JPH0775546B2 - 水痘−帯状疱疹ウイルスにたいするワクチン - Google Patents
水痘−帯状疱疹ウイルスにたいするワクチンInfo
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- JPH0775546B2 JPH0775546B2 JP61178991A JP17899186A JPH0775546B2 JP H0775546 B2 JPH0775546 B2 JP H0775546B2 JP 61178991 A JP61178991 A JP 61178991A JP 17899186 A JP17899186 A JP 17899186A JP H0775546 B2 JPH0775546 B2 JP H0775546B2
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
- C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Description
【発明の詳細な説明】 水痘は、ヘルペスウイルス群の一員である水痘−帯状庖
疹ウイルス（varicella−zostervirus）（VZV）により
惹起される。この病気は以前にVZV免疫をもたない人に
生ずる。VZV−特異抗体は発病のすぐ後に示され、快復
期中に減少するが、多年の間検出可能であり、この病気
にたいする免疫と関連する。水痘は高度に伝染性であ
り;20才以前に人口の90％以上がVZVに曝される。全ての
場合ではないにせよ、大部分において、VZVは、脊髄後
根神経節細胞中に潜伏するようである。この潜伏状態か
ら、VZVは再活性化し、特異抗体の存在下においてさ
え、恐らく、弱体化した細胞性免疫の結果として、帯状
庖疹を起し得る。この病気は、免疫の抑制が受けた20才
以上の人が非常にかかり易い。
疹ウイルス（varicella−zostervirus）（VZV）により
惹起される。この病気は以前にVZV免疫をもたない人に
生ずる。VZV−特異抗体は発病のすぐ後に示され、快復
期中に減少するが、多年の間検出可能であり、この病気
にたいする免疫と関連する。水痘は高度に伝染性であ
り;20才以前に人口の90％以上がVZVに曝される。全ての
場合ではないにせよ、大部分において、VZVは、脊髄後
根神経節細胞中に潜伏するようである。この潜伏状態か
ら、VZVは再活性化し、特異抗体の存在下においてさ
え、恐らく、弱体化した細胞性免疫の結果として、帯状
庖疹を起し得る。この病気は、免疫の抑制が受けた20才
以上の人が非常にかかり易い。
VZVは、その表層に５種の主要糖蛋白を有する:gp115（1
15,000ダルトン糖蛋白）、gp105、gp92、gp83、gp55。
これらの糖蛋白は３種の遺伝子の産物であるようであ
る:gA（gp105）、gB（還元種gp62およびgp57からなる。
非還元状態でgp115）、そしてgC（gp92、gp83、gp5
5）。gAおよびgBにたいする単クローン抗体は、補体非
依存性の中和を示し、gCにたいする単クローン抗体は補
体依存性の中和を示す。
15,000ダルトン糖蛋白）、gp105、gp92、gp83、gp55。
これらの糖蛋白は３種の遺伝子の産物であるようであ
る:gA（gp105）、gB（還元種gp62およびgp57からなる。
非還元状態でgp115）、そしてgC（gp92、gp83、gp5
5）。gAおよびgBにたいする単クローン抗体は、補体非
依存性の中和を示し、gCにたいする単クローン抗体は補
体依存性の中和を示す。
VZV感染に伴なう病気を防ぐと思われる抗原を供給する
ことが、本発明の目的である。もう一つの目的は、VZV
抗体量を測定する診断に用い得る抗原に供給することで
ある。もう一つの目的は、これら抗原の調製法を与える
ことである。もう一つの目的は、VZVにたいする抗体
と、生体内および試験管内の両方において高めるための
抗原の使用方法を供給することである。もう一つの目的
は、他の方法により合成されるか、発現ベクター中で発
現される、ペプチド抗原を含む蛋白抗原の全配列を記載
することである。当該発明のこれらおよび他の目的は、
以下の記載から明らかになろう。
ことが、本発明の目的である。もう一つの目的は、VZV
抗体量を測定する診断に用い得る抗原に供給することで
ある。もう一つの目的は、これら抗原の調製法を与える
ことである。もう一つの目的は、VZVにたいする抗体
と、生体内および試験管内の両方において高めるための
抗原の使用方法を供給することである。もう一つの目的
は、他の方法により合成されるか、発現ベクター中で発
現される、ペプチド抗原を含む蛋白抗原の全配列を記載
することである。当該発明のこれらおよび他の目的は、
以下の記載から明らかになろう。
VZVgB遺伝子のDNA配列が同定された。該配列の断片が、
VZV−感染細胞から雑種−選択mRNA（hybrid−select m
RNA）に用いられた。該mRNAからの試験管内翻訳産物
が、単クローン抗体アフイニテイークロマトグラフイー
により精製されたgBにたいして形成されたモルモツト抗
体により免疫沈降された。このような蛋白は、VZVにた
いするワクチンの調製に有用である。
VZV−感染細胞から雑種−選択mRNA（hybrid−select m
RNA）に用いられた。該mRNAからの試験管内翻訳産物
が、単クローン抗体アフイニテイークロマトグラフイー
により精製されたgBにたいして形成されたモルモツト抗
体により免疫沈降された。このような蛋白は、VZVにた
いするワクチンの調製に有用である。
本発明は、保護免疫原性糖蛋白をコードするVZV DNA部
分の同定に向けられている。より特定すれば、その各ヌ
クレオチド配列および由来するアミノ酸配列が、全VZV
ゲノムの既知配列中に位置づけされた2.6キロ塩基対（K
bp）DNA断片に向けられている。
分の同定に向けられている。より特定すれば、その各ヌ
クレオチド配列および由来するアミノ酸配列が、全VZV
ゲノムの既知配列中に位置づけされた2.6キロ塩基対（K
bp）DNA断片に向けられている。
本発明はまた、該2.6Kbp DNA断片の全部または一部を含
むベクターにも向けられている。
むベクターにも向けられている。
本発明はまたこれらのベクターを含む宿主細胞にも関す
るものであり、この細胞は2.6Kbp断片でコードされたペ
プチドの全部又は一部を発現することができる。既知技
法に従つて、本分野の熟練者にとつては、上述のペプチ
ドの部分が化学的に合成され、または修飾されそしてそ
の免疫原性を保持することが出来るということは明らか
であろう。従つて、本発明はまた、これら蛋白のドメイ
ン、特に親水性領域およびスレオニンまたはセリンおよ
びＸが任意のアミノ酸残基であるアスパラギン−Ｘ−セ
リンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン残基を含み、
また取り囲んでいるドメインの化学合成にも向けられて
いる。これらドメインが、ウイルスの外側表層に存在す
ると思われるからである。
るものであり、この細胞は2.6Kbp断片でコードされたペ
プチドの全部又は一部を発現することができる。既知技
法に従つて、本分野の熟練者にとつては、上述のペプチ
ドの部分が化学的に合成され、または修飾されそしてそ
の免疫原性を保持することが出来るということは明らか
であろう。従つて、本発明はまた、これら蛋白のドメイ
ン、特に親水性領域およびスレオニンまたはセリンおよ
びＸが任意のアミノ酸残基であるアスパラギン−Ｘ−セ
リンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン残基を含み、
また取り囲んでいるドメインの化学合成にも向けられて
いる。これらドメインが、ウイルスの外側表層に存在す
ると思われるからである。
gBポリペプチドに翻訳され得るRNAをコードするDNA部分
は以下のように正確に同定されている： 数種のウイルス糖蛋白、gp115、gp62およびgp57（gp1お
よびgp3または“ジサルフアイドー連結２量体”として
も参照される）は、単クローン抗体により交叉反応性を
示し、gB糖蛋白遺伝子の産物であるとされてきた。該遺
伝子をVZVゲノム上にマツプする目的で、VZVゲノムDNA
ライブラリーからのプラスミドが、VZV−感染細胞からR
NAを雑種−選択するために用いられた。試験管内翻訳産
物が、単クローン抗体アフイニテイークロマトグラフイ
ーにより精製されたgBにたいして形成されたモルモツト
抗体により免疫沈降される。これら抗体は、ウイルスの
感染性を中和することが出来る。この分析によつて、10
0キロダルトン（KD）ポリペプチドが、Hind III−Ｄ断
片により選択されたmRNAから免疫沈降されることが分
る。VZVゲノムの該領域のDNA配列分析は、100KDの糖蛋
白様構造（疎水性リーダー、疎水性錨、9N−グリコシル
化認識部位）を有する蛋白をコードし得る2.6Kbp開放読
み取り枠（ORF）を明らかにする。該ORF DNAはHind II
I−Ｄ断片からクローンされ、100KD翻訳産物を有するmR
NAを雑種−選択し得ることが示されている。更に、100K
D種の免疫沈降性は、免疫アフイニテイーで精製されたg
Bにより特異適に阻止され得る。加うるに、VZV gBは、
免疫−アフイニテイークロマトグラフイーにより精製さ
れてきた。モルモツトに注射されると、該蛋白は試験管
内でVZV感染性を中和する抗体の形成を引き出すことが
出来る。精製されたVZV gBのの部分的なアミン酸配列分
析は、2.6Kbp ORFのDNA配列から帰属されたアミノ酸配
列と同一であることを示す。我々は、Hind III−Ｄ断片
中の該ORFが、糖蛋白gB遺伝子であり、中和エピトープ
（抗原決定基）を担う遺伝子産物を特定すると結論す
る。
は以下のように正確に同定されている： 数種のウイルス糖蛋白、gp115、gp62およびgp57（gp1お
よびgp3または“ジサルフアイドー連結２量体”として
も参照される）は、単クローン抗体により交叉反応性を
示し、gB糖蛋白遺伝子の産物であるとされてきた。該遺
伝子をVZVゲノム上にマツプする目的で、VZVゲノムDNA
ライブラリーからのプラスミドが、VZV−感染細胞からR
NAを雑種−選択するために用いられた。試験管内翻訳産
物が、単クローン抗体アフイニテイークロマトグラフイ
ーにより精製されたgBにたいして形成されたモルモツト
抗体により免疫沈降される。これら抗体は、ウイルスの
感染性を中和することが出来る。この分析によつて、10
0キロダルトン（KD）ポリペプチドが、Hind III−Ｄ断
片により選択されたmRNAから免疫沈降されることが分
る。VZVゲノムの該領域のDNA配列分析は、100KDの糖蛋
白様構造（疎水性リーダー、疎水性錨、9N−グリコシル
化認識部位）を有する蛋白をコードし得る2.6Kbp開放読
み取り枠（ORF）を明らかにする。該ORF DNAはHind II
I−Ｄ断片からクローンされ、100KD翻訳産物を有するmR
NAを雑種−選択し得ることが示されている。更に、100K
D種の免疫沈降性は、免疫アフイニテイーで精製されたg
Bにより特異適に阻止され得る。加うるに、VZV gBは、
免疫−アフイニテイークロマトグラフイーにより精製さ
れてきた。モルモツトに注射されると、該蛋白は試験管
内でVZV感染性を中和する抗体の形成を引き出すことが
出来る。精製されたVZV gBのの部分的なアミン酸配列分
析は、2.6Kbp ORFのDNA配列から帰属されたアミノ酸配
列と同一であることを示す。我々は、Hind III−Ｄ断片
中の該ORFが、糖蛋白gB遺伝子であり、中和エピトープ
（抗原決定基）を担う遺伝子産物を特定すると結論す
る。
既知技法に従つて、本分野の熟練者にとつては、上述の
DNA断片の全部または一部を、保護免疫原ポリペプチド
の全部または一部を生産する目的で発現ベクター中に置
き得ることは明白である。そのような発現ベクター系
は、しばしば、異性ポリペプチドの発現を指示する目的
で原核または真核細胞中に挿入されるプラスミドからな
つている。そのようなプラスミドは通常、異種ポリペプ
チドを特定するコード配列それ自身に加えて、プラスミ
ドを含む宿主細胞の選択のための配列、宿主細胞中でプ
ラスミドコピー数を増大するための配列、異種ポリペプ
チドの転写を開始させるための配列、異種ポリペプチド
の転写を終結させるための配列を含む。従つて、本発明
は、2.6Kbp DNA断片の全部または一部を含む宿主細胞お
よびベクターにも向けられている。
DNA断片の全部または一部を、保護免疫原ポリペプチド
の全部または一部を生産する目的で発現ベクター中に置
き得ることは明白である。そのような発現ベクター系
は、しばしば、異性ポリペプチドの発現を指示する目的
で原核または真核細胞中に挿入されるプラスミドからな
つている。そのようなプラスミドは通常、異種ポリペプ
チドを特定するコード配列それ自身に加えて、プラスミ
ドを含む宿主細胞の選択のための配列、宿主細胞中でプ
ラスミドコピー数を増大するための配列、異種ポリペプ
チドの転写を開始させるための配列、異種ポリペプチド
の転写を終結させるための配列を含む。従つて、本発明
は、2.6Kbp DNA断片の全部または一部を含む宿主細胞お
よびベクターにも向けられている。
VZV蛋白発現のための適当な宿主の例は、大腸菌（E.col
i）および枯草菌（B.subdilis）のような原核生物およ
び、S.セレビシエ（cerevisiae）および、チヤイニーズ
・ハムスター卵巣細胞およびベロ（Vero）細胞を含むが
それに限定されない連続哺乳動物細胞系のような真核生
物を含む。これら蛋白は単独または併用で、生理食塩水
または燐酸緩衝生理食塩水のような生理的に受容される
担体中で、感受性哺乳動物種の一員に投与量あたり約５
から150mcg、好ましくは投与量あたり10から50mcg量投
与されるときVZV病にたいし防御するのに有用である。
１ないし、それ以上の投与量が、VZV病にたいする有効
な防御をもたらすのに与えることができる。この蛋白
は、皮下または筋肉内への注射により与えることができ
る。これら蛋白がアデソ、ワクシニア、または単純庖疹
のようなウイルス性発現ベクターの手段によつてヒトの
中で直接発現され得ることもまた理解されねばならな
い。
i）および枯草菌（B.subdilis）のような原核生物およ
び、S.セレビシエ（cerevisiae）および、チヤイニーズ
・ハムスター卵巣細胞およびベロ（Vero）細胞を含むが
それに限定されない連続哺乳動物細胞系のような真核生
物を含む。これら蛋白は単独または併用で、生理食塩水
または燐酸緩衝生理食塩水のような生理的に受容される
担体中で、感受性哺乳動物種の一員に投与量あたり約５
から150mcg、好ましくは投与量あたり10から50mcg量投
与されるときVZV病にたいし防御するのに有用である。
１ないし、それ以上の投与量が、VZV病にたいする有効
な防御をもたらすのに与えることができる。この蛋白
は、皮下または筋肉内への注射により与えることができ
る。これら蛋白がアデソ、ワクシニア、または単純庖疹
のようなウイルス性発現ベクターの手段によつてヒトの
中で直接発現され得ることもまた理解されねばならな
い。
以下の例示は、本発明を説明するが、それだけのものと
限定するものではない。以下の例示中で指摘された各文
献の開示はここに参考として取り入れられている。
限定するものではない。以下の例示中で指摘された各文
献の開示はここに参考として取り入れられている。
実施例１ gB糖蛋白への前駆体蛋白をコードするRNAを選択し得るD
NA断片 細胞質性RNAはVZV−感染MRC−５細胞から、記載（J.M.C
hirgwinほか、バイオケミストリー第18巻5294頁（1979
年））のように調製された。異なるVZV Hind III断片
によりコードされたRNAは、ニトロセルロースに結合し
た（J.A.Cooperほか、ジヤーナル・オブ・ビロロジー第
37巻284頁（1981年））クローン化したVZV Hind III D
NA断片へのハイブリダイゼーシヨン（hybridization:雑
種形成）（J.R.EckerとR.W.Hyman、プロシーデイングス
・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
スUSA第79巻156頁（1982年））により選択された。これ
らRNAはウサギ網状赤血球破砕液中で翻訳された。この
ポリペプチド産物は、単クローン抗体アフイニテイー・
クロマトグラフイーにより精製されたgBにたいしつくら
れた多クローン性単一選択的モルモツト抗体により免疫
沈降された。（この精製は以下の実施例Ｖ中に記載され
ている）。この分析により、VZV Hind III−Ｄ断片によ
り選択されたmRNAからの100KD試験砕内翻訳産物が、ウ
イルスの感染性を中和する抗gB抗体により免疫沈降され
ることが見出された。（中和の記録は以下の実施例IV中
に記載されている）。
NA断片 細胞質性RNAはVZV−感染MRC−５細胞から、記載（J.M.C
hirgwinほか、バイオケミストリー第18巻5294頁（1979
年））のように調製された。異なるVZV Hind III断片
によりコードされたRNAは、ニトロセルロースに結合し
た（J.A.Cooperほか、ジヤーナル・オブ・ビロロジー第
37巻284頁（1981年））クローン化したVZV Hind III D
NA断片へのハイブリダイゼーシヨン（hybridization:雑
種形成）（J.R.EckerとR.W.Hyman、プロシーデイングス
・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オブ・サイエン
スUSA第79巻156頁（1982年））により選択された。これ
らRNAはウサギ網状赤血球破砕液中で翻訳された。この
ポリペプチド産物は、単クローン抗体アフイニテイー・
クロマトグラフイーにより精製されたgBにたいしつくら
れた多クローン性単一選択的モルモツト抗体により免疫
沈降された。（この精製は以下の実施例Ｖ中に記載され
ている）。この分析により、VZV Hind III−Ｄ断片によ
り選択されたmRNAからの100KD試験砕内翻訳産物が、ウ
イルスの感染性を中和する抗gB抗体により免疫沈降され
ることが見出された。（中和の記録は以下の実施例IV中
に記載されている）。
実施例II 大ORFを含むHind III−Ｄ DNAの断片 VZVゲノムからのHind III−Ｄ断片の配列解析は、糖蛋
白様構造（疎水性リーダー、疎水性錨、9N−グリコシル
化認識部位）を有する100KD蛋白をコードし得るORFを明
らかにした。このORF DNA部分はHind III−Ｄ断片から
クローン化され、単一選択的モルモツト血清および回復
期帯状庖疹血清の両方で免疫沈降し得る100KD翻訳産物
を有するmRNAを雑種選択し得ることが示された。さら
に、この100KD種の両血清による免疫沈降性は、免疫−
アフイニテイー精製gBにより阻害されるが、他の主要VZ
V糖蛋白によつては阻害されなかつた。従つてHind III
−Ｄ DNAのこの部分は、gB遺伝子と同定された。
白様構造（疎水性リーダー、疎水性錨、9N−グリコシル
化認識部位）を有する100KD蛋白をコードし得るORFを明
らかにした。このORF DNA部分はHind III−Ｄ断片から
クローン化され、単一選択的モルモツト血清および回復
期帯状庖疹血清の両方で免疫沈降し得る100KD翻訳産物
を有するmRNAを雑種選択し得ることが示された。さら
に、この100KD種の両血清による免疫沈降性は、免疫−
アフイニテイー精製gBにより阻害されるが、他の主要VZ
V糖蛋白によつては阻害されなかつた。従つてHind III
−Ｄ DNAのこの部分は、gB遺伝子と同定された。
実施例III VZV DNAの2.6Kbp部分のヌクレオチド配列決定 VZV Hind III−DNA部分の完全ヌクレオチド配列は、数
種の大開放読み取り枠を含む。これら開放読み取り枠の
１つは2.6Kbp長で、100KD蛋白をコードし、VZV gB抗原
をコードする実施例II中で述べた部分を含む。gB糖蛋白
をコードする完全2.6Kbp部分のヌクレオチド配列は以下
を与えられている： 前出のヌクレオチド配列は以下のペプチドをコードす
る： 実施例IV VZV gB糖蛋白の精製 単クローン抗体B1を保有する（Kellerほか、ジヤーナル
・オブ・ビロロジー第52巻:293頁（1984年）中に記載）
腹水液が、マウスから収穫された。等量の0.15M NaClが
添加された。次に、飽和（NH4）2SO4溶液が、等総量添
加され、４℃で一夜保持された。この混合物は10℃で20
00rpm遠心された。ペレツトは蒸留水中（2mg/ml）に再
懸濁され、結合用緩衝液（0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH
8.4）にたいし一夜透析された。１グラムの臭化シアン
−活性化セフアロース4B（フアルマシア、ピスカタウエ
イ、ニユージヤージー）が、0.001N、HCl中で膨潤さ
れ、60mlの粗焼結ガラス漏斗中に注がれた。これは200m
lの0.001N HCl、次いで50mlの結合用緩衝液で洗浄され
た。該セフアロースは次に、10mlの単クローン抗体溶液
と混合され、２時間23℃で回転された。次に、80μの
エタノールアミンが添加され、該溶液は１時間23℃で回
転された。該樹脂は使い捨てクロマトグラフイー・カラ
ム（バイオラド）中に注がれ、水分を流出させ10ml容の
以下の溶液で連続的に洗浄された:1）結合用緩衝液;2）
0.1M Na2HPO4;0.5M NaCl、pH8.2;3）0.1M NaOAc、0.5M
NaCl、pH4.0;4）0.1M NaHBO4、pH8.2;5）3M KSCN;6）0.
1M NaHBO4、pH8.2;次に、0.1M NaHBO4、pH8.2中４℃で
使用前貯蔵された。
種の大開放読み取り枠を含む。これら開放読み取り枠の
１つは2.6Kbp長で、100KD蛋白をコードし、VZV gB抗原
をコードする実施例II中で述べた部分を含む。gB糖蛋白
をコードする完全2.6Kbp部分のヌクレオチド配列は以下
を与えられている： 前出のヌクレオチド配列は以下のペプチドをコードす
る： 実施例IV VZV gB糖蛋白の精製 単クローン抗体B1を保有する（Kellerほか、ジヤーナル
・オブ・ビロロジー第52巻:293頁（1984年）中に記載）
腹水液が、マウスから収穫された。等量の0.15M NaClが
添加された。次に、飽和（NH4）2SO4溶液が、等総量添
加され、４℃で一夜保持された。この混合物は10℃で20
00rpm遠心された。ペレツトは蒸留水中（2mg/ml）に再
懸濁され、結合用緩衝液（0.1M NaHCO3、0.5M NaCl、pH
8.4）にたいし一夜透析された。１グラムの臭化シアン
−活性化セフアロース4B（フアルマシア、ピスカタウエ
イ、ニユージヤージー）が、0.001N、HCl中で膨潤さ
れ、60mlの粗焼結ガラス漏斗中に注がれた。これは200m
lの0.001N HCl、次いで50mlの結合用緩衝液で洗浄され
た。該セフアロースは次に、10mlの単クローン抗体溶液
と混合され、２時間23℃で回転された。次に、80μの
エタノールアミンが添加され、該溶液は１時間23℃で回
転された。該樹脂は使い捨てクロマトグラフイー・カラ
ム（バイオラド）中に注がれ、水分を流出させ10ml容の
以下の溶液で連続的に洗浄された:1）結合用緩衝液;2）
0.1M Na2HPO4;0.5M NaCl、pH8.2;3）0.1M NaOAc、0.5M
NaCl、pH4.0;4）0.1M NaHBO4、pH8.2;5）3M KSCN;6）0.
1M NaHBO4、pH8.2;次に、0.1M NaHBO4、pH8.2中４℃で
使用前貯蔵された。
VZV糖蛋白は、VZVにより80％細胞変性効果の程度まで感
染したMRC−５ヒト２倍体繊維芽細胞から精製された。7
50cm2ローラー・ボトル（roller bottle:細胞培養用回
転瓶）中の細胞は、0.15M NaCl、0.01M Na2HPO4、pH7.2
で２回洗浄され、よく水を除かれた。
染したMRC−５ヒト２倍体繊維芽細胞から精製された。7
50cm2ローラー・ボトル（roller bottle:細胞培養用回
転瓶）中の細胞は、0.15M NaCl、0.01M Na2HPO4、pH7.2
で２回洗浄され、よく水を除かれた。
10mlの50mMトリス、pH7.5、２％トリトン Ｘ−100、4m
Mフエニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）がボ
トル中で回転しつつ15分間インキユベートされた。次い
で、同じ10mlが、もう９個のローラーボトルを連続的に
抽出するのに用いられた。新鮮な10ml量の緩衝液が、10
個のローラーボトルを連続的にすすぐために用いられ、
最初の液と共に蓄えられた、結果として、20mlの抽出物
が、10個のローラーボトルからの材料を表すことにな
る。抽出物は使用されるまで−70℃で貯蔵された。
Mフエニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）がボ
トル中で回転しつつ15分間インキユベートされた。次い
で、同じ10mlが、もう９個のローラーボトルを連続的に
抽出するのに用いられた。新鮮な10ml量の緩衝液が、10
個のローラーボトルを連続的にすすぐために用いられ、
最初の液と共に蓄えられた、結果として、20mlの抽出物
が、10個のローラーボトルからの材料を表すことにな
る。抽出物は使用されるまで−70℃で貯蔵された。
抽出物は融解され、0.15M NaCl、0.01M Na2HPO4、0.05
％トリトンＸ−100、pH7.2にたいし一夜４℃で透析さ
れ、次いで1500rpm15分間４℃の遠心によつて清澄化さ
れた。20mlの抽出物が、1gの単クローン抗体−結合樹脂
に添加され、振盪しつつ一夜４℃でインキユベートされ
た。該スラリーは15分間1500rpm4℃で遠心され、0.1M N
aHBO4、pH8.2で３回洗浄された。該糖蛋白は23℃で10ml
の3M KSCNとのインキユベーシヨンにより溶出された。
該溶出物は直ちに0.15M NaCl、0.01M Na2HPO4、0.05％
トリトンＸ−100、pH7.2にたいし一夜４℃で透析され、
約1mg/mlに濃縮された。
％トリトンＸ−100、pH7.2にたいし一夜４℃で透析さ
れ、次いで1500rpm15分間４℃の遠心によつて清澄化さ
れた。20mlの抽出物が、1gの単クローン抗体−結合樹脂
に添加され、振盪しつつ一夜４℃でインキユベートされ
た。該スラリーは15分間1500rpm4℃で遠心され、0.1M N
aHBO4、pH8.2で３回洗浄された。該糖蛋白は23℃で10ml
の3M KSCNとのインキユベーシヨンにより溶出された。
該溶出物は直ちに0.15M NaCl、0.01M Na2HPO4、0.05％
トリトンＸ−100、pH7.2にたいし一夜４℃で透析され、
約1mg/mlに濃縮された。
免疫−アフイニテイー精製gBの中、約500μｇがLCC（液
クロマトグラフイー制御器）500FPLC（迅速蛋白液体ク
ロマトグラフイー）（フアルマシア）の試料ループ中に
入れられた。該試料は次いで、モノＱ陰イオン交換カラ
ム（フアルマシア）上に注入され、続いて5mlの20mMト
リス、pH7.7、20mM CHAPS（シグマ）で洗浄された。20m
Mトリス、pH7.5、20mM CHAPS中０−1M NaCl勾配がカラ
ム上にかけられ、各分画が集められた。約0.3M NaClの
位置に単一主要均質ピークが溶出され、セントリコン濃
縮器（アミコン）により、10mMトリス、pH7.5、10mM Na
Cl、0.05％トリトンＸ−100中50μ量にまで濃縮され
た。このピークは、以下の規準により、VZV gBであるこ
とが確かめられた。還元条件下でのドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動（SDS−PAG
E）後の銀染色において、該試料はKellerほか同書gp6
2、gp57;Okunoほか、ビロロジー第129巻;357頁（1983
年）、gp5;Groseほか、ビロロジー第132巻:138頁（1984
年）、gp66“ジサルフアイド結合２量体";Ferghaniほ
か、ジヤーナル・オブ・ビロロジー第52巻:55頁（1984
年）、64−65Kと記載されるように、分子量62,000およ
び57,000ダルトンの２つの蛋白として分析された。非還
元条件下でのSDS−PAGE後の銀染色において、該試料
は、Groseほか、同書、gp140、Vafaiほか、ジヤーナル
・オブ・ビロロジー第52巻:953頁（1984年）gp130と記
載されるように、分子量115,000の単一蛋白として分析
された。
クロマトグラフイー制御器）500FPLC（迅速蛋白液体ク
ロマトグラフイー）（フアルマシア）の試料ループ中に
入れられた。該試料は次いで、モノＱ陰イオン交換カラ
ム（フアルマシア）上に注入され、続いて5mlの20mMト
リス、pH7.7、20mM CHAPS（シグマ）で洗浄された。20m
Mトリス、pH7.5、20mM CHAPS中０−1M NaCl勾配がカラ
ム上にかけられ、各分画が集められた。約0.3M NaClの
位置に単一主要均質ピークが溶出され、セントリコン濃
縮器（アミコン）により、10mMトリス、pH7.5、10mM Na
Cl、0.05％トリトンＸ−100中50μ量にまで濃縮され
た。このピークは、以下の規準により、VZV gBであるこ
とが確かめられた。還元条件下でのドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動（SDS−PAG
E）後の銀染色において、該試料はKellerほか同書gp6
2、gp57;Okunoほか、ビロロジー第129巻;357頁（1983
年）、gp5;Groseほか、ビロロジー第132巻:138頁（1984
年）、gp66“ジサルフアイド結合２量体";Ferghaniほ
か、ジヤーナル・オブ・ビロロジー第52巻:55頁（1984
年）、64−65Kと記載されるように、分子量62,000およ
び57,000ダルトンの２つの蛋白として分析された。非還
元条件下でのSDS−PAGE後の銀染色において、該試料
は、Groseほか、同書、gp140、Vafaiほか、ジヤーナル
・オブ・ビロロジー第52巻:953頁（1984年）gp130と記
載されるように、分子量115,000の単一蛋白として分析
された。
実施例Ｖ 精製VZV gBポリペプチドは試験管内でVZV感染性を中和
する抗体を誘導する モルモツトが、フロインドの完全アジユバント中の20マ
イクログラムのVZV gB（上の実施例IVに記載されたよう
に免疫アフイニテイークロマトグラフイーにより精製さ
れた）を筋肉内投与され、続いて１ケ月後に２週間おき
に２回フロインドの不完全アジユバンド中VZV gB各10マ
イクログラムを投与された。これら３回の投与の後にモ
ルモツトから血清が得られた。各モルモツトからの血清
は記載された（Kellerほか、同上）ように試験管内VZV
中和検定に用いられた。この検定によつて、免疫後の血
清はVZV中和抗体を生成したが、免疫前のものにはなか
つた。
する抗体を誘導する モルモツトが、フロインドの完全アジユバント中の20マ
イクログラムのVZV gB（上の実施例IVに記載されたよう
に免疫アフイニテイークロマトグラフイーにより精製さ
れた）を筋肉内投与され、続いて１ケ月後に２週間おき
に２回フロインドの不完全アジユバンド中VZV gB各10マ
イクログラムを投与された。これら３回の投与の後にモ
ルモツトから血清が得られた。各モルモツトからの血清
は記載された（Kellerほか、同上）ように試験管内VZV
中和検定に用いられた。この検定によつて、免疫後の血
清はVZV中和抗体を生成したが、免疫前のものにはなか
つた。
実施例VI 精製VZV gBポリペプチドのアミノ酸分析 300μｇのVZV gB（実施例IVに記載されたように精製さ
れた）が、アプライド・バイオシステムズ気層配列決定
機を用いるアミノ末端配列分析にかけられた〔Hewickほ
か、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
第256巻:7790頁（1981年）〕。各段階で生成されたPTH
（フエニルチオヒダントイン）アミノ酸は高速液体クロ
マトグラフイーにより分離・定量された〔Speissほか、
プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンスUSA第70巻:2974頁（1979年）〕。
れた）が、アプライド・バイオシステムズ気層配列決定
機を用いるアミノ末端配列分析にかけられた〔Hewickほ
か、ジヤーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
第256巻:7790頁（1981年）〕。各段階で生成されたPTH
（フエニルチオヒダントイン）アミノ酸は高速液体クロ
マトグラフイーにより分離・定量された〔Speissほか、
プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンスUSA第70巻:2974頁（1979年）〕。
該配列分析は、gBが、上記実施例IV中の分析と合致する
２つの明瞭なアミノ末端を示した。配列決定機の各サイ
クルは0,1または２の同定可能なアミノ酸を示した。全
部でgB中の11アミノ酸が同定された。これらの中６つ
は、上の実施例III中のDNA配列から帰属されたアミノ酸
９−20の配列中に並べることが出来た。これらの中５つ
は上の実施例III中のDNA配列から帰属されたアミノ酸43
2−443の配列中に並べることが出来た。帰属されたアミ
ノ酸配列は868アミノ酸を含んでいるから、精製VZV gB
のこれらの配列のデータは、各々約430アミノ酸を含む
２つのポリペプチドに分けるような開裂が生じたことに
合致する。このことは、VZV gBの２つの還元種gp62およ
びgp57の非常によく似た分子量と合致するものである。
２つの明瞭なアミノ末端を示した。配列決定機の各サイ
クルは0,1または２の同定可能なアミノ酸を示した。全
部でgB中の11アミノ酸が同定された。これらの中６つ
は、上の実施例III中のDNA配列から帰属されたアミノ酸
９−20の配列中に並べることが出来た。これらの中５つ
は上の実施例III中のDNA配列から帰属されたアミノ酸43
2−443の配列中に並べることが出来た。帰属されたアミ
ノ酸配列は868アミノ酸を含んでいるから、精製VZV gB
のこれらの配列のデータは、各々約430アミノ酸を含む
２つのポリペプチドに分けるような開裂が生じたことに
合致する。このことは、VZV gBの２つの還元種gp62およ
びgp57の非常によく似た分子量と合致するものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ポール エム．ケラー アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴアニ ア，ランスデール，スプリング ヴアレー ロード 2057 (72)発明者 アンドリユー ジエー．デイヴイソン イギリス国，スコツトランド，グラスゴ ー，ウイロビイ ドライヴ 24 (56)参考文献 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，132［１］（1984) Ｐ．138−146 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，129［２］（1983) Ｐ．357−368
Claims (4)
- 【請求項１】下記ヌクレオチド配列を有する水痘−帯状
庖疹ウイルスDNAの2.6kbp断片： - 【請求項２】適当な宿主中で、水痘−帯状庖疹ウイルス
DNA断片によりコードされる蛋白を発現するように適応
された下記にヌクレオチド配列を有する2.6kbpDNA断片
を含むベクター。 - 【請求項３】宿主が原核または真核生物である特許請求
の範囲第２項によるベクター。 - 【請求項４】哺乳動物種において当該蛋白の全部が直接
発現される特許請求の範囲第２項によるウイルス性発現
ベクター。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US762001 | 1985-08-02 | ||
| US06/762,001 US4686101A (en) | 1985-08-02 | 1985-08-02 | Vaccine against varicella-zoster virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6270397A JPS6270397A (ja) | 1987-03-31 |
| JPH0775546B2 true JPH0775546B2 (ja) | 1995-08-16 |
Family
ID=25063859
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61178991A Expired - Lifetime JPH0775546B2 (ja) | 1985-08-02 | 1986-07-31 | 水痘−帯状疱疹ウイルスにたいするワクチン |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4686101A (ja) |
| EP (2) | EP0482671B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0775546B2 (ja) |
| DE (2) | DE3685617T2 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4952674A (en) * | 1986-05-02 | 1990-08-28 | Merck & Co., Inc. | Vaccine against varicella-zoster virus |
| EP0260012A1 (en) * | 1986-09-02 | 1988-03-16 | Merck & Co. Inc. | Promoter for expression of heterologous proteins in mammalian cells |
| JPH01252279A (ja) * | 1988-03-31 | 1989-10-06 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 帯状疱疹ウイルス糖蛋白質およびその製法 |
| DE69017769T2 (de) * | 1989-06-27 | 1995-07-13 | Smithkline Beecham Biologicals S.A., Rixensart | Verbindungen. |
| ES2150906T3 (es) | 1990-10-04 | 2000-12-16 | Res Corp Technologies Inc | Antigeno del virus varicella-zoster. |
| US5824319A (en) * | 1990-10-04 | 1998-10-20 | Research Corporation Technologies, Inc. | Varicella-zoster virus antigen |
| WO1994002596A1 (en) * | 1992-07-17 | 1994-02-03 | Merck & Co., Inc. | Method for preventing zoster or alleviating varicella related post-herpetic neuralgia |
| CA2177060A1 (en) * | 1993-12-21 | 1995-06-29 | Philip J. Provost | Thermostable varicella zoster virus |
| WO1995029991A1 (en) | 1994-04-28 | 1995-11-09 | Aviron | A novel vzv gene, mutant vzv and immunogenic compositions |
| US5710248A (en) | 1996-07-29 | 1998-01-20 | University Of Iowa Research Foundation | Peptide tag for immunodetection and immunopurification |
| US6251653B1 (en) | 1997-10-31 | 2001-06-26 | Merck & Co., Inc. | Method of improved mixing of a varicella-infected cell culture in roller bottles |
| EP1027426A4 (en) * | 1997-10-31 | 2006-04-19 | Merck & Co Inc | METHOD FOR IMPROVED MIXING OF A VARICELLA INFECTED CELL CULTURE IN ROLL BOTTLES |
| DE19757767A1 (de) * | 1997-12-23 | 1999-07-15 | Dade Behring Marburg Gmbh | Immunreaktive Bereiche des Glycoproteins gpII des Varicella-Zoster-Virus (VZV) |
| DE19757765A1 (de) * | 1997-12-23 | 1999-06-24 | Dade Behring Marburg Gmbh | Immunreaktives Protein VP26 des Varicella-Zoster-Virus (VZV) und seine diagnostische Verwendung |
| CN114081943B (zh) * | 2021-11-08 | 2024-04-02 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种水痘-带状疱疹mRNA疫苗组合物及其制备方法和应用 |
| CN115227811B (zh) * | 2022-08-26 | 2023-07-28 | 上海荣盛生物药业股份有限公司 | 一种水痘-带状疱疹病毒活疫苗原液的制备方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4452734A (en) * | 1980-02-11 | 1984-06-05 | Merck & Co., Inc. | Herpes subunit vaccine |
| EP0211756A1 (en) * | 1985-08-01 | 1987-02-25 | Merck & Co. Inc. | Assay for varicella-zoster virus (VZV) antibodies |
-
1985
- 1985-08-02 US US06/762,001 patent/US4686101A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-07-31 DE DE8686401709T patent/DE3685617T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-31 EP EP91120701A patent/EP0482671B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-31 EP EP86401709A patent/EP0210931B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-31 JP JP61178991A patent/JPH0775546B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-07-31 DE DE3650650T patent/DE3650650T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-03-23 US US07/028,826 patent/US4812559A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１２９［２（１９８３）Ｐ．３５７−３６８ |
| Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１３２［１（１９８４）Ｐ．１３８−１４６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0482671A1 (en) | 1992-04-29 |
| EP0210931A2 (en) | 1987-02-04 |
| EP0210931A3 (en) | 1987-09-02 |
| EP0210931B1 (en) | 1992-06-10 |
| DE3685617D1 (de) | 1992-07-16 |
| EP0482671B1 (en) | 1997-10-15 |
| DE3685617T2 (de) | 1992-12-24 |
| US4812559A (en) | 1989-03-14 |
| US4686101A (en) | 1987-08-11 |
| DE3650650T2 (de) | 1998-04-16 |
| JPS6270397A (ja) | 1987-03-31 |
| DE3650650D1 (de) | 1997-11-20 |
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