JPH0515384A - アミド化合物の製造方法および新規な微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 微生物の作用により、ニトリルからアミド化
合物を高い選択性及び効率で製造する。 【構成】 ストレプトマイセス（Streptomyces）属、ク
レブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）
属、エルビニア（Erwinia)属、ツカムレラ（Tukamurell
a)属、ゴルドナ（Gordona)属、モルガネラ（Morganell
a）属、プロテウス（Proteus)属、エンテロバクター（E
nterobacter）属、ミクロアスカス（Microascus）属、
キャンディダ（Candida)属およびパントエア（Pantoea)
属に属し、かつニトリルを水和する能力を有する微生物
又酵素をニトリルに作用させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、アミド化合物を微生物
学的に製造する方法、およびニトリルをアミドに変換す
る新規な微生物に関する。

【０００２】

【従来の技術と発明が解決しようとする課題】アミド化
合物は、産業上、有用な物質が多い。例えば、アクリル
アミドは高分子凝集剤、紙力増強剤、および繊維改質剤
などに利用され、メタクリルアミドは、適度な親水性、
親油性および優れた耐熱性、架橋性などの特徴を生かし
て、塗料、接着剤、光架橋性材料などに利用されてい
る。さらに、ニコチンアミドはビタミン原料として、ピ
ラジンアミドは医薬原料として有用である。

【０００３】近年、微生物又は微生物より抽出した酵素
の作用を利用して、ニトリルからアミドを製造するいく
つかの方法が提案されている。例えば、主に脂肪族ニト
リルを水和する微生物として、バチルス(Bacillus)属、
バクテリジューム(Bacteridium) 属、ミクロコッカス(M
icrococcus) 属、又はブレビバクテリウム(Brvibacteri
um) 属に属する微生物（特公昭６２−２１５１９号公
報）、コリネバクテリウム(Corynebacterium) 属、ノル
カジア(Nocardia)属に属する微生物（特公昭５６−１７
９１８号公報）、シュードモナス(Pseudomonas) 属に属
する微生物（特公昭５９−３７９５１号公報）などが提
案されている。また、ロドコッカス(Rhodococcus) 属に
属する微生物により、芳香族または複素環式ニトリルを
水和する方法も提案されている（特開平２−４７０号公
報）。

【０００４】一方、ニトリルの構造が複雑化する程、微
生物の水和活性、アミドへの変換効率が小さくなる。

【０００５】従って、本発明の目的は、反応活性及び選
択性が高く、構造が複雑であってもニトリルからアミド
化合物を効率よく工業的に有利に製造できる方法を提供
することにある。

【０００６】また、本発明の他の目的は、構造が複雑で
あってもニトリルを対応するアミドに高い選択性及び効
率で変換できる新規な微生物を提供することにある。

【０００７】

【発明の構成】本発明者らは、微生物による水和方法に
着目し、簡便かつ高い反応収率と高い選択性で、ニトリ
ルからアミドを生物学的に製造できる方法を鋭意検討し
た結果、ニトリルヒドラターゼを産生し、かつ活性の高
い特定の微生物が、複雑な構造を有するニトリルをも効
率よく水和し、アミドを生成することを見いだし、本発
明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、ニトリルを、微生物
又は酵素の作用により対応するアミドに変換し、生成し
たアミドを分離するアミドの製造方法において、前記微
生物又は酵素が、ストレプトマイセス（Streptomyces）
属、クレブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serrat
ia）属、エルビニア（Erwinia)属、ツカムレラ（Tukamu
rella)属、ゴルドナ（Gordona)属、モルガネラ（Morgan
ella）属、プロテウス（Proteus)属、エンテロバクター
（Enterobacter）属、ミクロアスカス（Microascus）
属、キャンディダ（Candida)属、およびパントエア（Pa
ntoea)属に属し、かつニトリルを水和する能力を有する
微生物群から選ばれた少なくとも一種の微生物、又はこ
れらの微生物の酵素であるアミド化合物の製造方法を提
供する。

【０００９】また、本発明は、ニトリルを水和しアミド
に変換する微生物が、キャンディダグイリエモンディ
（Candida guilliermondii）ＮＨ−２株（微工研菌寄第
１１３５０号）、パントエア アグロメランス（Pantoe
a agglomerans)ＮＨ−３株（微工研菌寄第１１３４９
号）、またはクレブシエラ ニュウモニアエ サブスピ
ーシズ ニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae subs
p. pneumoiae)ＮＨ−３６Ｔ２株（微工研菌寄第１１７
３９号）である新規な微生物を提供する。

【００１０】本発明において水和反応に付されるニトリ
ルには、広い範囲のニトリル、例えば、脂肪族ニトリ
ル、芳香族ニトリル、複素環式ニトリルなどが含まれ
る。

【００１１】脂肪族ニトリルとしては、炭素数２〜６の
飽和又は不飽和ニトリル、例えば、アセトニトリル、プ
ロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリ
ル、バレロニトリル、イソバレロニトリル、カプロニト
リルなどの飽和モノニトリル類；マロニトリル、サクシ
ノニトリル、アジポニトリルなどの飽和ジニトリル類；
α−アミノプロピオニトリル、α−アミノメチルチオブ
チロニトリル、α−アミノブチロニトリル、アミノアセ
トニトリルなどのα−アミノニトリル類；ラクトニトリ
ル、ヒドロキシアセトニトリル、α−ヒドロキシ−γ−
メチルチオブチロニトリルなどのα−ヒドロキシニトリ
ル類；アミノ−３−ピロピオニトリルなどのβ−アミノ
ニトリル類；アクリロニトリル、メタクリロニトリルな
どの不飽和ニトリル類が挙げられる。

【００１２】芳香族ニトリルには、例えば、下記一般式
［Ｉ］又は［ＩＩ］

【００１３】

【化１】 （式中、Ｒ₁ 及びＲ₂ は、同一又は異なって、水素原
子、ハロゲン原子、メチル基、ヒドロキシ基、メトキシ
基、アミノ基、又はニトロ基を示す）

【００１４】

【化２】 で表される化合物が含まれる。

【００１５】前記一般式［Ｉ］で表される化合物には、
例えば、ベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−およびｐ−クロロ
ベンゾニトリル、ｏ−、ｍ−およびｐ−フルオロベンゾ
ニトリル、ｏ−、ｍ−およびｐ−ニトロベンゾニトリ
ル、ｐ−アミノベンゾニトリル、４−シアノフェノー
ル、ｏ−、ｍ−およびｐ−トルニトリル、２，４−ジク
ロロベンゾニトリル、２，６−ジクロロベンゾニトリ
ル、２，６−ジフルオロベンゾニトリル、アニソニトリ
ルなどの芳香族モノニトリル類；フタロニトリル、イソ
フタロニトリル、テレフタロニトリルなどの芳香族ジニ
トリルなどが含まれる。一般式［ＩＩ］で表される芳香
族ニトリルには、例えば、α−ナフトニトリル、β−ナ
フトニトリルなどが含まれる。

【００１６】また、芳香族ニトリルには、例えば、シア
ン化ベンジルなども含まれる。

【００１７】複素環式ニトリルには、例えば、下記一般
式［ＩＩＩ］［ＩＶ］［Ｖ］又は［ＶＩ］で表される化
合物が含まれる。

【００１８】

【化３】 （式中、Ｘは、硫黄原子又は酸素原子を示す）

【００１９】

【化４】

【００２０】

【化５】

【００２１】

【化６】 前記一般式［ＩＩＩ］で表される化合物としては、例え
ば、２−チオフェンカルボニトリル、２−フロニトリル
などが挙げられる。

【００２２】前記一般式［ＩＶ］［Ｖ］で表される化合
物としては、例えば、２−シアノピリジン、３−シアノ
ピリジン、４−シアノピリジン、シアノピラジンなどが
挙げられる。

【００２３】一般式［ＶＩ］で表される化合物には、例
えば、５−シアノインドールが含まれる。

【００２４】複素環式ニトリルには、前記以外のニトリ
ル、例えば、シアノピペリジン、シアノピペラジンなど
の水素化された複素環式ニトリル、縮合複素環式ニトリ
ルも含まれる。

【００２５】なお、ニトリルが複数のシアノ基を有する
場合、少なくとも１個のシアノ基がアミド基に変換され
ればよい。

【００２６】本発明の製造方法で使用する微生物または
酵素は、構造が複雑な複素環式ニトリルに対しても水和
活性および選択性が高い。

【００２７】本発明において使用される微生物は、スト
レプトマイセス（Streptomyces）属、クレブシエラ（Kl
ebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニア
（Erwinia)属、ツカムレラ（Tukamurella)属、ゴルドナ
（Gordona)属、モルガネラ（Morganella）属、プロテウ
ス（Proteus)属、エンテロバクター（Enterobacter）
属、ミクロアスカス（Microascus）属、キャンディダ
（Candida)属、およびパントエア（Pantoea)属に属する
微生物群から選ばれ、かつニトリルを水和し、アミドを
生成する能力を有する限り、特に制限されない。

【００２８】ストレプトマイセス属に属する微生物とし
ては、例えば、ストレプトマイセスアルボグリセルス
（Streptomyces albogriseolus）ＨＵＴ ６０４５、ス
トレプトマイセス クリゾマルス（Streptomyces chrys
omallus)ＨＵＴ ６１４１、ストレプトマイセス シネ
レオルバー（Streptomyces cinereouruber）ＨＵＴ６１
４２、ストレプトマイセス ヂアスタチカス（Streptom
yces diastaticus）ＨＵＴ ６１１６、ストレプトマイ
セス オリバセウス（Streptomyces olivaceus）ＨＵＴ
６０６１、ストレプトマイセス ルブロシアノヂアス
タチカス（Streptomyces rubrocyanodiastaticus）ＨＵ
Ｔ ６１１７などが挙げられる。

【００２９】クレブシエラ属に属する微生物としては、
例えば、クレブシエラ ニュウモニアエ（Klebsiella p
neumoniae)ＩＦＯ １２０１９、ＩＦＯ ３３１９、Ｉ
ＦＯ１２０５９、ＩＡＭ １０６３、クレブシエラ ニ
ュウモニアエ サブスピーシズ ニュウモニアエ(Klebs
iella pneumoniae subsp. pneumoniae) ＮＨ−３６Ｔ２
株などが挙げられる。

【００３０】セラチア属に属する微生物の具体例として
は、例えば、セラチア ピリムシカ（Serratia plymuth
ica ）ＩＦＯ ３０５５、セラチア マルセッセンス
（Serratia marcescens ）ＩＡＭ １１０５などが挙げ
られる。

【００３１】エルビニア属に属する微生物には、例え
ば、エルビニア キャロトボラ（Erwinia carotovora）
ＩＦＯ ３０５７などが含まれる。

【００３２】ツカムレラ属に属する微生物には、例え
ば、ツカムレラ ポーロメタボラム（Tukamurella paur
ometabolum）ＪＣＭ ３２２６などが含まれる。 ゴル
ドナ属に属する微生物には、例えば、ゴルドナ ルブロ
ペルチンクタス（Gordona rubropertinctus)ＪＣＭ ３
２２７などが含まれる。

【００３３】モルガネラ属に属する微生物には、例え
ば、モルガネラ モルガニ（Morganella morganii)ＩＦ
Ｏ ３８４８などが含まれる。

【００３４】プロテウス属に属する微生物には、例え
ば、プロテウス ブルガリス（Proteus vulgaris）ＩＦ
Ｏ ３１６７などが含まれる。

【００３５】エンテロバクター属に属する微生物には、
例えば、エンテロバクター エアロジェネス（Enteroba
cter aerogenes）ＩＦＯ １２０１０などが含まれる。

【００３６】ミクロアスカス属に属する微生物には、例
えば、ミクロアスカス デスモスポラス(Microascus de
smosporus)ＩＦＯ６７６１などが含まれる。

【００３７】キャンディダ属に属する微生物には、例え
ば、キャンディダ グイリエモンディー（Candida guil
liermondii）ＮＨ−２株などが含まれる。

【００３８】パントエア属に属する微生物には、例え
ば、パントエア アグロメランス（Pantoea agglomeran
s)ＮＨ−３株などが含まれる。

【００３９】前記微生物は、野生株、変種株、または、
細胞融合もしくは遺伝子操作法などの遺伝的手法により
誘導される組み換え株など、いずれの株であってもよ
い。また、これらの微生物は、少なくとも一種使用すれ
ばよい。

【００４０】なお、ＩＦＯ番号の付された微生物は、
（財）醗酵研究所（ＩＦＯ）発行の「List of Culture
s、第８版、第１巻（1988）」に記載されており、該Ｉ
ＦＯから入手できる。ＩＡＭ番号の付された微生物は東
京大学応用微生物学研究所から入手できる。ＪＣＭ番号
の付された微生物は、理化学研究所 系統微生物保存機
関発行の「 Catalogue of strains 第４版（1989）」に
記載されており、理化学研究所 系統微生物保存機関よ
り入手できる。ＨＵＴ番号の付された微生物は、日本微
生物保存連盟（JFCC）発行の「 Catalogue of Culture
s、第４版（1987）」に記載されており、広島大学工学
部から入手できる。

【００４１】また、キャンディダ グイリエモンディー
ＮＨ−２株、およびパントエアアグロメランス ＮＨ
−３株、クレブシエラ ニュウモニアエ サブスピーシ
ズニュウモニアエ ＮＨ−３６ Ｔ２株は、本発明者ら
が自然界より分離したもので、アミド生成能の強い菌株
であり、それぞれ、微工研菌寄第１１３５０号（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１１３５０）、微工研菌寄第１１３４９号（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１１３４９）、微工研菌寄第１１７３９号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１１７３９）として工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託されている。以下に、それらの菌
学的性質を示す。

【００４２】キャンディダ グイリエモンディ ＮＨ−
２株 (1)形態 コロニー：半透明でクリーム色がかった白色、光沢があ
る。縁は完全で、仮性菌糸がまばらにある。

【００４３】分芽胞子：小さめで、楕円形 有性生殖の有無：なし (2)Ｃ源およびＮ源の同化 嫌気的：グルコース ＋ 好気的：グルコース ＋ ガラクトース ＋ ソルボース ＋ ラムノース ＋ ズルシトール ＋ イノシトール − マンニトール ＋ ソルビトール ＋ グリセリン ＋ エリスリトール − Ｄ−アラビノース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ リボース ＋ Ｄ−キシロース ＋ Ｌ−キシロース − アドニトール ＋ α−メチルグルコシド ＋ サリシン ＋ セロビオース ＋ マルトース ＋ ラクトース − メリビオース ＋ シュクロース ＋ トレハロース ＋ イヌリン − メレジトース ＋ ラフィノース ＋ デンプン − キシリトール ＋ グルコン酸 − ２−ケト−グルコン酸 ＋ ５−ケト−グルコン酸 − 硝酸塩 − (3)３０℃での生育 ＋ ３７℃での生育 ＋ (4)４−シアノピリジンの水和 ＋ 以上の菌学的性質をN. J. W. Kreger-van Rij による
“The Yeasts, a taxonomic study ”第３版（1984）に
従って分類し、ＮＨ−２株をキャンディダ グイリエモ
ンディ（Candida guilliermondii）と同定した。

【００４４】パントエア アグロメランス ＮＨ−３株 (a)形態 (1)細胞の形および大きさ 桿菌 ０．５〜０．７μ×１．２〜２．５μ (2)細胞の多形性の有無 なし (3)運動性 あり (4)胞子の有無 なし (5)グラム染色性 陰性 (6)鞭毛 周鞭毛 (b)生理学的性質 (1)オキシダーゼ 陰性 (2)カタラーゼ 陽性 (3)アミノペプチダーゼ 陽性 (4)硫化水素の生成 陰性 (5)インドールの生成 陰性 (6)ＶＰテスト 陰性 (7)硝酸塩の還元 陰性 (8)クエン酸の利用（Simons' ） 陽性 (9)ウレアーゼ 陰性 (10)フェニルアラニンデアミナーゼ 陽性 (11)マロン酸の利用 陽性 (12)シュクロースからレバンの生成 陰性 (13)レシチナーゼ 陰性 (14)デンプンの加水分解 陰性 (15)ゼラチンの加水分解 陰性 (16)カゼインの加水分解 陰性 (17)ＤＮＡの加水分解 陰性 (18)Tween 80の加水分解 陰性 (19)エクスリンの加水分解 陽性 (20)チロシンの分解 陰性 (21)３％ＫＯＨによる溶菌 陽性 (22)酸素に対する態度 通性嫌気
性 (23)３７℃での生育 する (24)４１℃での生育 しない (25)ｐＨ５．６での生育 する (26)Mac-Conkey-Agar 培地での生育 する (27)SS-Agar 培地での生育 する (28)Cetrimid-Agar 培地での生育 しない (29)色素の生成 黄色 非拡散性 あり 拡散性 なし 蛍光性 なし ピロシアニン なし (30)ＯＦテスト Ｆ (31)グルコースからガスの生成 − (32)糖から酸の生成 グルコース ＋ フラクトース ＋ キシロース ＋ ラムノース ＋ シュクロース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ メリビオース ＋ トレハロース ＋ ガラクトース ＋ ラクトース − ラフィノース − リボース ＋ マンノース ＋ マルトース − セロビオース ＋ メリジトース − アミグダリン ＋ アドニトール − イノシトール − マンニトール ＋ ズルシトール − ソルビトール − エリスリトール − アラビトール ＋ サリシン ＋ Ｎ−アセチルグルコサミン ＋ グリセリン ＋ エスクリン ＋ メチル−Ｄ−グルコシド − (33)ＯＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ） 陽性 (34)アルギニンジヒドロラーゼ 陰性 (35)リジンデカルボキシラーゼ 陰性 (36)オルニチンデカルボキシラーゼ 陰性 (37)４−シアノピリジンの水和 ＋ 以上の菌学的性質を、バージーの細菌分類書［Bergy's
Manualof SystematicBacteriology （1986）］に基づい
て分類すると、ＮＨ−３株は、エンテロバクター アグ
ロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定される
が、同種と、エルビニア ヘルビコラ（Erwinia herbic
ola ）、エルビニア ミレティアエ（Erwinia milletia
e ）の一部の種は、最近、パントエア アグロメランス
（Pantoea agglomerans ）として再分類することが提案
されており、広く支持されている［Gaviniら、 Int. J.
Syst. Bacteriol. 39, 337-45（1989）］。そこで、本
菌の特徴を、彼らに従って検討し、ＮＨ−３株をPantoe
a agglomerans と同定した。

【００４５】クレブシエラ ニュウモニアエ サブスピ
ーシズ ニュウモニアエＮＨ−３６ Ｔ２株 (a)形態 (1)細胞の形および大きさ 桿菌 ０．５〜０．７μ×１．２〜３．０μ (2)運動性 なし (3)グラム染色性 陰性 (4)胞子の有無 なし (b)生理学的性質 (1)オキシダーゼ 陰性 (2)カタラーゼ 陽性 (3)アミノペプチダーゼ(Cerny) 陽性 (4)インドールの生成 陰性 (5)ＶＰテスト 陽性 (6)硝酸塩の還元 陽性 (7)脱窒反応 陽性 (8)クエン酸の利用（Simons' ） 陽性 (9)ウレアーゼ 陽性 (10)フェニルアラニンデアミナーゼ 陰性 (11)マロン酸の利用 陽性 (12)シュクロースからレバンの生成 陰性 (13)レシチナーゼ 陰性 (14)デンプンの加水分解 陽性 (15)ゼラチンの加水分解 陰性 (16)カゼインの加水分解 陰性 (17)ＤＮＡの加水分解 陰性 (18)Tween 80の加水分解 陰性 (19)エクスリンの加水分解 陽性 (20)３％ＨＯＨによる溶菌 陽性 (21)酸素に対する態度 通性嫌気
性 (22)３７℃での生育 ＋ (23)４１℃での生育 ＋ (24)ｐＨ５．６での生育 ＋ (25)Mac-Conkey-Agar 培地での生育 ＋ (26)SS-Agar 培地での生育 ＋ (27)Cetrimid-Agar 培地での生育 ＋ (28)色素の生成 非拡散性 陰性 拡散性 陰性 蛍光性 陰性 ピロシアニン 陰性 (29)ＯＦテスト Ｆ (30)酸の生成 グルコース ＋ フラクトース ＋ キシロース ＋ ラムノース ＋ シュクロース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ メリビオース ＋ トレハロース ＋ ラクトース ＋ ラフィノース ＋ マンノース ＋ マルトース ＋ セロビオース ＋ メリジトース − アドニトール − エリスリトール − イノシトール ＋ マンニトール ＋ ズルシトール ＋ ソルビトール ＋ サリシン ＋ グリセリン ＋ (31)ＯＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ） 陽性 (32)アルギニンジヒドロラーゼ 陰性 (33)リジンデカルボキシラーゼ 陽性 (34)オルニチンデカルボキシラーゼ 陰性 (35)４−シアノピリジンの水和 ＋ (36)グルコースからガスの生成 ＋ 以上の菌学的性質を、前記バージーの細菌分類書に基づ
いて分類すると、ＮＨ−３６ Ｔ２株は、クレブシエラ
ニュウモニアエ サブスピーシズ ニュウモニアエと
同定された。

【００４６】本発明で使用する微生物は、適当な酵素誘
導源の存在下に培養するのが望ましい。酵素誘導源とし
ては、例えば、クロトノニトリル、クロトンアミド、ア
セトニトリル、トリメチルアセトニトリル、プロピオニ
トリル、プロピオンアミド、アセトアミド、イソバレロ
ニトリル、ｎ−ブチロニトリル、イソブチロニトリル、
ｎ−カプロニトリル、ｎ−ブチルアミド、イソブチルア
ミド、ｎ−カプロアミド、メタアクリロニトリル、メタ
アクリルアミド、ｎ−バレルアミド、イソバレロアミ
ド、ベンゾニトリル、ベンズアミド、２−シアノピリジ
ン、３−シアノピリジン、４−シアノピリジン、ピコリ
ンアミド、ニコチンアミド、イソニコチンアミドなどの
ニトリルおよびアミドなどが挙げられる。これらの酵素
誘導源は少なくとも一種使用できる。

【００４７】培地としては、前記酵素誘導源を含む慣用
の培地、例えば、(1) 前記酵素誘導源を唯一の窒素源ま
たは窒素源・炭素源とし、これにリン酸塩、ナトリウ
ム、カリウム、鉄、マグネシウム、マンガン、亜鉛、コ
バルトなどの無機栄養源；ビチオン、チアミンなどのビ
タミン類などを適宜含有する培地、(2) グルコース、フ
ルクトース、シュクロース、デキストリン、デンプンな
どの糖類、ソルビトール、エタノール、グリセロールな
どのアルコール類、フマル酸、クエン酸、酢酸、プロピ
オン酸などの有機酸類およびその塩類、パラフィンなど
の炭化水素類などから選択された少なくとも一種の炭素
源；硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの窒素
源；酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキスなど
の有機栄養源；前記酵素誘導源となるニトリル及び／又
はアミドなどの炭素源・窒素源；前記の無機栄養源、ビ
タミン類などを適宜含有した培地などが挙げられる。

【００４８】このような酵素誘導源を含む培地で前記微
生物を培養することにより、ニトリルに対して水和活性
を示す菌体を取得できる。

【００４９】培地のｐＨは、微生物の生育が阻害されな
い範囲、例えば、通常５〜９、好ましくはｐＨ６〜８程
度であり、培養温度は、通常２０〜５０℃、好ましくは
２５〜３７℃である。前記微生物の培養は、例えば、前
記培地で１〜５日間に亘り好気的に行うことができる。

【００５０】本発明の反応には、ニトリルを、前記微生
物、その処理物または微生物から分離したニトリルヒド
ラターゼ酵素により水和し、対応するアミドに変換させ
る全ての態様が含まれる。具体的には、例えば、次の通
りである。

【００５１】(1) ニトリルの存在下で微生物を培養する
方法、(2)培養した菌体培養物で、ニトリルを水和する
方法、(3) 菌体培養物から採取した菌体で、ニトリルを
水和する方法、(4) 菌体培養物から採取した菌体の処理
物、例えば菌体の破砕物で、ニトリルを水和する方法、
(5)培養菌体から分離したニトリルヒドラターゼ酵素
で、ニトリルを非生物学的に水和する方法、(6) 培養菌
体またはニトリルヒドラターゼ酵素を常法により担体に
固定化し、ニトリルを水和する方法など。

【００５２】菌体培養物からの菌体の採取は、慣用の方
法、例えば遠心分離法などで行なうことができる。ま
た、菌体の破砕も、例えば、ホモジナイザーなどにより
機械的に行なうことができる他、超音波などを用いて行
なうこともできる。

【００５３】本発明の方法において、反応に悪影響を及
ぼさない溶媒、例えば、水；生理食塩水；ｐＨ７〜９程
度のリン酸緩衝液などの緩衝液；アルコールなどの有機
溶媒と水との混液中に、微生物菌体または菌体処理物を
懸濁させ、ニトリルを共存させることにより、温和な条
件で速かに水和反応が進行し、対応するアミドが生成す
る。反応系の微生物菌体または菌体処理物の濃度は、通
常、０．１〜１０重量％程度、ニトリルの濃度は、通
常、０．１〜１０重量％程度である。反応は、例えば、
温度０〜４０℃程度、ｐＨ５〜１０程度、反応時間２分
〜２４時間程度で行なうことができる。

【００５４】なお、反応に際して、基質であるニトリル
の反応系内の濃度は、反応を阻害しない程度の濃度、例
えば、２重量％以下にコントロールしつつ逐次添加する
ことが望ましい。さらに、反応系のｐＨは、前記緩衝液
により、または水酸化ナトリウム、アンモニアなどの塩
基性化合物を添加することにより、ｐＨ７〜９程度にコ
ントロールするのが好ましい。

【００５５】このようにして生成したアミドは、慣用の
方法により分離精製できる。例えば、反応液を、直接、
膜分離、抽出、減圧濃縮、晶析、遠心分離などの分離手
段に供したり、反応液から菌体を遠心分離、膜分離など
によって除去した後、前記分離手段に供する方法などに
より、目的化合物であるアミドを分離することができ
る。なお、分離精製に際しては、任意の段階で、活性
炭、イオン交換樹脂などで処理して着色物質、不純物な
どを除去してもよい。

【００５６】

【発明の効果】本発明の製造方法は、反応活性および選
択性が極めて高く、構造が複雑であってもニトリルから
アミド化合物を効率よく工業的に有利に製造できる。
また、本発明の新規な微生物は、構造が複雑であっても
ニトリルを対応するアミド化合物に高い選択性および効
率で変換する。

【００５７】

【実施例】以下に、実施例に基づいて本発明をより詳細
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００５８】実施例１ 表１に示す培地５ｍｌを、φ２１ｍｍの試験管に入れ、
滅菌した後、表２に示す菌株をそれぞれ植菌し、３０℃
で７２時間振盪培養した。

【００５９】

【表１】 培養終了後、遠心分離により菌体を分離し、生菌体を得
た。培養生菌体の全量を、５０ｍＭカリウムリン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌに懸濁し、懸濁液に０．２
Ｍカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．２５ｍｌ、
４−シアノピリジン水溶液（０．２５ｍｌ）を加え、３
０℃で２４時間反応させた。反応終了後、遠心分離機で
菌体を除去し、得られた上清について、下記高速液体ク
ロマトグラフィーによりピリジン−４−カルボキサミド
を定量した。得られた結果を表２に示す。なお、高速液
体クロマトグラフィーによる反応生成物の定量は、下記
の条件で行なった。

【００６０】カラム：ユニシルパック５Ｃ₁₈（φ４．６
×２５０ｍｍ、ガスクロ工業製） 移動相：４０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ２．
５）：ＣＨ₃ ＣＮ＝３：１ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有量３ｇ／Ｌ 流速：１．２ｍｌ／分 温度：室温 検出波長：２０５ｎｍ

【００６１】

【表２】 実施例２ 表１に示す培地１５００ｍｌを、容量２．６Ｌの小型培
養槽（丸菱バイオエンジ製）に入れ、滅菌した後、エン
テロバクター エアロジェネス（Enterobacteraerogene
s）ＩＦＯ １２０１０を植菌した。温度３０℃、撹拌
速度４５０rpm、０．５vvm の通気の条件で７２時間培
養した。

【００６２】培養終了後、遠心分離にて菌体を分離し、
５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）３００ｍ
ｌに菌体を懸濁し、４−シアノピリジン３ｇを加えて、
温度３０℃、撹拌速度１００ｒｐｍの条件で２４時間反
応したところ、ピリジン−４−カルボキサミドは６．９
ｇ／Ｌの濃度で生成した。

【００６３】反応液から遠心分離にて菌体を除去した
後、上清を減圧濃縮し、得られた濃縮液を１００ｍｌの
ｎ−ブタノールにて３回抽出を行ない、ｎ−ブタノール
層を合わせ、減圧下に濃縮し、冷却することにより、ピ
リジン−４−カルボキサミド１．２ｇが得られた。

【００６４】実施例３ 表３に示す組成の培地５ｍｌを、φ２１ｍｍの試験管に
入れ、滅菌した後、エンテロバクター エアロジェネス
（Enterobacter aerogenes）ＩＦＯ １２０１０株、エ
ルビニア キャロトボラ（Erwiniacarotovora）ＩＦＯ
３０５７株、ゴルドナ ルブロペルチンクタス（Gord
ona rubropertinctus)ＪＣＭ ３２２７株、クレブシエ
ラ ニュウモニアエ（Klebsiella pneumoniae)ＩＦＯ
３３１９株、およびクレブシエラ ニュウモニアエ サ
ブスピーシズ ニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae
subsp. pneumoniae) ＮＨ−３６ Ｔ２株をそれぞれ一
白金耳植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。

【００６５】

【表３】 次いで、ＮＨ−３６ Ｔ２株を除く４種の培養液を前記
表１に示す滅菌済の培地（１００ｍｌ／５００ｍｌ容
坂口フラスコ）に、またＮＨ−３６ Ｔ２株の培養液を
表４に示す滅菌済の培地（１００ｍｌ／５００ｍｌ容
坂口フラスコ）に、それぞれ１ｍｌ植菌し、３０℃で７
２時間振盪培養した。

【００６６】

【表４】 培養終了後、遠心分離により菌体を集菌した後、５０ｍ
Ｍカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に菌体を懸濁
し、菌体濃度を光学濃度ＯＤ₆₆₀ ＝４に調整した。菌体
懸濁液０．２５ｍｌ、表５に示す４％のニトリル基質液
０．２５ｍｌ、２００ｍＭカリウムリン酸緩衝液０．２
５ｍｌ、および蒸溜水０．２５ｍｌからなる混合液を１
０℃で１時間静置し反応させた。なお、前記混合液中の
基質濃度は１％、菌体濃度はＯＤ₆₆₀ ＝１である。反応
混合液に２．５％リン酸１ｍｌを添加して反応を停止し
た後、遠心分離し、上清を適当な倍率で希釈し、下記の
条件で高速液体クロマトグラフィーにより、生成したア
ミドを定量した。

【００６７】高速液体クロマトグラフィーの条件 (1) アミドがピコリンアミド、ニコチンアミド、イソニ
コチンアミドおよびピラジンアミドである場合 カラム：Wakosil ５Ｃ₁₈（φ４．６×１５０ｍｍ、和光
純薬工業製） 移動相：４０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ２．
５）：ＣＨ₃ ＣＮ＝７：３ ＳＤＳ含有量３ｇ／Ｌ 流速：１．０ｍｌ／分 温度：室温 検出波長：２５４ｎｍ (2) アミドがベンズアミド、２−チオフェンカルボキサ
ミドおよびｍ−トルアミドである場合 カラム：Wakosil ５Ｃ₁₈（φ４．６×１５０ｍｍ、和光
純薬工業製） 移動相：４０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ２．
５）：ＣＨ₃ ＣＮ＝３：２ 流速：１．０ｍｌ／分 温度：室温 検出波長：２５４ｎｍ 結果を表５に示す。なお、相対活性はベンゾニトリルに
対する活性を１００％として表示した。

【００６８】

【表５】表５より、試験に供した菌株は、いずれも高い
水和活性を示す。特にＮＨ−３６ Ｔ２株は、各種のニ
トリルに対する水和活性が著しく高い。

【００６９】実施例４ 実施例３で用いた菌株のうちＮＨ−３６ Ｔ２株を除く
４種の菌株を、実施例３と同様にして培養し、遠心分離
により集菌した後、５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に菌体を懸濁し、菌体濃度をＯＤ₆₆₀ ＝８に
調整した。

【００７０】次いで、表６に示すように、４種類のニト
リル基質濃度１％、菌体濃度ＯＤ₆₆₀ ＝１〜４の混合液
を調製し、５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）中で、混合液１ｍｌを１０℃で４時間反応させた。
反応混合液に２．５％リン酸１ｍｌを添加して反応を停
止した後、遠心分離した。上清中に生成したアミドを、
実施例１と同様の高速液体クロマトグラフィーの分析条
件で定量した。なお、脂肪族アミドの場合には、下記の
ガスクロマトグラフィーの分析条件で、生成したアミド
を定量した。

【００７１】ガスクロマトグラフィーの条件 カラム：ポラパックＱ ８０〜１００メッシュ、φ２．
６ｍｍ×２．１ｍ Ｈｅ：４０ｃｍ³ ／分 検出：水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ） カラム温度：２１０〜２５０℃ 結果を表６に示す。なお、相対活性は、ピリジン−４−
カルボキサミドの生成量（モル）を１として、各アミド
の生成量（モル）から算出した。

【００７２】

【表６】表６より、試験に供した菌株は各種のニトリル
に対して高い水和活性を示す。

【００７３】実施例５ ＮＨ−３６ Ｔ２株を、実施例３と同様にして培養し、
遠心分離により集菌した後、５０ｍＭカリウムリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に菌体を懸濁し、菌体濃度をＯＤ
₆₆₀ ＝２に調整した。得られた菌体懸濁液０．２５ｍ
ｌ、２００ｍＭカリウムリン酸緩衝液０．２５ｍｌ、お
よび表７に示す９種類の２％ニトリル基質溶液０．５ｍ
ｌを混合し、１０℃で３０分間静置し反応させた。な
お、反応終了時の基質濃度は１％、菌体濃度はＯＤ₆₆₀
＝０．５とした。反応混合液に２．５％リン酸１ｍｌを
添加して反応を停止した後、実施例４と同様にして、生
成したアミドを定量した。結果を表７に示す。

【００７４】

【表７】 表７より、ＮＨ−３６ Ｔ２株はニトリルに対して著し
く高い水和活性を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成３年９月１９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００１１】脂肪族ニトリルとしては、炭素数２〜６の
飽和又は不飽和ニトリル、例えば、アセトニトリル、プ
ロピオニトリル、ブチロニトリル、イソブチロニトリ
ル、バレロニトリル、イソバレロニトリル、カプロニト
リルなどの飽和モノニトリル類；マロニトリル、サクシ
ノニトリル、アジポニトリルなどの飽和ジニトリル類；
α−アミノプロピオニトリル、α−アミノメチルチオブ
チロニトリル、α−アミノブチロニトリル、アミノアセ
トニトリルなどのα−アミノニトリル類；ラクトニトリ
ル、ヒドロキシアセトニトリル、α−ヒドロキシ−γ−
メチルチオブチロニトリルなどのα−ヒドロキシニトリ
ル類；アミノ−３−プロピオニトリルなどのβ−アミノ
ニトリル類；アクリロニトリル、メタクリロニトリルな
どの不飽和ニトリル類が挙げられる。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４４

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４４】パントエア アグロメランス ＮＨ−３株 (a)形態 (1)細胞の形および大きさ 桿菌 ０．５〜０．７μ×１．２〜２．５μ (2)細胞の多形性の有無 なし (3)運動性 あり (4)胞子の有無 なし (5)グラム染色性 陰性 (6)鞭毛 周鞭毛 (b)生理学的性質 (1)オキシダーゼ 陰性 (2)カタラーゼ 陽性 (3)アミノペプチダーゼ 陽性 (4)硫化水素の生成 陰性 (5)インドールの生成 陰性 (6)ＶＰテスト 陰性 (7)硝酸塩の還元 陰性 (8)クエン酸の利用（Simons' ） 陽性 (9)ウレアーゼ 陰性 (10)フェニルアラニンデアミナーゼ 陽性 (11)マロン酸の利用 陽性 (12)シュクロースからレバンの生成 陰性 (13)レシチナーゼ 陰性 (14)デンプンの加水分解 陰性 (15)ゼラチンの加水分解 陰性 (16)カゼインの加水分解 陰性 (17)ＤＮＡの加水分解 陰性 (18)Tween 80の加水分解 陰性 (19)エクスリンの加水分解 陽性 (20)チロシンの分解 陰性 (21)３％ＫＯＨによる溶菌 陽性 (22)酸素に対する態度 通性嫌気
性 (23)３７℃での生育 ＋ (24)４１℃での生育 − (25)ｐＨ５．６での生育 ＋ (26)Mac-Conkey-Agar 培地での生育 ＋ (27)SS-Agar 培地での生育 ＋ (28)Cetrimid-Agar 培地での生育 − (29)色素の生成 黄色 非拡散性 陽性 拡散性 陰性 蛍光性 陰性 ピロシアニン 陰性 (30)ＯＦテスト Ｆ (31)グルコースからガスの生成 − (32)糖から酸の生成 グルコース ＋ フラクトース ＋ キシロース ＋ ラムノース ＋ シュクロース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ メリビオース ＋ トレハロース ＋ ガラクトース ＋ ラクトース − ラフィノース − リボース ＋ マンノース ＋ マルトース − セロビオース ＋ メリジトース − アミグダリン ＋ アドニトール − イノシトール − マンニトール ＋ ズルシトール − ソルビトール − エリスリトール − アラビトール ＋ サリシン ＋ Ｎ−アセチルグルコサミン ＋ グリセリン ＋ エスクリン ＋ メチル−Ｄ−グルコシド − (33)ＯＮＰＧ（β−ガラクトシダーゼ） 陽性 (34)アルギニンジヒドロラーゼ 陰性 (35)リジンデカルボキシラーゼ 陰性 (36)オルニチンデカルボキシラーゼ 陰性 (37)４−シアノピリジンの水和 ＋ 以上の菌学的性質を、バージーの細菌分類書［Bergy's
Manualof SystematicBacteriology （1986）］に基づい
て分類すると、ＮＨ−３株は、エンテロバクター アグ
ロメランス（Enterobacter agglomerans）と同定される
が、同種と、エルビニア ヘルビコラ（Erwinia herbic
ola ）、エルビニア ミレティアエ（Erwinia milletia
e ）の一部の種は、最近、パントエア アグロメランス
（Pantoea agglomerans ）として再分類することが提案
されており、広く支持されている［Gaviniら、 Int. J.
Syst. Bacteriol. 39, 337-45（1989）］。そこで、本
菌の特徴を、彼らに従って検討し、ＮＨ−３株をPantoe
a agglomerans と同定した。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５９

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５９】

【表１】培養終了後、遠心分離により菌体を分離し、生
菌体を得た。培養生菌体の全量を、５０ｍＭカリウムリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．５ｍｌに懸濁し、懸濁液
に０．２Ｍカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．２
５ｍｌ、４−シアノピリジン水溶液（０．２５ｍｌ）を
加え、３０℃で２４時間反応させた。反応終了後、遠心
分離機で菌体を除去し、得られた上清について、下記高
速液体クロマトグラフィーによりイソニコチンアミドを
定量した。得られた結果を表２に示す。なお、高速液体
クロマトグラフィーによる反応生成物の定量は、下記の
条件で行なった。

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６０】カラム：ユニシルパック５Ｃ₁₈（φ４．６
×２５０ｍｍ、ガスクロ工業製） 移動相：４０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ２．
５）：ＣＨ₃ ＣＮ＝７：３ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）含有量３ｇ／Ｌ 流速：１．０ｍｌ／分 温度：室温 検出波長：２５４ｎｍ

【手続補正５】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００６６

【補正方法】変更

【補正内容】

【００６６】

【表４】培養終了後、遠心分離により菌体を集菌した
後、５０ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に菌
体を懸濁し、菌体濃度を光学密度ＯＤ₆₆₀ ＝４に調整し
た。菌体懸濁液０．２５ｍｌ、表５に示す４％のニトリ
ル基質液０．２５ｍｌ、２００ｍＭカリウムリン酸緩衝
液０．２５ｍｌ、および蒸溜水０．２５ｍｌからなる混
合液を１０℃で１時間静置し反応させた。なお、前記混
合液中の基質濃度は１％、菌体濃度はＯＤ₆₆₀ ＝１であ
る。反応混合液に２．５％リン酸１ｍｌを添加して反応
を停止した後、遠心分離し、上清を適当な倍率で希釈
し、下記の条件で高速液体クロマトグラフィーにより、
生成したアミドを定量した。

【手続補正６】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００７３】実施例５ ＮＨ−３６ Ｔ２株を、実施例３と同様にして培養し、
遠心分離により集菌した後、５０ｍＭカリウムリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）に菌体を懸濁し、菌体濃度をＯＤ
₆₆₀ ＝２に調整した。得られた菌体懸濁液０．２５ｍ
ｌ、２００ｍＭカリウムリン酸緩衝液０．２５ｍｌ、お
よび表７に示す９種類の２％ニトリル基質溶液０．５ｍ
ｌを混合し、１０℃で３０分間静置し反応させた。な
お、反応終了時の基質濃度は１％、菌体濃度はＯＤ₆₆₀
＝０．５である。反応混合液に２．５％リン酸１ｍｌを
添加して反応を停止した後、実施例４と同様にして、生
成したアミドを定量した。結果を表７に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:37）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ニトリルを、微生物又は酵素の作用によ
   り対応するアミドに変換し、生成したアミドを分離する
   アミドの製造方法において、前記微生物又は酵素が、ス
   トレプトマイセス（Streptomyces）属、クレブシエラ
   （Klebsiella）属、セラチア（Serratia）属、エルビニ
   ア（Erwinia)属、ツカムレラ（Tukamurella)属、ゴルド
   ナ（Gordona)属、モルガネラ（Morganella）属、プロテ
   ウス（Proteus)属、エンテロバクター（Enterobacter）
   属、ミクロアスカス（Microascus）属、キャンディダ
   （Candida)属、およびパントエア（Pantoea)属に属し、
   かつニトリルを水和する能力を有する微生物群から選ば
   れた少なくとも一種の微生物、又はこれらの微生物の酵
   素であることを特徴とするアミド化合物の製造方法。
2. 【請求項２】 ニトリルを水和しアミドに変換する微生
   物が、キャンディダグイリエモンディ（Candida guilli
   ermondii）ＮＨ−２株（微工研菌寄第１１３５０号）で
   ある新規な微生物。
3. 【請求項３】 ニトリルを水和しアミドに変換する微生
   物が、パントエアアグロメランス（Pantoea agglomeran
   s)ＮＨ−３株（微工研菌寄第１１３４９号）である新規
   な微生物。
4. 【請求項４】 ニトリルを水和しアミドに変換する微生
   物が、クレブシエラニュウモニアエ サブスピーシズ
   ニュウモニアエ(Klebsiella pneumoniae subsp. pneumo
   niae) ＮＨ−３６ Ｔ２株（微工研菌寄第１１７３９
   号）である新規な微生物。