JPH0774797B2 - 液体クロマトグラフィー用充てん剤並びにその製造方法及び使用方法 - Google Patents
液体クロマトグラフィー用充てん剤並びにその製造方法及び使用方法Info
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- JPH0774797B2 JPH0774797B2 JP63147037A JP14703788A JPH0774797B2 JP H0774797 B2 JPH0774797 B2 JP H0774797B2 JP 63147037 A JP63147037 A JP 63147037A JP 14703788 A JP14703788 A JP 14703788A JP H0774797 B2 JPH0774797 B2 JP H0774797B2
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- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
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- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
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- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
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Description
【発明の詳細な説明】 この出願は、この出願と同日に出願された同一出願人の
「液体クロマトグラフィー用二区域逆相充てん剤並びに
その製造方法及び使用方法」という発明の名称の出願に
関連する。
「液体クロマトグラフィー用二区域逆相充てん剤並びに
その製造方法及び使用方法」という発明の名称の出願に
関連する。
本発明は、液体クロマトグラフィーの充てん剤に関す
る。より詳しく述べるならば、本発明は、高性能液体ク
ロマクラフィーに使用するための改良充てん剤及びその
ような充てん剤を製造及び使用する方法に関する。
る。より詳しく述べるならば、本発明は、高性能液体ク
ロマクラフィーに使用するための改良充てん剤及びその
ような充てん剤を製造及び使用する方法に関する。
高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）による最新の液
体クロマトグラフィー手法の応用は、タンパク質の分
離、特性決定、及び精製の進歩に通じている。分離は、
大きさ（又は分子量）、所定のpHでの電荷、及び疎水性
アミノ酸組成及び三次構造に由来する）のようなタンパ
ク質の固有の性質に基礎を置く。これらの差異は、クロ
マトグラフィー手法にあってはもちろんのこと、古典的
なタンパク質分離処理で利用されている。電荷の違い
は、電気泳動及びイオン交換クロマトグラフィーで利用
される。大きさの違いは、超遠心分離及び寸法排他クロ
マトグラフィー（size exclusion chromatography）（S
EC）に利用される。個々のタンパク質の疎水性の違い
は、中性の塩の添加による分別沈殿に広く応用されてい
る。疎水性の固定相（逆相）を用いて行なうクロマトグ
ラフ分離は、タンパク質の分離及び特性決定のために大
いに有効且つ万能的な手段であることが立証されてい
る。
体クロマトグラフィー手法の応用は、タンパク質の分
離、特性決定、及び精製の進歩に通じている。分離は、
大きさ（又は分子量）、所定のpHでの電荷、及び疎水性
アミノ酸組成及び三次構造に由来する）のようなタンパ
ク質の固有の性質に基礎を置く。これらの差異は、クロ
マトグラフィー手法にあってはもちろんのこと、古典的
なタンパク質分離処理で利用されている。電荷の違い
は、電気泳動及びイオン交換クロマトグラフィーで利用
される。大きさの違いは、超遠心分離及び寸法排他クロ
マトグラフィー（size exclusion chromatography）（S
EC）に利用される。個々のタンパク質の疎水性の違い
は、中性の塩の添加による分別沈殿に広く応用されてい
る。疎水性の固定相（逆相）を用いて行なうクロマトグ
ラフ分離は、タンパク質の分離及び特性決定のために大
いに有効且つ万能的な手段であることが立証されてい
る。
逆相充てん剤を使用する液体クロマトグラフィーは、血
液、血清、又は血漿中の医薬物質についての定性及び定
量分析の両方に有効な手段であることが分っている。典
型的には、逆相充てん剤はアルキル結合シリカから作ら
れ、最も典型的には、この充てん剤は多孔質のシリカで
あって、それに結合したオクタデシルシラン（ODS）を
有する。
液、血清、又は血漿中の医薬物質についての定性及び定
量分析の両方に有効な手段であることが分っている。典
型的には、逆相充てん剤はアルキル結合シリカから作ら
れ、最も典型的には、この充てん剤は多孔質のシリカで
あって、それに結合したオクタデシルシラン（ODS）を
有する。
最近、オクタデシルシランが結合したシリカ充てん剤の
効率を向上させることに関して研究がなされている。例
えば、マーシャル（Marshall）らの文献（“Synthesis
of L C Reversed Phases of Higher Efficency by Init
ial Partial Deactivation of the Silica Surface、"J
ournal of Chromatography Sience、第22巻、pp.217〜2
20、1984年６月）を参照されたい。この文献には、末端
をキャップする少量の試薬（トリメチルクロロシランに
ようなもの）でシリカを前処理し、続いて徹底的ななオ
クタデシル化をすることが、一層効率の高い（バンド幅
がより狭い）逆相充てん剤を生ずる、ということが示唆
される。
効率を向上させることに関して研究がなされている。例
えば、マーシャル（Marshall）らの文献（“Synthesis
of L C Reversed Phases of Higher Efficency by Init
ial Partial Deactivation of the Silica Surface、"J
ournal of Chromatography Sience、第22巻、pp.217〜2
20、1984年６月）を参照されたい。この文献には、末端
をキャップする少量の試薬（トリメチルクロロシランに
ようなもの）でシリカを前処理し、続いて徹底的ななオ
クタデシル化をすることが、一層効率の高い（バンド幅
がより狭い）逆相充てん剤を生ずる、ということが示唆
される。
そのような充てん剤の効率は良好ではあるが、それらの
寿命は制限されている。オクタデシルシラン型充てん剤
は試料から親油性の医薬物質を吸収する一方、試料中に
含まれている他の物質から医薬物質を分別するのを妨げ
る傾向のあるタンパク質物質をも吸収する。これは最終
的には、クロマトグラフのカラムが完全に汚れることに
至る。従って、予め予備的な試料調製手順を実施して厄
介なタンパク質を除去することが必要であった。
寿命は制限されている。オクタデシルシラン型充てん剤
は試料から親油性の医薬物質を吸収する一方、試料中に
含まれている他の物質から医薬物質を分別するのを妨げ
る傾向のあるタンパク質物質をも吸収する。これは最終
的には、クロマトグラフのカラムが完全に汚れることに
至る。従って、予め予備的な試料調製手順を実施して厄
介なタンパク質を除去することが必要であった。
最も一般的なやり方では、タンパク質を沈澱させ、水性
上澄み液を水と不混和性を有機溶剤で抽出し、この有機
溶剤を蒸発により抽出物から除去し、そして高圧液体ク
ロマグラフィー（以下「HPLC」と略称する）で分析を行
なう前に移動相で分析物（analyte）の残留物を再構成
する。この方法は、非常に時間を消費し且つ原価的に非
効率的である。
上澄み液を水と不混和性を有機溶剤で抽出し、この有機
溶剤を蒸発により抽出物から除去し、そして高圧液体ク
ロマグラフィー（以下「HPLC」と略称する）で分析を行
なう前に移動相で分析物（analyte）の残留物を再構成
する。この方法は、非常に時間を消費し且つ原価的に非
効率的である。
現在用いられている第二の方法は、小さな使い捨てカラ
ム内のオクタデシルシランがシリカに結合した逆相充て
ん剤へ分析物を吸着させることを包含する。この手法は
自動化することができるとは言っても、カラムはタンパ
ク質が充てん剤上に残留するため一回の試料についての
み使用することができ、結果としてこの手法も多数の試
料については原価的に非効率的である。
ム内のオクタデシルシランがシリカに結合した逆相充て
ん剤へ分析物を吸着させることを包含する。この手法は
自動化することができるとは言っても、カラムはタンパ
ク質が充てん剤上に残留するため一回の試料についての
み使用することができ、結果としてこの手法も多数の試
料については原価的に非効率的である。
第三の方法では、シリカに結合させたオクタデシルシラ
ンの逆相充てん剤を、切り換え弁装置により分析カラム
から分離されているがそれへ接続可能な前置カラムへ入
れる。血清試料は直接前置カラムへ注入され、そこでタ
ンパク質が変性されそして蓄積され、タンパク質を除い
た分析物溶液が分別のための分析カラムへ進む。およそ
３回の注入後、前置カラムはバックフラッシュしてタン
パク質の残留物を除去しなくてはならない。この中断す
るバックフラッシュは、多数の試料については時間的に
非効率的である。その上、タンパク質はオクタデシルシ
ラン型充てん剤から完全には取り除くことができないの
で、この充てん剤は結局は劣化する。
ンの逆相充てん剤を、切り換え弁装置により分析カラム
から分離されているがそれへ接続可能な前置カラムへ入
れる。血清試料は直接前置カラムへ注入され、そこでタ
ンパク質が変性されそして蓄積され、タンパク質を除い
た分析物溶液が分別のための分析カラムへ進む。およそ
３回の注入後、前置カラムはバックフラッシュしてタン
パク質の残留物を除去しなくてはならない。この中断す
るバックフラッシュは、多数の試料については時間的に
非効率的である。その上、タンパク質はオクタデシルシ
ラン型充てん剤から完全には取り除くことができないの
で、この充てん剤は結局は劣化する。
従って、逆相液体クロマトグラフィーにとっては、タン
パク質を吸着する性質がより少ない充てん剤を得るとい
うことは望ましいことであろう。
パク質を吸着する性質がより少ない充てん剤を得るとい
うことは望ましいことであろう。
寸法排他クロマトグラフィーの観点からは、親水性の結
合相が表面の濃密な飽和被覆を形成するが多重重合体層
（「多重層」）を形成しない充てん剤を得ることが望ま
しいことであろう。商業的な高性能寸法排他クロマトグ
ラフのカラムは、典型的には、ジオールが結合した相、
最も代表的にはグリセリルプロピルシランを有する多孔
質のシリカ保持体を含んでなる充てん剤を有する。例え
ば、ファンコク（Pfannkock）ら、“Characterization
of Some Commercial High Performance Size−Exclusio
n Chromatography Colums for water−Soluble Polymer
s"、Journal of Chromatographic Science、第18巻、p
p.430〜441（1980年９月）を参照されたい。しかしなが
ら、ジオール結合相は、水性溶液から析出させた場合に
は厚い多重層被覆を与える傾向がある。
合相が表面の濃密な飽和被覆を形成するが多重重合体層
（「多重層」）を形成しない充てん剤を得ることが望ま
しいことであろう。商業的な高性能寸法排他クロマトグ
ラフのカラムは、典型的には、ジオールが結合した相、
最も代表的にはグリセリルプロピルシランを有する多孔
質のシリカ保持体を含んでなる充てん剤を有する。例え
ば、ファンコク（Pfannkock）ら、“Characterization
of Some Commercial High Performance Size−Exclusio
n Chromatography Colums for water−Soluble Polymer
s"、Journal of Chromatographic Science、第18巻、p
p.430〜441（1980年９月）を参照されたい。しかしなが
ら、ジオール結合相は、水性溶液から析出させた場合に
は厚い多重層被覆を与える傾向がある。
厚い多重層が結合した相は、溶質の接近を減少させ、従
って効率を低下させる、ということが知られている。例
えば、カークランド（Kirkland,J.），“High Speed Li
quid−Partition Chromatography With Chmically Bond
ed Oraganic Staionary Phases,"Journal of Chromatog
raphic Science、第９巻、pp.206〜214（1971年４月）
を参照されたい。その理由から、典型的には、ジオール
結合相は、飽和量未満が表面へ固定される条件下で、典
型的には１平方ナノメートル当り1.0分子以下（すなわ
ち1.0m/nM2）の量で、多孔質のシリカ保持体に適用さ
れる。レグニァー（Regnier）ら、“Glycerolpropylsil
ane Bonded Phases in the Steric Exclusion Chromato
graphy of Biolgical Macromolecules,"Journal of Chr
omatographic Science、第14巻、pp.316〜320（1976年
７月）を参照されたい。しかしながら、そのような「軽
い」適用は、カラムを非能率にしかねない希簿な結合相
に帰着する。
って効率を低下させる、ということが知られている。例
えば、カークランド（Kirkland,J.），“High Speed Li
quid−Partition Chromatography With Chmically Bond
ed Oraganic Staionary Phases,"Journal of Chromatog
raphic Science、第９巻、pp.206〜214（1971年４月）
を参照されたい。その理由から、典型的には、ジオール
結合相は、飽和量未満が表面へ固定される条件下で、典
型的には１平方ナノメートル当り1.0分子以下（すなわ
ち1.0m/nM2）の量で、多孔質のシリカ保持体に適用さ
れる。レグニァー（Regnier）ら、“Glycerolpropylsil
ane Bonded Phases in the Steric Exclusion Chromato
graphy of Biolgical Macromolecules,"Journal of Chr
omatographic Science、第14巻、pp.316〜320（1976年
７月）を参照されたい。しかしながら、そのような「軽
い」適用は、カラムを非能率にしかねない希簿な結合相
に帰着する。
従って、濃密であるが多重相でないジオールが結合した
相を有する寸法排他クロマトグラフィー充てん剤の必要
もまた存在する。
相を有する寸法排他クロマトグラフィー充てん剤の必要
もまた存在する。
本発明は、これらの必要性を、一つの態様においてはタ
ンパク質の吸着性がより小さい、従って改良された逆相
充てん剤であり、またもう一つの態様において濃密であ
るが多重層でないジオール結合相を用意し、従っえ改良
された寸法排置クロマトグラフィーの充てん剤である充
てん剤を提供することによって満たす。
ンパク質の吸着性がより小さい、従って改良された逆相
充てん剤であり、またもう一つの態様において濃密であ
るが多重層でないジオール結合相を用意し、従っえ改良
された寸法排置クロマトグラフィーの充てん剤である充
てん剤を提供することによって満たす。
本発明の充てん剤を製造するための好ましい方法は、次
に掲げる工程を包含する。
に掲げる工程を包含する。
１）多孔質シリカのようなヒドロキシル基を有する多孔
質の保持体を、下記の式、すなわち、 （この式において、Ｌは塩素、NR2（すなわち置換アミ
ノ基）、又はＮ−メチルアセトアミド基であり、Meはメ
チル基（すなわちCH3）であり、ｍは１〜３である）を
有するケタールシランと接触させる。好ましくは、この
ケタールシランは、 である。
質の保持体を、下記の式、すなわち、 （この式において、Ｌは塩素、NR2（すなわち置換アミ
ノ基）、又はＮ−メチルアセトアミド基であり、Meはメ
チル基（すなわちCH3）であり、ｍは１〜３である）を
有するケタールシランと接触させる。好ましくは、この
ケタールシランは、 である。
２）任意的に、その後トリメチルシリル試薬のような末
端をキャップする試薬を使用して、保持体の内表面及び
外表面の両方に残っているヒドロキシル基シラノール
基）を末端キャップ処理してもよい。
端をキャップする試薬を使用して、保持体の内表面及び
外表面の両方に残っているヒドロキシル基シラノール
基）を末端キャップ処理してもよい。
工程１及び２の結果は、逆相液体クロマトグラフィーで
使用することができる充てん剤である。それは、多孔質
の保持体の内表面及び外表面の両方にケタールでブロッ
クされたジオール（KBD）基を有する。そのようなケタ
ールでブロックされたジオール基は、本質において疎油
性（Iipophobic）であり且つタンパク質に対する吸着性
が相対的により小さい部分を有する。多孔質保持体の他
の部分は、恐らくはケタールシランのアルキル鎖及び／
又はメチル基の存在のため、本質において親油性であっ
て、親油性の分配相として働く。多孔質保持体の親油性
部分の性質は、タンパク質を含有している生物学的物質
（例えば血清又は血漿）中の多くの小さい分子（例えば
薬物）を分離及び定量するのに十分なだけの逆相特性を
この保持体に与える。
使用することができる充てん剤である。それは、多孔質
の保持体の内表面及び外表面の両方にケタールでブロッ
クされたジオール（KBD）基を有する。そのようなケタ
ールでブロックされたジオール基は、本質において疎油
性（Iipophobic）であり且つタンパク質に対する吸着性
が相対的により小さい部分を有する。多孔質保持体の他
の部分は、恐らくはケタールシランのアルキル鎖及び／
又はメチル基の存在のため、本質において親油性であっ
て、親油性の分配相として働く。多孔質保持体の親油性
部分の性質は、タンパク質を含有している生物学的物質
（例えば血清又は血漿）中の多くの小さい分子（例えば
薬物）を分離及び定量するのに十分なだけの逆相特性を
この保持体に与える。
任意的な末端キャップ工程を採用する場合には、多孔質
保持体の内表面及び外表面の両方がトリメチルシリル基
で末端をキャップした基を有する。そのような末端キャ
ップ基は、相対的に吸着性がより小さく、そしてそれ自
体が、そうでなければ未反応のままであろう多孔質保持
体のヒドロキシル基のために好ましい。
保持体の内表面及び外表面の両方がトリメチルシリル基
で末端をキャップした基を有する。そのような末端キャ
ップ基は、相対的に吸着性がより小さく、そしてそれ自
体が、そうでなければ未反応のままであろう多孔質保持
体のヒドロキシル基のために好ましい。
更にその上の任意の工程として、他の逆相表面処理剤を
工程１のケタールでブロックされたジオール基と組合せ
て使用してもよい。従って、多孔質シリカを前処理し
て、多孔質シリカの表面に他の基、例えば飽和量未満の
オクタデシルシリル（ODS）基を生成させることが可能
である。多孔質シリカの表面でのODS基とKBD基との組合
わせは、充てん剤の吸着量を飽和したODS表面のそれと
飽和したKBD表面のそれとの間に低下させることが望ま
しい場合に有効である逆相充てん剤を供給する。任意的
に、そのような充てん剤のケタール原子団を加水分解し
てジオールにし、カラムの保持能力を改善しそして更に
逆相吸着量を所望のレベルに低下させてもよい。同様
に、逆相処理剤の他の組合わせをケタールでブロックさ
れたジオール基と一緒に使用してもよい。
工程１のケタールでブロックされたジオール基と組合せ
て使用してもよい。従って、多孔質シリカを前処理し
て、多孔質シリカの表面に他の基、例えば飽和量未満の
オクタデシルシリル（ODS）基を生成させることが可能
である。多孔質シリカの表面でのODS基とKBD基との組合
わせは、充てん剤の吸着量を飽和したODS表面のそれと
飽和したKBD表面のそれとの間に低下させることが望ま
しい場合に有効である逆相充てん剤を供給する。任意的
に、そのような充てん剤のケタール原子団を加水分解し
てジオールにし、カラムの保持能力を改善しそして更に
逆相吸着量を所望のレベルに低下させてもよい。同様
に、逆相処理剤の他の組合わせをケタールでブロックさ
れたジオール基と一緒に使用してもよい。
本発明の逆相充てん剤の外表面はタンパク質に対する吸
着性がより小さいケタールでブロックされたジオール基
を含有しているので、この充てん剤は、少なくとも、血
清タンパク質を吸着する程度が小さいということが示さ
れている。タンパク質は、本発明の逆相充てん剤を詰め
たカラムを通り抜け、その一方、薬物や代謝物のような
小さい分子は、親油性の分配相（partitioing phase）
により分離される。
着性がより小さいケタールでブロックされたジオール基
を含有しているので、この充てん剤は、少なくとも、血
清タンパク質を吸着する程度が小さいということが示さ
れている。タンパク質は、本発明の逆相充てん剤を詰め
たカラムを通り抜け、その一方、薬物や代謝物のような
小さい分子は、親油性の分配相（partitioing phase）
により分離される。
本発明の逆相充てん剤は、一般に本願と同日の本願出願
人による特許出願明細書の二区域（dualzone）逆相充て
ん剤ほど効果的ではないけれども、大抵の場合に申し分
なく働くことが分った。しかも、本発明の逆相充てん剤
を製造する方法は、本願と同日の本願出願人による上記
特許出願明細書に開示されたものよりも複雑ではない。
人による特許出願明細書の二区域（dualzone）逆相充て
ん剤ほど効果的ではないけれども、大抵の場合に申し分
なく働くことが分った。しかも、本発明の逆相充てん剤
を製造する方法は、本願と同日の本願出願人による上記
特許出願明細書に開示されたものよりも複雑ではない。
寸法排他クロマトグラフィーのために有用なジオールが
結合した相を有する充てんが所望される場合には、第三
の工程を行なうことができる。この第三の工程では、上
記のケタールでブロックされたジオール基を、 ３）例えば硫酸（H2SO4）で加水分解して、ケタール基
を切り離し、そして多孔質保持体の表面に、 のようなジオール基を形成させる。
結合した相を有する充てんが所望される場合には、第三
の工程を行なうことができる。この第三の工程では、上
記のケタールでブロックされたジオール基を、 ３）例えば硫酸（H2SO4）で加水分解して、ケタール基
を切り離し、そして多孔質保持体の表面に、 のようなジオール基を形成させる。
そうすることによって、濃密なジオール結合相が作り出
されるが、それは多重層の相ではない。それがカラムの
効力がなくなるを防止する能力は希簿な「軽い」ジオー
ル結合相のそれよりも大きく、またそれは、厚い多重相
のジオール結合相よりも溶質に対してより大きな入口
（access）をも有する。
されるが、それは多重層の相ではない。それがカラムの
効力がなくなるを防止する能力は希簿な「軽い」ジオー
ル結合相のそれよりも大きく、またそれは、厚い多重相
のジオール結合相よりも溶質に対してより大きな入口
（access）をも有する。
それゆえに、本発明の目的は、改良された逆相クロマト
グラフィー特性があるいは改良された寸法排他クロマト
グラフィー特性を有する充てん剤を提供すること、その
ような充てん剤を製造する方法を提供すること、そして
本発明の改良充てん剤を使用する方法を提供することで
ある。本発明のそのほかの目的及び利点は、以下に掲げ
る詳細な説明及び特許請求の範囲の記載から明らかとな
ろう。
グラフィー特性があるいは改良された寸法排他クロマト
グラフィー特性を有する充てん剤を提供すること、その
ような充てん剤を製造する方法を提供すること、そして
本発明の改良充てん剤を使用する方法を提供することで
ある。本発明のそのほかの目的及び利点は、以下に掲げ
る詳細な説明及び特許請求の範囲の記載から明らかとな
ろう。
本発明の充てん剤のための多孔質の保持体は、多孔質の
メタロイド酸化物、多孔質の金属酸化物、及び多孔質の
混合金属酸化物のような、その表面にヒドロキシル基を
有するどのような多孔質の固体でもよい。このような物
質には、シリカ、シリカゲル、アルミナ、スタニア、チ
タニア、ジルコニア、その他同種類のものが含まれる。
けれども、標準的な高性能液体クロマトグラフの充てん
剤は、ほとんど常にシリカ粒子又はシリカゲルであり、
従って多孔質シリカが最も好ましい。それゆえに、以下
においては、多孔質保持体を多孔質シリカと呼ぶ。好ま
しくは、細孔の直径は、逆相充てん剤については50〜12
0オングストローム、最も好ましくはほぼ60オングスト
ローム、そしてSEC充てん剤については50〜1000オング
ストローム、最も好ましくは300オングストロームであ
る。
メタロイド酸化物、多孔質の金属酸化物、及び多孔質の
混合金属酸化物のような、その表面にヒドロキシル基を
有するどのような多孔質の固体でもよい。このような物
質には、シリカ、シリカゲル、アルミナ、スタニア、チ
タニア、ジルコニア、その他同種類のものが含まれる。
けれども、標準的な高性能液体クロマトグラフの充てん
剤は、ほとんど常にシリカ粒子又はシリカゲルであり、
従って多孔質シリカが最も好ましい。それゆえに、以下
においては、多孔質保持体を多孔質シリカと呼ぶ。好ま
しくは、細孔の直径は、逆相充てん剤については50〜12
0オングストローム、最も好ましくはほぼ60オングスト
ローム、そしてSEC充てん剤については50〜1000オング
ストローム、最も好ましくは300オングストロームであ
る。
前述のように、本発明の充てん剤を製造法における最初
の工程は、多孔質シリカを、次に式、すなわち、 （この式において、Ｌは塩素又はＮ−メチルアセトアミ
ド基であり、Meはメチル基であり、ｍは１〜３である）
を有するケタールシランと接触させる。好ましいケター
ルシランは、 である。このタイプのケタールシランは、1986年10月３
日に提出され、そして本発明と同一の譲受人に譲渡され
た同時係属米国特許出願第914899号明細書に開示された
方法により調製することができよう。
の工程は、多孔質シリカを、次に式、すなわち、 （この式において、Ｌは塩素又はＮ−メチルアセトアミ
ド基であり、Meはメチル基であり、ｍは１〜３である）
を有するケタールシランと接触させる。好ましいケター
ルシランは、 である。このタイプのケタールシランは、1986年10月３
日に提出され、そして本発明と同一の譲受人に譲渡され
た同時係属米国特許出願第914899号明細書に開示された
方法により調製することができよう。
好ましいケタールシラに見られるＮ−メチルアセトアミ
ド基は、1986年８月28日に提出され、本発明と同一の譲
受人に譲渡された同時係属米国特許出願第901349号明細
書に開示された「リービング原子団（leaving group
s）」のうち一つである。従って、Ｎ−メチルアセトア
ミドのリービング原子団を含有しているケタールシラン
は、「急速反応」シランを考えることができる。米国特
許出願第901349号明細書に開示されたように、この急速
に反応する性質のシランは、最初に主として多孔質保持
体の外表面のヒドロキシル基と反応するけれども、本発
明で遭遇する条件の下では、外表面及び内表面の両方が
ケタールでブロックされたジオール基を有する。
ド基は、1986年８月28日に提出され、本発明と同一の譲
受人に譲渡された同時係属米国特許出願第901349号明細
書に開示された「リービング原子団（leaving group
s）」のうち一つである。従って、Ｎ−メチルアセトア
ミドのリービング原子団を含有しているケタールシラン
は、「急速反応」シランを考えることができる。米国特
許出願第901349号明細書に開示されたように、この急速
に反応する性質のシランは、最初に主として多孔質保持
体の外表面のヒドロキシル基と反応するけれども、本発
明で遭遇する条件の下では、外表面及び内表面の両方が
ケタールでブロックされたジオール基を有する。
ケタールシランは、0.5〜10.0m/nM2、好ましくは1.7〜
4.7m/nM2の範囲にわたる量で使用することができ、そし
て最も好ましくは、多孔質シリカを、１〜16時間の好ま
しい期間還流させながら乾燥した非プロトン性溶剤中で
好ましい約2.4m/nM2の量の好ましいケタールシランと接
触させる。
4.7m/nM2の範囲にわたる量で使用することができ、そし
て最も好ましくは、多孔質シリカを、１〜16時間の好ま
しい期間還流させながら乾燥した非プロトン性溶剤中で
好ましい約2.4m/nM2の量の好ましいケタールシランと接
触させる。
この段階では、多数のシラノール基が多孔質シリカの内
表面及び外表面の両方に未反応のまま残ることがある。
従って、任意の工程として、望ましくないどのような残
留シラノール基をも吸着性により少ないトリメチルシリ
ル（TMS）基に変えるために末端キャップ試薬を加えて
もよい。これば、好ましくは、多孔質シリカの過剰の、
例えば2.0m/nM2の（（CH3）3Si）2NHと接触させること
により行なわれる。これは、接近することができる残り
のシラノール基の完全な処理を確実にするのに十分なだ
けの期間行なわせるべきである。前述のように、この工
程は任意のものであって、省略しても差支えない。いず
れにしても、この段階における充てん剤は、逆相クロマ
トグラフィーに使用することができる。
表面及び外表面の両方に未反応のまま残ることがある。
従って、任意の工程として、望ましくないどのような残
留シラノール基をも吸着性により少ないトリメチルシリ
ル（TMS）基に変えるために末端キャップ試薬を加えて
もよい。これば、好ましくは、多孔質シリカの過剰の、
例えば2.0m/nM2の（（CH3）3Si）2NHと接触させること
により行なわれる。これは、接近することができる残り
のシラノール基の完全な処理を確実にするのに十分なだ
けの期間行なわせるべきである。前述のように、この工
程は任意のものであって、省略しても差支えない。いず
れにしても、この段階における充てん剤は、逆相クロマ
トグラフィーに使用することができる。
もう一つの任意の工程は、室温で約６時間例えば0.5モ
ル濃度の硫酸（H2SO4）を用いて加水分解し、ケタール
でブロックされているジオール基を切り離し、そしてジ
オール基を形成させるものである。このように、好まし
いケタールシランを使用し、そして加水分解を行なえ
ば、ジオール基は、 となるであろう。このようなジオール結合相は、その充
てん剤を寸法排他のクロマトグラフィーで使用可能なも
のにする。
ル濃度の硫酸（H2SO4）を用いて加水分解し、ケタール
でブロックされているジオール基を切り離し、そしてジ
オール基を形成させるものである。このように、好まし
いケタールシランを使用し、そして加水分解を行なえ
ば、ジオール基は、 となるであろう。このようなジオール結合相は、その充
てん剤を寸法排他のクロマトグラフィーで使用可能なも
のにする。
・逆相充てん剤の調製 最初に、5.00gのICN/Woelmシリカ（表面積424m2/g、粒
度５μｍ）（前もって秤量し、真空オーブン内で180℃
で16時間乾燥させたもの）と200ccのヘキサン（モレキ
ュラーシーブで乾燥させ、濾過したもの）を、窒素スウ
ィープを備えたグリースを使用しないじゃま板付きの50
0ccの三つ口フラスコに入れ、そしてこのスラリーを10
分間音波処理してシリカの細孔から空気を追い出した。
次いで、フラスコに、エアーモーター駆動のかい型撹拌
機、添加濾斗、そして反応中に水分を排除するためのド
ライエライトで保護された窒素スウィープを載せた凝縮
器を取り付けた。混合物をかき混ぜ、そして反応物が還
流するに至るまで20分間加熱した。次に、5.7ccケター
ルシランを20ccのヘキサンに溶解させたものを、還流さ
せながら５分かけて加えた。このケタールシランの構造
は、 であり、そしてこれにKBDAという表示を付した。KBDAの
添加後、20ccのヘキサンを全て一緒に加えた。この混合
物を２時間還流させた。次いで、この混合物をかき混ぜ
ずに室温まで冷却させ、そして処理されたシリカを濾過
して単離し、ヘキサンで２回、エタノールで１回、そし
てジエチルエーテルで３回続けて洗浄して清浄にした。
この処理シリカを、真空オーブン中で一晩80℃で乾燥さ
せた。この処理シリカのバルク分析結果は、炭素12.58
重量％であった。
度５μｍ）（前もって秤量し、真空オーブン内で180℃
で16時間乾燥させたもの）と200ccのヘキサン（モレキ
ュラーシーブで乾燥させ、濾過したもの）を、窒素スウ
ィープを備えたグリースを使用しないじゃま板付きの50
0ccの三つ口フラスコに入れ、そしてこのスラリーを10
分間音波処理してシリカの細孔から空気を追い出した。
次いで、フラスコに、エアーモーター駆動のかい型撹拌
機、添加濾斗、そして反応中に水分を排除するためのド
ライエライトで保護された窒素スウィープを載せた凝縮
器を取り付けた。混合物をかき混ぜ、そして反応物が還
流するに至るまで20分間加熱した。次に、5.7ccケター
ルシランを20ccのヘキサンに溶解させたものを、還流さ
せながら５分かけて加えた。このケタールシランの構造
は、 であり、そしてこれにKBDAという表示を付した。KBDAの
添加後、20ccのヘキサンを全て一緒に加えた。この混合
物を２時間還流させた。次いで、この混合物をかき混ぜ
ずに室温まで冷却させ、そして処理されたシリカを濾過
して単離し、ヘキサンで２回、エタノールで１回、そし
てジエチルエーテルで３回続けて洗浄して清浄にした。
この処理シリカを、真空オーブン中で一晩80℃で乾燥さ
せた。この処理シリカのバルク分析結果は、炭素12.58
重量％であった。
次に、この処理シリカをクロマトグラフのカラム（4.6m
m×100mm）に詰め、Perkin Elmer 2C55 Specに取り付け
た。５μｌのサンプルループに入れた、ベンジルアルコ
ールを0.1モル濃度のリン酸（H3PO4）緩衝液に溶解させ
た資料を、1ml/minの流量で分析した。ベンジルアルコ
ールは、従来技術のジオール結合相よりもかなり大きい
ｋ′＝2.4で検出された。
m×100mm）に詰め、Perkin Elmer 2C55 Specに取り付け
た。５μｌのサンプルループに入れた、ベンジルアルコ
ールを0.1モル濃度のリン酸（H3PO4）緩衝液に溶解させ
た資料を、1ml/minの流量で分析した。ベンジルアルコ
ールは、従来技術のジオール結合相よりもかなり大きい
ｋ′＝2.4で検出された。
本発明を詳細に且つその好ましい態様を参照して説明し
てきたが、特許請求の範囲に明らかに示された本発明の
範囲から逸脱することなく改良及び改変が可能であると
いうことは明らかであろう。
てきたが、特許請求の範囲に明らかに示された本発明の
範囲から逸脱することなく改良及び改変が可能であると
いうことは明らかであろう。
Claims (17)
- 【請求項１】下記の式 （式中のMeはメチル基を表し、ｍは１〜３である）を有
するケタールでブロックされたジオール基を表面に有す
る多孔質の保持体を含んでなる液体クロマトグラフのカ
ラム用逆相充てん剤。 - 【請求項２】前記多孔質保持体が多孔質のシリカであ
る、請求項１記載の充てん剤。 - 【請求項３】前記ケタールでブロックされたジオール基
の式が、 （この式においてはMeはメチル基である）である、請求
項２記載の充てん剤。 - 【請求項４】前記多孔質シリカ保持体がその表面にトリ
メチルシリルで末端をキャップした基をも有する、請求
項３記載の充てん剤。 - 【請求項５】前記多孔質シリカ保持体がその表面にオク
タデシルシリル基をも有する、請求項３記載の充てん
剤。 - 【請求項６】ａ）多孔質のメタロイド酸化物、多孔質の
金属酸化物、及び多孔質の混合金属酸化物からなる群よ
り選択したヒドロキシル基を有する多孔質保持体を用意
する工程、 ｂ）この多孔質保持体に、次の式、すなわち （この式において、Ｌは塩素又はＮ−メチルアセトアミ
ド基であり、Meはメチル基であり、ｍは１〜３である）
を有するケタールシランを、該多孔質保持体の表面にケ
タールでブロックされたジオール基が生成するのに十分
なだけの量で且つ十分なだけの期間接触させる工程、 を含んでなる液体クロマトグラフのカラム用の充てん剤
製造方法。 - 【請求項７】前記多孔質保持体がシラノール基を含有し
ている多孔質シリカである、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】前記ケタールでブロックされたジオール基
を加水分解してジオール基にする工程を更に包含してい
る、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】前記多孔質シリカを過剰のトリメチルシリ
ル基で末端をキャップする試薬と接触させて、該多孔質
シリカの表面の残りのシラノール基をキャップする工程
を更に包含している、請求項７記載の方法。 - 【請求項１０】前記末端をキャップする試薬が（（C
H3）３−Si）2NHである、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】前記ケタールシランが、 （この式においてMeはメチル基である）である、請求項
６記載の方法。 - 【請求項１２】（ａ）分析すべき血清、血漿、又は他の
生物学的流体を含有している分析物（analyte）を用意
する工程、 （ｂ）この分析物を、下記の式 （この式においてMeはメチル基である）を有するケター
ルでブロックされたジオール基をその表面に有する多孔
質の保持体を含んでなる充てん剤を詰めた液体クロマト
グラフィーカラムと接触させる工程、 を含んでなる、逆相液体クロマトグラフィーによる分析
方法。 - 【請求項１３】前記多孔質の保持体が多孔質のシリカで
ある、請求項12記載の方法。 - 【請求項１４】前記多孔質保持体がその表面にトリメチ
ルシリル基で未端をキャップした基をも有する、請求項
13記載の方法。 - 【請求項１５】（ａ）分析用の分析物を用意する工程、
（ｂ）この分析物を、次の式、すなわち、 （この式においてMeはメチル基である）のジオール基を
その表面に有する多孔質の保持体を含んでなる充てん剤
を詰めた液体クロマトグラフィーカラムと接触させる工
程、 を含んでなる、寸法排他クロマトグラフィーによる分析
方法。 - 【請求項１６】前記多孔質の保持体が多孔質のシリカで
ある、請求項15記載の方法。 - 【請求項１７】前記多孔質シリカ保持体がその表面にト
リメチルシリル基で末端をキャップした基をも有する、
請求項16記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63147 | 1987-06-17 | ||
| US07/063,147 US4773994A (en) | 1987-06-17 | 1987-06-17 | Liquid chromatography packing materials |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6416961A JPS6416961A (en) | 1989-01-20 |
| JPH0774797B2 true JPH0774797B2 (ja) | 1995-08-09 |
Family
ID=22047236
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63147037A Expired - Fee Related JPH0774797B2 (ja) | 1987-06-17 | 1988-06-16 | 液体クロマトグラフィー用充てん剤並びにその製造方法及び使用方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4773994A (ja) |
| EP (1) | EP0295808A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0774797B2 (ja) |
| CA (1) | CA1316901C (ja) |
| FI (1) | FI882896A7 (ja) |
| NO (1) | NO169577C (ja) |
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| DE4018778A1 (de) * | 1990-06-12 | 1991-12-19 | Braun Melsungen Ag | Adsorptionsmaterial zur selektiven entfernung von ldl- oder/und vldl |
| DE4130475A1 (de) * | 1991-09-13 | 1993-03-18 | Merck Patent Gmbh | Modifizierte chromatographische traegermaterialien |
| ES2058020B1 (es) * | 1992-07-03 | 1995-10-01 | Consejo Superior Investigacion | Procedimiento de fabricacion de soportes solidos inertes activados con grupos amino. |
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| WO2000040872A1 (de) * | 1998-12-30 | 2000-07-13 | Voith Turbo Gmbh & Co. Kg | Hydrodynamischer retarder mit mitteln zum erzeugen von druckimpulsen |
| SE0202551D0 (sv) * | 2002-08-27 | 2002-08-27 | Amersham Biosciences Ab | Chromatographic two-layer particles |
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| US7468130B2 (en) * | 2005-02-15 | 2008-12-23 | Dionex Corporation | Organosilanes and substrates covalently bonded with same and methods for synthesis and use same |
| WO2008106043A2 (en) * | 2007-02-26 | 2008-09-04 | Alltech Associates Inc. | Ultra-fast chromatography |
| US7557232B2 (en) * | 2007-05-25 | 2009-07-07 | Dionex Corporation | Compositions useful as chromatography stationary phases |
| CN104549184B (zh) * | 2015-01-31 | 2017-02-15 | 苏州汇通色谱分离纯化有限公司 | 一种富勒烯及其衍生物分离专用色谱分离介质的制备方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| DE2313073C2 (de) * | 1973-03-16 | 1984-11-29 | Istvan Prof. Dr. 6600 Saarbruecken Halasz | Verfahren zur chemischen Modifizierung von Oberflächen anorganischer Festkörper und deren Verwendung |
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| US4062693A (en) * | 1976-09-29 | 1977-12-13 | Union Carbide Corporation | Dry liquid alumina trihydrate concentrates |
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| US4233366A (en) * | 1978-10-23 | 1980-11-11 | Dresser Industries, Inc. | Silane coated silicate minerals and method for preparing same |
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- 1987-06-17 US US07/063,147 patent/US4773994A/en not_active Expired - Lifetime
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1988
- 1988-03-22 NO NO881249A patent/NO169577C/no unknown
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- 1988-06-16 JP JP63147037A patent/JPH0774797B2/ja not_active Expired - Fee Related
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