JPH0771495B2 - 大腸菌による蛋白分泌生産の方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、枯草菌の発現分泌系を
大腸菌で利用して有用物質の分泌生産を行うための遺伝
子組換え技術を利用した方法に関し、なかでも、農医薬
品の遺伝子組換え技術を利用した分泌生産に好適な方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】大腸菌は、遺伝子組換え実験における宿
主として安全性評価が最初に認定された細菌であり、他
の細菌に比べて形質転換が簡単でその効果も高く、更に
大腸菌を用いた各種物質の生産における生産性の向上を
目的とした多くの知見が明らかとされており、宿主とし
ての実用性の高い細菌と考えられている。

【０００３】しかしながら、外来タンパク質遺伝子を大
腸菌で発現させて、外来タンパク質を菌体内に生産させ
たり、菌体外に分泌させた場合、得られたタンパク質が
ペリプラズマであることが多いので、その精製には工程
数が増し、作業が煩雑となる。

【０００４】また、例えば、J. Bacteriol., 156, 949
(1983)、Eurr. J. Appl. Microbiol., 18, 339 (1983)
等に大腸菌から外来タンパク質を菌体外に分泌させる方
法が開示されているが、分泌量が少なく、こられの方法
は必ずしも実用的な方法とはいえない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、枯草
菌の発現分泌系を利用して大腸菌での外来有用タンパク
質の高分泌生産を可能とする組換え発現分泌プラスミ
ド、該プラスミドを有する大腸菌形質転換体、及び該大
腸菌形質転換体を用いた有用タンパク質の高分泌生産方
法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の組換え発現分泌
プラスミドは、 ａ）プロモーター、リボゾーム結合部位及び分泌シグナ
ルをコードする領域を含む塩基配列と、 ｂ）該塩基配列に機能的に連結された所望のタンパク質
をコードする構造遺伝子と、 ｃ）大腸菌での複製のための複製オリジンとを有し、前
記プロモーター、リボゾーム結合部位及び分泌シグナル
をコードする領域が、バチルス アミロリキファシエン
スの中性プロテアーゼ遺伝子のものであることを特徴と
する。

【０００７】上記塩基配列ａとしては、バチルス アミ
ロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子由来のプ
ロモーター、リボゾーム結合部位（シャイン・ダルカー
ノ配列；ＳＤ配列）及び分泌シグナルをコードする領域
を含むものが利用される。

【０００８】なお、プロモーターとは、ＲＮＡポリメラ
ーゼが認識し結合する領域を指し、リボソーム結合部位
とはＲＮＡポリメラーゼにより合成されたｍＲＮＡがリ
ボゾームと結合する部分をコードする領域をいう。ま
た、分泌シグナルとは、菌体外に分泌されるタンパク質
（成熟タンパク質）の菌体内で生産される前駆体のＮ末
端部分のポリペプチドをいい、成熟タンパク質が菌体外
に分泌される過程で除去され、成熟タンパク質の細胞膜
通過において重要な役割を果していると考えられている
ものである。

【０００９】この塩基配列（ａ）としては、例えば、プ
ラスミドｐＮＰＡ２２５（特開平１−２７３５９１号公
報）の有するバチルス アミロリキファシエンスの中性
プロテアーゼ遺伝子由来のプモーター、リボゾーム結合
部位及び分泌シグナルをコードする領域を含む部分を利
用することができる。

【００１０】また、大腸菌での複製のための複製オリジ
ン（ｃ）としては、種々の大腸菌等に由来するプラスミ
ドの有する複製オリジンが利用できる。このような複製
オリジンとしては、たとえば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
３、ｐＵＣ１９の有するものなどが利用できる。

【００１１】本発明の組換え発現分泌プラスミドは、例
えば、複製オリジン（ｃ）を有するプラスミドに上記の
塩基配列（ａ）及び所望のタンパク質をコードする構造
遺伝子（ｂ）を機能的に連結して組み込んで構築するこ
とができる。ここで、塩基配列（ａ）と構造遺伝子
（ｂ）とを機能的に連結するとは、構造遺伝子（ｃ）に
コードされたタンパク質の発現・分泌が塩基配列（ａ）
によってなされるように、その位置関係を選択してこれ
らを連結することをいい、例えば、必要に応じて適当な
リンカーを介在させて、塩基配列（ａ）における分泌シ
グナルをコードする領域の下流（３’端側）に構造遺伝
子（ｂ）を連結することで達成できる。

【００１２】塩基配列（ａ）及び構造遺伝子（ｂ）を組
み込むプラスミドとしては、上述のｐＢＲ３２２、ｐＵ
Ｃ１３、ｐＵＣ１９等のプラスミド及びこれらから誘導
された各種プラスミドなどが利用できる。これらのプラ
スミドとしては、市販されているものなどが使用でき
る。

【００１３】構造遺伝子（ｂ）としては、大腸菌で分泌
生産させたいタンパク質をコードするものが利用され
る。本発明においては、種々のタンパク質の分泌生産を
行うことができるが、本発明の組換え発現分泌プラスミ
ドは、例えば、α１−アンチトリプシン、インシュリン
様成長因子、エグリン、ニワトリ卵白シスタチン、シス
タチンＣ、シスタチンＳ、ウシ成長ホルモン、ヒト成長
ホルモン、ヒトすい分泌性トリプシン阻害物質、ヒト分
泌性白血球タンパク分解酵素阻害物質、腫瘍壊死因子、
神経細胞増殖因子など分泌性タンパク質の大腸菌での分
泌生産に好都合である。

【００１４】なお、本発明の組換え発現分泌プラスミド
には、所望に応じて、選択マーカー遺伝子、ターミネー
ター、誘導発現を行うための領域などの各種の遺伝子や
塩基配列を組合せて用いることができる。

【００１５】上記構成の本発明の組換え発現分泌プラス
ミドによって宿主大腸菌を形質転換することにより、所
望のタンパク質の分泌生産のための形質転換体を得るこ
とができる。

【００１６】宿主としては、例えば、大腸菌ＭＣ１０６
１株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０５株、ＪＭ１０９株、Ｄ
Ｈ５α株及びＪＥ５５０５株などを用いることができ
る。

【００１７】この形質転換体を培養して、該形質転換体
の有するの組換え発現分泌プラスミドに組み込んだ構造
遺伝子にコードされたタンパク質の分泌生産を行うこと
ができる。

【００１８】本発明の組換え発現分泌プラスミドが導入
された大腸菌形質転換体は、宿主の大腸菌と変りなく同
様の条件で容易かつ良好に培養できる。

【００１９】該形質転換体の培養は、例えば、１×ＬＢ
（１％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母エキス、
０．５％ＮａＣｌ）などの液体培地を利用することがで
き、必要に応じて各組成分の濃度は適宜選択できる。ま
た、培地には、必要に応じてグルコースなどの菌体の増
殖や維持などに利用される物質や、形質転換体のスクリ
ーニングや選択マーカーでの選択のたの物質（抗生物質
等）などを添加することができる。

【００２０】培養温度には特別の制限はないが、通常３
７℃が好都合である。

【００２１】該形質転換体の培養によって培養上清に分
泌されたタンパク質は、ゲル濾過、イオン交換カラムク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）などを用いた各種分離精製方法によって所望の精
製度で回収することができる。

【００２２】

【実施例】

実施例１２２キロダルトン ヒト成長ホルモン（２２ＫｈＧＨ）構
造遺伝子を含むＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片の
調製（図２参照）ｈＧＨの成熟タンパク質をコードする
公知のＤＮＡ塩基配列（以下単にｈＧＨ遺伝子という）
の５’末端側（該タンパク質のＮ末端をコードする側）
にＥｃｏＲＩ及びＳｔｕＩ切断部位を、またその３’末
端側（該タンパク質のＣ末端をコードする側）にＢａｍ
ＨＩ切断部位を設けた合成ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩと
ＢａｍＨＩとで消化したｐＢＲ３２２ベクターに組み込
んで構築したプラスミドｐＨＧＨ１０で大腸菌ＨＢ１０
１株を常法により形質転換して形質転換体を得た後、こ
れを１×ＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％バ
クト酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、５０
μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含む）５００ｍｌに植
菌し、３７℃で一晩培養した。

【００２３】培養菌体を集菌、洗浄し、アルカリ法によ
り菌体からプラスミドＤＮＡを回収した。

【００２４】次に、回収したプラスミドＤＮＡ（約２０
０μｇ）に、１０×高緩衝液［１ＭＮａＣｌ、０．５Ｍ
Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＭｇＣｌ
₂ 、１０ｍＭ ＤＴＴ］１２μｌ及び制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＨｉｎｄＩＩＩ（共に宝酒造製）各々７単位を加
え、これに水を加えて全量を１２０μｌとし、３７℃で
一晩反応させた。

【００２５】反応終了後、反応液を尿素を含まない５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけ
て、目的とするｈＧＨ遺伝子を含むＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片（小断片）を含む部分のゲルを切り取り、
これにＤＮＡ回収液［０．５Ｍ酢酸ナトリウム、１０ｍ
Ｍ酢酸マグネシウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウ
ム（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．５］の１．５ｍｌを加えて一
晩ゆっくり室温で振とう混合した後、ＤＮＡ回収液中か
らＤＮＡ断片をセルロースＤＥ−５２（ワットマン社
製）を用いて回収し、得られた回収品に水４５μｌを加
えてから、フェノール、クロロホルム抽出後、エタノー
ル沈殿を行い、目的とするｈＧＨ遺伝子を含むＥｃｏＲ
Ｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を沈殿物として得た。

【００２６】続いて、１０×高緩衝液５μｌにＳｔｕＩ
（宝酒造製）８単位、及び水を加えて全量を５０μｌと
し、３７℃、一晩反応させた。フェノール、クロロホル
ム抽出後、エタノール沈殿を行い、目的とするＳｔｕＩ
−ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片を得た。

【００２７】実施例２ ベクターＤＮＡ断片の調製（図１及び図２参照） 枯草菌形質転換体ＭＴ４３０（ｐＮＰＡ２２５）（特開
平１−２７３５９１号公報、ＦＥＲＭ ＢＰ−１０７
９）をカナマイシンを終濃度で５μｇ／ｍｌとなるよう
に加えた２×ＬＢ培地（２％バクトトリプトン、１％バ
クト酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）の５００
ｍｌに植菌し、３０℃、２０時間ゆるやかに振とう培養
した。

【００２８】培養終了後、培養液を８０００ｒｐｍ、４
℃、１０分間遠心して菌体を培養上清から分離し、分離
された菌体から、常法[H. C. Brinboim and J. Poly: N
ucleic Acid Res., 7, 15131 (1979)]に従ってプラスミ
ドＤＮＡ（ｐＮＰＡ２２５）を回収した。

【００２９】次に、このプラスミドＤＮＡ（約１００μ
ｇ）に、１０×高緩衝液の６μｌ、ＳｔｕＩ（宝酒造
製）１０単位、ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造製）１０単位を
加え、さらに水を加えて全量を６０μｌとして、３７℃
一晩反応させた。続いて、微生物由来のアルカリフォス
ファターゼ（ＢＡＰ、宝酒造製）１０単位、１Ｍ Ｔｒ
ｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．０）１０μｌを添加し、最後に水
を加えてその全量を２００μｌとし、３７℃、２時間反
応させ、常法による脱リン酸化反応を行った。

【００３０】反応終了後、反応液をフェノール、クロロ
ホルムで抽出し、エタノール沈殿を行い、ベクターＤＡ
Ｎ断片を沈殿物として得た。これをＴ₁₀Ｅ₁ 緩衝液［１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ］１０００μｌに溶解させてベクターＤＮＡ断片溶
液とし、以下の操作に用いた。

【００３１】なお、このベクターＤＮＡ断片は、図１に
示したｐＮＰＡ２２５のａ部分に相当し、バチルス ア
ミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子のプロ
モーター（Ｐｍ）、リボゾーム結合部位（ＳＤ）及び分
泌シグナルをコードする領域（Ｉ）を含む塩基配列を有
する。

【００３２】実施例３ プラスミドｐＮＰＧ５の構築（図２参照） 実施例１で得たｈＧＨ遺伝子を含むＳｔｕＩ−Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片沈殿物に実施例２で得たベクターＤＮＡ断片
溶液の２μｌを加えて得た混合液に、さらにＤＮＡ溶液
［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ ］の１μｌ、ＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造製、Ｎｏ．６０２１）のＡ液２４μｌ及びＢ液
３μｌを加え、１６℃で３時間反応させた。

【００３３】次に、得られた反応液を用いて、枯草菌Ｍ
Ｔ４３０株をＣｈａｎｇらのプロトプラスト法［Chang,
S. and Cohen, S. N. : Mol. Gen. Genet., 168, 111
(1978)］に従って形質転換した。なお、プロトプラスト
の再生培地にはカナマイシンを最終濃度で１５０μｇ／
ｍｌとなるように加えた。得られた形質転換体からプラ
スミドＤＮＡを常法により調製した。

【００３４】このプラスミドＤＮＡの一部を用い、種々
の制限酵素でのＰＡＧＥ上での分解パターンの分析、及
び種々の制限酵素での処理によって得られたＤＮＡ断片
のＤＮＡシークエンスの解析を行った結果、得られたプ
ラスミドＤＮＡは、ｐＮＰＡ２２５の図１に示したＳｔ
ｕＩとＨｉｎｄＩＩＩの間の領域が、ｈＧＨ遺伝子を含
むＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に置き換わった組換え
プラスミドｐＮＰＧ５であることが確認された。

【００３５】実施例４ 発現プラスミドｐＨＧＥ１９５の構築（図３参照） 実施例３で得られプラスミドＤＮＡ（組換えプラスミド
ｐＮＰＧ５）の約２００μｇに１０×高緩衝液の１２μ
ｌ、ＡｖａＩ（宝酒造製）の７単位を加え、最後に水を
加えてその全量を１２０μｌとして、３７℃、一晩反応
させた。

【００３６】次に、得られた反応液にＮａＣｌ濃度が１
５０ｍＭとなるように、１００ｍＭＮａＣｌ溶液を追加
後、ＳｐｈＩ（宝酒造製）の６単位を加え、さらに一晩
反応させた。

【００３７】反応終了後、反応液を尿素を含まない５％
ＰＡＧＥにかけて目的とするＤＮＡ断片（小断片）を含
むバンド部分のゲルを切り取り、実施例１と同様に処理
して、バチルス アミロリキファシエンスの中性プロテ
アーゼ遺伝子のプロモーター、リボゾーム結合部位及び
分泌シグナルをコードする領域を含む塩基配列を有する
ＤＮＡ断片の下流（３’端側）に、ｈＧＨ遺伝子を含む
ＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片が連結した構成を有する
ＡｖａＩ−ＳｐｈＩＤＮＡ断片を得た。

【００３８】一方、ｐＣＵ１９（宝酒造製）ＤＮＡ約１
００μｇを上記と同様にしてＡｖａＩ及びＳｐｈＩで処
理した後、常法に従って、脱リン酸化酵素（ＢＡＰ）処
理し、フェノール、クロロホルム抽出後、エタノール沈
殿を行い、ベクターＤＮＡ断片を沈殿物として得た。こ
の沈殿物をＴ₁₀Ｅ₁ 緩衝液１００μｌに溶解させてベク
ターＤＮＡ断片溶液を得た。

【００３９】続いて、このベクターＤＮＡ断片溶液の２
μｌと、先に得たＡｖａＩ−ＳｐｈＩＤＮＡ断片の全量
を混合し、実施例３と同様にしてＤＮＡライゲーション
キットを用い、ライゲーション反応を行った後、得られ
た反応液をそのまま大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル
（宝酒造製、Ｎｏ．９０５２）２００μｌに加えて氷水
中に３０分間保った。

【００４０】次に、この混合液を４５℃で４５秒加温
後、これに更に１×ＬＢ培地の１ｍｌを加えて３７℃、
１時間保ち、その適当量を、４０μｇ／ｍｌ濃度のアン
ピシリンを含む１×ＬＢアガープレートの数枚に塗り、
これを３７℃で一晩保った。

【００４１】アガープレートに現われた形質転換体６株
を１×ＬＢ培地２０ｍｌに植菌し、３７℃で一晩培養し
た後、実施例１と同様にしてプラスミドＤＮＡを調製し
た。

【００４２】得られたプラスミドＤＮＡの一部を用い、
種々の制限酵素で消化した後のＰＡＧＥ上での分解パタ
ーンを分析した。更に、培養液から常法に従ってタンパ
ク質を得た後、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したとこ
ろ標品の移動率と一致するバンドが確認された。以上の
分析結果から、得られたプラスミドＤＮＡは、図３に示
す構成のプラスミドｐＨＧＥ１９５であることが確認さ
れた。

【００４３】得られたｐＨＧＥ１９５で、さらに、大腸
菌ＪＭ１０５、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１をそれぞれ常
法により形質転換し、３種の形質転換体を得た。

【００４４】実施例５ 大腸菌ＨＢ１０１をプラスミドｐＨＧＥ１９５で形質転
換して得た形質転換体の培養 実施例４で得た大腸菌ＨＢ１０１をプラスミドｐＨＧＥ
１９５で形質転換して得た形質転換体ＨＢ１０１（ｐＨ
ＧＥ１９５）株を、１×ＬＢ培地２０ｍｌに植菌し、３
７℃で１５０ｒｐｍの振とう条件で一晩振とう培養し
た。培養終了後、培養液を遠心にかけて９０μｌの培養
上清を採取した。この培養上清にトリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）の１０μｌ（終濃度１０％）を加え、４℃、３０分
間放置後遠心し、得られた沈殿物を少量のアセトンで洗
浄して乾燥させた。

【００４５】続いて、この沈殿物の一部を、少量のＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ緩衝液（０．２５ＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、４％
ＳＤＳ、１０％メルカプトエタノール、２０％グリセリ
ン、ｐＨ６．８）に溶解させ、これを１８％ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ（テフコ社製）で分析した結果、ｈＧＨ標品と移
動率が一致するタンパク質の存在がみられた。さらに先
に得た沈殿物のｈＧＨ活性を測定したところ、ｈＧＨ標
品と同様のｈＧＨ活性を有するものであった。したがっ
て、これらの分析から、上記の培養液中に目的とするｈ
ＧＨが分泌されたことが確認された。

【００４６】実施例６ リンカーＤＮＡ断片の合成とその精製 下記の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ断片Ｌ₄₃、Ｌ₄₄を
フォスホアミダイド法により全自動合成機（アプライド
バイオシステム社製）で合成した。 Ｌ₄₃ 5′CCTCTTCTCCGGGCAAACCGCCGCGTTTAGTTGGCG 3 ′ （配列番号：１） Ｌ₄₄ 5′GGCCGCCAACTAAACGCGGCGGTTTGCCCGGAGAAGAGG 3′（配列番号：２） なお、各一本鎖ＤＮＡ断片の精製は、以下の操作によっ
て行った。

【００４７】合成終了後、反応生成物を容器に移し、濃
アンモニア水１．５ｍｌを加え、密栓して室温で１時
間、更に５５℃で一晩反応させた後、反応物を濃縮乾燥
固した。これを水に溶かし、７Ｍ尿素含有２０％ＰＡＧ
Ｅにかけ、目的とする１本鎖ＤＮＡ断片を含むゲル部分
を切り出し、これにＤＮＡ回収液１．５ｍｌを加えて一
晩ゆっくり室温で振とう混合した後、ＤＮＡ回収液中か
ら１本鎖ＤＮＡ断片をセルロースＤＥ−５２（ワットマ
ン社製）を用いて分離、精製した。

【００４８】実施例７ ２本鎖リンカーの調製（図４参照） 実施例６で得られた１本鎖ＤＮＡ断片Ｌ₄₃、Ｌ₄₄の１μ
ｇずつを合せ、これにＴ₄ ポリヌクレオチドキナーゼ
（宝酒造製）７単位、１０ｍＭ ＡＴＰ５μｌ、１０×
リン酸化溶液（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ７．
５）、１００ｍＭＭｇＣｌ₂ 、５ｍＭジチオスレイトー
ル（ＤＴＴ）、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）５μｌに水を加
えて全量を５０μｌとし、３７℃、１５時間反応させた
後、反応液を３分間、９５℃に加熱後、ゆっくり室温ま
で冷却したのち、反応混合物を濃縮乾固し、２本鎖リン
カー（ＳｔｕＩ−Ｃｆｒｌ３ＩＤＮＡ断片）を得た。

【００４９】実施例８ シスタチンＣ遺伝子を含むＤＮＡ断片の調製（図４参
照） 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１（ｐＴＰＩ−２０１）（特
開昭６４−７４９８８号公報）をアンピシリン終濃度４
μｇ／ｍｌとなるように加えた１×ＬＢ培地２０ｍｌに
植菌し、３７℃、一晩振とう培養した。

【００５０】得られた培養液から集菌し、常法によりプ
ラスミドＤＮＡを回収し、このプラスミドＤＮＡの約２
００μｇに反応溶液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍ
ＭＴｒｉｓ・Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＭｇＣｌ
₂ 、１０ｍＭ ＤＴＴ）の１２μｌ、ＥｃｏＲＩ及びＨ
ｉｎｄＩＩＩ（ともに宝酒造製）各々７単位を加え、最
後に水を加えて全量を１２０μｌとして、３７℃、一晩
反応させた。

【００５１】得られた反応混合物を尿素を含まない５％
ＰＡＧＥにかけ、目的とするＤＮＡ断片を含むゲル部分
を切り出し、実施例１と同様に処理し、セルロースＤＥ
−５２での回収品に水４５μｌを加えて、フェノール、
クロロホルム抽出後、エタノール沈殿を行い、シスタチ
ンＣ遺伝子（成熟タンパク質をコードする構造遺伝子）
を含むＤＮＡ断片を得た。

【００５２】続いて、これを上記組成の反応溶液５μｌ
に溶かし、Ｃｆｒｌ３Ｉ（宝酒造製）７単位を加え、更
に水を加えて全量を５０μｌとして、３７℃、１．５時
間の反応を行った後、尿素を含まない５％ＰＡＧＥにか
けて前述と同様の処理を行って、精製された目的とする
シスタチンＣ遺伝子を含むＣｆｒｌ３Ｉ−ＨＩｎｄＩＩ
ＩＤＮＡ断片を得た。

【００５３】実施例９ ２本鎖リンカーの、シスタチンＣ遺伝子を含むＣｆｒｌ
３Ｉ−ＨＩｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片への結合（図４参照） 実施例７で得られた２本鎖リンカーに実施例８で得たシ
スタチンＣ遺伝子を含むＣｆｒｌ３Ｉ−ＨＩｎｄＩＩＩ
ＤＮＡ断片を合せ、実施例３と同様にしてＤＮＡ溶液３
μｌ、ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造社製、Ｎ
ｏ．６０２１）Ａ液２４μｌ、Ｂ液３μｌを加え、１６
℃、３時間反応させた。フェノール、クロロホルムで抽
出後、エタノール沈殿を行い、目的とするＤＮＡ断片
（ＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）を得た。

【００５４】実施例１０ プラスミドｐＮＰＣ２の構築（図４参照） 実施例９で得たＤＮＡ断片全量に、実施例２で調製した
ＤＮＡ断片溶液の２μｌを加え、実施例３と同様にＤＮ
Ａライゲーションキットを用いてライゲーションを行っ
た後、枯草菌ＭＴ４３０株をＣｈａｎｇらのプロトプラ
スト法に従って形質転換した。

【００５５】なお、プロトプラストの再生培地にはカナ
マイシンを最終濃度で１５０μｇ／ｍｌとなるように加
えた。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを常法
により調製した。

【００５６】このプラスミドＤＮＡの一部を用い、種々
の制限酵素でのＰＡＧＥ上での分解パターンの分析、及
び種々の制限酵素での処理によって得られたＤＮＡ断片
のＤＮＡシークエンスの解析を行った結果、得られたプ
ラスミドＤＮＡは、ｐＮＰＡ２２５の図１に示したＳｔ
ｕＩとＨｉｎｄＩＩＩの間の領域が、前述のシスタチン
Ｃ遺伝子を含むＤＮＡ断片に置き換わった組換えプラス
ミドｐＮＰＣ２であることが確認された。

【００５７】実施例１１ 発現プラスミドｐＣＣＥ１９２の構築（図５参照） 実施例１０で得られたＭＴ４３０（ｐＮＰＣ２）株をカ
ナマイシンを終濃度５μｇ／ｍｌとなるように加えた２
×ＬＢ培地２０ｍｌに植菌し、３０℃、一晩ゆるやかな
振とう培養を行った。

【００５８】培養液から集菌し、常法に従ってプラスミ
ドＤＮＡ（ｐＮＰＣ２）を回収し、その約２００μｇに
１０×高緩衝液１２μｌ、ＡｖａＩ（宝酒造製）７単位
を加え、更に水を加えて全量を１２０μｌとして、３７
℃、一晩反応させた。続いて、これにＮａＣｌを終濃度
が１５０ｍＭとなるように１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液を
追加後、ＳｐｈＩ（宝酒造製）６単位を加え、一晩反応
させた。

【００５９】得られた反応混合液を尿素を含まない５％
ＰＡＧＥにかけ、実施例１と同様に処理し、バチルス
アミロリキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子のプ
ロモーター、リボゾーム結合部位及び分泌シグナルをコ
ードする領域を含む塩基配列の下流にシスタチンＣ遺伝
子が連結した構成を有するＡｖａＩ−ＳｐｈＩＤＮＡ断
片を得た。

【００６０】一方、ｐＣＵ１９（宝酒造製）ＤＮＡ約１
００μｇを上記と同様にしてＡｖａＩ及びＳｐｈＩで処
理した後、常法に従って、脱リン酸化酵素（ＢＡＰ）処
理し、フェノール、クロロホルム抽出後、エタノール沈
殿を行い、ベクターＤＮＡ断片を沈殿物として得た。こ
の沈殿物をＴ₁₀Ｅ₁ 緩衝液１００μｌに溶解させてベク
ターＤＮＡ断片溶液を得た。

【００６１】続いて、このベクターＤＮＡ断片溶液の２
μｌと、先に得たＡｖａＩ−ＳｐｈＩＤＮＡ断片の全量
を混合し、実施例３と同様にしてＤＮＡライゲーション
キットを用い、ライゲーション反応を行った後、得られ
た反応液をそのまま大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル
（宝酒造製、Ｎｏ．９０５２）２００μｌに加えて、氷
水中に３０分間保った。

【００６２】次に、この混合液を４５℃で４５秒加温
後、これに更に１×ＬＢ培地の１ｍｌを加えて３７℃、
１時間保ち、その適当量を、４０μｇ／ｍｌ濃度のアン
ピシリンを含む１×ＬＢアガープレートの数枚に塗り、
これを３７℃で一晩保った。

【００６３】アガープレートに現われた形質転換体［Ｊ
Ｍ１０９（ｐＣＣＥ１９２）、ＦＥＲＭ ＢＰ−３１６
７］を実施例４と同様にして培養し、プラスミドＤＮＡ
を調製した。得られたプラスミドＤＮＡの一部を用い、
種々の制限酵素でのＰＡＧＥ上での分解パターンの分
析、及び活性測定を行った結果、得られたプラスミドＤ
ＮＡは、図５に示す構成のプラスミドｐＣＣＥ１９２で
あることが確認された。

【００６４】実施例１２ 発現株の造成 実施例１１で得られたプラスミドｐＣＣＥ１９２のＴ10
Ｅ1 緩衝液溶液の２μｌと大腸菌ＪＭ１０５コンピテン
トセル（宝酒造製）２００μｌを用いて実施例１１と同
様にして形質転換体を得た。

【００６５】さらに、大腸菌ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１
のコンピテントセル（ともに宝酒造製）各々２００μｌ
をそれぞれ用いて同様の操作により形質転換体を得た。

【００６６】実施例１３ プラスミドｐＣＣＥ１９２を含む大腸菌形質転換体の培
養と分泌されたシスタチンＣの精製 実施例１２で得た大腸菌形質転換体ＨＢ１０１（ｐＣＣ
Ｅ１９２）株を１×ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌ濃度のア
ンピシリンを含む）の２０ｍｌに植菌し、３７℃、一晩
培養した。

【００６７】培養終了後、培養液全量を新鮮な１×ＬＢ
培地（５０μｇ／ｍｌ濃度のアンピシリンを含む）の５
００ｍｌに混合し、３７℃、１５０ｒｐｍの振とう条件
で一晩更に振とう培養した後、培養上清（４５０ｍｌ）
を遠心分離により分取した。

【００６８】次に、この培養上清に硫安を終濃度が８０
％飽和となるように添加し、４℃、３時間攪拌した。得
られた沈殿を、１２０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離
で回収し、これを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ・Ｃｌ（ｐＨ８．
５）５０ｍｌに溶解し、同緩衝液で平衡化したＤｏｗｅ
ｘ・１−Ｘ２カラム（２．８ｃｍφ、５ｃｍ）にかけ素
通し画分と、同緩衝液での洗浄画分を合せて１００ｍｌ
を得、これをシスタチンＣ含有画分とした。

【００６９】次に、このシスタチンＣ含有画分に８０％
飽和となるように硫安を添加し、４℃、３時間攪拌し
た。１２０００ｒｐｍ、２０分間遠心後、沈殿物を水３
ｍｌに溶かし、５０ｍＭリン酸緩衝液液（ｐＨ６．８）
で平衡化したセファデックスＧ−５０カラム（１．４ｃ
ｍφ、８２ｃｍ）にかけ、同緩衝液で溶出させた。

【００７０】各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥや酵素
活性の測定（実施例１４参照）で確認し、目的とするシ
スタチンＣ含有フラクションＮｏ．３４〜３７までを集
め約７０％の回収率でＳＤＳ−ＰＡＧＥでの単一バンド
の目的物を得た。

【００７１】このフラクションをギ酸緩衝液（ｐＨ２．
５）中で、透析し、凍結乾燥後アミノ酸分析（アプライ
ドバイオシステム社４７０Ａ型）を行った結果、これが
目的物であることを確認した。

【００７２】実施例１４ 活性測定法 ６μｇ／ｍｌ濃度に調製したパパイン水溶液（シグマ社
製）２０μｌ、０．２Ｍシステイン水溶液４０μｌ及び
５０ｍＭリン酸緩衝液反応用液（ｐＨ６．８）１８７０
μｌを合せ、これにサンプル溶液２０μｌを加え、室温
で３０分間反応させた後、２０μＭに調製したシスタチ
ンＣ活性測定用基質（Ｚ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡペプ
チド研究所製）水溶液５０μｌを加えすばやく蛍光光度
計（日本分光ＳＰ−７７０型）で測定した。ＥＸ３７０
ｎｍ、ＥＭ４４０ｎｍで測定した。シスタチンＣの量
は、活性型パパインとシスタチンＣとが一対一で結合す
ると仮定して、実測値から計算して求めた。

【００７３】実施例１５ ＨＢ１０１（ｐＣＣＥ１９２）株のグルコースを含有す
る液体培地での培養 実施例９で得た大腸菌形質転換体ＨＢ１０１（ｐＣＣＥ
１９２）株を、２×ＬＢＧ培地（２％バクトトリプト
ン、１％バクト酵母エキス、１％ＮａＣｌ、０．２％グ
ルコース、終濃度５０ｍｇ／ｍｌのアンピシリン）２０
ｍｌに植菌し、３７℃で一夜培養した。

【００７４】培養液から遠心により培養上清を採取し、
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）で適当濃度に希釈
し、サンプル溶液とした。

【００７５】実施例１４に示した方法で活性を測定した
結果、この培養上清には活性換算で約１２０ｇ／ｌのシ
スタチンＣが分泌、蓄積されたことが認められた。

【００７６】また、２×ＬＢＧ培地２０ｍｌで３７℃、
一夜培養して得た培養液全量を新鮮な２×ＬＢＧ培地の
２５０ｍｌ、または５００ｍｌに混合し、１００ｒｐｍ
の振とう条件で振とう培養し、得られた培養上清の活性
を測定したところ活性換算で約３０〜５０ｍｇ／ｌのシ
スタチンＣが分泌されたことが認められた。

【００７７】

【発明の効果】本発明により、枯草菌の発現分泌系を利
用して大腸菌での外来有用タンパク質の高分泌生産を可
能とする組換え発現分泌プラスミド、該プラスミドを有
する大腸菌形質転換体、及び該大腸菌形質転換体を用い
た有用タンパク質の高分泌生産方法を提供することがで
きる。

【００７８】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列の特徴：二本鎖
リンカー（ＳｔｕＩ−Ｃｆｒｌ３ＩＤＮＡ断片）調製用 配列 CCTCTTCTCC GGGCAAACCG CCGCGTTTAG TTGGCG 36 配列番号：２配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ配列の特徴：二本鎖
リンカー（ＳｔｕＩ−Ｃｆｒｌ３ＩＤＮＡ断片）調製用 配列 GGCCGCCAAC TAAACGCGGC GGTTTGCCCG GAGAAGAGG 39

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＮＰＡ２２５の構造を示す図であ
る。

【図２】プラスミドｐＮＰＧ５の構築過程を示す図であ
る。

【図３】プラスミドｐＨＧＥ１９５の構築過程を示す図
である。

【図４】プラスミドｐＮＰＣ２の構築過程を示す図であ
る。

【図５】プラスミドｐＰＣＣＥ１９２の構築過程を示す
図である。

【図６】実施例１３でのシスタチンＣ精製のためのセフ
ァデックスＧ−５０カラムクロマトにおけるクロマトグ
ラムを示すグラフである。

【符号の説明】

Ｐｍ プロモーター ＣＤ リボゾーム結合部位 Ｉ 分泌シグナルをコードする領域 ＩＩ 結合領域 ＩＩＩ αアミラーゼ成熟タンパク質構造遺伝子

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 三田 泉 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内 (72)発明者 川島 伸広 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内 (56)参考文献 特開 平３−83590（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−273591（ＪＰ，Ａ)

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロモーター、リボゾーム結合部位及び
   分泌シグナルをコードする領域を含む塩基配列と、該塩
   基配列に機能的に連結された所望のタンパク質をコード
   する構造遺伝子と、大腸菌での複製のための複製オリジ
   ンとを有し、前記プロモーター、リボゾーム結合部位及
   び分泌シグナルをコードする領域が、バチルス アミロ
   リキファシエンスの中性プロテアーゼ遺伝子由来のもの
   であることを特徴とする組換え発現分泌プラスミド。
2. 【請求項２】 前記塩基配列がプラスミドｐＮＰＡ２２
   ５から得られたものである請求項１に記載の組換え発現
   分泌プラスミド。
3. 【請求項３】大腸菌を請求項１または２に記載の組換え
   発現分泌プラスミドにより形質転換して得た大腸菌形質
   転換体。
4. 【請求項４】 請求項３の大腸菌形質転換体を培養し、
   培養上清に所望のタンパク質を分泌させる過程と、得ら
   れた培養上清中から所望のタンパク質を回収する過程と
   を含むことを特徴とする大腸菌でのタンパク質の分泌生
   産方法。
5. 【請求項５】 大腸菌形質転換体の培養が、グルコース
   を含有する液体培地で行われる請求項４に記載のタンパ
   ク質の分泌生産方法。