JPH01252279A - 帯状疱疹ウイルス糖蛋白質およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【粟ニブＩＩ虜１ 本発明は、帯状庖疹ウィルス（ＶＺＶ）に起因する帯状
庖疹の診断、予防に有効な帯状庖疹ウィルス糖蛋白質並
びにその製法、およびこれを用いたワクチンに関する。

さらに詳細には、遺伝子組換え技術を利用し真核細胞内
で発現された帯状庖疹ウィルス糖蛋白質およびその製法
に関する。

九訓左１遣 水痘帯状庖疹は、小児を中心として発症するウィルス性
疾患である。この疾患は、ヘルペスウィルス群に属する
帯状庖疹ウィルスに感染することにより発症することが
確認されている。このウィルスは、伝染力が非常につよ
いことが知られており、常に他数の小児が集まる保育所
等においては特に注意が必要な疾患である。また、まれ
ではあるが、この疾患には脳炎のような重症合併症が引
き起こされることが知られている。小児の主要感染症と
しては、他に麻疹、ムンプス、風疹等が挙げられるが、
これらについては有効なワクチンが実用化されてきてお
り、比較的重症な疾患の中では、この帯状庖疹（水痘）
のみが、今後の有効なワクチン開発が期待されている状
況にある。

これまでに、大阪大学微生物研究所の高橋らが開発した
弱毒生ワクチンのみが、帯状庖疹に対するワクチンとし
て存在するが、安全性の面では必ずしも十分であるとは
言えず、このような弱毒生ワクチンに取って代わる有効
なコンポーネントワクチンの開発が待ち望まれている。

また、同属のヘルペスウィルス（Ｈ３Ｖ）では、ウィル
スが持つ遺伝子に同様に発癌性があることが知られてお
り、同じヘルペスウィルス群に属する帯状庖疹ウィルス
についても発癌性が存在することが危惧され、このよう
なことを考慮しても遺伝子組換え技術等を利用した安全
なコンポーネントワクチンの開発が望まれる。

帯状庖疹ウィルスの基本的な構造としては、ウィルス表
面を覆う膜蛋白質として、３種の主な糖蛋白質が存在す
ることが知られている。これらの糖蛋白質は、糖蛋白１
（ｇｐｌ＞、糖蛋白１１（ｇｐＩ＋）ならびに糖蛋白ｍ
　（ｇｐＩＩ１）と呼ばれており、ワクチン用の免疫原
蛋白質としては、これらの糖蛋白質の利用が最も有効で
あると考えられる。

また、ＶＺＶは、ＤＮＡウィルスであり、約１２５キロ
塩基対（ｋｂｐ）からなる遺伝子を有するウィルスであ
る。

１束肢薯 帯状庖疹ウィルス関連の蛋白質を遺伝子組換えにより発
現さぜな例としては、これまでに数件の報告がなされて
いる。特開昭６１−８１７９２号では、ＶＺＶ−ｇｐｌ
の遺伝子をクローニングし、大腸菌を宿主としてこれを
発現させることに成功したことを報告している。特開昭
６２−７０３９７号においては、ｇｐｍの遺伝子をクロ
ーニングし、インビトロトランスレーション（試験管内
翻訳）によりこの遺伝子の転写・翻訳産物を確認してい
る。さらに、特開昭６２−２８５７９２号においては、
ｇｐｍをコードする遺伝子をクローニングしたことを報
告している。

上記のような報告は、遺伝子組換えによる帯状庖疹ワク
チンの可能性を示唆しているものであるが、現実に使用
可能なワクチンを供給できる技術を開示しているもので
はない。すなわち、いずれの報告もｖｚＶの遺伝子解析
を中心としたものであり、発現産物の解析等に関しては
十分とは言えない。すなわち、宿主細胞に該遺伝子を導
入して実際に発現を確認しているものは、特開昭６１−
８１７９２号におけるＶＺＶ−ｇｐ１遺伝子の大腸菌で
の発現のみである。さらにｖｚＶの表面抗原である糖蛋
白質（ｇｐＬ　　ｇｐＩｒならびにｇｐｍ＞は、いずれ
も糖鎖を有する蛋白質であることから、大腸菌を宿主細
胞として発現させた場合には、糖鎖付加のない蛋白質し
か得られないために、ウィルス由来の本来の糖蛋白質と
比較して生物学的活性に一部欠ける発現産物が産生され
ることが危惧される。すなわち、一般に糖蛋白質を遺伝
子組換え技術を用いて発現させる場合には、糖付加能力
のある真核細胞（酵母、培養細胞等）を宿主細胞として
用いることが好ましいと考えられる。また、ウィルス構
成糖蛋白質等を遺伝子組換えにより産生させる場合には
、組み込む遺伝子と宿主細胞の組み合せというものが非
常に重要となり、これが得られる産物の性状や発現量に
大きく影響する。

１’ｆｌｆｌＬ溝 このような状況の下において、先に述べた問題を解決す
へく、本発明者らは帯状庖疹ウィルスからｇｐＩＩをコ
ードする遺伝子を単離することに成功し、これを真核細
胞内で発現させることを試みたところ、目的の帯状庖疹
ウィルス糖蛋白質を効率よく発現させることに成功した
。さらに本発明により得られる帯状庖疹ウィルス糖蛋白
質は、ウィルス由来の糖蛋白質と同様の抗原性を有し、
これに加えてワクチンとしての使用にも適した充分な免
疫原性を有していることが確認され本発明を完成するに
至った。

すなわち、本発明は、遺伝子組換え技術を応用し真核細
胞を宿主として用いた発現系により得られるｇｐＩＩ、
さらにはそのような糖蛋白質の製造方法を提供するもの
である。このようにして得られる本発明のｇｐＩＩは、
帯状庖疹ウィルスに対する診断試薬、並びにワクチンと
して非常に優れた糖蛋白質である。

日の　　・ 本発明に用いる帯状庖疹ウィルス株は、１９８５年に熊
本大学において水痘と診断された小児（１２才）の水痘
内容より分離された臨床分離株（永代株）であり、ヒト
胎児節（ＨＥＬ）細胞により安定に維持されているウィ
ルス株である。

本発明のｇｐｌＩ−ＤＮＡは、上記ウィルス株から通常
の遺伝子クローニング技術を用いることにより調製され
る。このような■Ｚ■永代株のｇｐＩＩ−ＤＮＡを組み
込んだプラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
　ＮＭ５２２／　ｐＭＴ１６として本発明者らにより微
生物工業研究所に寄託されている（微工研菌寄第９７７
７号）。

このような本発明のｇｐＩＩ−ＤＮＡは、下記の制限酵
素切断地図で表されるような約２．７ｋｂＰの遺伝子で
ある。

ＶＺＶ　　ｇｐＩ［−ＤＮＡ　　（２，７ｋｂｐ）さら
にこのｇｐＩＩ−ＤＮＡの塩基配列を解析した結果、ｇ
ｐＩＩのＮ末端には、疎水性の強いアミノ酸配列が存在
することが確認された。すなわち、ｇｐＩＩのＮ末端の
アミノ酸配列のうち、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ
−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−３ａｒ−Ｖａｌ−の領域が
非常に疎水性が強いことがわがっな。本発明においては
、ｇｐＩＩ遺伝子のうち、これらのアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子領域を一部除去することにより、さらに真
核細胞内で目的のｇｐＩＩを効率よく発現させることが
できる。このようにして発現されたＮ末一部欠損ｇｐＩ
Ｉは、修飾しない本来のｇｐＩＩと較べて抗原性　免疫
原性ともに何等劣ることのない糖蛋白質であることが確
認された。

本発明においてｇｐＩＩを発現させる場合には、宿主細
胞として真核細胞が用いられる。そのような真核細胞と
しては、酵母または、は乳類動物由来の動物細胞もしく
は、昆虫細胞由来の細胞を用いることが可能である。本
発明のｇｐＩＩを発現させる場合には、用いる宿主細胞
に応じた発現プラスミドを構築し、これを宿主細胞に導
入し形質転換体を得、これを培養することにより目的の
ｇｐＵを得ることが可能となる。以下、宿主細胞として
培養細胞を用いた場合、ならびに酵母を用いた場合に応
じてそれぞれ詳細に説明する。

培養細胞を宿主として用いる場合には、ＳＶ４０ウィル
ス遺伝子の一部をｇｐＩＩ−ＤＮＡと置換することによ
り、形質転換細胞内でｇｐＩＩを発現することが可能な
組換えウィルスを調製し、これをヘルパーウィルスとと
もに宿主細胞に導入することにより目的のｇｐｆｆを形
質転換体により発現させることが可能となる。または、
宿主細胞内においてプラスミド状態で増殖てきるウィル
ス（パピローマウィルス等）遺伝子の一部とｇｐＵ−１
）ＮＡを結合させ宿主細胞に導入すれば、プラスミド状
態で目的のｇｐＵを発現する細胞を得ることができる。

さらに、大腸菌プラスミドにおいてｇｐＩＩ−ＤＮＡの
上流にウィルスや高等動物由来のプロモーターを結合さ
せたプラスミドを培養細胞に導入ずれば、宿主染色体遺
伝子に組み込まれたｇｐＩＩ−ＤＮＡが発現される形質
転換細胞を得ることが可能となる。

このようなプラスミドとしては、ｐ　ｓ　ｒ、ｖベクタ
ー（ファルマシア社製）等のような市販のものを利用す
ることもできる。

一方、酵母を宿主として用いる場合には、酵母の遺伝子
と大腸菌に遺伝子を担い、さらに適当なプロモーター領
域を担ったシャトルベクターにｇｐＩＩ−ＤＮＡを組み
込むことが好ましい。そのようなシャトルベクターとは
、酵母の遺伝子複製開始点（例えば２μｏｒｉならびに
／もしくはａｒｓｌ）、酵母における選択マーカーとな
る遺伝子、酵母由来のプロモーター領域遺伝子、大腸菌
の遺伝子複製開始点領域（例えば、ｐＢＲ３２２由来の
ｏｒｉ領域）および大腸菌ての選択マーカーとなる遺伝
子を有するプラスミドである。ここで言う酵母の選択マ
ーカーの例としては、ロイシン、ヒスチジンまたはトリ
プトファン等のアミノ酸産生遺伝子等が挙げられる。大
腸菌ての選択マーカー遺伝子の一例としては、アンピシ
リン、カナマイシン、デトラサイクリンまたはクロラム
フェニコール等の耐性遺伝子が挙（つられる。

ｇｐＩＩの発現に用いる酵母由来のプロモーターとは、
酵母菌体内で作用することが可能な形質発現調節領域遺
伝子を指し、例えば抑制性酸性フォスファターゼ（ＰＩ
＋０５）プロモーターや、グルタルアルデハイド−３−
リン酸脱水素酵素（ＧＡＰ−ＤＩ＋　）プロモーター等
が最も好ましい例として挙げられる。

このようなシャトルベクターの好ましい具体例として、
Ｐ　Ｈ０５プロモーター下流に外来遺伝子を組み込むこ
とが可能なｐＡＭ８２　（特開昭５８−３６６９９号、
微工研条寄第３１３号）、ＧＡＰ−Ｄｌｌプロモーター
を有するｐＹＧｌｏｏ　［実験医学Ｖｏ１．５　Ｎｏ、
１１　ｐ１３６−１４１（１９８７）］等が挙げられる
。また、宿主の酵母菌としては、サツカロミセス・セレ
ビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ）　Ａｌ２２　（微工研条寄第３１２号）、サツカ
ロミセス′セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ａｌ２２　ｐｈｏ８０　（微工
研条寄第５０９号）等が好ましい宿主細胞株として挙げ
られる。しがしながら、これらに限定されるものではな
い。

上記のような酵母用発現ベクター（シャトルベクター）
を用いて酵母を形質転換させる場合には、通常の酵母形
質転換法［伊藤ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

１５３、　ｐ１６３−１６８（１９８３）］により、目
的のｇｐＩＩ発現が可能な形質転換酵母を得ることがで
きる。

このようにして得られたｇｐｌＩ発現形質転換体から、
下記のようにして目的の糖蛋白質ｇｐＩＩを精製するこ
とが可能である。

まず、得られた形質転換体をその細胞に応じた培地と条
件のもとに培養することにより目的のｇｐＩＩを形質転
換体の細胞質中に発現させる。宿主に酵母を用いた場合
には、超音波もしくはガラスピーズや高圧細胞破砕機（
マントンゴーリン）のような物理的処理、または必要に
応じて界面活性剤のような化学的処理も加えることによ
り集めた菌体を破砕する。一方、培養細胞を宿主に用い
た場合には、酵母の場合のような激しい処理は必要とぜ
ず、界面活性剤で処理することにより細胞質内のｇｐＩ
Ｉを溶出することができる。このようにして得られた破
砕液（ライセード）は、遠心分離等により宿主細胞由来
の沈澱物を除いた後、Ｖｚｖ−ｇｐＩＩに対する抗体を
用いたアフイニテイクロマトグラフィにより目的の糖蛋
白質ｇｐＩＩを容易に精製することができる。さらに精
製を行う場合には、通常の精製手法、例えばイオン交換
クロマトグラフィ、密度勾配遠心ならびに種々のアフィ
ニティクロマトグラフィー等によりワクチンとして使用
可能な純度まで精製することが可能である。

このようにして得られる■ＺＶ糖蛋白質ｇｐＩＩは、ウ
ィルス由来の糖蛋白質と何等変わらない抗原性を示し、
さらに動物実験による免疫原性の試験においても同様の
結果が得られた。

本発明の糖蛋白質ｇｐＩＩは、ＶＺＶの感染を予防する
ワクチンとして、さらに■Ｚ■関連の抗原・抗体系測定
試薬において非常に利用価値の高い遺伝子組換え発現産
物である。

次に、その実施例に従い、本発明をさらに詳細に説明す
るが、本発明はこれに限定されるものではない。

熊本大学医学部において採取された、小児（１２才）の
水痘内容を、あらかじめＨＥＬ（ヒト胎児肺細胞）を２
５−２の培養フラスコに培養したものへ接種した。３７
℃で１週間培養し細胞変性が起きた時点でかきとり、さ
らに３代継代した。分離したウィルスかＶＺＶであるこ
との確認は、■ｚ■粒子表面糖蛋白ｇｐＩに対するモノ
クローナル抗体を用いた免疫蛍光反応で陽性、ＨＳ　Ｖ
粒子表面糖蛋白ｇＢに対するモノクローナル抗体を用い
た免疫蛍光反応て陰性てあったことによりおこない、こ
の臨床分離株をＶＺＶ永代株とした。

ｎ口すいｔ１１七］　　ＤＮＡの；。

ｉ）Ｖ　Ｚ　Ｖ　−Ｄ　Ｎ　Ａの調製 ＨＥ　Ｌ細胞（ヒト胎児肺細胞）（約ＩＸ　１０’　ｃ
ｅｌｌｓ）に水痘帯状庖疹ウィルス（ＶＺＶ）（永代株
）を感染させ、３７℃で４８〜７２時間培養して、細胞
変性が充分に起きた時点でかきとり、１５００ｒｐｍに
て１０分間遠心して感染細胞と上清とを分離して、感染
細胞のベレットを得る。これをリン酸ナトリウム緩復液
−生理食塩液（ｐｌ＋７．３）　　（以下、ＰＢＳと略
記する）　１０ｍ１に懸濁し、この懸濁液を凍結隔解〔
−５０℃（アセトン−ドライアイス）と３７℃にて３回
凍結隔解を繰り返す〕して、細胞を破壊し、細胞残渣を
低速遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１０分間）により除
去する。得られる溶液をグリセロールクツション（５ｘ
、４５ｘ）に重層し、３５．　ＯＯＯｒｐｍにて１時間
遠心分離する。得られたベレット０．５〜１ｍｌをＰＢ
ＳＩ〜２ｍｌに懸濁し、これにＤ　Ｎ　ａｓｅ　１０μ
９　／　ｍｌおよびＲＮ　ａｓｅ３００μ９／ｍ１を３
７℃で１時間作用させ、ついで１１５量の５ＸＳＴＥＰ
　（０，５Ｘ　ＳＤＳ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−［ＩＣ１
、ｐＨ７，５０，４ＭＥＤＴＡ、０．１％プロテイナー
ゼＫ）を加え、５０℃で３０分間作用させる。この処理
液を等量のフェノール、フェノールクロロホルム（１：
　　１）およびクロロホルムの順で抽出し、ＤＮＡを含
む水層を得る。

この水層をＴＥ［復液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｆ（ＣＩ
、　１ｍＭＥＤＴＡ、　ｐＨ７，５）に透析した後、冷
エタノールを加えてＤＮＡを沈澱させて、ＶＺＶ−ＤＮ
Ａを得る。

１ｉ）ＶＺＶ−ＤＮＡの旧ｎｄｌｌ＋切断Ｄフラグメン
トのクローン化 上記の方法で調製したＶＺＶ−ＤＮＡ約１０μ９を、１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−［（ＣＩ、ｐＨ７，５，７ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２．６０ｍＭ　ＮａＣｌの混液、０２ｍ１中で、
制限酵素旧ｎｄｌｌ＋により３７℃、６時間処理した後
、０７％アガロース電気泳動により各断片を分離し、Ｄ
フラグメント（０，４００〜０５００マツプユニツト）
に相当する部分のゲルを切り取り、電気泳動的にＤフラ
グメント（第１図参照）を回収する。

前記と同様にして制限酵素旧ｎｄｌｌ＋により開裂され
たｐＢＲ３２２プラズミド１／ＩＯＴル量と上記Ｄフラ
グメント約１μ９とをＤ　Ｎ　Ａ　　ｌｉｇａｔｉｏｎ
　ｋｉｔ　（宝酒造（株）製造　販売〕を用いて１６°
Ｃて約３０分反応させる。

高木座敷編著「遺伝子操作実験法」第８章に記載の方法
で大腸菌１１ＢＩＯＩの培養液を調製し、その菌液０２
ｍ１に上記反応液を加え混合させ、０℃で２０分間放置
した後、アンピシリン１００μ９７ｍ１を含む寒天プレ
ート上に塗沫し、３７℃で一夜培養する。出現したコロ
ニーについて、アンピシリン１００μ９７ｍ１を含む寒
天プレートにそれぞれ塗沫し、同様に培養してアンピシ
リンを含む寒天プレートでのみ増殖したコロニーを選択
する。ｒ、ＢＲ３２２はアンピシリン耐性遺伝子とテト
ラサイクリン耐性遺伝子を有するが、テトラサイクリン
耐性遺伝子中にある旧ｎｄｍ部位にＶＺＶ−ＤＮＡ断片
が挿入されることによりテトラサイクリン耐性が消失さ
れるため、上記選択されたコロニーはｐＢＲ３２２−Ｖ
　Ｚ　Ｖ　ＤＮ　Ａの旧ｎｄＩＩＩ　Ｄフラグメントの
組換えＤＮＡを保持していることになる。　　上記の方
法で得られたコロニーについて、　「代謝」第１７巻、
第４号、第８１〜８９頁（１９８０）　ｒプラグミドＤ
ＮＡの調製に記載される方法にしたがってプラスミドを
調製する。得られたプラスミドを種々の制限酵素（Ｂａ
ｍ１ｌＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、　　Ｈｐａｌ
、５ａ１１＞にてその切断パターンを分析することによ
り、ＶＺＶ−ＤＮＡの旧ｎｄｌｌｌ−Ｄフラグメントが
ｐＢＲ３２２に組み込まれたＰＢＲ３２２−Ｈｉｎｄｌ
ｌｌ−Ｄフラグメントの組換えＤＮＡ　（プラスミドｐ
ＢＲＶ−４＞を得る。

＝１８− １ｉｉ）プラスミドｐＮＯ−６の調製 上記の方法で得られたプラスミドｐＢＲＶ−４１０μ９
を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１（Ｃ１（ｐＨ７，５＞、７
ｍＭ　ＭｇＣｈ、１００ｍＭ　ＭＣＩ、７ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノールの混液１００ＪＡに加え、これに制
限酵素Ｈｐａ１１０単位を加えて、３７℃で２時間反応
させる。この反応液を、高木座敷著「遺伝子操作マニュ
アル」３３〜３４頁に記載の方法により、１ｘアガロー
スにて電気泳動により約３．６ＫｂｐフラグメントＤＮ
Ａを分離、抽出する。

得られた３、　５ＫｂｐフラグメントＤ　Ｎ　Ａ　１１
００ｎとクローニングベクターｐＮＯ１５２３Ｃファル
マシア（株）製〕（Ｈｐａ＋で処理して開裂したもの）
　１０ｎｇとを、ＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（
宝酒造（株）製〕を用いて１６℃で３０分反応させる。

この反応液を用い、高木座敷編著「遺伝子操作実験法」
１６１〜１６２頁に記載の方法により、大腸菌ＭＣ１０
０９を形質転換させ、その形質転換体からアンピシリン
及びストレプトマイシン耐性菌を選択し、この菌から上
記「代謝」第１７巻、第４号、第８１〜８９頁（１９８
０）に記載の方法にしたがってｇｐＵＭ伝子を含むプラ
スミドｐＮＯ−６を得る。

ｉＶ）プラスミドｐＴＺ１６の調製 上記の方法で得たプラスミドｐＮｏ−６を下記のように
処理してｇｐＩＩ遺伝子翻訳開始コドンＡＴＧ上流のＥ
ｃｏ７２２１部位のみをＳａｌｌ部位に、１訳終止コド
ンＴＡＡの下流のＥｃｏＲＶ部位のみをＳａｌｌ部位に
変換したフラグメントを得、プラスミドｐＴ２１８ＲＣ
ファルマシア（株））（Ｓａｌｌて開裂したもの）へ組
み込んだ。

ｐＮ０６　１０μ！＋を、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−４１
ＣＩ　（ｐＨ８，０＞、７ｍＭＭｇＣ１２，１５０ｍＭ
　ＮａＣ１の混液１００ｄに加えこれに制限酵素Ｅｃｏ
Ｔ２２１１０単位を加えて３７℃で２時間反応させる。

またｐＮ０６１０μ９を、１０ｍＭ　Ｔｒ　１ｓ−１１
ＣＩ　（ｐＨ７，５）７ｍＭＭｇＣｈ、１５０ｍＭ　Ｎ
ａＣｌ、７ｍＭ　２−メルカプトエタノールの混液１０
０ｔｌＱに加えこれに制限酵素ＥｃｏＲＶ　１０単位を
加えて３７℃で２時間反応させる。これら２つの反応液
をそれぞれ、高木座敷著「遺伝子操作マニュアルＪ３３
〜３４頁に記載の方法により、１ｘアガロースにて電気
泳動により、ＥｃｏＴ２２１．２］Ｈ＋ｐフラグメント
、ＥｃｏＲＶ　１．６［＋ｐフラグメントを、別々に分
離・抽出する。これらフラグメントを、それぞれＴ４Ｄ
ＮＡポリラーゼ０１単位、２００　ｔｔ　ＭｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＴ’、６７＋ｎＭ　Ｔｒｉ
ｓ−１１ＣＩ　（’ｐ＋＋８．６）、６．７ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２．１０ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１６．
７ｍＭ　（ＮＨａ　）　２ｓＯａノ混液５０ｄ中で別々
に３７℃、３０分間反応後、フェノール処理、エタノー
ル沈澱を行う。これらＤ　Ｎ　Ａ　　ｌｐｍｏｌｅを、
Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ、（宝酒造製
）、　１０　ｐｍｏｌｅＳａｌｌ！Ｊンカ−（１）混液
、４５Δ中で１０’Ｃ、３０分間反応後、エタノール沈
澱をそれぞれ行う。これらＤＮＡを、５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）、１０ｍＭ　ＭｇＣｈ　５０
ｍＭ　ＮａＣｌの混液１００Δにそれぞれ加え、これに
制限酵素Ｎｄｅｌ　１０単位を加えて３７°Ｃで２時間
反応させる。これら反応液を高木座敷著「遺伝子操作マ
ニュアル」３３〜３４頁に記載の方法により、１ｘアガ
ロースにて電気泳動により、それぞれ１．３Ｋｂｐフラ
グメントＤＮＡを分離　抽出する。

得られた２種の１．３ＫｂｐフラグメントＤＮＡを、Ｎ
ｄｅ１部位を介して結合さぜるため（ＤＮＡ　Ｉｉｇａ
−ｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（宝酒造製）を用いて〕、１６°
Ｃで３０分間反応後、エタノール沈澱を行う（第３図参
照）。

このＤＮＡを、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１１ｃＩ　（ｐＨ
７，５）、７＋ｎＭＭｇＣｌ２１７５ｍＭ　ＮａＣｌ、
７ｍＭ　２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ　ＨＤ
ＴＡの混液５０越に加え、これに制限酵素５ａ１１を５
単位加えて３７℃で２時間反応させる。この反応液を、
高木座敷著「遺伝子操作マニュアル」３３〜３４頁に記
載の方法により、１ｘアガロースゲルにて電気泳動によ
り２．７ＸｂｐフラグメントＤＮＡを分離・抽出する。

得られた２、　７ＸｂｐフラグメントＤ　Ｎ　Ａ　５０
ｎｇと大腸菌プラスミドｐＴＺ１８Ｒ（ファルマシア社
製）（Ｓａｌｌで処理して開裂したもの）　５ｎｇとを
ＤＮＡ　ｌｉｇａ−ｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（宝酒造製）と
の混液４５Ｍ！２を用いて１６℃で３０分間反応させる
。この反応液を用い、高木座敷編著「遺伝子操作実験法
」１６１・〜１６２頁の記載の方法により、大腸菌ＮＭ
５２２を形質転換させ、アンピシリン、Ｘ−Ｇａ１．Ｉ
ＰＴＧ含有プレートに成育してくる白色クローンを複数
選択し、これらの菌体がら「代謝」第１７巻、第４号、
第８１〜８９頁（１９８０）の記載の方法に従ってプラ
スミドを調製する。これらのプラスミドを、各々制限酵
素５ａｌＬＥｃｏＲｖ、ＥｃｏＴ２２１で処理し、ｇｐ
ＩＩ遺伝子翻訳開始コドンＡＴＧ上流のＥｃ。

Ｔ２２１部位のみと、ｇｐＩＩ遺伝子翻訳終止コドンＴ
ＡＡの下流のＥｃｏＲＶ部位のみがＳａｌｌ部位に変換
されたフラグメントがＰ　Ｔ　Ｚ　１８　Ｒに組み込ま
れた組換えＤＮＡ　（プラスミドｐＭＴ１６）を得る（
第２図参照）。このようにして調製されたプラスミドｐ
ＭＴ１６は、大腸菌に組み込み、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２／　ｐＭＴ１６：　　微工研
菌寄第９７７７号として寄託されている。

−仁ユＪヨ■ＺＶ−■　−プ；ズ≧゛の責。

前記２（ｉＶ）で得られたＶＺＶｇｐＩＩ遺伝子全体を
含有するプラスミドｐＭＴ１６１０μ！Ｉを、１０ｍＭ
　Ｔｒｉｓ−１（ＣＩ　（ｐｌ＋７．５＞、７ＩＩＩＭ
　ＭｇＣｌ２．１７５ｍＭ　ＮａＣ１，７ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール、０．２ｍＭ　ｌ１ＤＴＡ、５ａｌ
ｔ　１０単位の混液１００Ａ中て３７°Ｃ２時間反応後
、フェノール処理、エタノール沈澱を行う。このＤＮＡ
を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐ）１８．１１１
＞　１０ｍＭ　ＭｇＣｈ　５０ｍＭ　ＮａＣ１、Ｂｇｌ
ｌ　１０単位の混液１００Δ中で３７℃、２時間反応後
、ＩＸアガロース電気泳動により前記と同様の方法にて
ＶＺＶｇｐＩＩ遺伝子を含む２．７ＫｂｐのＤＮＡフラ
グメントを分離抽出する。

このＤＮＡフラグメントｔｏｏｎｇと、シャトルベクタ
ーｐＡＭ８２　（Ｘｈｏｌで処理して開裂したもの）（
微工研条寄第３１３号）　１ｏｎｇおよび、ｐＹＧｌｏ
ｏ　（Ｓａｌｌで処理して開裂したもの＞　１０ｎｇと
を、それぞれＤＮＡ　　１ｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用
いた混液４５Δ中にて１６℃、１時間反応させる。

これらの反応液を用い、高木座敷編著「遺伝子操作実験
法」１６１〜１６２頁に記載の方法により、各々大腸菌
＋ｌＢ１０１を形質転換し、アンピシリン耐性菌を選択
培養し、その菌体から、各々Ｔ’１（０５、ＧＡＰＤプ
ロモーター下流にＶＺＶｇｐＩＩが結合された組換えプ
ラスミドｐＡＭ２、ｐＹＧ２８をそれぞれ単離する（第
４図参照）。

４　　、・　　　−■の 酵母としてサツカロミセス　セレビシェＡｔ４２２［ａ
　１ｅｕ２　ｈｉｓ４　Ｃａｎ１　（Ｃｉｒ＋）］　　
（微工研条寄３１２号）並びにサツカロミセス・セレビ
シェＡＨ２２ｐｈｏ８０　（微工研条寄第５０９号）を
用い、これをＹＰＤ培地（２％ポリペプトン、１ｚイー
ストエキス、２ｘグルコース）１００ｍｌに接種し、３
０°Ｃで一晩培養した後、遠心して集菌水２０ｍ１にて
菌体を洗浄し、ついて１．２Ｍソルビトール及び１００
μｇ／ｍｌチモリアーゼ６０．０００　（生化学工業製
）の溶液５ｍｌに懸濁させ、３０°Ｃで約３θ分間保ち
、スフェロプラスト化した。ついで、スフェロプラス１
〜を１．２Ｍツルし）・−ル溶液で３回洗浄した後、２
Ｍソルヒ゛トール、　］ＯｍＭ　ＣａＣｌ２および、　
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７、５）の溶液６
００Δに懸濁させ、その６０ｄずつを小試験管に分注し
た。これに前に調製した組換えプラスミドｐＹ０２８と
ｐＡＭ２　（１０μ９）をそれぞれ加えて、充分混合し
、さらにＯ，ＩＭ　ＣａＣｌ２液３Δを加えて最終濃度
１０ｍＭ　ＣａＣｌ２とし、室温に５〜１０分間放置し
た。ついでこれに、２０Ｘポリエチレングリコール４、
０００．１０ｍＭ　ＣａＣｌ２および１０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−）１ｃＩ　（ｐ［１７，５）溶液１ｍｌずつ加えて
混合し、室温に約２０分間放置した。この混合液０．２
ｍｌずつを４５°Ｃに保温された再生培地（２２気ソル
ビトール、２ｘグルコース、０．７％イーストニトロゲ
ンベースアミノ酸、２％ＹＰＤ、２ｃＩｇ／ｍｌしスチ
ヂン、３ｘ寒天）　１０ｍ１に加え、軽く混合させ、予
め準備された１、２Ｍソルビトール含有最小培地（０，
７％イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％グロコー
ス、２０μｇ／ｍｌヒスチヂン、２ｘ寒天）プレートに
重層し、固化させた後、３０°Ｃで培養してロイシン非
要求性酵母のコロニーを得た。このコロニーを２０μｇ
／ｍｌヒスチヂンを含むバルクボルダ−ミニマムメディ
ウム［東江ら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒａｌ、　１１３．　
　ｐ７２７−７３８］にて培養して形質転換酵母サツカ
ロミセスセレビシェを得た。このようにして得られた形
質転換酵母のコロニーをさらに２ｃＩ９７ｍ１ヒスチヂ
ンを含むバルクホルダーミニマムメディウムの寒天プレ
ート上に塗布し、３０℃にて培養してコロニーを形成さ
せた。　（ロイシン非要求性となった形質転換体の再確
認のため）ついでこのコロニーから菌体を分離し、２ｃ
Ｉｇ／ｍｌしスチヂンを含むバルクホルダーミニマムメ
ディウム１０ｍ１に接種し、３０℃にて培養を行う。約
２４時間後、対数増殖期にある菌体を遠心して集菌し、
これをリン酸を含まない最小培地（バルクホルダーミニ
マノ−メディウムに含まれるＫＨ２ＰＯ４をＫＣＩで置
換し、さらに２ｃＩ９／ｍ＋しスヂヂンを加えたもの＞
１０ｍ１に菌体数的４Ｘ１０６個／ｍｌになるように懸
濁し、３０°Ｃにて約２４時間培養を続けたのち、４０
００回転、１０分間の遠心により菌体を集めた。

これらの菌体を１．２Ｍソルビト−ル、５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，２）、１４ｍＭ２−メルカプトエタノ
ール、１００μｇ／ｍｌザイモリエース６０．０００の
溶液３１に懸濁させ、３０°Ｃにて３０分間緩やかに振
とうしてスフェロプラスト化し、遠心分離によりこれを
集めた。

この各々のスフェロプラストをＩＪトリトンＸ−１００
を添加した５０ＩＩＩＭリン酸Ｍ衝液（ｐｌ（７，２）
　１ｍｌに懸濁し、グラスビーズを加えて攪はんして菌
体を破壊した。これらの破壊液を１５０００回転で１０
分間遠心し、その上清を、■ＺＶ糖蛋白ｇｐＩＩに対す
るポリクローナル抗体を同定した９６穴プレートに添加
し、３７°Ｃで１時間反応させ、洗浄後、パーオキシダ
ーゼを結合したｇｐｕに対するモノクローナル抗体を添
加し、３７°Ｃで１時間反応さぜ、洗浄後、パーオキシ
ダーゼの基質であるＴＭＢＺ　（テ１ヘラメチルベンチ
ジン塩酸塩）のＥＤＴＡ溶液（０，ｏｏ６％過酸化水素
）をプレートに添加し、発色させた。発色の程度をオー
トリーダー（０，Ｄ、　４５０ｎｍ　）で測定して第１
表の結果を得た。陰性対照として、ｇｐＩＩＤＮＡを組
み込んでいないプラスミドｐＹＧ１００あるいはｐＡＭ
８２を用いて形質転換した形質転換酵母を用いて同様に
処理したものについてのｇｐＩＩ抗原活性も測定した。

第　　１　　表 この表から明らかなように、本発明のｇｐＩＩＤＮＡを
組み込んだシャトルヘクターを導入した酵母のみに非常
に高い糖蛋白ｇｐＩＩ抗原活性が検出できた。

ＣＯ８細胞およびＬＴＫ−細胞のいづれの細胞も、両宿
主細胞内へ導入されれば、組み込まれた外来遺伝子の発
現が可能となるように、ＳＶ４０　ｏｒｉ遺伝子の一部
およびＴＫ遺伝子の一部をもつ発現プラスミドの構築を
行った。

ファルマシア社より市販されているｐＫｓＶ−１０（カ
タログＮｏ、　２７−４９２６−０１）を制限酵素Ｐｖ
ｕ　ＩＩおよびＢｇｌ■で切断しＳＶ４０初期プロモー
ターとＤＮＡ複製開始点を含む領域の約５７０ｂｐの断
片をまた同じくファルマシア社製、ｐＮＥＯ（カタログ
Ｎｏ、　２７−４９２４−０１）を制限酵素Ｂｇｌｌｌ
、およびＰｖｕ　ＩＩで切断されるネオマイシン耐性遺
伝子の一部を含む領域的３０ｂｐの断片を、高木座敷著
「遺伝子操作マニュアル」３３〜３４頁記載の方法によ
り、１．５％アガロースゲルにて電気泳動し、分離・抽
出を行った。これらの２つの断片を、制限酵素Ｐｖｕ　
ＩＩで切断したプラスミドｐＢＲ３２２に、第５国に示
すようにＤ　ＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｎ（宝酒造製
、ｃｏｄｅ　６０２１）を用い添付のプロトコールに従
い、ライゲーションを行い、この反応液を用い、高木座
敷編著「遺伝子繰作実験法」１６１〜１６２頁の記載の
方法により、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換させ、その形
質転換体からアンピシリン耐性菌を選択し、この菌から
「代謝」第１７巻、第４号、第８１〜８９頁（１９８０
−２９＝ ）に記載の方法に従って目的のプラスミドｐＳＮＰ−９
を得た。次に、このｐＳＮＰ−９１０ｔｔｑを、２０ｍ
Ｍ　ＴｒｉＳ−１１ｃＩ（ｐＨ８，５）、７ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｈ、７ｍＭ　２−メルカプ１〜エタノール、０．０１
％ウシ血清アルフミンの混液１０Ｍに加え、これに制限
酵素Ｂａ１１５単位を加えて、３７°Ｃで２時間反応さ
せる。この反応液を上記と同様にして、１．２％アガロ
ース電気泳動に付して約６５０ｂｐの発現には不要と考
えられる領域の断片を除き、余りの約４Ｋｂｐの断片を
分離・抽出する。

得られた約４Ｋｂｐのフラグメント（断片）を１００ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐｌ（７，６）、５ｍＭ　Ｍｇ
Ｃｌ２の混液７．５ｄにとかし、上記と同様、Ｄ　Ｎ　
Ａ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いてプラスミドを閉
環させ、この反応液を用いて上記と同様に大腸菌ＨＢＩ
吋を形質転換し、目的のプラスミドｐＳＶ−４を得た。

さらに、このプラスミド（２μ９）を、１０ｍ　　Ｔｒ
ｉｓ−１１ＣＩ　　（ｐＨ７，５）　　、７ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｌ２．６０ｍＭ　　ＮａＣ＋、７ｍＭ　Ｚメルカプ
トエタノールの混液１００Ａにとかし、これに制限酵素
Ｐｖｕ■を１０単位を加え３７°Ｃで２時間反応させ、
前記と同様に、制限酵素Ｐｖｕ　ｎで開裂したプラスミ
ドＤＮＡを得る。

次に、予めクローン化したｐＢＲ３２２−ＴＸ　Ｄ　Ｎ
　Ａ　（特開昭６１−５７８６号、５頁右下欄に記載）
よりＴＫ遺伝子の発現に必要な制限酵素ＰｖｕＩＩで切
り出される約２Ｋｂｐのフラグメントを得る。

上記のフラグメン１へと、前述の制限酵素Ｐｖｕ　ＩＩ
で開裂したプラスミドｐＳＶ−４を、Ｄ　Ｎ　Ａ　　Ｌ
ｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ　（宝酒造製）を用い添付のプロ
トコールに従い反応させ、この反応液を用い前述と同様
の方法で大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換させ、第５図に示
すようにＴＸ遺伝子とＳＶ４０プロモーターが同じ向き
に直列に連って組み込まれているプラスミドｐＴＸＳＶ
を得た。

ここに構築された、発現ベクターｐＴＫｓＶは、約２Ｋ
ｂｐのＴＩ遺伝子を持つことにより、ＬＴＫ−細胞の形
質転換が可能であり、また、ＳＶ４０の初期プロモータ
ー等遺伝子を持つことにより、ＣＯ８細胞の形質転換も
可能となった。そして、発現を目的とする外来遺伝子を
組み込む部位としては、Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＢａｍＨｌ、
　　５ａｌｌが挙げられる。

２　　ＶＺＶ　　　　　ＩＩ　　−プーズミドの■ 上記プラスミドｐＴＫｓＶを下記のように処理して、ｔ
（ｉｎｄｌｌＩ部位に糖蛋白ｇｌ’１遺伝子を含むＶＺ
Ｖ　ＤＮＡの旧ｎｄｌｌｌ切断Ｄフラグメントを組み込
んだ。

発現プラスミド（２μｑ）を、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　（ｐＨ７，５＞　７ｍＭ　ＭｇＣｈ、６０ｍＭ　
ＮａＣｌの混合液１００Δにとかし、これに制限酵素口
ｎｄｌ［Ｉ　１０単位を加えて、３７℃で１時間反応さ
せる。この反応液を、高木座敷著「遺伝子操作マニュア
ル」３３〜３４頁に記載の方法により、１．０％アガロ
ースゲルにて電気泳動により約６．３Ｋｂｐに開環した
フラグメントを分離・抽出する。

同様にして、前記酵母発現で述べたｐＢＲＶ−３（１μ
９）を、制限酵素口ｎｄｌｌｌで切断し、糖蛋白ｇｐＩ
Ｉ遺伝子を含む、ＶＺＶＤＮＡの旧口ｄｌｌ＋断片Ｄ　
（１２Ｋｂｐ）を分離・抽出する。このＤＮＡ断と上記
の開環したｐＴＫｓＶを、Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｌｉｇａｔｉｏ
ｎ　ｋｉｔ　（宝酒造製、ｃｏｄｅ６０２１）を用い、
添付のプロトコールに従い、ライゲーションさせた。こ
の反応液を用い、高木座敷編著「遺伝子操作実験法」１
６１〜１６２頁に記載の方法により、大腸菌ＨＢＩＯＩ
を形質転換させ、その形質転換体からアンピシリン耐性
菌を選択し、この菌から、「代謝」第１７巻、第４号、
第８１〜８９頁（１９８０）に記載の方法にしたがって
、ＴＫ遺伝子、ＳＶ４０プロモーターの向きに対し、糖
蛋白ｇｐＩＩＤＮＡが正向きに組み込まれた発現プラス
ミドｐＴＳＨ−１６と、糖蛋白ｇｐＩＩＤＮＡが逆向き
に組み込まれた発現プラスミドｐＴＳＨ−５を得る。

ＣＯ８″の　　　　■の （２）で得られたｐＴＳＨ−１６およびｐＴｓＨ−５を
用い、ＣＯ８細胞を下記のように形質転換を行った。

上記のプラスミドｐＴｓＨ−１６およびｐＴｓＨ−５を
制限酵素ＥｃｏＲＩで切断（開環）して得られるフラグ
メント２　ｌ１ｇとＬ■に−Ｄ　Ｎ　Ａ　（キャリアＤ
ＮＡ＞２μ９とを１３０ｍＭ　ＣａＣｌ２２００Ｊに溶
解し、これに２χヘペス溶液（ＮａＣＩ　１６ｇ／Ｑ、
ＫＣＩ　０．７４ｇＩＱ、Ｎａ）ＩＰＯａ　　２■２０
０．２５ｇ／Ｑ、デキストロース２ｇ／２、Ｎ−（２−
ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ−（２−エタンスル
ホン酸）１０ｇ／Ｑ、ｐｌ＋７．１１＞　２００Δを混
合し、室温で３０分間放置する。生じた沈澱物を充分に
懸濁した後、その混合液をＣＯＳ細胞の約６０％単一層
（約１０５Ｃｅｌｌ／フラー３３＝ スコ）に滴下する。３７°Ｃで１時間細胞に吸着さぜな
後、ＤＭＥＭ　５ｍｌを添加し、５％　ＣＯ２雰囲気下
、３７℃で４時間培養する。ＤＭＲＭを吸引して除去後
、１５χジメチルホキシトを含むヘペス溶液を添加し、
室温で４分間放置する。この混合物をＤＭＥＭで２回洗
浄した後、新たにＤＭＩＥＭ　５ｍｌを添加し、５％　
ＣＯ２，３７℃で２４時間培養する。ついて、ｔ（ＡＴ
培地に交換し、４日間培養する。

発現確認における陰性対照用のとして、ｇｐＩＩ遺伝子
を含まないプラスミドｐＴＳＫＶを用いて同様に形質転
換を行った。

４　　■の　　　至 上記のようにして得た細胞が、糖蛋白ｇｐＩＩを発現し
ていることを確認するために以下の試験を行１つな。

ｐＴｓ［（−１６およびｐＴｓＨ−５により形質転換さ
れたそれぞれ（７）ＣＯ３細胞を、１ｘノニデッｌ−Ｐ
−４０含有ＰＢＳ　５００Δで可溶化し、１５０００回
転、３０分間の遠心を行った。

その上清を、ｇｐＩＩに対するポリクローナル抗体を固
定した９６穴プレー１−に添加し、３７°Ｃで１時間反
応さぜた。洗浄後、パーオキシダーゼを結合したｇｐＩ
Ｉに対するモノクローナル抗体を添加し、３７℃で１時
間反応させ、洗浄後、パーオキシダーゼの基質であるテ
トラメヂルベンチジンを添加すると、ｇｐＩＩの存在を
認める発色がみられた。

ｇｐＩＩ遺伝子の５°末端側の塩基配列を、マキサム・
ギルバート法により一部解析しな（第６図参照）。その
結果からｇｐＩＩのＮ末端のアミノ酸配列は、 Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｖａｔ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｖ
ａｔ−３ｅｒ−Ｖａｌ−と考えられ、疎水性の強いこの
領域をコードする遺伝子を下記のようにして除去しな。

実施例１で横築したプラスミドｐＭ７１６５μｑを、１
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐｌ＋８．０．７ｍＭ　Ｍ
ｇＣｈ、７ｍＭ　２−メルカプトエタノール、１７５ｍ
Ｍ　ＮａＣ１，０，２ｍＭ　ＥＤＴＡの混液１００越に
加え、これに制限酵素５ａ１１　１０単位およびＢｇｌ
　１　１５．１１位を加えて、３７℃で２時間反応させ
る。

この反応液を、高木座敷著「遺伝子操作マニュアル」３
３〜３４頁に記載の方法により、１．２％アガロースゲ
ルにて電気泳動により２．７Ｋｂｐのフラクメン１〜を
分離・抽出する。得られた２、　７Ｘｂｐフラグメント
のＤＮＡ　４ｓを１（１ｍＭ　ＴｒｉｓＪＩＣＩ　ｐＨ
７，５，７１６Ｍ　ＭｇＣＩ２．５０ｍＭ　ＭＣＩ、７
ｍＭ　２−メルカプトエタノールの混液５０Δに加えこ
れに制限酵素ＢａｎＨ１０単位を加えて３７℃で２時間
反応させる。この反応液を」１記、高木座敷著「遺伝子
操作マニュアル」に記載の方法により１２％アガロース
ゲルにて電気泳動し、上記２７Ｋｂｐフラグメン１−Ｄ
ＮＡのＮ末端より、約８５ｂｐのフラグメントＤＮＡが
除去されたＤＮＡフラグメントを得る。

このフラグメントＤＮＡは、ｇｐＩＩのＮ末端の部分を
コードする遺伝子か、本来の開始コドンＡＴＧより約６
０ｂｐ欠失した状態となっている。前述のＮ末端の９ア
ミノ酸をコードする遺伝子領域のみが除去された遺伝子
フラグメントを横築するために、除去しすぎた領域を補
う合成りＮＡを付加する。

このような合成りＮＡとして、除去し過ぎたアミノ酸配
列をコードする遺伝子、新たな開始コドンならびにベク
ターへの組み込みに必要な制限酵素認識部位ＴＣＧＡＣ
を付加した約４５ｂｐのグラグメントＤＮＡの合成を行
なった。合成にあたっては、第７図に示すプラス鎖とマ
イナス鎖を別々に合成した。

合成は、アプライドシステムズ社のＤＮＡ合成機３８１
Ａを用いた。

得られた合成１１ＮＡを前述のＢａｎ１ｌ−５ａｌｌ　
　２．７ｋｂｐフラグメントＤＮＡに、ＤＮＡ　Ｉｉｇ
ａｔｉｏｎ　ｋｉｔ　（宝酒造社製）を用い、リンカ−
ライゲーションと同様に付加反応を行った。このフラグ
メントＤＮＡにエタノールを加え沈澱させ枦取した後、
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ）＋７．５．７ｍＭ　
ＭｇＣｈ、１７５ｍＭ　ＮａＣ］、７ｆｌＩＭメルカス
トエタノール、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡの混液１００乾に
溶がし、制限酵素５ａｌｌを１０単位加えて３７°Ｃで
２時間反応させる。この反応液に等量のフェノールを加
え、ＤＮＡを含む水層画分を回収し、これに冷エタノー
ルを加えてＤＮＡを沈澱させる。このＤＮＡを沢取し、
ＤＮＡ　ｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔを用いクローニングベ
クターｐＢ１３２２の制限酵素Ｓａ目部位を開裂したも
のへ組み込んだ。この反応液を用い、高木東歌編著「遺
伝子操作実験法」１６１〜１６２頁に記載の方法により
、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換させ、その形質転換体か
らアンピシリン耐性、ストレプトマイシン感受性菌を選
択し、　「代謝」第１７巻、第４号、第８１〜８９頁（
１９８０）に記載の方法にしたがって、ｇｐＩＩのＮ末
疎水性アミノ酸領域をコードする遺伝子が除去されたｇ
ｐＩＩ遺伝子が組み込まれたプラスミドｐＢＲ］−１９
を得る（第９図参照）。

□←λコリｉＪＪ亡泗漕遣 上記のようにして構築されたｇｐＩＩ遺伝子が、目的通
りの塩基配列を有していることの確認を、塩基配列を解
読することにより行った。

プラスミドｐｉＲ１−１９よりｇｐＩＩ遺伝子である５
ａｔＩフラグメントＤＮＡを抽出し、　「蛋白質　核酸
・酵素」第２９巻、第４号、２９４〜３０６頁（１９８
４）に記載の方法にしたがって一本鎖ＤＮＡを調製し、
宝酒造製［Ｍ１３シークエンシングキッｌ−Ｊを用い、
塩基配列決定を行った。Ｎ末端よりＩ）　Ｑ　ｂ　ｐの
解読を行った結果、第８図に示すように目的通りの塩基
配列を有していることが確認された。

３　　　　、　　　　ベ　　　− 一梵一 上記のプラスミドｐＢＲ１−１９１０μ！］を、１０ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＩＩＣＩ（ｐｌ＋７．５）、　　７ｍＭ
　ＭｇＣｈ、　　１７５ｍＭ　ＮａＣ！、　　７ｍＭ　
２−メルカプトエタノール、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、制
限酵素Ｓａｌ　１１０単位の混液１００ｔｌＱ中で３７
°Ｃ５２時間反応後、高木座敷著「遺伝子操作マニュア
ル」３３〜３４頁に記載の方法により、１２％アガロー
スゲルにて電気泳動により２．７Ｋｔ＋ｐのフラグメン
トを分離　抽出する。

このフラグメントＤＮＡ　１１００ｎと酵母用発現ベク
タｐＡＭ８２　（Ｘｈｏ　Ｉで開裂したもの）　１０１
ｇ、およびｐｙｃ＋００　（Ｓａｌ　Ｉで処理して開裂
したもの＞　ＬｏｎｇとをそれぞれＤ　Ｎ　Ａ　ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて１６℃、１時間反応させる
。

これらの反応液を用い、高木東歌編著「遺伝子操作実験
法」１６１〜１６２真に記載の方法により、大腸菌１１
ＢＩＯＩをそれぞれ形質転換させ、その形質転換体から
アンピシリン耐性菌を選択　培養し、酸性フォスファタ
ーゼプロモーター下流に５゛端欠損ｇｐＵ遺伝子が組み
込まれたプラスミドｐＭＡ３１ならびにＧ　Ａ　Ｐ　−
Ｄ　ＩＩプロモーター下流に５′端欠損ｇｐＩＩ遺伝子
が組み込まれたプラスミドｐＲ１２５をそれぞれ単離す
る。　（第９図参照） 乏　　−′　」ＬＮ＊Ｊ−損−ｇ」とＩＪΣ発１上記プ
ラスミドｐＭＡ３１ならびにｐＲ＋２５を用いて、実施
例１の場合と同様に、酵母を形質転換した。得られた形
質転換酵母により発現されたｇｐＩＩの抗原活性を実施
例１と同様に測定した。その結果を第２表に示す。

第　　２　　表 ※　ｐＭＡ３１およびｐ　ＲＩ　２５の値は、９倍希釈
した酵母抽出液の測定値から換算した数値である。

この結果かられかるように、実施例３で構築したＮ末端
欠損ｇｐＩＩ３１伝子を用いた発現系のはう＝４０− が、目的糖蛋白質ｇｐＩＩの発現量が非常に高いことが
確認された。

実施例１〜３により得られた本発明のｇｐＩＩは、モル
モットを用いた免疫試験においてウィルス由来ｇｐＩＩ
と同等の免疫原性を示し、本発明のｇｐＩＩがワクチン
として利用が十分可能であることが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＶＺＶ−ＤＮＡを制限酵素旧ｎｄｌｌＩで切
断したものを電気泳動させた時の泳動パターンを示す。 第２図および第３図は、プラスミドｐＭＴ１６の構築図
を示す。 第４図は、発現プラスミドｐＡＭ２およびｐＹＧ２８の
構築図を示す。 第５図は、発現プラスミドｐＴｓＨ−５ならびにｐＴｓ
）［−１６の構築図を示す。 第６図は、本発明においてクローニングした■ｚｖ−ｇ
ｐＩＩ遺伝子の５″端領域の塩基配列を示す。 第７図は、実施例３で調製した合成りＮＡの塩−４１＝ 基配列を示す。 第８図は、実施例３で構築したＮ末欠損ｇｐＩＩ遺伝子
の５′端領域の塩基配列およびＮ末端アミノ酸配列を示
す。 第９図は、発現プラスミドｐＭＡ３］およびｐＲＩ２５
の構築図を示す。 第１図 Ｈｉｎｌ　Ｉ 特開平１−２５２２７９　（１２ン 第２図 Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ μｍ　０１ 一一一 マＵ

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）帯状庖疹ウィルス（ＶＺＶ）の糖蛋白質ｇｐII遺
   伝子を真核細胞内で発現させることにより得られる帯状
   庖疹ウィルス糖蛋白質。
2. （２）ｇｐII遺伝子が下記の制限酵素切断点地図で現さ
   れる約２．７ｋｂｐの遺伝子である前記第（１）項記載
   の帯状庖疹ウィルス糖蛋白質。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ＶＺＶｇｐII−ＤＮＡ（２．７ｋｂｐ）
3. （３）ｇｐII遺伝子が、ｇｐII−Ｎ末端の疎水性の強い
   配列をコードする領域が除去された遺伝子である前記第
   （１）項記載の帯状庖疹ウィルス糖蛋白質。
4. （４）帯状庖疹ウィルス（ＶＺＶ）の糖蛋白質ｇｐII遺
   伝子を真核細胞内で発現させることにより得られる帯状
   庖疹ウィルス糖蛋白質からなることを特徴とする帯状庖
   疹ウィルスに対するワクチン。
5. （５）該真核細胞が酵母である前記第（４）項記載のワ
   クチン。
6. （６）下記の制限酵素切断点地図で現される約２．７ｋ
   ｂｐのＶＺＶ−ｇｐII遺伝子発現ベクターにより真核細
   胞を形質転換し、この形質転換体を培養することにより
   、該形質転換体内にｇｐIIを産生させることを特徴とす
   るＶＺＶ−ｇｐIIの製法。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ＶＺＶｇｐII−ＤＮＡ（２．７ｋｂｐ）
7. （７）該ＶＺＶ−ｇｐII遺伝子が、ｇｐIIをコードする
   遺伝子の５′端領域を一部除去した遺伝子である前記第
   （６）項記載のＶＺＶ−ｇｐIIの製法。
8. （８）該ＶＺＶ−ｇｐII遺伝子が、ｇｐII遺伝子から翻
   訳されるペプチドのうちＮ末端からアミノ酸９個分をコ
   ードする遺伝子を除去した遺伝子断片である前記第（７
   ）項記載のＶＺＶ−ｇｐIIの製法。