JPH0771516B2 - 酵素基質の安定化のための１−アリールセミカルバジドの使用およびこの安定化剤を含有する診断薬 - Google Patents

酵素基質の安定化のための１−アリールセミカルバジドの使用およびこの安定化剤を含有する診断薬

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JPH0771516B2
JPH0771516B2 JP2413423A JP41342390A JPH0771516B2 JP H0771516 B2 JPH0771516 B2 JP H0771516B2 JP 2413423 A JP2413423 A JP 2413423A JP 41342390 A JP41342390 A JP 41342390A JP H0771516 B2 JPH0771516 B2 JP H0771516B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素加水分解によって
ロイコ色物質を形成させることができ、次いで、酸化剤
と反応させて有色物質を得ることができる酵素基質の安
定化のための１−アリールセミカルバジドの使用に関す
るものである。
【０００２】さらに、本発明は、上記酵素基質の安定化
方法に関するものである。
【０００３】また、本発明は、酵素加水分解によってロ
イコ色物質を形成させることができ、次いで、酸化剤と
反応させて有色物質を得ることができる酵素基質を含有
する酵素の比色測定用診断薬に関するものである。
【０００４】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒド
ロラーゼは、水の消費を伴って結合を加水分解的に開裂
する酵素であることが分かっている。臨床化学および診
断学において、近年、特に、エステルおよびエーテル結
合を開裂させるこれらヒドロラーゼの活性の測定は重要
になってきた。例えば、エステラーゼ、例えば白血球中
に生じるカルボキシルエステル開裂酵素、またはリン酸
エステルを加水分解するアルカリ性または酸性ホスファ
ターゼのようなホスファターゼが挙げられる。腎臓疾患
および尿生殖路の疾患の診断に関して、それらの固有の
エステル化分解活性に基づいて、尿中の白血球を検出す
るのに有用であることが証明されている。酸性ホスファ
ターゼの活性測定は、前立腺癌の早期診断に有用な手段
である。アルカリ性ホスファターゼは、酵素免疫測定法
に関して、標識酵素として使用することができる。
【０００５】グリコシダーゼ、例えばガラクトシダー
ゼ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、アミラーゼまた
はＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼは、グリ
コシド結合を開裂する。ヒトおよび動物において、これ
らは複数の生理的機能を果たす。すなわち、例えば、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼは、それによってラクトースの
加水分解が行われるので、炭水化物代謝において重要な
役割を果たす。さらに、β−Ｄ−ガラクトシダーゼは、
糖脂質、ムコ多糖類および糖蛋白の低下におけるキー酵
素である。また、生理学的に重要なグリコシダーゼとし
ては、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−およびβ−
Ｄ−グルコシダーゼならびにα−Ｄ−マンノシダーゼが
挙げられる。
【０００６】これらの生理学的価値に加えて、近年、グ
リコシダーゼは診断学の分野および遺伝子工学の分野に
おいて重要になってきた。すなわち、例えば、これらの
酵素は、酵素免疫測定法に関して、指示酵素として広範
囲に用いられる。これに関して、特に、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼの使用が挙げられる。
【０００７】体液中における酵素Ｎ−アセチル−β−Ｄ
−グルコサミニダーゼ（β−ＮＡＧase）の存在は、生
体において、疾患または機能障害に関する有用な指示薬
である。例えば、尿において、腎臓移植の場合、数値の
増大は、提供された腎臓の拒絶の指標である。多くの腎
臓に関する疾患および毒性損傷の場合にも数値の増大が
生じる。女性の唾液において、ＮＡＧase活性は、受胎
能および妊娠の指標である。
【０００８】ヒドロラーゼの検出に関して、これらは、
酵素的に開裂され、これによって、非常に弱く着色され
たかまたは好ましくは無色の開裂生成物を遊離させ、酸
化によって有色物質に転換することができる適当な基質
と混合することができる。該基質から遊離された非常に
弱く着色されたかまたは好ましくは無色の開裂生成物
は、ロイコ色物質と称する。対応する基質およびヒドロ
ラーゼ測定方法は、従来技術、例えば欧州特許出願第
０,２７４,７００号公開明細書によって公知である。
【０００９】一般に、上記測定方法は、下記式によって
示すことができる：
【化１】 Ｇ−Ｏ−Ｌは、水の存在下で適当なヒドロラーゼ酵素の
作用によって開裂生成物を生じるヒドロラーゼ基質を示
している。Ｇ−ＯＨは、対応する酸またはアルコール、
例えば糖であり得る。ＨＯ−Ｌは、酸化して有色物質Ｆ
を得ることができるロイコ色物質である。
【００１０】一般に、上記ヒドロラーゼ基質は、加水分
解によって遊離され得るロイコ色物質よりも酸化するの
がより困難である。このことは、これらヒドロラーゼ基
質がほとんど酸化剤と一緒に使用され、しばしばこれら
と接触して維持・貯蔵されるので、特に重要である。
【００１１】上記のような基質は、比色測定法が無色基
質から開始され、酵素開裂によって強く着色された最終
生成物にする場合に有利に用いられる。これは、例え
ば、基質が、例えば試験ストリップ上で、高濃度で使用
される場合、および／または測定法の可能な限り最高の
感度が達成される場合である。それ自体が既に着色され
ている基質を高濃度で使用する場合も、この固有の着色
は、低い酵素濃度の場合に測定反応によって非常に弱い
着色をおおい隠し、無感覚試験を生じることができる。
したがって、理解できるように、比較的長い貯蔵の場合
でさえ、基質が無色のままであり、該貯蔵条件下では着
色されない限り、無職のヒドロラーゼ基質の長所は唯一
維持される。したがって、比較的長期間の貯蔵および／
または比較的高温であっても結果として着色を形成しな
いような、できる限り安定である形態でこのようなヒド
ロラーゼ基質を貯蔵するようにしなければならない。
【００１２】したがって、上記のヒドロラーゼ基質に関
して安定剤が必要であり、該安定剤は、ａ）それ自体が
非常に貯蔵安定であり、とりわけ高温の場合でも着色さ
れずに長時間貯蔵することができ、ｂ）同時に存在する
酸化剤、例えばヨウ素酸塩によって酸化されず、ｃ）ヒ
ドロラーゼ基質から遊離されたロイコ色物質の酸化を防
止しない。
【００１３】ドイツ連邦共和国特許出願第２７１６０６
０号公開明細書によって、空気および光のような環境的
影響に対する酸化指示薬を安定化する１−アリールセミ
カルバジドが公知である。これら酸化指示薬は、過酸化
水素の比色検出に役立つ。したがって、理解できるよう
に、これらは、強い酸化剤の存在下では貯蔵されない。
酸化指示薬の安定化は、指示薬と検出されるべき酸化剤
との測定反応を防止しない。
【００１４】この従来技術に関して、もちろん、１−ア
リールセミカルバジドは、強い酸化剤の存在下で反応せ
ず、他方、測定されるべき酵素による加水分解の後、対
応するロイコ色物質の酸化によって、色形成によってこ
の酵素の存在を障害なく示さなければならないので、１
−アリールセミカルバジドが、それ自体が酸化指示薬で
はない上記ヒドロラーゼ基質を安定にすることができる
ことを確認することは驚くことであった。
【００１５】
【課題を解決するための手段】酵素加水分解によってロ
イコ色物質を形成させることができ、次いで、酸化剤と
反応させて有色物質を得ることができる本発明のヒドロ
ラーゼ基質の安定化は、特許請求の範囲に特性を記載し
た。
【００１６】すなわち、本発明は、酵素加水分解によっ
てロイコ色物質を形成させることができ、次いで、酸化
剤と反応させて有色物質を得ることができる酵素基質の
安定化のための一般式[Ｉ]： Ａr−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯＮＨ2 [Ｉ] （式中、Ａrは、場合によってアルキル、アルコキシま
たはハロゲン原子によって置換されていてもよいアリー
ル基を意味する）で示される１−アリールセミカルバジ
ドの使用を提供するものである。
【００１７】さらに、本発明は、酵素加水分解によって
ロイコ色物質を形成させることができ、次いで、酸化剤
と反応させて有色物質を得ることができる酵素基質の安
定化方法であって、該基質を一般式[Ｉ]： Ａr−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯＮＨ2 [Ｉ] （式中、Ａrは、場合によってアルキル、アルコキシま
たはハロゲン原子によって置換されていてもよいアリー
ル基を意味する）で示される１−アリールセミカルバジ
ドと接触させることを特徴とする安定化方法を提供する
ものである。
【００１８】また、本発明は、酵素加水分解によってロ
イコ色物質を形成させることができ、次いで、酸化剤と
反応させて有色物質を得ることができる酵素基質を含有
する酵素の比色測定用診断薬であって、酵素基質の安定
化のために、一般式[Ｉ]： Ａr−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯＮＨ2 [Ｉ] （式中、Ａrは、場合によってアルキル、アルコキシま
たはハロゲン原子によって置換されていてもよいアリー
ル基を意味する）で示される１−アリールセミカルバジ
ドを含有することを特徴とする診断薬を提供するもので
ある。
【００１９】一般式[Ｉ]で示される１−アリールセミカ
ルバジドの定義における“アリール"は、炭化水素残基
を表し、好ましくは、６〜１０個の環原子を有するもの
であり、特に好ましくはフェニルまたはナフチル基であ
る。
【００２０】“アルキル"は、炭素原子６個まで、好ま
しくは４個までを含有する直鎖状または分枝鎖状アルキ
ル基を表す。この例としては、メチル、エチル、プロピ
ル、イソブチルおよびtert−ブチル基が挙げられ、メチ
ルおよびエチル基が好ましい。
【００２１】“アルコキシ"は、炭素原子６個まで、好
ましくは４個までを含有する直鎖状または分枝鎖状アル
コキシ基を表す。この例としては、メトキシ、エトキ
シ、プロポキシ、イソブトキシおよびtert−ブトキシ基
が挙げられ、メトキシおよびエトキシ基が好ましい。
【００２２】“ハロゲン原子"は、フッ素原子、塩素原
子、臭素原子またはヨウ素原子が挙げられ、好ましくは
塩素原子である。
【００２３】ｏ−クロロ−、ｍ−クロロ−、ｐ−クロロ
−、ｏ−メチル−、ｍ−メチル−、ｐ−メチル−、ｏ−
メトキシ−、ｍ−メトキシ−、ｐ−メトキシ−および非
置換−フェニルセミカルバジドならびにナフチルセミカ
ルバジドは、本発明の使用に特に有用であることが分か
った。メチルフェニルセミカルバジドおよびフェニルセ
ミカルバジドは、非常に好適であり、ｐ−メチルフェニ
ルセミカルバジドが特に好ましい。
【００２４】本発明の一般的[Ｉ]で示される１−アリー
ルセミカルバジドは、例えばフェリシアン化カリウム、
過ホウ酸塩、ペルオキシダーゼ／過酸化水素および好ま
しくはヨウ素酸塩、例えばヨウ素酸カリウムのような強
い酸化剤の非存在下だけではなく、該酸化剤の存在下で
も、前記のようなヒドロラーゼ基質の貯蔵安定性を増大
させる。
【００２５】安定化の効果は、場合によって、酸化剤お
よび固体の非溶解１−アリールセミカルバジドと混合し
た、溶液中、特に水溶液中に存在する基質、または特
に、固体の非溶解ヒドロラーゼ基質であり、これは、例
えば、結晶、粉末、凍結乾燥品または錠剤に打錠された
固形物である。ヒドロラーゼ基質の着色の予防のための
形態での安定化は、ヒドロラーゼ基質および酸化剤が、
例えば紙または高分子膜のような吸収剤または膨潤可能
な担体の中またはその上に担体結合しているか、あるい
はヒドロラーゼ基質および酸化剤が、互いに直接接触し
ているが分離している担体物質中またはその上に存在し
ている試験担体の場合、好ましくは可能である。
【００２６】ヒドロラーゼの測定用試験担体を添付の図
１および図２に示す。
【００２７】図１は、ヒドロラーゼ酵素の比色測定用試
験担体(１)の側面図である。好ましくは強い合成物質に
よって形成された担体ホイル(２)上に、被覆メッシュ
(４)によって吸収剤担体(３)を固定し、該被覆メッシュ
(４)を該担体ホイル(２)上に溶融接着剤(５)によって固
定した。吸収剤担体(３)は、例えば、測定に必要な試
薬、特にヒドロラーゼ基質、酸化剤および安定化剤を含
浸させた紙からなっていてよい。該試薬は、溶液から一
度に、すなわち、一段階で、試薬担体(３)に適用され得
るか、あるいは、それらは、分離溶液による含浸によっ
て数段階で含浸させ得る。好ましくは、該試薬担体(３)
に、まず、測定反応に必要なｐＨ値に調節した緩衝溶液
中にできる限り溶解した酸化剤の溶液を含浸させ、次い
で、乾燥させ、その後、ヒドロラーゼ基質および本発明
の安定化剤を含有する溶液で２度目の含浸を行う。
【００２８】図２は、ヒドロラーゼ酵素の比色測定用試
験担体(６)の側面図である。図１の試験担体と同様の方
法で構成される。しかしながら、溶融接着剤(５)で担体
ホイル(２)に固定され、吸収剤担体(３)から離れている
被覆メッシュ(４)の下にメッシュ(７)を含んでいる。好
ましくは高分子性物質からなっているこのメッシュは、
酸化剤を含浸している。該試薬担体(３)は、ヒドロラー
ゼ基質、安定化剤および場合によって測定反応を行うの
に必要なｐＨ値に調節するための緩衝物質を含有しい
る。
【００２９】図１または図２の試験担体の被覆メッシュ
(４)に関して、ヒドロラーゼ含有溶液を適用する場合、
あるいは試験担体がこのような容器に浸漬される場合、
該試料は、被覆メッシュ(４)を介して、含浸された試薬
の溶解によって、吸収剤担体(３)中に浸透する。ヒドロ
ラーゼが存在する場合、前記の反応が生じ、最後に有色
物質が形成され、これは、試験担体上で肉眼で評価され
得るか、あるいは測光的にレミッションを測定すること
ができ、したがって、研究される試料中で測定され得る
酵素の濃度に関する結果が得られる。
【００３０】本発明の一般式[Ｉ]で示される１−アリー
ルセミカルバジドの使用の場合、前記のヒドロラーゼ基
質の顕著な安定化が生じることが分かった。この安定化
は、特に、それらが、単独で、または酸化剤、例えばヨ
ウ素酸塩と一緒に貯蔵される場合、特に、高温の場合お
よび光の作用下で、このようなヒドロラーゼ基質の着色
を実質的に低下させるかまたは完全になくすることによ
って確認され得る。安定化の達成に関して、ヒドロラー
ゼ基質および１−アリールセミカルバジドは、研究しよ
うとする液体と接触させた後、試料液中の一般式[Ｉ]で
示される１−アリールセミカルバジドの濃度が０.２５
〜５０ミリモル／リットルであり、特に０.５〜２０ミ
リモル／リットルであるように混合されるのが好まし
く、同一条件下の酵素基質の濃度は、２.５〜５０ミリ
モル／リットルであり、特に好ましくは、５〜３０ミリ
モル／リットルである。試薬が、試験担体、例えば、図
１および図２のものに使用される場合、上記濃度は、使
用される担体物質の含浸に使用される溶液の濃度に相当
する。
【００３１】前記のヒドロラーゼ基質への一般式[Ｉ]で
示される１−アリールセミカルバジドの安定化効果は、
中性およびアルカリ性媒質中だけでなく、特に約３.５
からの酸性ｐＨ範囲中でも現れる。
【００３２】特に、図２の試験担体の場合、試薬紙(３)
がヒドロラーゼ基質および１−アリールセミカルバジド
以外にアスコルビン酸またはチオ硫酸塩を含有する場
合、ヒドロラーゼ基質の安定化を低減せずに、アリール
セミカルバジドの濃度を減少させ得ることが分かった。
しかしながら、試料を適用し、次いで試薬成分を混合す
る場合、アスコルビン酸またはチオ硫酸塩が非常に迅速
に酸化され、次いで、酵素的に形成されたロイコ色物質
に対して充分量の酸化剤がまだ利用可能であるほどに、
メッシュ(７)中の酸化剤の量が非常に多いことに注意す
べきである。このようなアスコルビン酸またはチオ硫酸
塩の添加によって、１−アリールセミカルバジドの濃度
が減少するだけではなく、驚くことに、ヒドロラーゼ測
定の場合にさらに迅速な発色が観察される。
【００３３】安定化のための一般式[Ｉ]で示される１−
アリールセミカルバジドの使用は、加水分解によって３
−ヒドロキシインドールまたはインドール核が置換され
た３−ヒドロキシインドール、例えば５−ブロモ−４−
クロロ−３−ヒドロキシインドールを生じるヒドロラー
ゼ基質に関して特に効果的であることが分かった。
【００３４】一般式[Ｉ]で示される１−アリールセミカ
ルバジドの使用は、一般式[II]：
【化２】 ｛式中、Ｇは、無機酸もしくは有機酸の残基またはグリ
コシド基であり、Ｒ1およびＲ2は、同一または異なって
いてもよく、水素原子、ハロゲン原子、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3
Ｈ2もしくはこれらの酸の基の塩、ヒドロキシル、ニト
ロ、カルボキシル、カルボキシアミドもしくはシアノ、
あるいは場合によって１つまたはそれ以上のヒドロキシ
ル、カルボキシル、ハロゲン原子、シアノ、ＳＯ3Ｈも
しくはＰＯ3Ｈ2またはこれらの酸残基のうちの１つの塩
によって置換されていてもよいアルキル、アルケニル、
アルコキシ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニ
ル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、アリ
ールもしくはアラルキル基であるか、あるいは隣接する
炭素原子に２つの置換基が存在する場合は、一緒になっ
て、場合によって１つまたはそれ以上のＳＯ3Ｈ、ＰＯ3
Ｈ2もしくはこれらの酸の基の塩、アルキルおよび／ま
たはカルボキシル基によって置換されていてもよい１,
４−ブタジエンジイル基を表し、Ｒ3は、水素原子、−
ＣＯ−ＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2もしくはこれらの
酸の基の塩、場合によって１つまたはそれ以上のハロゲ
ン原子、ＣＯＯＨ、ＳＯ3Ｈおよび／またはＰＯ3Ｈ2も
しくはこれらの酸の基の塩によって置換されていてもよ
いアルキルカルボニル基、または場合によって１つまた
はそれ以上のＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2もしくはこれらの酸の
基の塩によって置換されていてもよいアリールカルボニ
ル基であり、Ｌは、一般式[III]：
【化３】 ［式中、Ｒ4およびＲ5は、同一または異なっていてもよ
く、アルキル基であるか、または一緒に酸素原子、硫黄
原子または窒素原子を含み得る３〜６員の飽和炭化水素
鎖であり（ここで、該アルキルまたは炭化水素鎖は、場
合によって１つまたはそれ以上のヒドロキシル、カルボ
キシル、アルコキシカルボニル、アルコキシ、ＳＯ3Ｈ
またはＰＯ3Ｈ2、これらの酸の基の塩またはハロゲン原
子によって置換されていてもよい）、Ｒ6およびＲ7は、
同一または異なっていてよく、水素原子、ハロゲン原
子、ヒドロキシルもしくはカルボキシアミド基、または
場合によって１つまたはそれ以上のヒドロキシル、カル
ボキシル、ハロゲン原子、ＳＯ3ＨまたはＰＯ3Ｈ2もし
くはこれらの酸の基の塩によって置換されていてもよい
アルキル、アルコキシ、アルキルカルボニル、アルコキ
シカルボニル、アリールまたはアラルキル基である］で
示される基であるか、あるいは、Ｌは、一般式[IV]：
【化４】 ［式中、−Ｘ−Ｙ−は、−ＮＲ8−ＣＯ−または−Ｎ＝
ＣＲ9−であり、Ｒ8は、水素原子またはアルキル基であ
り、Ｒ9は、場合によってヒドロキシル、ジアルキルホ
スフィニル、カルボキシル、ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2、これ
らの酸の基の塩および／またはアルコキシカルボニルに
よって置換されていてもよいアルキル、アルケニル、ア
ルコキシ、アルキルチオ、アリール、アラルキル；場合
によって１つまたは２つのアルキル基で置換されていて
もよいアミノ（ここで、該アルキル基は、場合によって
１つまたはそれ以上のヒドロキシル、カルボキシルおよ
び／またはアルコキシカルボニル基によって置換されて
いてもよく、該アミノが２つのアルキル基によって置換
されている場合、これらの基は一緒に結合して、該アミ
ノ基の窒素原子から離れて、場合によって酸素原子、硫
黄原子または別の窒素原子を含んでいてもよい環を形成
し得る）、または１つまたは２つのアシル基、アルコキ
シおよび／またはアラルコキシカルボニル基、Ｈ2Ｎ−
ＣＯ−、アルキル−アラルキル−および／またはアリー
ルカルバモイル基によって置換されていてもよいアミ
ノ；または水素原子、カルボキシル、アルコキシカルボ
ニル、カルボキシアミドまたはハロゲン原子であり、Ｚ
は、−ＮＲ10−Ｎ＝Ｎ−（ここで、Ｒ10は、水素原子ま
たはアルキルもしくはアラルキル基である）であるか、
あるいは、Ｚは、窒素原子または炭素原子および場合に
よって１つまたはそれ以上の硫黄原子または窒素原子か
ら選択された３〜５員を含む不飽和鎖である（ここで、
炭素原子は、アルキル、アルコキシ、ヒドロキシアルキ
ル、アルキルチオ、ヒドロキシル、アラルキル、アリー
ル、カルボキシル、カルボキシアミド、アルコキシカル
ボニル、シアノ、アミノ（ここで、該アミノは場合によ
って１つまたは２つのアルキル基によって置換されてい
てもよく、該アルキル基は、場合によって１つまたはそ
れ以上のヒドロキシル、カルボキシルおよび／またはア
ルコキシカルボニル基によって置換されていてもよ
い）、および／またはハロゲン原子によって置換されて
おり；二重結合を介して結合しておらず、場合によって
アルキルまたはアラルキルまたは２つの隣接する鎖状置
換基で置換されていてもよい窒素原子は、場合によって
アリールまたは対応する互変異性体の基で置換されてい
るかまたは縮合されていてもよいアルキレン基を形成す
る。）］で示されるピラゾロ−複素環の基である｝で示
されるヒドロラーゼ基質の安定化に特に有用であること
が分かった。
【００３５】Ｇの定義における無機酸残基に関して、特
に、エステル結合によってアミノフェノール基本構造と
結合しているオルト−もしくはピロリン酸残基または硫
酸残基が挙げられる。好ましくはＰＯ3ＭＭ'およびＳＯ
3Ｍの残基、特にＰＯ3ＭＭ'の残基である（ここで、遊
離酸の場合、ＭおよびＭ'は水素原子であり、該酸が塩
の形態である場合、ＭおよびＭ'はアルカリ金属、アル
カリ土類金属またはアンモニウムイオンである）。
【００３６】ＭおよびＭ'の定義におけるアルカリ金属
イオンに関して、リチウム、ナトリウムおよびカリウム
イオンが挙げられる。アルカリ土類金属イオンは、特
に、マグネシウム、カルシウムおよびバリウムイオンで
ある。
【００３７】ＭおよびＭ'の定義におけるアンモニウム
イオンとしては、非置換アンモニウムイオンＮＨ4 +、ま
たは１つまたはそれ以上のアルキルもしくはアラルキル
基によって置換されているアンモニウムイオンが挙げら
れる。この場合、アルキル基としては、６個までの炭素
原子を含むものが挙げられ、好ましくはメチルおよびエ
チル基である。アラルキル基に関して、上記定義のアル
キル基がアリール基によって置換されているものが挙げ
られ、該アリールは、炭素芳香族またはヘテロ芳香族の
基であり、好ましくは、６〜１０個の環原子を含有する
ものであり、特に、フェニルまたはナフチル基である。
好ましいアラルキル基は、ベンジル基である。置換され
たアンモニウムイオンの置換基は、同一または異なって
いてもよい。第４級窒素−複素環化合物の陽イオンは、
アンモニウムイオンとして使用することもできる。その
例として、ピペリジニウム陽イオンおよびピリジニウム
イオンが挙げられる。
【００３８】Ｇの定義における有機酸残基に関して、特
に、アルカンカルボン酸、アミノ酸およびオリゴペプチ
ドの残基が挙げられ、これらは、一般式[II]で示される
アミノフェノール基本構造においてエステルとして結合
しているそのカルボキシル末端を介して存在している。
【００３９】Ｇの定義におけるアルカンカルボン酸残基
は、２０個までの炭素原子を含有する化合物である。特
に好ましくは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、パルミチン
酸およびステアリン酸である。飽和酸残基に加えて、Ｇ
は、不飽和酸残基、例えばオレイン酸、リノール酸、ま
たはリノレン酸の残基であり得る。
【００４０】アミノ酸残基は、好ましくは、Ｌ−もしく
はＤ−型またはラセミ型の天然α−アミノ酸の残基であ
る。特に好ましくは、グリシン、アラニン、バリン、ロ
イシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびチロシ
ンの残基であり、この場合、Ｌ−型が非常に好ましい。
【００４１】オリゴペプチド残基に関して、例えば、ジ
−、トリ−、テトラ−またはペンタペプチドが挙げら
れ、好ましくはジ−またはトリ−ペプチドである。ここ
で、アミノ酸成分としては、上記アミノ酸を用いるのが
好ましい。
【００４２】アミノフェノール基にエステルによって結
合しているアミノ酸またはオリゴペプチド残基のアミノ
基は、遊離または保護形であってよい。保護基として
は、全ての慣用のアミノ保護基が挙げられ、特に、アシ
ル、オキシカルボニル、チオカルボニル、スルホ、スル
フィノ、ビニル、シクロヘキセニル、ホスホリルまたは
カルバモイル基である。特に好ましいアミノ保護基は、
トシル、ベンジルオキシカルボニルおよびtert−ブトキ
シカルボニル基である。
【００４３】Ｇの定義におけるグリコシド基は、単糖類
またはオリゴ糖類であり得る。該糖残基は、α−または
β−グリコシド的にアミノフェノール基本構造に結合し
得る。好ましい単糖類の例は、ガラクトース、グルコー
スおよびマンノースである。Ｎ−アセチルグルコサミン
が特に好ましく、β−グリコシド的に結合したＮ−アセ
チル−２−Ｄ−グルコサミンが非常に好ましい。
【００４４】しかしながら、オリゴ糖は、糖残基として
も使用することができる。これらの化合物は、２〜１０
個、好ましくは２〜７個の単糖単位からなっているオリ
ゴ糖であり、特に好ましくはヘプトースである。
【００４５】Ｇで示される有機酸および無機酸の残基お
よびグリコシド残基の群のうち、一般式[II]で示される
化合物に関して、グリコシド残基が好ましい。このよう
なＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ基質が一
般式[Ｉ]で示される１−アリールセミカルバジドによっ
て特によく安定化されるので、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン残基が非常に好ましい。
【００４６】特記しない限り、各一般式において以下の
意味を有する以下の基を用いた：単独およびアルキルス
ルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルカルボニ
ル、アルキルチオ、アルキルカルバモイル、アルキルア
ミノ、ジアルキルホスフィニルおよびアラルキル基の中
の“アルキル”は、６個まで、好ましくは４個までの炭
素原子を含有する直鎖状または分枝鎖状のアルキル基を
意味する。この例としては、メチル、エチル、プロピ
ル、イソブチルおよびtert−ブチル基が挙げられる。
【００４７】アミノ基が２つのアルキルによって置換さ
れている場合、これらの基は、結合して全体として窒素
原子を含む環になるような方法で環を形成することがで
きる。これらのアミノ基は、酸素原子、硫黄原子または
他の窒素原子を含み得る全体として５または６員を含有
する環を表すものが好ましい。モルホリノ基が特に好ま
しい。ヒドロキシアルキル基は、ヒドロキシル基によっ
て置換されている、６個まで、好ましくは４個までの炭
素原子を有するアルキル基である。該ヒドロキシアルキ
ル基は、第１級、第２級または第３級アルコールの残基
であり得る。２−および１−ヒドロキシエチルおよびヒ
ドロキシメチル基が特に好ましい。
【００４８】単独およびアルコキシカルボニルおよびア
ラルコキシカルボニル基中の“アルコキシ”は、６個ま
で、好ましくは４個までの炭素原子を有するアルコキシ
基である。この例としては、メトキシ、エトキシ、プロ
ポキシ、イソブトキシおよびtert−ブトキシ基が挙げら
れる。
【００４９】単独およびアリールカルボニルおよびアリ
ールカルバモイル基中の“アリール"は、炭素芳香族ま
たはヘテロ芳香族の基を表し、好ましくは６〜１０個の
環原子を有しており、特に好ましくはフェニル基または
ナフチル基であり、これらは、アルキル、アルコキシお
よび／またはハロゲン原子によってさらに置換されてい
てもよく、フェニル基が特に好ましい。
【００５０】単独またはアラルキルカルバモイル基中の
“アラルキル"基は、上記定義のアルキルがアリール基
によって置換されている基を表し、ベンジル基が好まし
い。
【００５１】例えばアラルコキシカルボニル基中の、
“アラルコキシ"基は、上記定義のアルコキシ基がアリ
ール基によって置換されている基を表し、ベンジルオキ
シ基が好ましい。
【００５２】“ハロゲン原子"は、フッ素原子、塩素原
子、臭素原子またはヨウ素原子を表し、フッ素原子およ
び塩素原子が好ましい。
【００５３】“アルケニル"は、２〜６個、好ましくは
２〜４個の炭素原子を有する不飽和炭化水素基を表し、
ビニル基およびアリル基が好ましい。
【００５４】アシル基は、アルキル、アラルキルまたは
アリール部分を含有し得るカルボン酸残基であり、アセ
チル、フェニルアセチルおよびベンゾイル基が好まし
い。
【００５５】アルキレン基に関して、２つの非結合部分
を有し、３〜５個、好ましくは３〜４個の炭素原子を有
する直鎖状または分枝鎖状の、飽和または不飽和炭化水
素鎖が挙げられる。この例としては、−ＣＨ2−ＣＨ＝
ＣＨ−、
【化５】
【化６】 −(ＣＨ2)4−および−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−が挙げ
られる。ブタジエンジイル基（−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｃ
Ｈ−）およびテトラメチレン基（−(ＣＨ2)4−）が好ま
しい。
【００５６】ジアルキルホスフィニル基に関して、
【化７】 （ここで、アルキルは、前記定義と同じである）で示さ
れる基が挙げられ、ジメチルホスフィニル基が好まし
い。
【００５７】ＳＯ3Ｈ、ＰＯ3Ｈ2およびカルボキシル基
の塩としては、アルカリ金属およびアルカリ土類金属塩
ならびにアンモニウム塩を用いることができる。アルカ
リ金属塩に関して、リチウム、ナトリウム、カリウム、
ルビジウムおよびセシウム塩が挙げられ、好ましくはリ
チウム、ナトリウムおよびカリウム塩であり、特に好ま
しくはナトリウム塩およびカリウム塩である。アルカリ
土類金属塩は、ベリリウム、マグネシウム、カルシウ
ム、ストロンチウムおよびバリウムが挙げられ、好まし
くは、マグネシウムおよびカルシウムであり、特に好ま
しくはカルシウム塩である。アンモニウム塩に関して、
非置換アンモニウムイオンＮＨ4 +を使用することができ
る。しかしながら、該アンモニウムイオンが４つまでの
アルキル、アリールまたはアラルキル基によって置換さ
れているこれらのアンモニウム塩を使用することもでき
る。これらの基に関しては前記定義が適用される。ここ
で、アルキル基に関しては、メチル、エチルおよびｎ−
プロピルが好ましく、アリール基に関しては、フェニル
基が好ましく、アラルキル基に関しては、ベンジル基が
好ましい。アンモニウムイオンに関しては、第４級窒素
複素環化合物の陽イオンを使用することもできる。この
例としては、ピペリジニウム陽イオンおよびピリジニウ
ムイオンが挙げられる。
【００５８】カルボキシアミド基に関しては、−ＣＯＮ
Ｈ2基が挙げられるが、該アミノ基が、場合によって１
つまたは２つのアルキル基（ここで、該アルキル基は、
１つまたはそれ以上のヒドロキシル、カルボキシルおよ
び／またはアルコキシカルボニル基によって置換されて
いてもよい）によって置換されていてもよい基であって
もよい。
【００５９】Ｒ3が水素原子、または１つまたはそれ以
上のハロゲン原子によって置換されているアルキルカル
ボニル基、好ましくはトリフルオロアセチル基であるこ
れらヒドロラーゼ基質が特に好ましい。Ｒ3の定義に関
して、水素原子が特に好ましい。
【００６０】Ｌが一般式[IV]で示されるピラゾロ−複素
環基である一般式[II]で示される本発明化合物は、特に
良好に安定化可能である。これらのうち、一般式[IV]に
おいて、Ｚが、不飽和鎖のうち少なくとも１つの二重結
合が二重結合または窒素原子と結合するような位置であ
るものが特に好ましい。
【００６１】また、Ｌが一般式[IV]で示されるピラゾロ
−複素環基である（ここで、不飽和鎖Ｚにおいて、該不
飽和鎖は、二重結合を介して結合していない窒素原子を
含有している場合、アルキルまたはアラルキル基によっ
て置換されている）一般式[II]で示される化合物が特に
好ましい。
【００６２】一般式[IV]で示される基に関して、互変異
性体も可能である。これらは、一般式[IV]に含まれると
考えることもできる。
【００６３】本発明の好ましく安定化可能である一般[I
I]で示される化合物は、Ｌが下記一般式[Ｖ]〜[XVI]で
示される基から選択された基および対応する互変異性体
である化合物である：
【化８】
【００６４】ここで、Ｘ−ＹおよびＲ10は、前記定義と
同じである。Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14は、同一また
は異なっていてよく、水素原子、ヒドロキシル、アルキ
ル、アルコキシ、アルキルチオ、アラルキル、アリー
ル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、カルボキシ
アミド、シアノ、アミノ（ここで、該アミノは、場合に
よって１つまたは２つのアルキル基によって置換されて
いてもよく、該アルキル基は、１つまたはそれ以上のヒ
ドロキシル、カルボキシルおよび／またはアルコキシカ
ルボニル基で置換されていてもよい）、またはハロゲン
原子であり、ここで、２つの隣接する基は、場合によっ
てアルキレン基を形成することができ、該アルキレン基
は、場合によってアリールによって置換されているかま
たは縮合されている。これらの基の定義は、前記定義と
同じである。
【００６５】本発明の好ましく安定化可能な基質は、Ｌ
が一般式[Ｖ]、[VI]、[VII]、[IX]、[Ｘ]および[XII]で
示されるものおよび対応する互変異性体から選択された
基である一般式[II]で示される基質である。Ｘ−ＹがＮ
＝ＣＲ9（ここで、Ｒ9は一般式[IV]における定義と同じ
であり、水素原子またはアルコキシ基が好ましい）であ
る化合物が特に好ましい。
【００６６】本発明の定義において顕著に安定化させる
ものは、特に、(４−ヒドロキシフェニル)−(２−メチ
ルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イル)−アミンお
よび(４−ヒドロキシフェニル)−(ピラゾロ[１,５−ａ]
ピリジン−３−イル)−アミンのβ−グリコシド的結合
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニドである。
【００６７】一般式[II]で示される化合物は、一般式[X
VII]：
【化９】 （式中、Ｒ1〜Ｒ3およびＬは、一般式[II]における定義
と同じであり、Ａは水素原子、場合によって置換された
アンモニウムイオンまたはアルカリ金属である)で示さ
れるロイコアゾメチン色物質を、一般式[XVIII]： Ｇ−Ｄ [XVIII] （式中、Ｇは、一般式[II]における定義と同じ有機酸も
しくは無機酸の残基またはグリコシド残基であり、グリ
コシド基中に存在する官能基、例えばアミノおよび／ま
たはヒドロキシル基が場合によってペプチドおよび炭水
化物化学において慣用である保護基で置換されていても
よく、Ｄは、反応性基である）で示される化合物と反応
させることによって製造することができ、その後、保護
基を分離させることができる。
【００６８】非置換アンモニウムイオンは、ＮＨ4 +であ
る。このイオンは、一般式[XVII]におけるＡの定義にお
いて、このイオンは、場合によって１つまたはそれ以上
の前記で定義されたアルキルまたはアラルキル基によっ
て置換され得る。置換アンモニウムイオンの置換基は、
同一または異なっていてもよい。アンモニウムイオンに
関して、第４級窒素複素環化合物の陽イオンを使用する
こともできる。例えば、ピペリジニウム陽イオンおよび
ピリジニウムイオンが挙げられる。
【００６９】一般式[XVII]におけるＡの定義におけるア
ルカリ金属は、特に、リチウム、ナトリウムまたはカリ
ウムであり、ナトリウムが特に好ましい。
【００７０】Ｄは、一般式[XVII]におけるフェノールま
たはフェノラート基ＯＡと反応させることができる反応
性基である。該反応性基の選択は、基Ｇの性質に依存す
る。Ｇが糖残基である場合、Ｄは、置換が容易な基が好
ましく、例えばアセチル基またはハロゲン原子であり、
該ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子お
よびヨウ素原子から選択され得、この場合、塩素原子、
臭素原子およびヨウ素原子が好ましい。
【００７１】炭水化物化学において慣用である保護基に
関して、特に、アセチル、ベンゾイル、ベンジルおよび
トリメチルシリル基が挙げられる。
【００７２】Ｇがアミノ酸またはペプチド残基であり、
そのカルボキシル末端と一般式[XVII]で示されるアミノ
フェノールとによってエステル化されることができる場
合、反応性基Ｄとしては、ペプチド化学において慣用で
ある基を使用することができる。反応性誘導体として、
例えば、酸ハロゲン化物、好ましくは酸塩化物、または
通常ペプチド合成に使用される無水物および活性エステ
ルの混合物が使用される。同一の反応性基は、アルカン
カルボン酸とアミノフェノール構造との結合に関して使
用することもできる。
【００７３】Ｇが無機酸残基である場合、一般式[XVII]
で示される化合物は、対応する酸ハロゲン化物、特に酸
塩化物と好ましく反応させることができる。
【００７４】各々の場合、エステル化の場合、一般式[X
VII]におけるＲ3が水素原子である場合、エステル化反
応を行う前に、このアミノ基を、保護基、例えばペプチ
ド化学においてこの目的に慣用的に使用される保護基で
置換し、次いで、再度、この保護基を除去することに注
意すべきである。
【００７５】例として、一般式[II]で示される化合物の
製造方法を、ＧがＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニ
ド基である特に好ましく安定化可能である化合物の例を
用いて説明する。この製造方法は、一般式[II]で示され
る他のグリコシド誘導体の製造にも同様に用いることが
できる。
【００７６】一般式[II]で示されるＮ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニジル誘導体は、一般式[XVIII]で示さ
れる化合物として、一般式[XIX]：
【化１０】 （式中、Ｗはハロゲン原子であり、Ｒは炭水化物化学に
おいて慣用的なヒドロキシル保護基であり、Ｂはアジド
基、保護アミノ基または−ＮＨ−ＣＯＣＨ3基である
か、あるいは、ＢとＷは一緒に
【化１１】 を表す）で示される化合物を、一般式[XVII]：
【化１２】 （式中、Ｒ1〜Ｒ3およびＬは、一般式[II]における定義
と同じであり、Ａは水素原子、場合によって置換されて
いるアンモニウムイオンまたはアルカリ金属である）で
示される化合物と反応させ、Ｂが保護アミノ基である場
合、該アミノ保護基を除去し、Ｂがアジド基である場
合、これを還元によってアミノ基に転換し、該アミノ基
をアセチル化によって−ＮＨＣＯＣＨ3基に転換し、次
いで、ヒドロキシル保護基を分離する。
【００７７】例えば、前記一般式[XVII]で示されるロイ
コアゾメチン色物質と一般式[XIX]：
【化１３】 （式中、Ｗはハロゲン原子であり、Ｂは−ＮＨＣＯＣＨ
3基であり、Ｒは炭水化物化学において慣用的な保護基
である）で示されるペル−Ｏ−置換１−ハロ−Ｎ−アセ
チルグルコサミンとを糖残基のＣ−１原子におけるワル
デン反転によって反応させて、ペル−Ｏ−置換β−グリ
コシドを得、公知の方法によって後者からヒドロキシル
保護基を分離する。
【００７８】一般式[II]で示されるＮ−アセチル−β−
Ｄ−グルコサミニドを得るための前記一般式[XVII]で示
される化合物と一般式[XIX]で示される化合物との反応
は、アセトン水溶液中、または水／ベンゼンもしくは水
／クロロホルム混合物における相転換条件下、酸レセプ
ター、例えば水酸化アルカリ金属、炭酸アルカリ金属、
重炭酸アルカリ金属の存在下で行うのが好ましい(シン
セシス(Ｓynthesis）、２２３／１９８８参照）。
【００７９】また、一般式[II]で示されるＮ−アセチル
−β−Ｄ−グルコサミニドは、Ａが水素原子である一般
式[XVII]で示されるロイコアゾメチン色物質を、まず水
酸化アルカリ金属またはアルカリ金属アルコラートでア
ルカリ金属塩に転換するか、あるいは場合によって置換
されていてもよいアミンでアンモニウム塩に転換するこ
とによって製造することができ（ここで、アルカリ金属
およびアンモニウムイオンは、前記定義と同じであ
る）、次いで、これを、双極性中性溶媒、例えばアセト
ン、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタンまたはジメ
チルホルムアミド中、ペル−Ｏ−置換１−ハロ−Ｎ−ア
セチルグルコサミンと反応させる。
【００８０】また、一般式[XVII]で示されるロイコアゾ
メチン色物質および１−ハロ−Ｎ−アセチルグルコサミ
ンによる一般式[II]で示されるＮ−アセチルグルコサミ
ニドの合成の場合、場合によって乾燥剤、例えば塩化カ
ルシウムまたはドライエリット（ＤrieritR）の使用と
共に、溶媒、例えば塩化メチレン、クロロホルム、ベン
ゼン、トルエンまたはジオキサン中で、個々の銀塩もし
くは銀塩の混合物（酸化銀、炭酸銀−セライト（Ｃelit
eR）、銀トリフラート、サリチル酸銀）および／または
個々の水銀塩もしくは水銀塩の混合物（臭化水銀、シア
ン化水銀、酢酸水銀、酸化水銀）の添加が有用であるこ
とが分かった。
【００８１】また、ＢおよびＷが一緒に
【化１４】 を形成する一般式[XIX]で示されるオキサゾリンは、一
般式[II]で示されるＮ−アセチルグルコサミニドの合成
に関して、有機酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸、ま
たは三フッ化ホウ素エーテル(boron trifluoride ether
eate)のようなルイス酸または塩化第二鉄の存在下で用
いることができる。このようなグリコシド化反応の例
は、カルボハイドレート・リサーチ（Ｃarbohydrate Ｒ
esearch）、１３６、３０９−３２３／１９８５および
６４、３３４−３３８／１９７８に開示されている。
【００８２】また、一般式[II]で示されるＮ−アセチル
グルコサミニドの製造方法は、Ｂが、保護基（例えばベ
ンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ジ
クロロアセトアミドもしくはフタルイミド基)、または
アミノ基を遊離させることができるグリコシド化条件下
で安定な適当な置換基（例えばアジド基）で置換されて
いるアミノ基である一般式[XIX]で示される化合物にお
いて行うことができる。グリコシド化反応は、ペプチド
化学の方法にしたがって保護基を分離することまたはア
ジド基を還元することによって、アミノ基を遊離させ、
最後に、選択的にＮ−アセチル化することによって行わ
れる（例えば、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミ
ストリー(Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.)、３２、３７６７／１９６７
参照)。
【００８３】保護基の分離は、炭水化物化学によって公
知の方法で、ベンジル型の保護基の場合は水素化分解に
よって、アシル基（例えばアセチル基）を分離するた
め、メタノール中でナトリウムメチラート、シアン化ナ
トリウムまたは重炭酸ナトリウムの作用によって行われ
る。保護基を分離する方法は、Ａdv.Ｃarbohydr.Ｃhem.
Ｂiochem.、３９、１３／１９８１に開示されている。
【００８４】１−ハロ−Ｎ−アセチルグルコサミンの合
成は、例えば、オーガニック・シンセシス（Ｏrg.Ｓynt
h.）、４６、１；メソッズ・イン・カルボハイドレート
・ケミストリー（Ｍethods in Ｃarbohydrate Ｃhe
m.）、６、２８２／１９７２およびジャーナル・オブ・
オーガニック・ケミストリー（Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.）、２
６、４４５／１９６１に開示されている。
【００８５】一般式[II]で示される化合物および一般式
[XVII']：
【化１５】 ［式中、Ｒ1〜Ｒ3およびＬは一般式[II]における定義と
同じであり、Ｌは、好ましくは、一般式[IV]：
【化１６】 （式中、Ｘ−ＹおよびＺは一般式[II]における定義と同
じである）で示されるピラゾロ−複素環基である］で示
される化合物の製造に必要なロイコアゾメチン色物質
は、公知の方法に従って、還元剤、例えば接触水素添
加、ホウ水素化ナトリウム、パラジウム／ヒドラジンま
たはジチオン酸ナトリウムによって、一般式[XX]：
【化１７】 （式中、Ｒ1、Ｒ2およびＬは、一般式[XVII']における
定義と同じである）で示される対応する有色物質を還元
することによって製造することができる。このような還
元剤は、ホイベン・ウェイル（Ｈouben−Ｗeyl）、Ｖo
l.４／１ｃおよび４／１ｄに開示されている。
【００８６】アシル基Ｒ3は、一般式[II]で示される化
合物におけるように、Ｒ3が水素原子である一般式[XVI
I']で示されるロイコ色物質またはＧがグリコシドであ
る一般式[II]で示される化合物の製造の場合に生じるよ
うな保護ペル−Ｏ−置換Ｎ−アセチル−グルコサミニド
のいずれかの段階で導入され得る。これらは、ペプチド
化学によって公知であるような、活性化酸誘導体、例え
ば、ハロゲン化物、無水物、混合無水物が使用される。
【００８７】一般式[XVII']で示される化合物の製造に
必要な一般式[XX]で示される有色物質は、一般式[XX
I]： ＮＨ2−Ｌ [XXI] （式中、Ｌは、一般式[II]における定義と同じであり、
好ましくは一般式[IV]で示されるピラゾロ−複素環基で
あり、該一般式[IV]におけるＸ−ＹおよびＺは一般式[I
I]における定義と同じである）で示されるアミノ化合物
と、一般式[XXII]：
【化１８】 （式中、Ｒ1およびＲ2は、一般式[II]における定義と同
じであり、Ｖは水素原子またはハロゲン原子、カルボキ
シルまたはＳＯ3Ｈである）で示されるフェノールとの
酸化カップリングによって最も好ましく製造することが
できる。このために、一般式[XXI]で示されるアミノ化
合物と、好ましくはＶが水素原子である一般式[XXII]で
示されるフェノールとは、酸化剤、例えば、フェリシア
ン化カリウム、過硫酸カリウム、過硫酸水素カリウム、
ヨウ素、過酸化水素／ペルオキシダーゼ、二酸化鉛、Ｎ
aＯＣl、ＮaＯＢr、有機酸化剤、例えばＮ−ブロモスク
シンイミドまたは関連化合物の存在下で反応させる。
【００８８】また、一般式[XX]で示される有色物質は、
一般式[XXIII]：
【化１９】 （式中、Ｒ1およびＲ2は一般式[II]における定義と同じ
であり、Ｈalはハロゲン原子であり、該ハロゲン原子
は、フッ素原子、塩素原子またはヨウ素原子であり、好
ましくは、塩素原子である）で示されるＮ−ハロイミン
と、一般式[XXIV] Ｌ−Ｈ [XXIV] （式中、Ｌは一般式[II]における定義と同じであり、好
ましくは、Ｘ−ＹおよびＺが一般式[II]における定義と
同じである一般式[IV]で示されるピラゾロ−複素環基で
ある）で示される化合物を反応させることによって製造
することができる。
【００８９】該反応条件は、ホウベン−ウェイル（Ｈou
ben−Ｗeyl）、Ｖol.７／ｂ、pp２９６およびそれに続
く頁に開示されているものと同様に選択することができ
る。
【００９０】一般式[XXI]で示されるアミノ化合物に関
しては、以下の製造方法である。Ｌが一般式[II]におい
て定義したように一般式[III]で示される基である場
合、これらアミノ化合物は、公知のものであるか、また
は、公知の化合物と同様に製造することができる。通
常、Ｎ,Ｎ−ジ置換アニリンを出発物質として用いてこ
れをニトロソ化する。該ニトロソ基の還元によって、一
般式Ｌ−ＮＨ2で示されるｐ−フェニレンジアミン誘導
体を得る（Ｊ.Ａ.Ｃ.Ｓ.、７３、３１００／１９５１参
照）。
【００９１】Ｌが一般式[IV]で示されるピラゾロ−複素
環基である一般式[XXI]で示される化合物は、Ｌが一般
式[IV]で示されるピラゾロ−複素環基である一般式[XXI
V]で示される化合物を、公知の方法に従って、対応する
アミノ化合物に転換する公知の方法と同様に製造するこ
とができる。これは、 ａ）硝酸または硫酸および／または無水酢酸と混合した
硝酸との反応によって対応するニトロ化合物を得るか、
あるいは ｂ）亜硝酸との反応によって対応するニトロソ化合物を
得るか、あるいは ｃ）芳香族ジアゾニウム塩との反応によって対応するア
リールアゾ化合物を得、 次いで、還元することができる。ニトロ、ニトロソおよ
びアリールアゾ（すなわち、アリール−Ｎ＝Ｎ−）基
（ここで、アリールは、アリール基およびこのような基
を含有する他の基について既に説明した定義と同じであ
る）は、例えば塩酸または氷酢酸のような酸中の亜鉛、
亜二チオン酸ナトリウム、例えば塩酸のような酸中のス
ズ、塩化第二スズのような試薬による還元によって、ま
たは例えばパラジウム−炭素によるような接触水素添加
によって転換して、アミノ化合物を得ることができる。
このような反応は、ホウベン−ウェイルのメトデン・デ
ア・オルガニシェン・ヘミィー（Ｍethoden der organi
schen Ｃhemie）、Ｖol.１１／１、pp.３４１およびそ
れに続く頁に開示されている。
【００９２】一般式[XXIV]で示される化合物から出発す
るニトロ、ニトロソまたはアリールアゾの導入は、硝酸
または硫酸もしくは無水酢酸と混合した硝酸によるニト
ロ化によって行われる。
【００９３】亜硝酸によるニトロソ化によって、あるい
は芳香族ジアゾニウム塩とのアゾカップリングによっ
て、ニトロソ基またはアリールアゾ基を導入することが
できる。このような反応の例としては、ホウベン−ウェ
イルのメトデン・デア・オルガニシェン・ヘミィー、Ｖ
ol.１０／１および１０／３に開示されている。
【００９４】一般式[XXIV]で示される複素環化合物は、
Ｈが水素原子ではなくカルボキシル、アルコキシカルボ
ニルまたはアルキルカルボニル基である場合、これら
は、濃塩酸による加水分解によって、カルボン酸の場
合、一般式[XXII]で示される化合物への熱脱カルボキシ
ルによって転換され得る。次に、これに、ニトロ、ニト
ロソまたはアリールアゾ基が導入される。
【００９５】二重結合に結合しておらず、かつ一般式[I
V]におけるＸ−ＸまたはＺ中に存在する窒素原子は、場
合によっては、アルキル化またはアラルキル化されてい
てもよい。Ｎ−アルキル化またはＮ−アラルキル化は、
ジメチルホルムアミドまたは水性アルコール系のような
溶媒中、水素化ナトリウム、第３級アミン、炭酸アルカ
リ金属または水酸化ナトリウムのような塩基の存在下、
例えばハロゲン化アルキルもしくはアラルキル、硫酸ジ
アルキルもしくはジアラルキル、またはアリールスルホ
ン酸アルキルエステルもしくはアラルキルエステルのよ
うなアルキル化剤もしくはアラルキル化剤と、一般式[X
XIV]で示される対応する化合物、好ましくは、Ｈが水素
原子ではなくニトロ、ニトロソ、アルコキシカルボニ
ル、アシルまたはアリールアゾ基である複素環化合物と
の反応によって行うことができる。
【００９６】一般式[XXIV]で示される所望の出発物質、
またはＨの代わりにアルコキシカルボニルまたはアシル
であり、Ｌが一般式[IV]で示されるピラゾロ−複素環基
である一般式[XXIV]で示される対応するこれらの化合物
は、既に記載されているかまたはこれらの公知化合物と
同様に合成され得る。複素環系の製造に関する情報は、
以下の文献から得られる：ジー・ピー・エリス（Ｇ.Ｐ.
Ｅllis)、“ザ・ケミストリー・オブ・ヘテロサイクリ
ック・コンパウンズ(Ｔhe Ｃhemistry of Ｈete-rocycl
ic Ｃompounds）中の“シンセシス・オブ・ヒューズド
・ヘテロサイクルズ(Ｓynthesis of fused Ｈeterocycl
es)"、イー・シー・テイラー(Ｅ.Ｃ.Ｔaylor)編、１９
８７、ジョン・ウィリィー・アンド・サンズ(Ｊohn Ｗi
ley andＳons)発行；ピー・エヌ・プレストン(Ｐ.Ｎ.Ｐ
reston)、“ザ・ケミストリー・オブ・ヘテロサイクリ
ック・コンパウンズ”中の“コンデンスト・イミダゾー
ルズ（Ｃondensed Ｉmidazoles)”、エイ・ウェイスバ
ーガー(Ａ.Ｗeissberger)およびイー・シー・テイラー
編、ジョン・ウィリィー・アンド・サンズ発行；Ａdv.o
f Ｈet.Ｃhem.、３６、３４３／１９８４；Ｃhem.Ｐhar
m.Ｂull.、２２、４８２／１９７４；Ｊ.Ｈet.Ｃhem.、
１２、４８１／１９７５；Ｃhem.Ｐharm.Ｂull.、２
２、１８１４／１９７４；Ａnn.６６０、１０４／１９
６２；Ｃhem.Ｐharm. Ｂull.２３、４５２／１９７
５；Ｊ.Ｈet.Ｃhem.、１０、４１１/１９７３；Ｊ.Ｃhe
m.Ｓoc.、Ｐerkin Ｉ、２０４７／１９７７。
【００９７】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに詳
細に説明する。
【００９８】
【実施例】実施例１ １.１ (４−ヒドロキシフェニル)−(２−メチルピラゾ
ロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イル)−アミン
【化２０】
【００９９】１.１.１ ３−アセチル−２−メチルピラ
ゾロ[１,５−ａ]ピリジン（ジャーナル・オブ・オーガ
ニック・ケミストリー（Ｊ.Ｏrg.Ｃhem.）、４２、４４
３／１９７７参照）７gを６Ｎ塩酸１４０mlに溶解し、
０℃で、水に硝酸ナトリウム５.５２gを入れた溶液で滴
下混合した。２時間後、使用した氷浴を取り外し、反応
混合物を室温に一晩放置し、次いで、ｐＨ９に調節し
た。沈澱したニトロソ化合物(６.４g)を吸引濾過し、２
Ｎ塩酸約１５０mlに溶解した。該ニトロソ化合物の溶液
を塩化第二スズ・二水和物１５gと混合し、室温で１時
間攪拌した。次いで、反応を完全にするため、濃塩酸２
０mlに入れた塩化第二スズ・二水和物６gを再度添加し
た。該粗生成物を、酢酸エチルを用いてシリカゲルクロ
マトグラフィーにかけた。生成物を含有している画分を
蒸発させ、残留物をエタノールに溶解し、エタノール性
塩酸と混合した。しばらくした後、分離した沈澱物を吸
引濾過し、乾燥させた。３−アミノ−２−メチルピラゾ
ロ[１,５−ａ]ピリジン・塩酸塩３.１g（理論値の４５
％）を得た。融点＞２７５℃；Ｒf(シリカゲル；酢酸エ
チル／アセトン／氷酢酸／水、５０：２５：１２.５：
１２.５ v／v／v／v)＝０.６。
【０１００】１.１.２ フェノール２.８２gをピリジン
７５mlに溶解し、該溶液を水４５０mlと混合した。次い
で、これに、水１５０mlに上記１.１.１で製造した３−
アミノ−２−メチルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン・塩
酸塩５.５gを入れた溶液を添加し、該反応混合物を、攪
拌しながら、水４５０mlにフェリシアン化カリウム７８
gを入れた溶液と混合した。沈澱した青色物質を吸引濾
過し、水で洗浄し、乾燥させた。収量：４.８５g。 ＴＬＣ（シリカゲル、酢酸エチル／塩化メチレン、１：
１ v／v）：Ｒf＝０.５。
【０１０１】１.１.３ ロイコ色物質に還元するため
に、有色物質を酢酸エチル２００mlに溶解し、該溶液を
炭酸ナトリウム飽和水溶液約１００mlと混合した。該溶
液を、強く振盪させながら、脱色されるまで、亜二チオ
ン酸ナトリウムと混合した。有機相を分離し、乾燥さ
せ、蒸発させて少量にした。リグロインと混合し、得ら
れた沈澱物を吸引濾過し、リグロインで洗浄し、その後
乾燥させた。さらに後処理するのに充分に純品である標
記化合物４.４５gを得た。塩化メチレン／メタノール
（９８：２ v／v）を用いてシリカゲルクロマトグラフ
ィーによって精製することができる。 Ｒf(シリカゲル、酢酸エチル／塩化メチレン、１：１
v／v)＝０.６。 Ｒf(シリカゲル、塩化メチレン／メタノール、９５：５
v／v)＝０.３。
【０１０２】１.２ (４−ヒドロキシフェニル)−(２−
メチルピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イル)−アミ
ンのＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコース−２−アミニド
【化２１】
【０１０３】１.２.１ １.１で製造したロイコ色物質
２.６g、塩化２−アセトアミド−３,４,６−トリ−Ｏ−
アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコシル８.８３g
および臭化ベンジルトリエチルアンモニウム４.２１g
を、クロロホルム１２５mlと水１２５mlとの混合物中に
入れた。該混合物を強く攪拌し、炭酸カリウム８.７gと
混合し、還流下で６時間沸騰させ、３時間後、ハロゲノ
ース(halogenose)４.４gおよび炭酸カリウム４.３gを再
度添加した。クロロホルム相を分離し、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥させ、蒸発させた。残留物を、酢酸エチルを
用いてシリカゲルクロマトグラフィーにかけた。生成物
を含有している画分を蒸発させた。
【０１０４】１.２.２ １.２.１で製造した保護糖誘導
体４６０mgをメタノール１０mlに溶解し、重炭酸ナトリ
ウム０.９gと混合し、室温で３時間強く攪拌した。反応
混合物を濾過し、濾液を蒸発させ、残留物を、酢酸エチ
ル／メタノール(８：２ v／v)を用いてシリカゲルクロ
マトグラフィーにかけた。生成物を含有している画分を
合わせて、蒸発させた。残留物を少量のメタノール中に
取り、該溶液をジエチルエーテルと混合した。得られた
沈澱物を吸引濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。融
点１８８〜１９１℃；Ｒf（シリカゲル、トルエン／酢
酸／酢酸エチル／メタノール、１：１：１：１ v／v／v
／v）＝０.３５を有する標記化合物を得た。
【０１０５】実施例２ ２.１ (４−ヒドロキシフェニル)−(ピラゾロ[１,５−
ａ]ピリジン−３−アル)−アミン
【化２２】
【０１０６】２.１.１ ピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン
（Ａnn.Ｃhem.、４９８／１９７７）２gを６Ｎ塩酸３０
mlに溶解し、該溶液を０℃に冷却し、水３０mlに硝酸ナ
トリウム６.９gを入れた溶液をゆっくりと滴下した。１
時間後、ニトロソ化が終了した。該反応混合物に水約１
００mlを添加し、酢酸エチルによって繰返して抽出し
た。有機相を乾燥させ、蒸発させた。３−ニトロソ−ピ
ラゾロ[１,５−ａ]ピリジン９.６gを得た。
【０１０７】２.１.２ ２.１.１で製造したニトロソ化
合物９gを、濃塩酸１８０mlに塩化第二スズ・二水和物
２２gを入れた溶液中に入れた。該反応混合物を室温で
１時間攪拌し、還元を完了するために、濃塩酸３０mlに
入れた塩化第二スズ・二水和物８gと混合した。該懸濁
液を氷約１５０g上に注ぎ、水酸化ナトリウムでｐＨ１
２に調節し、酢酸エチルで迅速に抽出した。酢酸エチル
相を乾燥させ、蒸発させた。残留物をジエチルエーテル
約３５０mlに溶解し、エーテル性塩酸と混合した。得ら
れた沈澱物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、乾燥
させた。融点２２８〜２３２℃を有する３−アミノピラ
ゾロ[１,５−ａ]ピリジン・塩酸塩１１.３g（理論値の
１００％）を得た。 Ｒf（シリカゲル、酢酸エチル／メタノール、９：１ v
／v）＝０.５２。
【０１０８】２.１.３ 出発物質として３−アミノピラ
ゾロ[１,５−ａ]ピリジンを用いて、１.１.２および１.
１.３と同様に、ロイコ色物質(４−ヒドロキシフェニ
ル)ピラゾロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イル)−アミン
を得た。 Ｒf(シリカゲル、酢酸エチル／ジエチルエーテル、１：
１ v／v)＝０.６８。
【０１０９】２.２ (４−ヒドロキシフェニル)(ピラゾ
ロ[１,５−ａ]ピリジン−３−イル)−アミンのＮ−アセ
チル−β−Ｄ−グルコース−２−アミニド
【化２３】
【０１１０】実施例１.２と同様に、２.１において得ら
れたロイコ色物質および塩化２−アセトアミド−３,４,
６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グル
コシルから標記化合物を得た。融点１４３℃。Ｒf(シリ
カゲル、トルエン／酢酸エチル／メタノール、２：１：
１ v／v／v)＝０.２７。
【０１１１】実施例３ ａ）シュライヒャー・アンド・シュール（Ｓchleicher
and Ｓchuell）社の濾紙(２３ ＳＬ)に下記溶液を連続
的に含浸させて乾燥させた。 １．クエン酸塩緩衝液 ２００ミリモル／リットル、ｐＨ５.０ ヨウ化カリウム ２０ミリモル／リットル ２．フェニルセミカルバジド ３ミリモル／リットル メタノールに入れた実施例１ で得たヒドロラーゼ基質 １０ミリモル／リットル
【０１１２】ｂ）安定化剤としてメチルセミカルバジド
（１.５ミリモル／リットル）を用いた以外は実施例３
ａ）と同様に含浸させた。
【０１１３】実施例３ａ）および３ｂ）で得た試験紙
を、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ(β−
ＮＡＧase)を含有していない尿に浸漬すると、あるいは
該試験紙に尿を滴下すると、試験紙は１０分間にわたっ
て着色されなかった。尿が約２０Ｕ／リットルの濃度の
β−ＮＡＧaseを含有している場合、約５分後、試験紙
が異なった色に着色された。
【０１１４】安定化剤なしで実施例３ａ）および３ｂ）
と同様に試験ストリップを製造すると、まず、同一の結
果が得られるが、４５℃で１週間貯蔵した後は該試験ス
トリップが赤色に着色されていた。この後、安定化され
た試験ストリップを新しく調製した試験ストリップと比
較した。
【０１１５】実施例４ ａ）シュライヒャー・アンド・シュール社の濾
紙(２３ ＳＬ)に下記溶液を連続的に含浸させて乾燥さ
せた。 １．クエン酸塩緩衝液 １００ミリモル／リットル、ｐＨ５.０ ヨウ化カリウム ２０ミリモル／リットル ２．フェニルセミカルバジド １０ミリモル／リットル メタノールに入れた実施例２ で得たヒドロラーゼ基質 １０ミリモル／リットル
【０１１６】ｂ）安定化剤としてメチル−フェニルセミ
カルバジドを用いた以外は実施例４ａ）と同様に含浸さ
せた。
【０１１７】実施例４ａ）および４ｂ）で得た試験紙
を、β−ＮＡＧaseを含有していない尿に浸漬すると、
あるいは該試験紙に尿を滴下すると、試験紙は、１０分
後、着色されていなかった。この尿が約２０Ｕ／リット
ルの濃度のβ−ＮＡＧaseを含有している場合、約５分
後、試験紙は異なった色に着色された。
【０１１８】安定化剤なしで実施例４ａ）および４ｂ）
と同様に試験ストリップを製造すると、まず、同一の結
果が得られるが、４５℃で１週間貯蔵した後は該試験ス
トリップが赤色に着色されていた。この後、安定化され
た試験ストリップを新しく調製した試験ストリップと比
較した。
【０１１９】実施例５ 図２の試験ストリップを以下のように製造すると、実施
例３および４と同様の結果が得られた。
【０１２０】試薬紙(３)（シュライヒャー・アンド・シ
ュール社の濾紙２３ ＳＬ）に、ヨウ化カリウムを用い
ずに、 ａ）実施例３ａ）と同様に、 ｂ）実施例３ｂ）と同様に、 ｃ）実施例４ａ）と同様に、 ｄ）実施例４ｂ）と同様に含浸させた。
【０１２１】メッシュ(７)（スイス、チューリッヒのチ
ューリッヒャー・ボイテルトゥクファブリク（Ｚuerich
er Ｂeuteltuchfabrik）のＮＹ ７５ ＨＣ、フィラメ
ント厚さ６０μm）にヨウ化カリウム水溶液（４０ミリ
モル／リットル）を含浸させ、乾燥させた。各々６×６
mmの大きさの試薬紙(３)およびメッシュ(７)を、メッシ
ュ(７)と同一物質の被覆メッシュ(４)を介して、酸化メ
ッシュ(７)が試薬紙(３)と被覆メッシュ(４)の間に存在
するように、溶融接着剤(５)によって、硬いポリスチレ
ンフィルム（１００×６mm）上に固定した。
【０１２２】得られた試験ストリップを、β−ＮＡＧas
eを含有しない尿中に浸漬するか、あるいは尿を被覆メ
ッシュ(４)上に滴下すると、該試験ストリップは、１０
分間にわたって着色されない。尿が約２０Ｕ／リットル
の濃度のβ−ＮＡＧaseを含有している場合、約５分
後、試薬紙は異なった色に着色される。
【０１２３】安定化剤なしで上記と同様に試験ストリッ
プを製造すると、まず、同一の結果が得られるが、４５
℃で１週間貯蔵した後は該試験ストリップが赤色に着色
されていた。この後、安定化された試験ストリップを新
しく調製した試験ストリップと比較した。
【０１２４】実施例６ 実施例２で製造したヒドロキシラーゼ基質を用いて、実
施例５と同様の方法で図２の試験担体を製造した。しか
しながら、アスコルビン酸の溶液を用いて、試薬紙の予
備含浸を行った。
【０１２５】該試薬紙(３)に、下記溶液を連続的に含浸
させ、乾燥させた。 １．クエン酸塩緩衝液 ２００ミリモル／リットル、ｐＨ５.０ アスコルビン酸 ３ミリモル／リットル ２．フェニルセミカルバシド ０.５ミリモル／リットル メタノールに入れた実施例２ で製造したヒドロラーゼ基質 １０ミリモル／リットル
【０１２６】ヨウ化カリウム水溶液（４０ミリモル／リ
ットル）を酸化メッシュ(７)に含浸させた。
【０１２７】ここで、本発明の安定化剤を用いる場合、
安定化剤を含有しないものと比較して試験担体上のヒド
ロキシラーゼ基質の安定化を確認する。
【０１２８】試薬紙(３)にアスコルビン酸を添加するこ
とによって、安定化に必要なセミカルバジドの濃度を明
らかに減少させることができる。さらに、より迅速な試
験系が得られる。
【０１２９】アスコルビン酸をチオ硫酸ナトリウムに代
えた場合も同一の結果が得られる。
【０１３０】実施例７ 以下の方法でシュライヒャー・アンド・シュール社の紙
(２３ ＳＬ)に含浸させた。 １．１Ｎ塩酸でｐＨ８.０に調節した水１リットルに入
れたホウ酸６５gおよび水酸化ナトリウム２１gによる予
備含浸。 ２．エタノール１リットルに３−(Ｎ−トルエン−４−
スルホニル−Ｌ−アラニルオキシ)−インドール（欧州
特許出願第０,０１２,９５７号の実施例７に従って製造
した）０.７８g、デカノール２１.７mlおよび１０ミリ
モル／リットルのフェニルセミカルバジドを含有する溶
液による予備含浸フリースの主含浸。
【０１３１】この試薬紙上に白血球の溶液を滴下する
と、この紙は青色に着色された。
【０１３２】安定化剤を含有しない以外は上記方法と同
様に試験紙を製造すると、最初は、同一の結果が得られ
た。しかしながら、４５℃で３週間の応力時間の場合、
この紙は、青色がかってくるが、安定化剤を含有してい
る紙は白色のままである。
【０１３３】実施例８ シュライヒャー・アンド・シュール社の紙(２３ ＳＬ)
に、以下のように含浸させた。 １．ヘペス緩衝液（５０ミリモル／リットル、ｐＨ７.
５）による予備含浸。 ２．メタノールに入れた１ミリモル／リットルの５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド(ドイツ、ダイセンホフェンのシグマ・ヒェ
ミィー・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・
ハフツング(SigmaＣhemie ＧmbＨ))および１０ミリモ
ル／リットルのフェニルセミカルバジドによる主含浸。
【０１３４】β−Ｄ−ガラクトシダーゼの溶液をこの紙
に滴下すると、青色の着色が得られた。安定化剤を含有
しない試験紙を製造した場合、結果は、まず同一であ
る。しかしながら、４５℃で３週間の応力時間の場合、
この紙は青色がかってくるが、安定化剤を含有している
紙は白色のままである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ヒドロラーゼ酵素の比色測定用試験担体の側
面図である。
【図２】 ヒドロラーゼ酵素の比色測定用試験担体の側
面図である。
【符号の説明】
１および６・・・試験担体、 ２・・・担体ホイル、 ３・・・吸収剤試薬担体、 ４・・・被覆メッシュ、 ５・・・溶融接着剤、 ７・・・メッシュ。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酵素加水分解によってロイコ色物質を形
    成させることができ、次いで、酸化剤と反応させて有色
    物質を得ることができるヒドロラーゼ基質の安定化方法
    であって、該基質を一般式[Ｉ]： Ａr−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯＮＨ2 [Ｉ] （式中、Ａrは、場合によってアルキル、アルコキシま
    たはハロゲン原子によって置換されていてもよいアリー
    ル基を意味する）で示される１−アリールセミカルバジ
    ドと接触させることを特徴とするヒドロラーゼ基質の安
    定化方法。
  2. 【請求項２】 酵素加水分解によってロイコ色物質を形
    成させることができ、次いで、酸化剤と反応させて有色
    物質を得ることができるヒドロラーゼ基質を含有するヒ
    ドロラーゼ酵素の比色測定用診断薬であって、ヒドロラ
    ーゼ基質の安定化のために、一般式[Ｉ]： Ａr−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯＮＨ2 [Ｉ] （式中、Ａrは、場合によってアルキル、アルコキシま
    たはハロゲン原子によって置換されていてもよいアリー
    ル基を意味する）で示される１−アリールセミカルバジ
    ドを含有することを特徴とする診断薬。
  3. 【請求項３】 さらに酸化剤を含有してなる請求項２記
    載の診断薬。
  4. 【請求項４】 担体結合形態の成分を含む請求項２また
    は３記載の診断薬。
JP2413423A 1989-12-21 1990-12-21 酵素基質の安定化のための１−アリールセミカルバジドの使用およびこの安定化剤を含有する診断薬 Expired - Lifetime JPH0771516B2 (ja)

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