JPH0771499B2 - ｐｈｅＡフィードバック制御に抵抗性を付与するための方法および物質 - Google Patents
ｐｈｅＡフィードバック制御に抵抗性を付与するための方法および物質Info
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- JPH0771499B2 JPH0771499B2 JP2513799A JP51379990A JPH0771499B2 JP H0771499 B2 JPH0771499 B2 JP H0771499B2 JP 2513799 A JP2513799 A JP 2513799A JP 51379990 A JP51379990 A JP 51379990A JP H0771499 B2 JPH0771499 B2 JP H0771499B2
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- des
- phenylalanine
- escherichia coli
- prephenate dehydratase
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
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- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は一般的には、フェニルアラニンの微生物合成に
関し、さらに詳しくは、大腸菌酵素、コリスミ酸ムター
ゼ／プレフェン酸デヒドラターゼのポリペプチド類縁体
をコードする新規なDNA配列に関する。野生型酵素に比
べて、この類縁体の酵素活性は、フェニルアラニンによ
るフィードバック制御に対し強い抵抗性を示す。したが
って、類縁体をコードするDNA配列は、フェニルアラニ
ンの産生に用いられる微生物の酵素的資力の補給に有用
である。
関し、さらに詳しくは、大腸菌酵素、コリスミ酸ムター
ゼ／プレフェン酸デヒドラターゼのポリペプチド類縁体
をコードする新規なDNA配列に関する。野生型酵素に比
べて、この類縁体の酵素活性は、フェニルアラニンによ
るフィードバック制御に対し強い抵抗性を示す。したが
って、類縁体をコードするDNA配列は、フェニルアラニ
ンの産生に用いられる微生物の酵素的資力の補給に有用
である。
大腸菌におけるＬ−フェニルアラニンの微生物産生に
は、多くの代謝性酵素が関与している。これらの中で最
も重要な酵素には、コリスミ酸のプレフェン酸への変換
およびプレフェン酸のフェニルピルビン酸への変換の両
者に関与する二官能性酵素、コリスミ酸ムターゼ／プレ
フェン酸デヒドラターゼ（CMPD）がある。CMPDは大腸菌
pheA遺伝子の発現生成物であることが決定されていて、
そのヌクレオチド配列はHudsonら（J.Mo1.Bio1.、180:1
023〜1051、1984）によって報告されている。
は、多くの代謝性酵素が関与している。これらの中で最
も重要な酵素には、コリスミ酸のプレフェン酸への変換
およびプレフェン酸のフェニルピルビン酸への変換の両
者に関与する二官能性酵素、コリスミ酸ムターゼ／プレ
フェン酸デヒドラターゼ（CMPD）がある。CMPDは大腸菌
pheA遺伝子の発現生成物であることが決定されていて、
そのヌクレオチド配列はHudsonら（J.Mo1.Bio1.、180:1
023〜1051、1984）によって報告されている。
CMPDは、pheA遺伝子発現の２個の同一のポリペプチドか
らなるダイマー型で酵素的に機能すると提唱されてき
た。この酵素は、その代謝経路の最終生成物、Ｌ−フェ
ニルアラニンによりその活性の「フィードバック制御」
を受けやすい。フェニルアラニンのレベルが1.0mMに近
づくと、たとえば、プレフェン酸デヒドラターゼの活性
は劇的に減速し、これは多分、酵素的に不活性なCMPDポ
リペプチドテトラマーの可逆的形成にフェニルアラニン
が関与するためと考えられる（たとえばBaldwinら:Arc
h.Biochem.Biophys.、211：′66〜75、1981参照）。フ
ェニルアラニン濃度約1.0mMでは、プレフェン酸デヒド
ラターゼの活性は少なくとも90％は低下する。
らなるダイマー型で酵素的に機能すると提唱されてき
た。この酵素は、その代謝経路の最終生成物、Ｌ−フェ
ニルアラニンによりその活性の「フィードバック制御」
を受けやすい。フェニルアラニンのレベルが1.0mMに近
づくと、たとえば、プレフェン酸デヒドラターゼの活性
は劇的に減速し、これは多分、酵素的に不活性なCMPDポ
リペプチドテトラマーの可逆的形成にフェニルアラニン
が関与するためと考えられる（たとえばBaldwinら:Arc
h.Biochem.Biophys.、211：′66〜75、1981参照）。フ
ェニルアラニン濃度約1.0mMでは、プレフェン酸デヒド
ラターゼの活性は少なくとも90％は低下する。
遺伝子のクローニングおよび発現のための組換え技術の
出現とともに、フェニルアラニンの産生に用いられる大
腸菌宿主細胞の内因性CMPDの能力を増大させる試みが行
われてきた（Forbergら： J.Biotech.、７:319〜332、 1988;Choiら:Biotech.Lett.、８:223〜228、1982;Hwang
ら:Appl.Microbiol. Biotechnol.、22:108〜113、1985;Gilら:Enzyme Micro
b. Technol.、７:370〜372、1985:Parkら:Chem.Eng.Commu
n.、45:185〜196,1986）。
出現とともに、フェニルアラニンの産生に用いられる大
腸菌宿主細胞の内因性CMPDの能力を増大させる試みが行
われてきた（Forbergら： J.Biotech.、７:319〜332、 1988;Choiら:Biotech.Lett.、８:223〜228、1982;Hwang
ら:Appl.Microbiol. Biotechnol.、22:108〜113、1985;Gilら:Enzyme Micro
b. Technol.、７:370〜372、1985:Parkら:Chem.Eng.Commu
n.、45:185〜196,1986）。
フェニルアラニンのフィードバック制御を実質的にもた
ないCMPD酵素を、大腸菌の変異株が産生することは、す
でに報告されている（たとえば、Tribe:公告オーストラ
リア特許第72727/81号参照）。
ないCMPD酵素を、大腸菌の変異株が産生することは、す
でに報告されている（たとえば、Tribe:公告オーストラ
リア特許第72727/81号参照）。
Beckmannら（米国特許第4,753,883号）は、「大腸菌CMP
Dの触媒作用に必須なセグメントはＮ−末端337アミノ酸
内にあり、フェニルアラニンフィードバック感受性は単
一のアミノ酸、トリプトファン338によるものであり、
全49C−末端アミノ酸の欠失は触媒活性を破壊しない
が、フィードバック感受性は実質的に破壊される」とい
うことを基盤に、フェニルアラニン抑制に対して感受性
の低いCMPD類縁ポリペプチドをコードする「変異体」DN
A配列による宿主細胞の形質転換を報告している。Beckm
annらは、CMPD Trp338欠失ならびにTrp338に関する置
換類縁体をコードするDNA配列を導入するプラスミドベ
クターの開発、およびこのようなプラスミドベクター
の、フェニルアラニン産生微生物宿主の形質転換への使
用を提案している。
Dの触媒作用に必須なセグメントはＮ−末端337アミノ酸
内にあり、フェニルアラニンフィードバック感受性は単
一のアミノ酸、トリプトファン338によるものであり、
全49C−末端アミノ酸の欠失は触媒活性を破壊しない
が、フィードバック感受性は実質的に破壊される」とい
うことを基盤に、フェニルアラニン抑制に対して感受性
の低いCMPD類縁ポリペプチドをコードする「変異体」DN
A配列による宿主細胞の形質転換を報告している。Beckm
annらは、CMPD Trp338欠失ならびにTrp338に関する置
換類縁体をコードするDNA配列を導入するプラスミドベ
クターの開発、およびこのようなプラスミドベクター
の、フェニルアラニン産生微生物宿主の形質転換への使
用を提案している。
簡単な要約 本発明は、野生型大腸菌CMPD酵素に比較してフェニルア
ラニンの存在による抑制に対する感受性の低い、プレフ
ェン酸デヒドラターゼおよび／またはコリスミ酸ムター
ゼ酵素活性を有する大腸菌CMPD類縁体ポリペプチドをコ
ードする新規なDNA配列を提供するものである。本発明
はまた、これらの配列によってコードされるポリペプチ
ドを提供する。本発明によるDNA配列は、大腸菌CMPDの
残基301〜315、好ましくは残基304〜310に関する欠失、
置換および／または付加類縁体をコードする配列を包含
する。現時点で好ましい類縁体コード配列は以下のポリ
ペプチドに特定できる。この場合、「des」の記号はそ
の関連残基の欠失または消失を意味する。すなわち、
〔des−Gln307、des−Ala308、des−Gly309、des−Ala
310〕CMPD;〔Leu36〕CMPD; 〔des−Thr304、Lys305、des−Gln306〕CMPD;および〔C
ys309〕CMPDである。これらの類縁体コードDNA配列それ
ぞれの発現生成物は、プレフェン酸デヒドラターゼおよ
びコリスミ酸ムターゼ活性の両者を示すが、これらの生
成物に対する酵素活性の一方または両者のフェニルアラ
ニンの存在による抑制に対する感受性は低い。100mM濃
度のフェニルアラニンによるプレフェン酸デヒドラター
ゼ活性の阻害に対する抵抗性については、〔des−Thr
304、Lys305、des−Gln306〕 CMPDコードDNA配列の発現生成物が好ましい。コリスミ
酸ムターゼ活性の抑制に対する抵抗性については〔Cys
209〕CMPDが好ましい。
ラニンの存在による抑制に対する感受性の低い、プレフ
ェン酸デヒドラターゼおよび／またはコリスミ酸ムター
ゼ酵素活性を有する大腸菌CMPD類縁体ポリペプチドをコ
ードする新規なDNA配列を提供するものである。本発明
はまた、これらの配列によってコードされるポリペプチ
ドを提供する。本発明によるDNA配列は、大腸菌CMPDの
残基301〜315、好ましくは残基304〜310に関する欠失、
置換および／または付加類縁体をコードする配列を包含
する。現時点で好ましい類縁体コード配列は以下のポリ
ペプチドに特定できる。この場合、「des」の記号はそ
の関連残基の欠失または消失を意味する。すなわち、
〔des−Gln307、des−Ala308、des−Gly309、des−Ala
310〕CMPD;〔Leu36〕CMPD; 〔des−Thr304、Lys305、des−Gln306〕CMPD;および〔C
ys309〕CMPDである。これらの類縁体コードDNA配列それ
ぞれの発現生成物は、プレフェン酸デヒドラターゼおよ
びコリスミ酸ムターゼ活性の両者を示すが、これらの生
成物に対する酵素活性の一方または両者のフェニルアラ
ニンの存在による抑制に対する感受性は低い。100mM濃
度のフェニルアラニンによるプレフェン酸デヒドラター
ゼ活性の阻害に対する抵抗性については、〔des−Thr
304、Lys305、des−Gln306〕 CMPDコードDNA配列の発現生成物が好ましい。コリスミ
酸ムターゼ活性の抑制に対する抵抗性については〔Cys
209〕CMPDが好ましい。
本発明はまた、所望のCMPD類縁体ポリペプチドの、それ
によって形質転換された選ばれた細胞たとえば大腸菌内
での発現（転写および翻訳）を容易にする発現制御DNA
配列（プロモーター、オペレーター等）と機能的に連結
した本発明のDNA配列からなる、自律複製DNA発現ベクタ
ーを提供する。好ましい発現ベクターは、宿主細胞形質
転換の確認に用いられる選択可能マーカー遺伝子からな
り、例１に示したようにEcoR IおよびHae II部位の間で
修飾され、野生型大腸菌CMPD酵素の内因性発現に機能的
に関連する配列から誘導された発現制御DNA配列（たと
えば、大腸菌pheA遺伝子の発現制御配列）を有するプロ
モーターを包含する。
によって形質転換された選ばれた細胞たとえば大腸菌内
での発現（転写および翻訳）を容易にする発現制御DNA
配列（プロモーター、オペレーター等）と機能的に連結
した本発明のDNA配列からなる、自律複製DNA発現ベクタ
ーを提供する。好ましい発現ベクターは、宿主細胞形質
転換の確認に用いられる選択可能マーカー遺伝子からな
り、例１に示したようにEcoR IおよびHae II部位の間で
修飾され、野生型大腸菌CMPD酵素の内因性発現に機能的
に関連する配列から誘導された発現制御DNA配列（たと
えば、大腸菌pheA遺伝子の発現制御配列）を有するプロ
モーターを包含する。
本発明の好ましい原型大腸菌CMPD類縁体コードDNA配列
は、野生型大腸菌pheA遺伝子を導入したベクターに化学
的突然変異を行って開発されたが、以下に述べる本発明
のDNA配列の、特定部位の突然変異（たとえば野生型phe
A遺伝子に対して行われた）による、またCMPDポリペプ
チドコード配列の一部もしくは全部の化学的合成での製
造による形成も本発明に包含される。
は、野生型大腸菌pheA遺伝子を導入したベクターに化学
的突然変異を行って開発されたが、以下に述べる本発明
のDNA配列の、特定部位の突然変異（たとえば野生型phe
A遺伝子に対して行われた）による、またCMPDポリペプ
チドコード配列の一部もしくは全部の化学的合成での製
造による形成も本発明に包含される。
CMPDの失欠類縁体をコードする本発明のDNA配列は、野
生型酵素のアミノ酸配列における位置301から315のアミ
ノ酸残基にわたる領域内の残基を特定する１個〜15個の
コドンを欠いている。欠失は連続的でも不連続であって
もよく、アミノ酸残基304から310をコードする塩基対に
わたる領域に作成するのが好ましい。本発明の置換類縁
体コードDNA配列は、CMPDのアミノ酸配列中位置301から
315まで（好ましくは残基304から310まで）の１個もし
くは２個以上の残基を特定するコドン内の１〜３個の塩
基対が、その位置で野生型に存在する以外のアミノ酸へ
変化した発現を起こすように変化している配列を包含す
る。付加類縁体コードDNA配列は、その酵素の上述の領
域内に、付加的残基の付加的コドンを然るべく包含す
る。現時点で好ましい配列は、欠失類縁体ポリペプチ
ド、置換類縁体ポリペプチド、および野生型CMPDアミノ
酸配列に欠失と置換の両者を含有するポリペプチド類縁
体をコードする配列である。上述の修飾を、コリスミ酸
ムターゼおよび／またはプレフェン酸デヒドラターゼ活
性が増大し、またフェニルアラニンフィードバック抑制
抵抗性がさらに増大したCMPDポリペプチド類縁体の表現
を可能にする、他の既知のおよび今後開発されるDNA配
列修飾と「組合わせる」ことも、本発明の企図の範囲内
である。
生型酵素のアミノ酸配列における位置301から315のアミ
ノ酸残基にわたる領域内の残基を特定する１個〜15個の
コドンを欠いている。欠失は連続的でも不連続であって
もよく、アミノ酸残基304から310をコードする塩基対に
わたる領域に作成するのが好ましい。本発明の置換類縁
体コードDNA配列は、CMPDのアミノ酸配列中位置301から
315まで（好ましくは残基304から310まで）の１個もし
くは２個以上の残基を特定するコドン内の１〜３個の塩
基対が、その位置で野生型に存在する以外のアミノ酸へ
変化した発現を起こすように変化している配列を包含す
る。付加類縁体コードDNA配列は、その酵素の上述の領
域内に、付加的残基の付加的コドンを然るべく包含す
る。現時点で好ましい配列は、欠失類縁体ポリペプチ
ド、置換類縁体ポリペプチド、および野生型CMPDアミノ
酸配列に欠失と置換の両者を含有するポリペプチド類縁
体をコードする配列である。上述の修飾を、コリスミ酸
ムターゼおよび／またはプレフェン酸デヒドラターゼ活
性が増大し、またフェニルアラニンフィードバック抑制
抵抗性がさらに増大したCMPDポリペプチド類縁体の表現
を可能にする、他の既知のおよび今後開発されるDNA配
列修飾と「組合わせる」ことも、本発明の企図の範囲内
である。
本発明のDNA配列は、フェニルアラニンを合成する細胞
の能力を増大させる目的で、適当な大腸菌宿主の形質転
換（ベクターまたは染色体挿入法による）に使用した場
合、その有用性を発揮する。
の能力を増大させる目的で、適当な大腸菌宿主の形質転
換（ベクターまたは染色体挿入法による）に使用した場
合、その有用性を発揮する。
本発明の他の態様および利点は、その好ましい実施態様
についての詳細な説明から明白であろう。
についての詳細な説明から明白であろう。
図面の簡単な説明 図１はpheA DNAを含有するプラスミドpJN302の制限地
図である。
図である。
詳細な説明 以下の例示的な例は、本発明の現時点において好ましい
DNA配列の生成に関する。さらに詳しくは、例１は、化
学的突然変異による類縁体コードDNA配列の生成、例２
は、フェニルアラニンフィードバック抑制スクリーニン
グの結果を示し、例３は、例１で生成されたDNA配列に
ついて行われた配列解析に関する。
DNA配列の生成に関する。さらに詳しくは、例１は、化
学的突然変異による類縁体コードDNA配列の生成、例２
は、フェニルアラニンフィードバック抑制スクリーニン
グの結果を示し、例３は、例１で生成されたDNA配列に
ついて行われた配列解析に関する。
例１ 化学的突然変異はプラスミドpJN302に対して行われた。
プラスミドpJN302は、大腸菌K12のpheA遺伝子からなるE
coR I〜BamH I挿入体を有するベクターpLG338から構成
される。
プラスミドpJN302は、大腸菌K12のpheA遺伝子からなるE
coR I〜BamH I挿入体を有するベクターpLG338から構成
される。
pheA遺伝子は、プロモーターに関連する調節配列が除か
れ、コード配列の下流のBamHI部位に挿入されるように
修飾されている。pheA遺伝子は野生型のCMPDをコードす
る。
れ、コード配列の下流のBamHI部位に挿入されるように
修飾されている。pheA遺伝子は野生型のCMPDをコードす
る。
pheA遺伝子は、大腸菌K12の染色体から、Edwardsら:PCT
公告第WO87/00202号（参考として本明細書に導入）およ
びHudsonら:J.Mol.Biol.,180:1023〜1051（1984）の両
者に記載されている6.3kb EcoR I〜BamH Iフラグメン
ト上に単離できる。pheA遺伝子およびその隣接領域のヌ
クレオチド配列を決定したのち、BamHI制限部位を遺伝
子のすぐ下流に、Edwardsら:PCT公告第WO87/00202号に
例示されている特定部位の突然変異によって配列GGTGCC
をGGATCCに変換して導入できる。この配列は以下のよう
に、pheA遺伝子のTGA停止コドンに続く第７番目のヌク
レオチドに始まる。
公告第WO87/00202号（参考として本明細書に導入）およ
びHudsonら:J.Mol.Biol.,180:1023〜1051（1984）の両
者に記載されている6.3kb EcoR I〜BamH Iフラグメン
ト上に単離できる。pheA遺伝子およびその隣接領域のヌ
クレオチド配列を決定したのち、BamHI制限部位を遺伝
子のすぐ下流に、Edwardsら:PCT公告第WO87/00202号に
例示されている特定部位の突然変異によって配列GGTGCC
をGGATCCに変換して導入できる。この配列は以下のよう
に、pheA遺伝子のTGA停止コドンに続く第７番目のヌク
レオチドに始まる。
Val Asp Pro Thr 開始 BamH I GTT GAT CCA ACC TGA TGA AAAGGATCCGGATG pheA遺伝子のプロモーター領域は、そのプロモーターと
アテニュエーターを、天然のプロモーターに基づくがプ
リブナウ配列（−10）に重複する２回軸対称を欠く合成
プロモーターに置換して、脱調節できる。この置換は、
遺伝子の上流のEcoR I部位と天然pheA遺伝子のＮ−末端
内のHae II部位の間に行うことができる。合成的置換領
域のヌクレオチド配列は、以下の通りであってもよい。
アテニュエーターを、天然のプロモーターに基づくがプ
リブナウ配列（−10）に重複する２回軸対称を欠く合成
プロモーターに置換して、脱調節できる。この置換は、
遺伝子の上流のEcoR I部位と天然pheA遺伝子のＮ−末端
内のHae II部位の間に行うことができる。合成的置換領
域のヌクレオチド配列は、以下の通りであってもよい。
プロモーターの−35および−10領域、ならびにリボソー
ム結合部位（ATG開始コドンの前のS.D.）のように、末
端制限部位には下線を付してある。pheA遺伝子は、Edwa
rdsらに記載された構築体から、上流EcoR I部位および
下流BamH I部位におけるBamH IおよびEcoR I切断によっ
て単離され、EcoRI/BamH IはEcoR IおよびBamH I切断pL
G338（Stokerら:Gene、18:335〜341、1982）にクローン
化して、図にその制限地図を示したpJN302を生成するこ
とができる。PLG338はStokerらの研究室をはじめ多くの
研究室から容易に入手できる。
ム結合部位（ATG開始コドンの前のS.D.）のように、末
端制限部位には下線を付してある。pheA遺伝子は、Edwa
rdsらに記載された構築体から、上流EcoR I部位および
下流BamH I部位におけるBamH IおよびEcoR I切断によっ
て単離され、EcoRI/BamH IはEcoR IおよびBamH I切断pL
G338（Stokerら:Gene、18:335〜341、1982）にクローン
化して、図にその制限地図を示したpJN302を生成するこ
とができる。PLG338はStokerらの研究室をはじめ多くの
研究室から容易に入手できる。
pJN302DNA約２μｇを200μの反応混合物中、50mM酢酸
ナトリウムpH4.6、88mM亜硝酸ナトリウムおよび0.25mM
スペルミンと混合した。反応混合物を30℃でインキュベ
ートし、30分後にサンプル60μを取り出した。このサ
ンプルを1M Tris（pH8）30μに取った。これに、4M
NaCl4.5μおよびエタノール300μを加えた。つい
でDNAを−20℃で４時間沈殿させ、エッペンドルフマイ
クロフェージ遠心分離により回収した。60分後にさらに
サンプル70μを取り、これに1MTris（pH8）35μを
加えた。ついでさらに4MNaCl 5.25μおよびエタノー
ル350μを加えた。DNAを前述のように沈殿させ、回収
した。残った反応混合物70μは全部で90分インキュベ
ートした後に除去し、60分サンプルと同様に処理した。
DNAペレットを水10μに再懸濁し、それぞれ３μを
用いて、細菌HW1012株（pheA）のコンピーテント細胞の
形質転換に使用した。形質転換体は、カナマイシン40μ
g/mlを含有するLBプレート上に単離した。全コロニーを
計1.5mlのＬ−培地にプールした。細胞を洗浄し、食塩
水中1:5に希釈した。次に、毒性アミノ酸類縁体、β−
２−チエニルアラニンおよび３−フルオロ−チロシンを
含むプレート上で生育できる細胞を選択した。とくに、
洗浄細胞100μ部を、以下の生育培地上でそれぞれ平
板培養した。
ナトリウムpH4.6、88mM亜硝酸ナトリウムおよび0.25mM
スペルミンと混合した。反応混合物を30℃でインキュベ
ートし、30分後にサンプル60μを取り出した。このサ
ンプルを1M Tris（pH8）30μに取った。これに、4M
NaCl4.5μおよびエタノール300μを加えた。つい
でDNAを−20℃で４時間沈殿させ、エッペンドルフマイ
クロフェージ遠心分離により回収した。60分後にさらに
サンプル70μを取り、これに1MTris（pH8）35μを
加えた。ついでさらに4MNaCl 5.25μおよびエタノー
ル350μを加えた。DNAを前述のように沈殿させ、回収
した。残った反応混合物70μは全部で90分インキュベ
ートした後に除去し、60分サンプルと同様に処理した。
DNAペレットを水10μに再懸濁し、それぞれ３μを
用いて、細菌HW1012株（pheA）のコンピーテント細胞の
形質転換に使用した。形質転換体は、カナマイシン40μ
g/mlを含有するLBプレート上に単離した。全コロニーを
計1.5mlのＬ−培地にプールした。細胞を洗浄し、食塩
水中1:5に希釈した。次に、毒性アミノ酸類縁体、β−
２−チエニルアラニンおよび３−フルオロ−チロシンを
含むプレート上で生育できる細胞を選択した。とくに、
洗浄細胞100μ部を、以下の生育培地上でそれぞれ平
板培養した。
１） M9最小培地、0.5％グルコース、40μg/mlカナマ
イシンおよび10mMβ−２−チエニルアラニン（Ｌ−フェ
ニルアラニンの毒性類縁体） ２） M9最小培地、0.5％グルコース、40μg/mlカナマ
イシンおよび20mMβ−２−チエニルアラニン ３） M9最小培地、0.5％グルコース、40μg/mlカナマ
イシンおよび1mM3−フルオロチロシン 10mMβ−２−チエニルアラニン含有プレート上には数千
のコロニーが得られた。その数個について検定を行った
が、フィードバック抑制の抵抗性は低レベルであった。
これらはさらに検査しなかった。３−フルオロチロシン
を含有するプレート上では20個のコロニーが得られた。
これらの４個について検査したが、フィードバック抑制
の抵抗性は同じく低レベルであった。これらはさらに検
査しなかった。20mMβ−２−チェニルアラニンを含むプ
レート上には４個のコロニーが得られた。これらはそれ
ぞれ、Ｌ−フェニルアラニンに対するきわめて高レベル
のフィードバック抑制抵抗性をもつCMPDを生成した。そ
れぞれからプラスミドDNAを単離し、HW1012の新鮮なコ
ンピーテント細胞の再形質転換に使用した。
イシンおよび10mMβ−２−チエニルアラニン（Ｌ−フェ
ニルアラニンの毒性類縁体） ２） M9最小培地、0.5％グルコース、40μg/mlカナマ
イシンおよび20mMβ−２−チエニルアラニン ３） M9最小培地、0.5％グルコース、40μg/mlカナマ
イシンおよび1mM3−フルオロチロシン 10mMβ−２−チエニルアラニン含有プレート上には数千
のコロニーが得られた。その数個について検定を行った
が、フィードバック抑制の抵抗性は低レベルであった。
これらはさらに検査しなかった。３−フルオロチロシン
を含有するプレート上では20個のコロニーが得られた。
これらの４個について検査したが、フィードバック抑制
の抵抗性は同じく低レベルであった。これらはさらに検
査しなかった。20mMβ−２−チェニルアラニンを含むプ
レート上には４個のコロニーが得られた。これらはそれ
ぞれ、Ｌ−フェニルアラニンに対するきわめて高レベル
のフィードバック抑制抵抗性をもつCMPDを生成した。そ
れぞれからプラスミドDNAを単離し、HW1012の新鮮なコ
ンピーテント細胞の再形質転換に使用した。
４個の各コロニーからのプラスミドで再形質転換された
細胞は、M9最小培地、0.5％グルコース、40μg/mlカナ
マイシンおよび20mMβ−２−チエニルアラニンのプレー
ト上で画線培養すると増殖可能であった。再形質転換体
も、最初の単離体の場合に相当するレベルのＬ−フェニ
ルアラニンに対するフィードバック抑制抵抗性をもつCM
PDを産生した。ついで各再形質転換体からプラスミドDN
Aを単離し、pheA遺伝子内の突然変異の性質を決定する
ために特性を調べた。４種の突然変異プラスミドはpJN3
05、pJN306、pJN307およびpJN308と命名した。
細胞は、M9最小培地、0.5％グルコース、40μg/mlカナ
マイシンおよび20mMβ−２−チエニルアラニンのプレー
ト上で画線培養すると増殖可能であった。再形質転換体
も、最初の単離体の場合に相当するレベルのＬ−フェニ
ルアラニンに対するフィードバック抑制抵抗性をもつCM
PDを産生した。ついで各再形質転換体からプラスミドDN
Aを単離し、pheA遺伝子内の突然変異の性質を決定する
ために特性を調べた。４種の突然変異プラスミドはpJN3
05、pJN306、pJN307およびpJN308と命名した。
例２ ４種の突然変異プラスミドをもつCMPD DNA配列によっ
てコードされる推定CMPD類縁体のフェニルアラニンフィ
ードバック抑制に対する抵抗性を解析し、次のようにph
eA遺伝子発現の野生型CMPD生成物の場合と比較した。
てコードされる推定CMPD類縁体のフェニルアラニンフィ
ードバック抑制に対する抵抗性を解析し、次のようにph
eA遺伝子発現の野生型CMPD生成物の場合と比較した。
細胞抽出物の調製 CMPD検定のための酵素の単離には、pJN302、pJN305、pJ
N306、pJN307またはpJN308のいずれかを含有するHW1012
の細胞25ml容量を、40μg/mlのカナマイシンを含有する
Ｌ−培地中、光学密度（O.D.）が約1.0になるまで増殖
させた。細胞を遠心分離によって回収し、200mM Tris
（pH8）10ml中で洗浄し、200mM Tris（pH8）1mlに再懸
濁した。次に細胞をフレンチ細胞プレスで破壊した。分
解物を14krpmで15分間遠心分離し、上清を検定用に残し
た。PD検定には上清50μを、CM検定には20μを使用
した。
N306、pJN307またはpJN308のいずれかを含有するHW1012
の細胞25ml容量を、40μg/mlのカナマイシンを含有する
Ｌ−培地中、光学密度（O.D.）が約1.0になるまで増殖
させた。細胞を遠心分離によって回収し、200mM Tris
（pH8）10ml中で洗浄し、200mM Tris（pH8）1mlに再懸
濁した。次に細胞をフレンチ細胞プレスで破壊した。分
解物を14krpmで15分間遠心分離し、上清を検定用に残し
た。PD検定には上清50μを、CM検定には20μを使用
した。
PD検定操作 PD活性は、27mM Tris（pH8）、1mMプレフェン酸カリウ
ム、検定すべき細胞抽出液50μおよび表１に示すよう
に様々な濃度のＬ−フェニルアラニンを含有する反応混
合物1.25ml中で検定した。反応は、プレフェン酸塩の添
加によって開始させた。反応混合物を37℃で１分間イン
キュベートし、この時点でサンプル0.25mlを取り、1M
NaOH0.75mlと混合した。ついで吸収を水ブランクに対し
て320nmで測定した。サンプルをさらに５および９分で
取り、同様に処理した。
ム、検定すべき細胞抽出液50μおよび表１に示すよう
に様々な濃度のＬ−フェニルアラニンを含有する反応混
合物1.25ml中で検定した。反応は、プレフェン酸塩の添
加によって開始させた。反応混合物を37℃で１分間イン
キュベートし、この時点でサンプル0.25mlを取り、1M
NaOH0.75mlと混合した。ついで吸収を水ブランクに対し
て320nmで測定した。サンプルをさらに５および９分で
取り、同様に処理した。
320nmにおける吸収の増加速度を計算し、抽出液の非存
在下における対照速度に対して補正した。PD活性の単位
は、フェニルピルビン酸に対する吸光係数として17,500
M-1cm-1を用いる検定条件下において１分間に1.0μmole
のプレフェン酸のフェニルピルビン酸への変換を触媒す
る酵素の量として定義する。
在下における対照速度に対して補正した。PD活性の単位
は、フェニルピルビン酸に対する吸光係数として17,500
M-1cm-1を用いる検定条件下において１分間に1.0μmole
のプレフェン酸のフェニルピルビン酸への変換を触媒す
る酵素の量として定義する。
PD活性は表１に、抽出液1mlあたりの単位で、またＬ−
フェニルアラニンの非存在下に測定した活性に対する百
分率として示す。
フェニルアラニンの非存在下に測定した活性に対する百
分率として示す。
CM検定操作 CM活性は、1mMコリスミ酸、100mMTris（pH7.5）、0.5mM
EDTA、0.01％BSA、検定すべき細胞抽出液20μ、お
よび表２に示すような様様の濃度のＬ−フェニルアラニ
ンを含有する反応混合物0.8ml中で検定した。
EDTA、0.01％BSA、検定すべき細胞抽出液20μ、お
よび表２に示すような様様の濃度のＬ−フェニルアラニ
ンを含有する反応混合物0.8ml中で検定した。
反応は細胞抽出液の添加によって開始させた。反応混合
物は37℃で５分間インキュベートし、この時点で4.5M
HCl 0.1mlを加えて停止させた。反応混合物をさらに10
分間37℃でインキュベートしてすべてのプレフェン酸を
フェニルピルビン酸に変換し、この時点で12M NaOH
0.1mlを加え、吸収を320nmで測定した。基質の吸収を補
正するために、細胞抽出液のみを欠くブランクを含め
た。値はまた、宿主CM/プレフェン酸デヒドロゲナーゼ
によるCM活性についても補正した。すべての検定は二重
に実施し、その平均値を示す。単位は、検定条件下１分
間に1.0μmoleのコリスミ酸のプレフェン酸への変換を
触媒する酵素の量として定義する。吸光係数はPD検定の
場合と同じである。
物は37℃で５分間インキュベートし、この時点で4.5M
HCl 0.1mlを加えて停止させた。反応混合物をさらに10
分間37℃でインキュベートしてすべてのプレフェン酸を
フェニルピルビン酸に変換し、この時点で12M NaOH
0.1mlを加え、吸収を320nmで測定した。基質の吸収を補
正するために、細胞抽出液のみを欠くブランクを含め
た。値はまた、宿主CM/プレフェン酸デヒドロゲナーゼ
によるCM活性についても補正した。すべての検定は二重
に実施し、その平均値を示す。単位は、検定条件下１分
間に1.0μmoleのコリスミ酸のプレフェン酸への変換を
触媒する酵素の量として定義する。吸光係数はPD検定の
場合と同じである。
CM活性は表２に、抽出液1mlあたりの単位で、またＬ−
フェニルアラニンの非存在下に測定した活性に対する百
分率として示す。
フェニルアラニンの非存在下に測定した活性に対する百
分率として示す。
表１および２は、野生型酵素のプレフェン酸デヒドラー
ゼ（PD）およびコリスミ酸ムターゼ（CM）の両活性がＬ
−フェニルアラニンの存在によって阻害されることを明
瞭に示している。PD活性は低レベル（10mM）でほぼ完全
に阻害されるが、CMは高レベル（100mM）でも約30％以
上阻害されることはない。これは、Ｌ−フェニルアラニ
ンのレベルが50〜100mMに達するとPD基質、プレフェン
酸の実質的な蓄積を示すが、CM気質、コリスミ酸の実質
的な蓄積はみられないフェニルアラニンの微生物発酵製
造の検討結果と一致している。したがって、CMPD類縁体
発現生成物についてのPD活性抑制に対する抵抗性はきわ
めて顕著であったが、CM活性の抑制に対する抵抗性はそ
れほど劇的ではなかった。しかしながら、低フェニルア
ラニン濃度（10mM）では、常に、類縁体によるCM活性の
かなりの程度の活性化が認められた。このような結果は
野生型酵素についてはこれまでに報告されていない。
ゼ（PD）およびコリスミ酸ムターゼ（CM）の両活性がＬ
−フェニルアラニンの存在によって阻害されることを明
瞭に示している。PD活性は低レベル（10mM）でほぼ完全
に阻害されるが、CMは高レベル（100mM）でも約30％以
上阻害されることはない。これは、Ｌ−フェニルアラニ
ンのレベルが50〜100mMに達するとPD基質、プレフェン
酸の実質的な蓄積を示すが、CM気質、コリスミ酸の実質
的な蓄積はみられないフェニルアラニンの微生物発酵製
造の検討結果と一致している。したがって、CMPD類縁体
発現生成物についてのPD活性抑制に対する抵抗性はきわ
めて顕著であったが、CM活性の抑制に対する抵抗性はそ
れほど劇的ではなかった。しかしながら、低フェニルア
ラニン濃度（10mM）では、常に、類縁体によるCM活性の
かなりの程度の活性化が認められた。このような結果は
野生型酵素についてはこれまでに報告されていない。
例３ プラスミドpJN305、pJN306、pJN307およびpJN308のサブ
クローン解析により、各プラスミドから得られた221塩
基対AlwNI/NcoI制限フラグメント（野生型酵素のCMPD残
基266〜337のコドンを包含する）はpJN302のAlwNI〜Nco
Iフラグメントを置換することができて、得られたプラ
スミドは相当するフェニルアラニン抑制抵抗性CMPD活性
の発現を可能にすることが明らかにされた。pJN305の完
全配列決定により、CMPD残基301〜305を特定する領域外
には突然変異は認められなかった。
クローン解析により、各プラスミドから得られた221塩
基対AlwNI/NcoI制限フラグメント（野生型酵素のCMPD残
基266〜337のコドンを包含する）はpJN302のAlwNI〜Nco
Iフラグメントを置換することができて、得られたプラ
スミドは相当するフェニルアラニン抑制抵抗性CMPD活性
の発現を可能にすることが明らかにされた。pJN305の完
全配列決定により、CMPD残基301〜305を特定する領域外
には突然変異は認められなかった。
これらのフラグメントから誘導される４つのAlwNI/NcoI
それぞれのDNA配列解析で、CMPD残基310〜315を特定す
るコドンを含む領域外のDNA配列には変化のないことが
明らかにされた。以下の表３には、pJN302（野生型）な
らびにpJN305、pJN306、pJN307、pJN308のこれらの領域
におけるヌクレオチド配列およびそれから帰納されるア
ミノ酸配列を示す。
それぞれのDNA配列解析で、CMPD残基310〜315を特定す
るコドンを含む領域外のDNA配列には変化のないことが
明らかにされた。以下の表３には、pJN302（野生型）な
らびにpJN305、pJN306、pJN307、pJN308のこれらの領域
におけるヌクレオチド配列およびそれから帰納されるア
ミノ酸配列を示す。
本発明の変異体pheA遺伝子について最良の力価を与える
点で現在好ましい宿主株は、pJN307で形質転換された大
腸菌株で、AG077と命名された株である。
点で現在好ましい宿主株は、pJN307で形質転換された大
腸菌株で、AG077と命名された株である。
表３に示した情報から、最初に調製されたCMPD類縁体は
いずれも、残基304〜310を包含する小領域でのみ野生型
と特異的に異なることが明らかである。プラスミドpJN3
06およびpJN308のDNAはそれぞれ、置換類縁体、〔Leu
306〕CMPDおよび〔Cys309〕CMPDを特定する。プラスミ
ドpJN305は欠失類縁体、〔des−Gln307、des−Ala308、
des−Gly309、des−Ala310〕CMPDを特定し、プラスミド
pJN307は欠失、置換複合類縁体、〔des−Thr304、Lys
305、des−Gln306〕CMPDを特定する。
いずれも、残基304〜310を包含する小領域でのみ野生型
と特異的に異なることが明らかである。プラスミドpJN3
06およびpJN308のDNAはそれぞれ、置換類縁体、〔Leu
306〕CMPDおよび〔Cys309〕CMPDを特定する。プラスミ
ドpJN305は欠失類縁体、〔des−Gln307、des−Ala308、
des−Gly309、des−Ala310〕CMPDを特定し、プラスミド
pJN307は欠失、置換複合類縁体、〔des−Thr304、Lys
305、des−Gln306〕CMPDを特定する。
前述のように、プラスミドに含まれるpheA遺伝子の化学
的突然変異は本発明の好ましいDNA配列を得る最初の手
段を構成するものであるが、上記例の特定の突然変異ク
ローンの配列決定で得られる情報は、突然変異配列の複
製（pheA遺伝子コピーの特定部位の突然変異誘発または
pheA遺伝子の全部もしくは一部の合成）および他の類縁
体コードDNAの開発の両者を可能にする。たとえば、CMP
Dの残基301〜315を特定するDNA領域はpheA遺伝子のAlwN
IおよびNco Iエンドヌクレアーゼ消化によって生成する
221塩基対制限フラグメント内に含まれることに注目す
べきである。このように開発されたこのフラグメント
は、CMPD残基301〜305を特定するコドンにもっと隣接し
た唯一の制限エンドヌクレアーゼ消化部位を包含するよ
うに合成することは容易であり、この合成フラグメント
をpheA遺伝子中の天然の配列のAlwN I/Nco Iフラグメン
トの代わりに用いることもできる。ついで、短い合成DN
A二重鎖を用いる「カセット」フォーマット突然変異誘
導も容易に使用できる。本発明のフェニルアラニンおよ
びフェニルアラニン誘導体フィードバック抑制抵抗性類
縁体をコードする配列の開発には、新しいポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）法を使用できる可能性もある。
的突然変異は本発明の好ましいDNA配列を得る最初の手
段を構成するものであるが、上記例の特定の突然変異ク
ローンの配列決定で得られる情報は、突然変異配列の複
製（pheA遺伝子コピーの特定部位の突然変異誘発または
pheA遺伝子の全部もしくは一部の合成）および他の類縁
体コードDNAの開発の両者を可能にする。たとえば、CMP
Dの残基301〜315を特定するDNA領域はpheA遺伝子のAlwN
IおよびNco Iエンドヌクレアーゼ消化によって生成する
221塩基対制限フラグメント内に含まれることに注目す
べきである。このように開発されたこのフラグメント
は、CMPD残基301〜305を特定するコドンにもっと隣接し
た唯一の制限エンドヌクレアーゼ消化部位を包含するよ
うに合成することは容易であり、この合成フラグメント
をpheA遺伝子中の天然の配列のAlwN I/Nco Iフラグメン
トの代わりに用いることもできる。ついで、短い合成DN
A二重鎖を用いる「カセット」フォーマット突然変異誘
導も容易に使用できる。本発明のフェニルアラニンおよ
びフェニルアラニン誘導体フィードバック抑制抵抗性類
縁体をコードする配列の開発には、新しいポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）法を使用できる可能性もある。
以上、好ましい実施態様について上述した本発明には、
本技術分野の熟練者によれば多くの修飾および改変が思
い浮かぶことが期待される。したがって、請求の範囲に
おける限定のみが本発明を限定するものである。
本技術分野の熟練者によれば多くの修飾および改変が思
い浮かぶことが期待される。したがって、請求の範囲に
おける限定のみが本発明を限定するものである。
Claims (1)
- 【請求項１】フェニルアラニンによるフィードバック制
御に対して抵抗性を有する大腸菌由来コリスミ酸ムター
ゼ／プレフェン酸デヒドラターゼのポリペプチド類縁体
をコードするDNA断片であって、該ポリペプチド類縁体
は、 野性型の大腸菌由来コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸
デヒドラターゼの307番目のグルタミン、308番目のアラ
ニン、309番目のグリシン及び310番目のアラニンが全て
欠失した大腸菌由来コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸
デヒドラターゼ； 野性型の大腸菌由来コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸
デヒドラターゼの306番目のグルタミンの代わりにロイ
シンを有する大腸菌由来コリスミ酸ムターゼ／プレフェ
ン酸デヒドラターゼ； 野性型の大腸菌由来コリスミ酸ムターゼ／プレフェン酸
デヒドラターゼの304番目のスレオニンン及び306番目の
グリシンが欠失し、305番目のグリシンの代わりにリシ
ンを有する大腸菌由来コリスミ酸ムターゼ／プレフェン
酸デヒドラターゼ； 及び、野性型の大腸菌由来コリスミ酸ムターゼ／プレフ
ェン酸デヒドラターゼの309番目のグリシンの代わりに
システインを有する大腸菌由来コリスミ酸ムターゼ／プ
レフェン酸デヒドラターゼ からなる群より選ばれるものである上記DNA断片。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/409,769 US5120837A (en) | 1989-09-20 | 1989-09-20 | Dna encoding phe a feedback inhibition resistant enzyme analogues |
| US409,769 | 1989-09-20 | ||
| PCT/US1990/005369 WO1991004263A1 (en) | 1989-09-20 | 1990-09-20 | Methods and materials for phe a feedback inhibition resistance |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04501813A JPH04501813A (ja) | 1992-04-02 |
| JPH0771499B2 true JPH0771499B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=23621887
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2513799A Expired - Lifetime JPH0771499B2 (ja) | 1989-09-20 | 1990-09-20 | ｐｈｅＡフィードバック制御に抵抗性を付与するための方法および物質 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5120837A (ja) |
| EP (1) | EP0418840B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0771499B2 (ja) |
| KR (1) | KR0146371B1 (ja) |
| AT (1) | ATE119199T1 (ja) |
| AU (1) | AU647417B2 (ja) |
| CA (1) | CA2025491C (ja) |
| DE (1) | DE69017331T2 (ja) |
| DK (1) | DK0418840T3 (ja) |
| ES (1) | ES2068300T3 (ja) |
| GR (1) | GR3015250T3 (ja) |
| HU (2) | HU215148B (ja) |
| IE (1) | IE62451B1 (ja) |
| RU (1) | RU2070575C1 (ja) |
| WO (1) | WO1991004263A1 (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5856148A (en) * | 1991-12-12 | 1999-01-05 | Wacker Chemie Gmbh | Materials and methods for biosynthesis of serine and serine-related products |
| TW313589B (ja) * | 1991-12-12 | 1997-08-21 | Wacker Chemie Gmbh | |
| US6358714B1 (en) | 1995-04-03 | 2002-03-19 | The Nutrasweet Company | Materials and methods for the production of D-phenylalanine |
| US5728555A (en) * | 1996-09-30 | 1998-03-17 | Monsanto Company | Preparation of d-amino acids by direct fermentative means |
| AR030430A1 (es) * | 2000-06-29 | 2003-08-20 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Procedimiento para la obtencion de quimicos finos por cultivo de organismos que presentan una via de shiquimato modificada, composicion de acido nucleinico, uso de dicho acido nucleinico para la obtencion de plantas transgenicas, organismo geneticamente modificado, procedimiento para la produccion d |
| US6465217B1 (en) | 2000-07-05 | 2002-10-15 | Paradigm Genetics, Inc. | Methods and compositions for the modulation of chorismate synthase and chorismate mutase expression or activity in plants |
| AU2002347019A1 (en) * | 2001-12-07 | 2003-06-17 | Novozymes A/S | Polypeptides having protease activity and nucleic acids encoding same |
| DE10247437A1 (de) | 2002-10-11 | 2004-04-29 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Feedback-resistente Homoserin-Transsuccinylasen |
| DE10249642A1 (de) * | 2002-10-24 | 2004-05-13 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Feedback-resistente Homoserin-Transsuccinylasen mit modifiziertem C-Terminus |
| RU2250261C1 (ru) * | 2003-09-30 | 2005-04-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | ПРЕФЕНАТДЕГИДРАТАЗА-ХОРИЗМАТМУТАЗА И ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ПРЕФЕНАТДЕГИДРАТАЗУ-ХОРИЗМАТМУТАЗУ, ИЗ БАКТЕРИИ Methylophilus methylotrophus |
| US8435769B2 (en) * | 2007-04-13 | 2013-05-07 | Monsanto Technology Llc | Use of glyphosate to produce shikimic acid in microorganisms |
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