
分子のような物質をそれを含有する混合物から分離する
ことができ、かくしてその単離及び精製に可能にする。
かかるクロマトグラフ材料はまた診断試薬として用いる
こともできる。そのような使用の場合、親和性配位子が
特異的生体分子と同様の相互作用をすることができ、当
業者に公知の方法と組み合わせるときにはかかる生体分
子の検出及び／または定量を行うことができる。
本発明の親和性配位子をその公知のもしくは予期される
適用と共に表１にリストする。親和性プローブ（probe
s）及びその適用の該リストは単なる例示であって、本
発明を実施するのに用いることができる親和性プローブ
は他にも多くある。この観点において、タンパク質及び
ポリペプチドを含む親和性配位子はかかる分子及び
（１）かかるポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸
配列中に存在するかまたはその中で生ずる自然発生性の
対立遺伝子の変化、（２）例えば組換え光学による変異
誘発によってもたらされるタンパク質及びポリヘペプチ
ドのアミノ酸配列の変化（そこではアミノ酸配列中の１
以上のアミノ酸の種々の削除、挿入及び／または置換が
生ずる）、またはかかる親和性配位子を生産する微生物
の古典的変異誘発によってもたらされるポリペプチド及
びタンパク質における変化を包含する。
例えば親和性配位子プロテインＧはストレプトコッカス
から単離された自然発生タンパク質であって、アルブミ
ン及びIgGを結合することが知られている。しかしなが
らプロテインＧは組換えプロテインＧがこのタンパク質
を発現することができる組換え微生物から得ることがで
きるようにクローン化された〔Fahnestock S.R.ら（198
6）、J.Bact.167、870−880〕。加えるに、プロテイン
Ｇの遺伝子配列が組換え技術によってアルブミンに対す
るプロテインＧの特異性を変化させるように修飾され
た。特にこの分子のアルブミンを従わせる能力（the al
bumin binding capacity）がアルブミンに指向した領域
（the albumin bending regions）A1及びA2を削除する
ことによって実質上修飾された。さらに、Ｃ末端膜アン
カー領域（the C−terminal mcmbrane anchor region）
をリジンに富んだＣ−くり返し領域を保持しつつ削除し
た。Fahnestock S.R.（1987）、Trends in Biotechnolo
gy,S,79−83、及びFahnestock S.R.,Biofuture,Januar
y,1988中のNewly Auailable Immunosorbant:Recombinan
t Modified Streptococcal Protein G参照。この修飾し
たプロテインＧはGenox Gaithersbury MarylandからGam
mabind G Type2の商品名で販売されている。
本発明の実施に用いることができる固体保持体はケイ
素、チタン、アルミニウム、バナジウム、ジルコニウム
等の金属の酸化物及び当業者に公知の各種セラミックス
を包含する。さらに架橋ポリスチレン及びポリメタクリ
レートのような種々の高分子樹脂も固体保持体として用
いることができる。
固体保持体の１つの特徴はその圧縮性に関する。換言す
ればクロマトグラフカラム中の特定の固体保持体への適
用圧力が増大と、流速の増加が特定の固体保持体の有用
圧力範囲に亘って観察される。各固体保持体について圧
力の増加が流速の増加を生ぜず、ある場合には観測流速
の減少を引き起こすことがある臨界圧力がある。
「実質上非圧縮性」固体保持体とは約500psi（約35kg/c
m2）より上での圧力の増加で流速の増加を維持する保持
体のことである。かかる固体保持体の例はシリカ、チタ
ニア、アルミナ、バナジア（vanadia）、架橋スルホン
化もしくは硝酸化（ritrated）ポリスチレン等を包含す
る。これらの固体保持体に加え、他の非圧縮性固体保持
体は約200psi（約14kg/cm2）より上で圧力の増加と比例
した流速の増加を維持するものをも包含する。この群に
包含されるものは上記の500psi（約35kg/cm2）より上で
正の流れ特性を有する固体保持体及びポリメタクリレー
ト及びそのコポリマーをはじめとする保持体である。
固体保持体はまたその流れ特性（flow characteristic
s）によって定義することができる。つまり、ここで用
いられる固体保持体は0.1cm/minより大きな線流速を招
来する固体保持体（例えばメタクリレート類）及び好ま
しくは100cm/minより大きな線流速を招来する固体保持
体（例えばセラミックス、及びケイ素、アルミニウム、
チタン、バナジウム等の酸化物）である。
ここで用いられる「多糖類及びその誘導体」はセルロー
ス、アガロース、セファデックス、セファロース等を包
含する。これらの保持体はその圧力では圧縮され易い約
３〜30psi（約0.2〜2kg/cm2）より上では充分な流速を
維持し得ない。
ある場合には固体保持体の孔径（pore sizc）の選択が
クロマトグラフ材料の性能に抗力を及ぼす。例えばプロ
テインＡをPEG分子を介してシリカにカップリングさせ
るときに約500Åの孔径を有するシリカが商業上入手し
うるプロテインＡカラム（実施例13）と比較して増加し
た吸着を示すことが見い出された。しかしながら吸着速
度定数におけるこの増加は60Åの孔径を有するシリカを
用いてプロテインＡをPEG分子を介してカップリングし
た場合には観測させなかった。ゆえに固体保持体の孔径
は具体的な適用に当って特定のクロマトグラフ材料の性
能を最大にするために変化させることができるパラメー
タである。
「実質的に非イオン性の親水性スペーサー」を固体保持
体と親和性配位子の間に共有的に挿入する。このスペー
サーは、重合したときに極性であるがイオン化せずスペ
ーサーを親水性にする部分を含有するスペーサーを生成
するサブユニットのポリマーであればいずれのポリマー
でもよい。
それはポリエチレングリコール、ポリビニルアルコー
ル、ポリプロピレングリコール、ポリエチレンジチオー
ル、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポ
リ（エチレンサクシネート）、及びポリ非イオン性極性
アミノ酸（例えばグリシン、セリン、トレオニン、シス
テイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン及びその
組合せのポリマー）を包含する。かかるスペーサーは少
なくとも骨格原子数（骨格の長さ（a backbone lengt
h））24〜1200個を有することができるが、約500原子よ
り長くないのが好ましく、約90−100原子であるのがも
っとも好ましい。かくして指示した重合度を有する以下
のポリマーを非イオン性の親水性スペーサーとして用い
ることができる。
本発明を実施するのに用いられる好ましい非イオン性親
水性スペーサーはポリエチレングリコールである。ポリ
エチレングリコールは化学品供給会社から購入でき、一
般に平均分子量をもとに売られている。Aldrige Chemic
al社は200（４−mer及び５−merの混合物）、300、40
0、600、1000、1450、2000、3400、8000及び14000ダル
トンの平均分子量を有するPEGを販売している。これら
のポリエチレングリコール中600ダルトンと1450ダルト
ンの間の分子量を有するものが好ましい。
ここで用いられる「結合基」（a binding group）とは
非イオン性親水性リンカーを固体保持体に共有的にカッ
プリングすることができるいずれかの２官能性剤のこと
をいう。そのようなものとしての結合基の選択は主とし
て固体保持体及び非イオン性親水性リンカーの性質によ
って決定される。好ましい結合基は有機カプラー（coup
lers）のために以下に記述する化学結合を生ずる結合基
を包含する。セラミックス、またはケイ素、アルミニウ
ム、チタン、ジルコニウム、バナジウム等の酸化物が固
体保持体であるとき、好ましい結合基は （式中R1はOH、アルキル、置換アルキル、酸化アルキル
（alkyl oxide）、またはケイ素であり、R2は置換アル
キル、ジオール、エーテル、アルキルカルボキシ、アル
キルチオールまたはアルキルオキシである。）である。
このタイプの好ましい結合基はハロアルキルトリクロロ
シラン、イソシアナトアルキルトリアルコキシシラン及
びもっとも好ましくはグリシドキシアルキルトリアルコ
キキシランを包含する。
ここでいう「カップリング基」は親和性配位子を非イオ
ン生親水性スペーサーに共有的に結合するため及び／ま
たは非イオン生親水性スペーサーを固体保持体に共有的
に付加するために用いられる。かくしてＹは以下の化学
結合よりなる群から選ぶことができる。
またＹは上記Ｙ基の２以上のいずれかの組合せであって
もよい。かかるカップリング基を形成する化学試薬の選
択は用いる特定の配位子及び非イオン性親水性リンカー
による。カップリング基Ｙは該親水性スペーサー及び／
または親水性配位子からの１以上の原子を包含すること
ができることは理解されるべきである。かくして、メタ
ンスルホニルクロリドのような化学試薬を用いてポリエ
チレングリコールの末端炭素を１級または２級アミンに
カップリングして、２級または３級アミノカップリング
基を形成させることができる。
ここで用いられる「活性化されたカップリング基」とは
固体保持体にカップリングさせた非イオン性親水性スペ
ーサーに共有的にカップリングされた化学的に反応性の
部分（moiety）をいう。かかる活性化されたカップリン
グ基は親和性配位子をカップリング基を介して該非イオ
ン性スペーサーに共有的に付加するのに用いる上記化学
結合を形成するために用いる。かかる活性化されたカッ
プリング基を含有するクロマトグラフ材料は「活性化さ
れたクロマトグラフ材料」という場合がある。
表２は活性化されたカップリング基Ｙ′を含有する活性
化されたクロマトグラフ材料Ｓ−Ｂ−Ｘ−Ｙ′を形成
し、引き続いて種々の親和性配位子をカップリングさせ
てクロマトグラフ材料Ｓ−Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ｌを形成させる
ことができる種々の経路を例示するものである。この表
において非イオン性親水性リンカーＸはシリカ固体保持
体ＳにPEGカップリングされている。この表は単なる例
示であって、本クロマトグラフ材料の特定の適用によっ
て他の固体保持体、非イオン性親水性リンカー及び活性
化試薬を用いることができることはもちろんである。
〔好ましい態様〕 本発明の以下の好ましい態様は例示であって本発明の範
囲を明らかにまたは暗に限定する性質のものではない。
クロマトグラフ材料の製造 実施例１ 40μエポキシシリカ シリカゲル（Woelm,40μ、100g）を１丸底フラスコに
入れ、150℃にコントロールしたオーブン中で12時間乾
燥した。フラスコを取り出し、栓をし、室温に冷却し
た。メタノール（Karl Fischer級、１）、水4.1ml及
びトリメトキシグリシドキシラン（Petrarch Chemical
s）10.6mlをシリカに。フラスコをゆっくりした回転で2
4時間撹拌した。混合物を粗目の溶解急冷した（fritte
d）ガラスロートを通して濾過し、各200mlのメタノー
ル、水、メタノール及びエーテルで各３回洗浄した。エ
ーテル洗浄後、得られるエポキシシリカゲルをロート上
の吸引によって１時間乾燥した。ついでシリカをオーブ
ン中100℃で１時間乾燥した。
実施例２ 10μブロモプロピルシリカ シリカゲル（Vydac,10μ、10.0g）を500ml丸底フラスコ
に入れ、150℃にコントロールしたオーブン中で12時間
乾燥した。フラスコをオーブンから取り出し、栓をし、
室温に冷却した。トルエン（100ml）、メタノール（0.6
7ml）及びトリクロロブロミルプロピルシラン（trichlo
robromylpropyl silanc）（Petrarch）（1.20ml）を添
加中フラスコに激しく旋回しながら３回に分けて加え
た。ついでフラスコを室温で12時間回転によって撹拌し
た。反応混合物を粗目の溶解急冷ガラスロートを通して
濾過し、各100mlのメタノール、エーテル、メタノール
及びエーテルで各３回洗浄した。エーテル洗浄後、得ら
れるブロモプロピルシリカゲルをロート上の吸引によっ
て１時間乾燥し、ついでオーブン中100℃で１時間乾燥
した。
実施例３ 40μPEG600−エポキシ−シリカ 実施例１の方法によって製造したエポキシシリカ（40.0
g）を250ml丸底フラスコに入れ、約45原子（15−mer）
の長さを有するポリエチレングリコール600（Aldrich C
hemicals）180gを加えた。フラスコをゆっくり回転しな
がら150℃に２時間加熱した。フラスコを室温に冷却
し、エチレングリコールモノメチルエーテル4.82gを加
え、ついでフラスコを150℃でさらに１時間加熱した。
混合物を室温に冷却し、得られるペーストをメタノール
に溶解した。混合物を粗目の溶解急冷ガラスロートで濾
過し、各100mlのメタノール、10％酢酸、水、メタノー
ル及びエーテルで各３回洗浄した。エーテル洗浄後、得
られるPEG600シリカゲルをロート上の吸引によって１時
間乾燥した。ついでシリカをオーブン中100℃で１時間
乾燥した。
実施例４ 40μPEG600−プロピル−シリカ 40μシリカを用いて実施例２の方法によって製造したブ
ロモプロピルシリカ（40.9g）及びジオキサン300mlを、
乾燥窒素導入口、機械的攪拌機、及び還流冷却器として
も役立つ蒸留装置を備えた３つ首350ml丸底フラスコに
入れた。PEG600（Aldrich）55g、及び（15−Croun−
５）9.23gまたはテトラブチルアンモニウムブロミド（S
igma）13.5gを加え、混合物を攪拌モーターで攪拌し
た。フラスコを沸点に加熱し、溶媒約50mlを留去するこ
とによって共沸蒸留で水を除去した。混合物を室温に冷
却し、水素化ナトリウム2.53g（鉱油中60％懸濁液）を
加えた。水素の発生が止んだ後、混合物を２時間還流し
た。フラスコを室温に冷却し、反応混合物を粗目の溶解
急冷ガラスロートで濾過し、各100mlのメタノール、エ
ーテル、メタノール、及びエーテルで各３回洗浄した。
エーテル洗浄後、得られるPEG600−プロピル−シリカゲ
ルをロート上の吸引によって１時間乾燥させた。ついで
PEG600−プロピル−シリカをオーブン中100℃で１時間
乾燥した。
実施例５ 30μ500Å孔PEG600−プロピル−シリカ Amicon Matrex 500Å孔シリカゲルを、実施例２の方法
に従ってピリジン中のトリクロロブロモプロピルシラン
を用いて誘導体化した。ついでこのブロモプロピルシリ
カを実施例４の方法によってプロピレングリコール600
を用いて処理した。
実施例６ 40μナフトイル−PEG600−シリカ 実施例３の方法によって製造したPEG600−エポキシ−シ
リカ（3.04g）を100ml丸底フラスコに入れ、100℃で１
時間加熱した。フラスコを取り付けられた乾燥管で冷却
した。水素化カルシウムで乾燥したピリジン（30ml）を
加え、ついでフラスコを音波発生浴（a bath sonicato
r）中に置くことによってシリカを懸濁させた。ナフト
イルクロリド（31mg、0.16mmole）を加え、混合物を急
速に１分間、ついでゆっくりと２時間旋回した。反応混
合物を粗目の溶解急冷ガラスロートで濾過し、各100ml
のメタノール、エーテル、メタノール及びエーテルで各
３回洗浄した。エーテル洗浄後、得られるナフトイル−
PEG600−シリカゲルをロート上の吸引によって１時間乾
燥した。
実施例７ カルボニルジイミダゾール（CDI）−PEG600−エポキシ
−シリカ PEG600−エポキシ−シリカ（3.0g）を100ml丸底フラス
コ中のジオキサン30mlに懸濁させた。カルボニルジイミ
ダゾール（CDI）（0.365g、0.25mmol,Sigma）を加え、
懸濁液を50℃に30分加熱しながら攪拌した。得られた、
CDIで活性化したシリカゲルを粗目の溶解急冷ガラスロ
ートで濾過し、各100mlのジオキサン及びエーテルで各
２回洗浄した。ゲルをロート上の吸引によって１時間乾
燥した。
実施例８ フェニルボロン酸（PBA）−PEG600−シリカ 実施例７の方法によって製造したCDI−PEG600−エポキ
シ−シリカ（10.0g）を100ml丸底フラスコに入れた。0.
1Mリン酸緩衝液（pH7.5）30ml及びメタ−アミノフェニ
ルボロン酸ヘミサルフェート（Aldrich）0.419gを加
え、混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物を粗目
の溶解急冷ガラスロートで濾過し、各100mlの水、メタ
ノール、エーテル、メタノール及びエーテルで各３回洗
浄した。エーテル洗浄後、得られるPBA−PEG600−シリ
カゲルをロート上の吸引によって１時間乾燥した。
実施例９ プロテインＡ−PEG600−プロピル−シリカ 実施例５の方法で製造したPEG600−プロピル−シリカ
（1.0g）を実施例７の方法によってCDIで活性化した。
ついで乾燥CDIで活性化したシリカをプロテインＡ（Rep
ligen）10.0mgを含有する0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.4）4.0mlに懸濁した。懸濁液を室温で２時間旋回
した。エタノールアミン（20μ）を加え、シリカをさ
らに30分旋回した。ついでシリカゲルを濾過して未反応
のタンパク質及びCDIを除去し、ついでスラリ上向き充
填法（upward slurry packing method）によってHPLCカ
ラムに充填した。
実施例10 オボアルブミン−ヒドラジン−PEG600−シリカ CDIで活性化したPEG600プロピルシリカを実施例４及び
７に示した方法によって製造した。メタノール11mlに溶
解したヒドラジン（0.44ml）をこのCDIで活性化したPEG
600プロピルシリカに加えた。反応容器を手首の部分（a
wrist）に置き、室温で２時間振盪した。液相を焼結ガ
ラスロート上の真空濾過によって除去した。シリカをメ
タノールを用いてていねいに洗浄し、真空乾燥した。糖
タンパク質であるにわとりオボアルブミンは炭水化物部
分の水酸基のアルデヒド官能性（aldchyde functionali
es）への温和な過ヨウ素酸酸化によってカップリングす
るために調製された。オボアルミン（22mg）を0.15M Na
Clを含有する0.17M酢酸ナトリウム（pH5.6）2mlに溶解
した。ついで0.25M過ヨウ素酸ナトリウム10μを該溶
解糖タンパク質に加えた。反応をマグネティックスター
ラーで攪拌しつつ室温で10分進行させ、ついでエチレン
グリコール100μを加えて停止した。２％酢酸への緩
衝液交換はセファテックスＧ−50クロマトグラフィーに
よって行った。5mg/2ml2％酢酸の濃度の酸化オボアルブ
ミンを前記ヒドラジンPEG600シリカに加えた。室温で２
時間振盪後、カップリング反応を焼結ガラスロート上の
液相を除去することによって停止した。得られたシリカ
を10×0.46cm HPLLカラムに充填した。
実施例11 アルデヒド活性化PEGシリカ アルデヒド活性化したPEGシリカをPEG上の末端アルコー
ル基をMoffit酸化によって制限的に酸化することによっ
て製造した。40μPEG600プロピルシリカ（実施例４）
（40.0g）を500ml丸底フラスコ中のDMSO（Aldrich,4Å
分子篩上で乾燥）160ml中に懸濁し、発泡が止むまで混
合物を真空にした。ついで無水酢酸（4.0ml、42.4mmo
l）を加え、混合物を再度２分間真空にした。ついで懸
濁液を丸底フラスコ中ゆるやかに回転しながら室温で２
時間混合した。アルデヒド活性化シリカは350mlの溶解
急例ガラスロース中に注ぎ、ジオキサン160ml（３
回）、エーテル160mlで洗浄し、濾過ロート上空気乾燥
することにより仕上げた。
実施例12 プロテインＧシリカ 実施例11のアルデヒド活性化シリカ（1.0g）を50ml丸底
フラスコ中の、プロテインＧ（Gonex,GammaBind G Type
2）10.0mgを含有する0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（p
H3.5）4.0mlに懸濁した。懸濁液を２分間真空にし、ナ
トリウムシアノボロハイドライド（20.0mg、0.032mmo
l）を加えた。フラスコを２分間真空にし、室温で30分
回転してカップリング反応を完結させた。懸濁液を溶解
急例ガラスロートに注ぎ、シリカを0.1Mリン酸ナトリウ
ム緩衝液、pH7.4で洗浄することによって停止させた。
ついで該シリカを2500psi（約176kg/cm2）で10×0.46cm
HPLCカラムに充填した。
実施例13 抗BSA抗体シリカ 実施例11のアルデヒド活性化シリカ（1.0g）を50ml丸底
フラスコ中の親和性精製抗BSA抗体（BSAカラム上のウサ
ギ抗ウシアルブミンIgG画分〔Organon Tenknika,Cappel
Diu.〕から精製）8.5mgを含有する0.1Mクエン酸ナトリ
ウム緩衝液（pH3.5）4mlに懸濁させた。シリカ、抗体及
び緩衝液混合物を２分間真空にし、２分間音波処理し、
ついで手首振盪機（a wrist shaker）で１時間撹拌し
た。該シリカを水5mlで３回洗浄した。ついでグルコサ
ミン250mgを含有する0.1Mクエン酸ナトリウム緩衝液（p
H3.5）5mlのシリカに加えた。水素化ホウ素ナトリウム1
0mgを加えて、混合物を２分間音波処理し、手首振盪機
で20分撹拌した。ついでシリカを10×0.46cmのカラムに
充填した。
HPACクロマトグラフィー クロマトグラフ材料（典型的には1.1g）をP.A.Bristo
ら、J.Chromatograpry 1977、131、57のスラリー上向き
充填技術を用いて、磨かれた3/16″（約0.48cm）ステン
レススチールカラム（長さ100mm、I.D.4.6mm）に充填し
た。すべてのクロマトグラフ操作は室温（23−25℃）で
行った。ポンプ系はWater Model680段階的制御機によっ
てコントロールされた３台のWaters Model510ポンプよ
りなっていた。この系はModel710B自動サンプリング装
置及びWaters Model481分光光度検出器（spectrophotom
etric detector）を装置していた。データはNelson分析
A/D変換器（a Nelson analyticalA/D converter）で集
め、Nelson分析HPLCソフトウェアを用いるHewlett−Pac
kand300コンピュータで分析した。
実施例14 ジオールシリカのアルカリ劣化及び非特異的吸着 クロマトグラフィーに基づくシリカの分野ではシリカゲ
ルや結合シリカゲルをアルカリ性pH条件にさらすとシリ
カゲルが可溶化することがよく知られている。シロキサ
ン（Si−Ｏ−Si）結合によって結合した、例えばＣ−18
鎖との結合シリカゲルにおいては、そのシロキサン結合
が水酸化物イオンによって攻撃される。この実施例及び
実施例16においてはPEG600−プロピル−シリカのアルカ
リ耐性を実施例１の方法によって製造したエポキシシリ
カの酸加水分解によって製造したジオールシリカのアル
カリ耐性と比較した。
PEG600−プロピル−シリカ及びジオール−シリカに対す
るアルカリの影響、該シリカを充填し、pH10.5の緩衝液
で溶出するHPLCカラム中における過剰の逆圧の増強を観
測することによって比較した。アルカリ条件へさらすこ
とによる逆圧の増加はそのシリカがアルカリによって可
溶化されていることを示す。
増加逆圧の観測に加え、シリカとウシ血清アルブミン
（BSA）との相互作用を測定することによって非特異的
結合を調べた。
この実施例及び実施例15はジオールシリカ及びPEG600−
プロピル−シリカをpH10.5に種々の時間さらした後の、
観測逆圧及びジオールシリカ及びPEG600−プロピル−シ
リカからBSAの回収を記述する。BSA回収はBSAの増加す
る量（４−128μｇ）をHPLCカラムに注入し、溶出したB
SAのピーク面積を測定することによって測定した。ピー
ク面積対注入BSA用量の線形回帰分析（linear regressi
on analysis）は、カラムからのBSAの回収が高いならば
零になるｘ−切片（a uanishing X−intercept）を有す
る線形プロットを示すであろう。少量のBSAがカラムに
保持されている場合は回帰プロットのｘ−切片は＞０と
なるであろう。非特異的なBSA結合の量は回帰プロット
から導かれたｘ−切片によって測定される。
実施例１で製造したエポキシシリカのpH3加水分解によ
って製造した40μジオール−シリカをスラリー上向き充
填装置を用いてHPLCカラムに充填した。カラムをVolco
端管継手を用いてHPLC機器に連結した。カラムに1M水酸
化ナトリウムでpH10.5に調製した0.1M炭酸緩衝液を注入
することによってウシ血清アルブミン（BSA）の回収を
測定した。この緩衝液をポンプの１つに連結した貯槽に
入れ、ポンプにより2ml/minの速度でカラムに流した。B
SAの溶液を調製し上記と同様に注入した。カラムの逆圧
がシリカのかなりの可溶化を示す2000psi（約141kg/c
m2）になったことが認められた5.5時間後に実験を停止
した。第１図の結果はまたかなりの量のBSAがカラム上
に非特異的に保持されていることを示している。
実施例15 PEG600−プロピル−シリカのアルカリ安定性 実施例４の方法によって製造したPEG600−プロピル−シ
リカのカラムを用いる以外は実施例16と同様にして実験
を行った。pH10.5の炭酸緩衝液をポンプでカラムに2ml/
minで22時間流した。この時点で２〜128μｇのBSA試料
をカラムに注入し、ピーク面積を測定した。ピーク面積
対注入量のグラフを第２図に示す。この図面はアルカリ
に22時間さらした後でもBSAの回収率が99％より大きい
ことを示している。このことはPEG600−プロピル−シリ
カが実質的にBSAを非特異的に吸着しないこと、及びPEG
600のシリカへの結合が高pHで安定であることを示して
いる。加えるに、カラムの運転を始めた時に存在したカ
ラム上の初期600psi（約42kg/cm2）逆圧を越えた逆圧は
感知できるほどに成長しなかったことが認められた。
実施例16 プロテインＡ−PEG600−プロピル−シリカのヒトIgG結
合容量 プロテインＡ−PEG600−プロピル−シリカ（実施例９）
の容量を測定するために、このクロマトグラフ材料を含
有するカラムを2ml/minの流速の２％酢酸で15分洗浄
し、ついで2ml/minの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）で15分
間平衡化した。ヒトIgG溶液（1mg/ml）をポンプでカラ
ムに1/2ml/minで流し、カラム溶出液の280nmでの吸光度
を一定値に上がるまで監視した。この時点ではカラムは
IgGで飽和されたものと判断し、カラムを30カラム容量
の0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）で洗浄した。次に２％酢
酸溶液をポンプで流し、カラムの溶出液を集めることに
よってIgGをカラムから脱着した。該流出液を集め、そ
の280nm吸光度と、２％酢酸に既知量のIgGを溶解するこ
とによって調製した検量線（第３図）の吸光度を比較す
ることによって該流出液中のIgGを定量した。
流出液量は23.0mlであり、280nmでの吸光度は0.841であ
った。検量線における回帰係数を用いて、流出液中のIg
G濃度は0.927mg/ml、IgG容量は23.0×0.927 21.3mg IgG
/カラムと算出された。
このカラムと、同じ孔径（500Å）及び短い７原子リン
カーによって結合されたプロテインＡを有するシリカカ
ラムを比較するために、同じ量のシリカ及びほぼ同じ表
面積を有するPierceプロテインＡカラムを用いて同じIg
G容量実験を行った。このカラムの容量は約12mg IgG/カ
ラムであった。
実施例17 非イオン性親水性スペーサーを有するクロマトグラフ材
料はより大きな吸着速度定数を有することが測定され
た。
反応物質に利用できる（available）自由度の数を増加
させることによって、２分子化学反応のエントロピー必
要性が減少することが物理化学においてよく知られてい
る。スペーサーでカップリングした親和性プローブに、
比較的短いリンカー分子を用いてカップリングした親和
性プローブで利用できるよりもより大きな自由度を与え
るため、本発明のスペーサー分子を使用した。
長いスペーサー分子の効果をPEG600を介してプロテイン
Ａをカップリングさせたシリカを用いてテストし、プロ
テインＡを７原子リンカー（３−グリシドキシプロピ
ル）を介してカップリングさせた。Pierce Chemicals
（Rocktord,IL）製のプロテインＡカラムと比較した。
ヒトIgG各1.0mgをカラムに注入し、カラムの間隙容積を
「通り抜ける」溶出ピーク面積を測定することによっ
て、結合ヒトIgGの動力学（kinetics）を測定した。７
原子結合プロテインＡカラム（Pierce）についての積分
ピーク面積はプロテインＡ−PEG600−シリカカラムのそ
れよりも大きいことが第４図の棒グラフより分る、カラ
ムを通してのより大きなピークはプロテインＡをPEG600
分子によってシリカに結合するときより大きくなる。
IgG及びプロテインＡ結合反応の速度定数を導くために
棒グラフデータを動力学分析に付した： Af＋Sf SA Sf＝自由結合部位（mg/gゲル） Af＝自由分析物分子（mg/カラム容量） St＝総結合部位（mg/gゲル） SA＝結合分析物量 ｔ＝反応時間（カラム滞留時間） In〔Af〕＝Kt〔St〕−Kt〔SA〕 （In Af）対をプロットし、線形回帰（linear regress
ion）を分析することによって得られる因子ｋ及びStは
以下の通りである： ｋ＝勾配/t St＝ｙ切片／勾配 第５及び６図はプロテインＡ−PEG600−シリカカラム及
び７原子結合プロテインＡカラムについての比較プロッ
トをそれぞれ示す。カラムを1ml/minで溶出したとき、
前者の勾配は0.32であり後者の勾配は0.18であった。
結合動力学（kinetics）におけるほぼ２倍の効果の重要
性は第４図の棒グラフにおいて図示的に説明される。７
原子結合プロテインＡカラムは工業的利用に必要とされ
る速度でIgGを精製する能力において著しく制限され
る。
実施例18 PBA親和性クロマトグラフィー実験 実施例８の方法によって製造したフェニルボロン酸（PB
A）−PEG600−シリカをHPLCカラムに充填し、1,2−シス
−ジオールまたは、1,2−シス−アミノアルコール官能
基を有する分子を保持する能力を評価した。グリシドキ
シプロピルシランによってシリカにカップリングしたPB
A（Glad,M.ら、J.Chromatograpry（1980）、254−260）
またはセルロースにカップリングしたPBA（Moore,E.C.
ら、Biochemistry,13（1974）、2904−07）を用いて、
シス・ジオールを予め分析した。
ジオールまたはシス−アミノアルコール官能基を含有す
るテスト分子の、PBA−PEG600シリカ含有HPACカラムへ
の吸着をテストした。このカラムをアセトニトリルまた
はリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で溶出した。該化
合物がフェニルボロン酸に結合してカラムから溶出しな
い場合は、移動相をpH4（１％酢酸）に変えて化合物を
溶出した。以下の表はPBA−PEG600−シリカについてテ
ストした分子の行動（behavior）を要約するのみであ
る。
チミジングリコール、チミングリコール、ウラシル、ア
デノシン及びグリコシル化ヘモグロビンがカラムに結合
しないことは予期せざることであった。
実施例19 ５′−ジメトキシトリメチル化合成デオキシリボヌクレ
オチドの親和性単離のためのナフトイル−PEG600−シリ
カの使用 医学研究の開発に大きな影響を与えている遺伝子合成機
は合成におけるカップリング段階での定量的収率より低
い収率に由来する望ましくないより短い配列によって汚
染された（DNA）遺伝子配列を生成する。より短い望ま
しくないDNA配列から５′−DMT保護配列の精製は従来ナ
フトイル化−セルロースによる親和性クロマトグラフィ
ー（Cashion,P.J.,et al.（1973）、Biochem.,12、1985
−1990）によって行われてきた。
５′−ジメトキシトリメチル化した34−men DNA配列及
び脱保護34−men DNA配列のクロマトグラフ単離を示す
クロマトグラムを第７及び８図に示す。この実験に用い
たクロマトグラフ材料は実施例６の方法によって製造し
たナフトイル−PEG600−シリカであった。ナフトイル化
セルロースを用いて得られた結果と定量的に同様なこれ
らの結果は、ナフトイル化セルロースを用いたときに必
要とされた時間よりもむしろ分の単位において全クロマ
トグラムを展開することを可能にする線流速を用いて得
られた。
実施例20 PEG600−スルホン化ポリスチレン スルホン化架橋ポリスチレンをピリジン中のチオニルク
ロリド２当量を用いて０℃で２時間処理することによっ
てそのスルホニルクロリドに変換する。ついで溶媒をデ
カントし、スルホニルクロリド−ポリスチレンをジオキ
サンで２回洗浄する。ついでエチレンジアミン（ジオキ
サン中1:10v/v）を該スルホニルクロリド樹脂の10倍モ
ル加えてスルホンアミド結合１級アミン樹脂に変換す
る。
PEG600−をアミン誘導体化樹脂にカップリングするた
め、PEG4当量をカルボニルジイミダゾール２モル／モル
PEGを用い乾燥ジオキサン中35℃で30分撹拌することに
よって活性化する。ついでこのジオキサン溶液をアミン
誘導体化ポリスチレンに加え、カルボニルジイミダゾー
ル活性化末端を有するウレタン結合PEGを得る（PEG600
−ポリスチレン）。
実施例21 PEG−ポリスチレン上での免疫測定 CDI活性化ポリスチレンを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.4）40ml中のヤギ抗ヒトIgG（Sigma）1.0mgに接触
させる。未反応抗体を同じ緩衝液で３回すすぐことによ
って除去し、抗ヒトIgGがPEGを介して結合したポリスチ
レン表面を得る。未反応のCDI基を5mg/mlグルコースア
ミン4mlを用い室温で30分処理することによって静める
（be queuched）。
ついで抗ヒトIgG−PEGR600−ポリスチレン表面をリン酸
緩衝液中のヒトIgG（Sigma）1ng/mlに５分間接触させ
る。ついで表面を緩衝液で３回すすぐ。ついで抗ヒトIg
G（0.25ml、1mlに希釈、Sigma）アルカリホスファター
ゼ複合物を該表面に５分間接触させる。緩衝液で３回す
すいで未反応抗ヒトIgGアルカリホスファターゼ複合物
を除去する。ついで10mmol/リン酸パラニトロフェニ
ル（Sigma）の4ml溶液を該表面に接触させる。５分後、
ヒトIgGの存在を示す青色が生ずる。陰性コントロール
テストをヒトIgGの代りにウシ血清アルブミンを用いて
行う。
未知試料中のヒトIgG量はある範囲のヒトIgG濃度につい
ての標準分光光度検量線を作成することによって求め
る。ついで未知量のヒトIgGを含有する試料を順次に（s
erially）希釈し、上記のごとく分析してもとの試料中
のヒトIgG量を定量する。
実施例22 オボアルブミンシリカ上でのウサギ抗オボアルブミンIg
G類の精製 オボアルブミンに対して免疫化したウサギの血清を実施
例10のオボアルブミンシリカを充填したカラム（10×0.
46cm）上に荷した。0.15MNaClを含有する0.01Mリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.4）で洗浄することによって未結
合血清成分を除去した。IgGは0.15M NaClを含有する２
％酢酸で溶出した。この実験のクロマトグラムを第９図
に示す。ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動及び抗原結合活性のWestenブロット分析に
よって溶出液の同定を行った。減少した（the reduce
d）酸溶出液のコマッシーブルー（Coomassie blue）で
着色したゲルはＨ鎖IgG及びＬ鎖IgGと同じRf値を主バン
ドを示す（第９図のSDS−PAGE参照）。ひよこ胎芽抽出
結合物（chick mebryo exfract binding）を含有するレ
ーン（lanes）についてのウェスタンブロットはオボア
ルブミンのみへの酸溶出物の結合を示す。
実施例23 プロテインＧシリカのヒトIgG吸着容量 0.15MNaClを含有する0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH
7.4）12mlにヒトIgG（60mg、γ−グロブリン、Sigma）
を溶解した。溶液を、実施例12のプロテインＧシリカを
充填したカラム（10×0.46cm）にポンプで1.0ml/minの
流速で流した。ついでカラムを同一緩衝液80mlで洗浄し
てカラムから未結合IgGを除去した。ポンプでカラムに
0.15MNaCl含有２％酢酸10mlを流してIgGを脱着し、酸溶
出液を集めた。酸溶出液中のIgG量（36mg）はOD280nm吸
光度、及びOD280nm対0.15MNaCl含有２％酢酸中のIgG濃
度の検量線との比較によって求めた。
実施例24 プロテインＧシリカ上のマウス血清からのIgGの精製 正常マウス血清（200μ）を4.0ml/minの流速でプロテ
インＧシリカカラム（10×0.46cm）上に注入した。カラ
ムを0.15MNaCl含有0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
4）で洗浄して未結合血清成分を除去した。IgGは0.15MN
aClを含有する２％酢酸で溶出した。この実験のクロマ
トグラムを第10図に示す。酸溶出ピークの同定はドデシ
ル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳第
（第10図の右側参照）によって行った。
実施例25 プロテインＧシリカ上でのハイブリドーマ上清からIgG
の精製 ハイブリボーマ培養液（10ml）からの上清を流速2.0ml/
minでプロテインＧシリカカラム（10×0.46cm）上に負
荷した。カラムを0.15MNaClを含有する0.01Mリン酸ナト
リウム緩衝液（pH7.4）で洗浄して未結合血清成分を除
去した。IgGは0.15MNaClを含有する２％酢酸で溶出し
た。この実験のクロマトグラムを第11図に示す。酸溶出
ピークの同定はドデジル硫酸ナトリウム−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（第11図、挿入）によって行った。
実施例26 抗BSAカラム上でのBSAの単離 0.15MNaCl含有0.01Mリン酸ナトリウム（pH7.4）中に5mg
/ml BSAを含む50mlを抗BSAカラムに1ml/分の流速で注入
した。カラムを洗浄し、BSAを0.15MNaCl含有２％酢酸を
用い2ml/minで、ついで0.15MNaCl含有20％酢酸を用い2m
l/minで溶出した（第12図）。1ml/minの流速で500μ
のウシ胎児血清を注入し、カラムを洗浄し、BSAを0.15M
NaCl含有２％酢酸を用い2ml/minで溶出した（第13
図）。抗BSAカラムでのBSAの単離は２％溶出試料につい
てのゲル電気泳動によって確認した。
本発明の好ましい態様を記述したが、開示の態様に対す
る種々の修飾が可能であること及びかかる修飾も本発明
範囲内のものとして意図されていることは当業者にとっ
て明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
第１図はpH10.5の緩衝液で53分及び133分処理した後
の、40μジオールシリカを含有するカラムからウシ血清
アルブミンの回収を示す。 第２図はpH10.5の緩衝液で22時間処理した後の、ポリエ
チレングリコール600とカップリングさせた40μシリカ
を含有するカラムからウシ血清アルブミンの回収を示
す。 第３図はPEG−シリカにカップリングさせたプロテイン
Ａを含有するカラムから回収したIgGの量を測定するた
めの検量線である。 第４図は７原子のリンカーを介してシリカに及び45原子
のPEG分子を介してシリカに結合したプロテインＡへの
ヒトIgGの結合を示す。 第５図及び第６図は７原子のリンカー及び45原子のPEG
スペーサーを介してシリカに係合したプロテインＡに結
合するヒトIgGについての片対数動力学的（semi−log K
inetic）プロットを示す。 第７図及び第８図はＳ′−ジメトキシトリチル化した34
単位の一本鎖DNA配列及び保護していない34単位の一本
鎖DNA配列の単離を示すクロマトグラムである。 第９図はオボアルブミンシリカ上のウサギ抗アルブミン
IgGの精製を示すクロマトグラムである。第９図のSDS−
PAGEはオボアルブミンシリカカラムから得られた酸溶出
液の電気泳動移動度を示す。 第10図はプロテインＧシリカ上のマウス血清からのIgG
の分離を示すクロマトグラムである。酸溶出液の電気泳
動移動度を第10図の右側に示す。 第11図はプロテインＧシリカ上のIgGハイブリドーマ上
清液からのIgG精製を示すクロマトグラムである。 第12図は抗BSAシリカカラム上のウシ血清アルブミンの
単離を示すクロマトグラムである。 第13図はウシ胎児血清からウシ血清アルブミンの精製を
示すクロマトグラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−38937（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−66756（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−252489（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−72699（ＪＰ，Ａ)

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式Ｓ−Ｂ−Ｘ（式中、Ｓは実質的に非
    圧縮性の固体保持体、Ｂは結合基、Ｘは、骨格原子数24
    〜1200個の主鎖を含み、実質的に非イオン性の親水性ス
    ペーサーである）を有し、かつＳ、Ｂ及びＸを共有的な
    カップリングすることによって形成されるクロマトグラ
    フ又は吸着材料。
  2. 【請求項２】一般式Ｓ−Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ｌ（式中、Ｙはカ
    ップリング基、Ｌは親和性配位子である）を有し、かつ
    Ｓ、Ｂ、Ｘ、Ｙ及びＬを共有的にカップリングすること
    によって形成される請求項１記載のクロマトグラフ又は
    吸着材料。
  3. 【請求項３】一般式Ｓ−Ｂ−Ｘ−Ｙ′（式中、Ｙ′は活
    性化されたカップリング基である）を有し、かつＳ、
    Ｂ、Ｘ及びＹ′を共有的にカップリングすることによっ
    て形成される請求項１記載のクロマトグラフ又は吸着材
    料。
  4. 【請求項４】固体保持体が金属酸化物、セラミックス及
    び架橋ポリスチレンよりなる群から選ばれる請求項１、
    ２または３記載のクロマトグラフ又は吸着材料。
  5. 【請求項５】固体保持体がシリカであり、Ｘがポリエチ
    レングリコールである請求項１、２または３記載のクロ
    マトグラフ又は吸着材料。
  6. 【請求項６】結合基がグリシドキシアルキルトリアルコ
    キシシラン、ハロアルキルトリクロロシラン及びイソシ
    アナトアルキルトリアルコキシシランよりなる群から選
    ばれる請求項１、２または３記載のクロマトグラフ又は
    吸着材料。
  7. 【請求項７】Ｙがエーテル、ウレタン、トリアジン、チ
    オール、イソチオシアネート、カルボキシル、ジスルフ
    ィド、アミン、シッフ塩基及びアミトよりなる群から選
    ばれる請求項２記載のクロマトグラフ又は吸着材料。
  8. 【請求項８】Ｌがボロン酸、イミノジ酢酸、キナクリ
    ン、アクリジン、スルフヒドリル、プロテインＡ、ジニ
    トロフェニル、ジバクロンブルー、ヘパリン、ゼラチ
    ン、コンカナバリンＡ、モノクローナル及びポリクロー
    ナル抗体及びその断片、レクチン類、ポリ（Ｕ）、ポリ
    （Ａ）、リジン、５′−AMP、２′、５′−ADP、アフィ
    ゲルブルー、有機水銀化合物、プロシオンレッド染料、
    ビオチン、アビジン、カルモジュリン、オリゴdT、オリ
    フェニルメチル、ナフトイル化合物及び抗原よりなる群
    から選ばれる請求項２記載のクロマトグラフ又は吸着材
    料。
  9. 【請求項９】Ｙ′が下記の活性化されたカップリング基
    よりなる群から選ばれる請求項３記載のクロマトグラフ
    又は吸着材料。
  10. 【請求項１０】溶液中に含まれる少なくとも１つの物質
    を分離する方法であって、 （ａ） 該溶液を請求項２又は８記載の材料（式中、Ｌ
    は該物質を該材料に結合させる親和性配位子である）と
    接触させる工程、及び （ｂ） 該材料に結合した物質から上記溶液を分離する
    工程を含む方法。
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