JPH0773503B2 - アミドの生物学的製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 （技術分野） 本発明は、水性媒体中で、ニトリルを水和して対応する
アミドを生成する能力を有する微生物由来の酵素の作用
によってニトリルを水和してこれを対応するアミドに変
換させる方法に関する。さらに具体的には、本発明は、
該水性媒体中に特定の界面活性剤を存在させることに特
徴を有するアミドの生物学的製造法に関する。

（先行技術） アミドは水性媒体中で対応するニトリルの水和によって
製造されるが、この水和を微生物の産生する酵素（ニト
リラーゼあるいはニトリルヒドラターゼ）の作用によっ
て行なう方法が提案されている（たとえば、特公昭62−
21519号、特公昭56−17918号、特公昭59−37951号、特
開昭61−162192号および特開昭62−91189号各公報なら
びに特願昭63−231744号明細書参照）。このようなアミ
ドの生物学的製造法は、工業的にも実施されていて、ア
クリルアミドの有利な製造法として注目されている。

このようなアミドの生物学的水和反応に使用し得る基質
ニトリルとして、脂肪族および芳香族等の数多くのニト
リルが提案されているが、本発明者らの知見によれば、
水に溶解しきれない基質が多量に反応系に存在する場合
は、反応中に菌体、基質および生成物等の巻き込みを生
じて塊を形成し、均一な攪拌が行えなくなる。この現象
は、特に芳香族ニトリル等の水に難溶性の基質を用いた
場合に顕著であって、そのようなニトリルの水和は工業
的には実施し難い。

〔発明の概要〕

（要 旨） 本発明は、上記の問題点を解決することを目的として種
々検討した結果、ニトリルの水和反応に際して反応系に
ポリオキシエチレン基を有する界面活性剤を存在させる
ことにより、反応系を均一な分散状態に保持できること
のみならず、全く意外にも該水和反応速度を大巾に向上
させ得ることを見出し、この知見に基いてなされたもの
である。

従って、本発明によるアミドの製造法は、 水性媒体中で、ニトリルを水和して対応するアミドを生
成する能力を有する微生物由来の酵素の作用によってニ
トリルを水和してこれを対応するアミドに変換する方法
において、該水性媒体中にポリオキシエチレン基を有す
る界面活性剤を存在させること、を特徴とするものであ
る。

（効 果） 本発明によれば、特定の界面活性剤の作用によって水に
難溶性のニトリルの水和反応を均一な分散状態に保持し
攪拌等のトラブルを生じることなく水和反応が行なえる
とともに、ニトリルの水和反応速度を大巾に向上させる
ことができる。水和反応速度の向上が、水に難溶性のニ
トリルにも、さらには水に易溶性のニトリルにも認めら
れることは、全く思いがけなかったことと解される。

このように、本発明によれば、特に芳香族ニトリルの水
和を有利に行なうことができる。農薬原料としての2,6
−ジフルオロベンズアミド（すなわち2,6−ジフルオロ
ベンゾニトリルの水和物）あるいは各種有機工業薬品原
料として有用なベンズアミド（すなわちベンゾニトリル
の水和物）等の重要性からいって、本発明のこの効果は
有用なものである。

〔発明の具体的説明〕

1.アミドの生物学的製造の基本的内容 本発明は微生物由来の酵素の作用によってニトリルを水
和してこれをアミドに変換する方法であるが、この方法
は基本的には微生物の培養および酵素の誘導ならびに得
られた酵素の基質ニトリルに対する作用からなる。

これらは単位操作としてそれ自身公知であって、本発明
でも合目的的な任意の態様を採ることができる。

本発明が前提とする「水性媒体中で、ニトリルを水和し
て対応するアミドを生成する能力を有する微生物由来の
酵素の作用によってニトリルを水和してこれを対応する
アミドに変換する方法」は、酵素の作用のさせ方につい
て合目的的な任意の態様を包含するものである。そのよ
うな態様の一つとして、微生物に産生させた酵素を回収
して、これを酵素標品として使用する方法があるが、こ
のようなふつうの触媒反応のような場合をも本発明では
「生物学的製造法」として扱うものとする。

2.水和反応の詳細 １） 微生物 本発明で使用する微生物は、前記した公報等に記載され
ているバチルス（Bacilus）、バクテリジウム（Bacteri
dium）、ミクロコッカス（Micrococcus）、ブレビバテ
リウム（Brevibacterium）、コリネバクテリウム（Cory
nebacterium）、ノカルジア（Nocardia）、シュードモ
ナス（Pseudomonas）、ロドコッカス（Rhodococcus）、
アースロバクター（Arthrobacter）およびミクロバクテ
リウム（Microbacterium）各属に属するものであるが、
特に特願昭63−234744号明細書記載のロドコッカス属ロ
ドクロウス種（Rhodococcus rhodochrous）の微生物が
その産生するニトリルヒドラターゼ酵素が、芳香族ニト
リルの水和に特に有効であることおよび安定性に優れて
いることにより好適である。

この種の株の代表的なものは、Ｊ−１株である。

Ｊ−１株の詳細は下記の通りである。

（１）由来および寄託 Ｊ−１株は、本発明者らが京都市左京区の土壌から採取
したものであって、昭和62年９月18日に工業技術院微生
物工業技術研究所に寄託されて、FERM BP−1478号の受
託番号を得ている。

（２）菌学的性質 （ａ）形 態 （１）細胞の形および大きさ 0.9〜1.0μ×３〜10μ （２）細胞の多形性の有無 培養初期に長桿状を呈し、棍棒状で湾曲なくスナッピン
グを伴った発育を示し、のちに短桿菌状に断裂する。

（３）運動性 なし （４）胞子の有無 なし （５）グラム染色性 陽性 （６）抗酸性 陰性 （７）異染小体 認められる （ｂ）各培地における生育状態（30℃） （１）肉汁寒天平板培養 直径1mm（48時間）円形、不規則、平滑で表面乾き気
味、扁平、不透明、淡オレンジピンク色 （２）肉汁寒天斜面培養 糸状、表面平滑、断面はやや隆起状で乾き気味、淡オレ
ンジピンク色 （３）肉汁液体培養 菌膜を形成し、旺盛に発育する。生育するにしたがっ
て、中程度の濁り、沈澱を生ずる。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養 表面に良く生育、穿刺部にそってロート状に発育する
が、下層部にはほとんど発育しない。ゼラチンは、液化
は認められない。

（５）リトマスミルク 変化しない （ｃ）生理学的性質 （１）硝酸塩の還元 陽性 （２）脱窒反応 陰性 （３）MRテスト 陰性 （４）VPテスト 陰性 （５）インドールの生成 陽性 （６）硫化水素の生成 陽性 （７）デンプンの加水分解 陰性 （８）クエン酸の利用 コーサーの培地：陰性 クリステンセンの培地：陽性 （９）無機窒素源の利用 硝酸塩：陽性 アンモニウム塩：陽性 （10）色素の生成 陰性 （11）ウレアーゼ 陽性 （12）オキシダーゼ 陰性 （13）カタラーゼ 陽性 （14）セルロースの加水分解 陰性 （15）生育の範囲 pH:5〜10 温度:10〜41℃ （16）酸素に対する態度 好気性 （17）チロシンの分解 陽性 （18）アデニンの分解 陽性 （19）ホスファターゼ 陽性 （20）Tween80加水分解 陽性 （21）Ｏ−Ｆテスト ０（弱い） （22）耐熱性（10％スキムミルム中72℃、15分） なし （23）糖から酸および 酸の生成 ガスの生成 ガスの生成 Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース ＋ − Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース ＋ − 麦芽糖 ＋ − ショ糖 ＋ − 乳糖 − − トレハロース − − Ｄ−ソルビット ＋ − Ｄ−マンニット ＋ − グリセリン ＋ − （24）単一炭素源としての 生育 イノシトール − 麦芽糖 ＋ Ｄ−マンニット ＋ ラムノース − Ｄ−ソルビット ＋ ｍ−ハイドロキシ 安息香酸 ＋ アジピン酸ナトリウム ＋ 安息香酸ナトリウム ＋ クエン酸ナトリウム ＋ 乳酸ナトリウム ＋ テストテトロン ＋ Ｌ−チロシン ＋ グリセロール(1%)(W/V) （＋） トレハロース （＋） ｐ−ハイドロキシ ＋ 安息香酸(1%)(W/V) （＋）弱いが陽性である。

（25）脂肪酸と細胞壁分析 不飽和、飽和直鎖脂肪酸、およびツベルクロステアリン
酸を含む。ミコール酸のTLCは単一スポットを与える。

以上の菌体的性質をバージーの細菌分類書（Bergy′s M
anual of Systematic Bacteriology）（1986）に基づい
て分類すると、Ｊ−１株は、好気性、グラム陽性、弱抗
酸性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌であ
り、鞭毛を着生しない。また、発育の初期過程で長桿菌
状で菌糸状を呈し、枝分れ（Branching）を伴なった発
育を示し、後に短桿菌状に断裂することよりノカルディ
ア型の細菌に属するものと認められる。

脂肪酸組成の分析は、ツベルクロステアリン酸を含む不
飽和、飽和の直鎖脂肪酸を含む。ミコール酸のTLCは標
準菌Rodococcus rhodochrous（IFO 3338）と同じRfを示
す単一スポットを与えることから、Mycobacterium属と
は区別される。またミコール酸の組成（炭素数）からNo
cardia属とは区別される。その他生化学的諸性質の検討
から、本菌はRhodococcus rhodochousと認められる。

２） 基質／ニトリル 上記のような微生物の産生する酵素の基質となるニトリ
ルは、芳香族および脂肪族のモノニトリルまたはジニト
リル、就中モノニトリル、である。

本発明の特色を最もよく享受するのは、芳香族ニトリ
ル、特に芳香環を形成する炭素数が４〜10のもの、であ
る。芳香族ニトリルの具体例のいくつかを例示すれば下
記の通りであって、下記の一般式〔Ｉ〕〜〔VI〕で示さ
れる化合物が挙げられる。

例えば、４−、３−、および２−シアノピリジン、がそ
れである。

（ここで、R¹およびR²は、それぞれ、Ｈ、CH₃、OH、OCH
₃、Cl、Ｆ、CN、NH₂またはNO₂である。） 例えば、ベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−およびｐ−クロロ
ベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−およびｐ−フルオロベンゾ
ニトリル、ｏ−およびｍ−ニトロベンゾニトリル、ｐ−
アミノベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−およびｐ−トルニト
リル、４−シアノフェノール、アニソニトリル、フタロ
ニトリル、イソフタロニトリル、テレフタロニトリル、
2,6−ジクロロベンゾニトリル、2,4−ジクロロベンゾニ
トリル、2,6−ジフルオロベンゾニトリル、がそれであ
る。

例えば、α−およびβ−ナフトニトリル、がそれであ
る。

（ここで、ＸはＳまたはＯである） 例えば、２−チオフェンカルボニトリルおよび２−フロ
ニトリル、がそれである。

リルおよび２−フロニトリル、がそれである。

例えば、５−シアノインドール、３−インドールアセト
ニトリル、がそれである。

すなわち、シアノピラジンである。

本発明で対象とするニトリルの他の一群は、脂肪族ニト
リルである。炭素数２〜６のモノまたはジニトリル、就
中モノニトリル、が適当である。生成アミドの有用性か
らいって、アクリロニトリルが代表的であり、また生産
性も良好である。

これらのニトリルに対応するアミドは、CN基がCONH₂基
に変換されたものであることはいうまでもない。なお、
ジニトリルの場合はCN基の少なくとも１個がCONH₂に変
換したものを対応するアミドと考えるものとする。

３） 界面活性剤 本発明で使用する界面活性剤は、ポリオキシエチレン基
を有するものであって、例えば、アルキルエーテル型、
アルキルアリールエーテル型、アルキルエステル型、ソ
ルビタンモノアルキルエステル型、ポリオキシエチレン
アルキルアミン等である。具体的には、アルキルエーテ
ル型としてはポリオキシエチレンステアリルエーテル
（ｎ＝14）〔エマルゲン（Emulgen）320P（花王
（株）〕、アルキルアリルエーテル型としてはポリオキ
シエチレンオクチルフェニルエーテル（ｎ＝10）〔トリ
トン（Triton）X100（和光純薬（株）〕、ソルビタンモ
ノアルキルエステル型としてはポリオキシエチレンモノ
オレイン酸ソルビタン（ｎ＝20）〔ツイン（Tween）80
（半井化学薬品（株）〕、ポリオキシエチレンアルキル
アミンとしてはポリオキシエチレンドデシルアミン（ｎ
＝５）〔アミート（Amiet）105（花王（株）〕等が挙げ
られる。

これらの界面活性剤の使用量は、基質の種類により変わ
り、また反応系の基質の濃度の増加とともに増加の傾向
があるが、通常は反応系に対して0.1〜５重量％の範囲
である。

４） 培養／酵素の産生 本発明で使用する微生物の培養は、それが合目的的なも
のである限り制限はなく、前記した各公報に記載された
方法に準じて行うことができる。

５） ニトリルの水和 本発明が前提とする「微生物由来の酵素の作用によって
ニトリルを水和してこれを対応するアミドに変換する方
法」とは、酵素の作用のさせ方について合目的的な種々
の態様を包含するものであることは前記したところであ
る。

そのような態様の一つは、微生物の培養系に基質のニト
リルを存在させておいて、培地中にアミドを生成させる
ことである。

酵素を作用させる態様の他の一つは、酵素が蓄積されて
いる培養液に基質ニトリルを添加して水和反応を行なわ
せることである。この態様の改変例として、菌体を破砕
した培養液を使用する方法が挙げられよう。

酵素を作用させる態様のさらに他の一つは、酵素を蓄積
した菌体を培養液から分離して、好ましくはこれを適当
な担体に担持させて「固定化」して、基質と接触させる
方法である。この方法、特にこの好ましい態様は、上記
の第二の態様と並んで、あるいは第二の態様以上に、工
業的実施に適したものということができる。担体の種類
および微生物の担持方法を含めて、そして所謂バイオリ
アクターとしての固定化微生物の利用も含めて、この技
術は周知のものである。

酵素を作用させる態様の他の一つは、酵素標品を得て、
この酵素によっていわば非生物学的にニトリルを水和す
る方法である。水和反応は、酵素活性が失なわれない範
囲のpHおよび温度条件で行なわれることはいうまでもな
く、これらの条件は一般に上記の生物学的手法でのそれ
と同じであるということができる。このような酵素作用
時に微生物が存在しない態様も本発明では「生物学的製
造法」として取扱うことは前記した通りである。

培養液ないし水和反応液中の基質濃度は、基質の種類に
よっても異なるが、通常0.5〜15モル／リットルであ
り、また反応温度は通常０〜30℃の範囲、至適pHは７〜
９の範囲である。pHの調整にはリン酸カリウムバッファ
ー、トリス/HClバッファー、HEPES/KOHバッファー、ホ
ウ酸ナトリウムバッファー等の緩衝剤を用いることが望
ましい。

3.実験例 以下の実験例で酵素活性の単位１ユニット（Ｕ）は、各
反応条件で各基質から対応するアミドを１μモル／分の
速度で生成させる酵素の量、として定義されたものであ
る。

実施例１ 2,6−ジフルオロベンゾニトリル40mMおよび表−１に示
す界面活性剤を所定量添加あるいは添加せずに調製した
0.1Mリン酸緩衝液（pH7）5mlに、ロドコッカス・ロドク
ロウスＪ−１菌より精製単離した酵素（ニトリルヒドラ
ターゼ）185μｇを添加して、攪拌下20℃で30分間反応
を行った。酵素活性は生成したアミドを高速液体クロマ
トグラフィー（HPLC）により定量し、それぞれ界面活性
剤を添加しない場合の活性を100としたときの相互活性
で示した。基質の大部分が不溶解の状態で反応が行われ
たが、界面活性剤を添加した系では、いずれも基質が均
一に分散し良好な攪拌状態が得られた。

結果を表−１に示す。

なお、上記Ｊ−１菌の培養および酵素の精製単離条件は
以下の通りである。

（１）培養 基本培地（１中） グルコース 10 ｇ K₂HPO₄ 0.5g KH₂PO₄ 0.5g MgSO₄・7H₂O 0.5g イーストエキス 1.0g ペプトン 7.5g 蒸留水 残部（pH7.2） CoCl₂ 10ml/リットルを含む上記基本培地に7.5g/リット
ルの尿素を添加し、この培地60mlにロドコッカス・ロド
クロウス Ｊ−１株（FERM BP−1478）の前培養液（上
記基本培地使用）4mlを加えて、28℃で96時間振盪培養
を行った。

（２）反応用菌体の調製 菌体を遠心分離によって採取し、0.85％NaCl溶液で洗浄
して再び遠心分離した後、0.85％ NaCl溶液に懸濁させ
て、反応用湿性菌体液とした。

（３）反応用酵素の調製 上記の方法で培養した菌体を遠心分離によって採取した
後、ホモジナイズして無細胞抽出液を調製した。下表に
示した硫安分画および各種クロマトグラフィーを行っ
て、精製酵素を調製した。得られた酵素を反応用酵素と
した。

実施例２ 界面活性剤アミート105を用い、表−２に示す各種基質
を所定濃度含む0.1Mリン酸緩衝液（pH ７）5mlに、実
施例１と同様にして得たロッドコッカス・ロドクロウス
Ｊ−１菌体0.1〜4mg（乾燥重量）を添加して、攪拌下
20℃で20〜30分間反応を行い、実施例１と同様にして相
対活性を測定した。

表−２には、最高の活性が得られたときの界面活性剤濃
度およびそのときの相対活性を示した。

なお、ベンゾニトリル（10mM）、３−シアノピリジン、
アクリロニトリルおよびプロピオニトリルはこれらが溶
解した状態で、その他は基質の大部分が不溶解の状態で
行われたが、この場合でも界面活性剤を添加した系では
基質が均一に分散して良好な攪拌状態が得られた。

界面活性剤無添加の場合の活性 実施例３ アミート105を所定量添加または無添加の0.1Mリン酸緩
衝液（pH ７）に、実施例１と同様にして得たロドコッ
カス・ロドクロウスＪ−１菌体0.85mg（乾燥重量）を含
有するように添加して4.5mlとし、この懸濁液に0.5gの
ベンゾニトリルを添加し、攪拌しながら20℃に維持し
た。反応の進行状態はベンゾニトリルおよび生成するベ
ンズアミドをHPLC分析により調べ、ベンゾニトリルが完
全に消費されるまで反応を継続した。

この反応において、基質の大部分が不溶解の状態で反応
を行われたが、界面活性剤を添加した系では基質が均一
に分散して良好な攪拌状態が得られた。一方、界面活性
剤添加の系では、菌体、基質、生成物の巻き込みを生じ
塊をつくり攪拌が良好に行えなかった。

結果を表−３に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/12 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】水性媒体中で、ニトリルを水和して対応す
   るアミドを生成する能力を有する微生物由来の酵素の作
   用によってニトリルを水和してこれを対応するアミドに
   変換する方法において、該水性媒体中にポリオキシエチ
   レン基を有する界面活性剤を存在させることを特徴とす
   る、アミドの生物学的製造法。
2. 【請求項２】微生物が、ロドコッカス属ロドクロウス種
   のＪ−１株（FERM BP−1478号）である、請求項１記載
   のアミドの生物学的製造法。
3. 【請求項３】ニトリルが、芳香環を形成する炭素数が４
   〜10の芳香族ニトリルである、請求項１〜２のいずれか
   １項記載のアミドの生物学的製造法。
4. 【請求項４】芳香族ニトリルが、下記の一般式〔Ｉ〕〜
   〔VI〕で示される化合物のいずれかである、請求項３記
   載のアミドの生物学的製造法。 （ここで、R¹およびR²は、それぞれＨ、CH₃、OH、OC
   H₃、Cl、Ｆ、CN、NH₂またはNO₂である） （ここで、ＸはＳまたはＯである）
5. 【請求項５】ニトリルが、炭素数２〜６の脂肪族ニトリ
   ルである、請求項１〜２のいずれか１項記載のアミドの
   生物学的製造法。