JPH0775548B2 - ヒト成長ホルモン変異蛋白質をコードしているｄｎａ - Google Patents

ヒト成長ホルモン変異蛋白質をコードしているｄｎａ

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JPH0775548B2
JPH0775548B2 JP3324324A JP32432491A JPH0775548B2 JP H0775548 B2 JPH0775548 B2 JP H0775548B2 JP 3324324 A JP3324324 A JP 3324324A JP 32432491 A JP32432491 A JP 32432491A JP H0775548 B2 JPH0775548 B2 JP H0775548B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明はヒトの成長ホルモンの変異蛋白質
の発見に基づくものであり、組替えＤＮＡ技術によるそ
のＤＮＡ配列およびそのＤＮＡ由来のアミノ酸配列の決
定に関するものである。本発明は更に、宿主微生物また
は細胞培養中でＤＮＡを発現させることにより、有用な
量のこの変異蛋白質を生産するための手段および方法を
提供するものである。
【０００２】ヒト成長ホルモンを含む多数のポリペプチ
ドを微生物により生産する手段および方法は、Ｇoeddel
ら（Ｕ.Ｓ.Ｓ.Ｎ.５５１２６、１９７９年７月５日出
願）により開示されている。この米国特許の対応出願で
ある英国特許出願公告第２０５５３８２号および欧州特
許出願公開第２２２４２号が既に公開されている。
【０００３】微生物宿主から各種の異種ポリペプチド類
を生産する方法では、その特定の所望の生成物を暗号化
しているＤＮＡ配列を同定することが必要であった。そ
れがわかると、合成的にあるいは組織由来のcＤＮＡか
らその配列を形成することができ、これを発現ベクター
に作働し得る様に挿入し、これを使って宿主生物を形質
転換し、そのポリペプチドを生産することができる。過
去に於いて、比較的小さな蛋白質は、その全遺伝子を合
成することにより、それを生産することができた。この
最初の実例はヒトインシュリンであった（英国特許出願
公告第２００７６７６号参照）。全て合成による遺伝子
を使用し、微生物学的発現によって生産するには大き過
ぎるポリペプチドについては、組織由来のmＲＮＡ転写
によってcＤＮＡを得ていた。
【０００４】いずれの場合に於いても、正しい順序で合
成を行なうため、あるいは適切なmＲＮＡ配列を単離す
るための正しい同種配列プローブを使用し得る様に、そ
のアミノ酸配列を知ることが必要である。ポリペプチド
配列がわからず、そのポリペプチドの出所（source）
に、配列を決めるに十分なだけのものを抽出し得るほど
の量のポリペプチドが含まれていない場合には問題であ
る。従って、遺伝子の発現される組織がわからない場
合、遺伝子の発現量が検出できる程でない場合、組織の
ごく僅かの細胞中で発現される場合には、微少のmＲＮ
Ａの単離に関する現在の技術水準から来るその他の種々
の制限により、従来用いられて来た方法は成功しない。
【０００５】この様な状況下、組換えＤＮＡ技術に於け
る改良精製法が、所望の異種蛋白質を得るのに有用であ
ると考えられている。本発明は、そのままの状態では遺
伝子の生産物が検出可能な程、あるいは有意に単離し得
る程には生産されない場合に、配列を決めるに十分量の
遺伝子の単離を有利にするのに組換えＤＮＡ技術を使用
することができることを見い出したことに基づくもので
ある。
【０００６】本発明は、ゲノムＤＮＡ由来のそのままの
（自生の）遺伝子バンクをプローブし、所望の遺伝子お
よびそれに付随する天然のイントロン配列を含有してい
るゲノム部分（section）を得る方法を提供するもので
ある。この断片を宿主細胞に導入すると、転写によって
忠実に相当するmＲＮＡ転写体が生産される。この様な
転写体は、もとの遺伝子には存在したであろうイントロ
ン配列に相当する配列を持っていない。というのは、そ
れは後転写過程の一部として切り取られてしまう（スプ
ライシング）からである。このmＲＮＡからcＤＮＡバン
クが調製され、そこから所望の蛋白質生成物を暗号化し
ている。cＤＮＡを単離し、次いで自体既知の方法で、
これを発現ベクターに、作働し得る様に挿入する。ＤＮ
Ａ配列に対する知識を後知恵的に利用することなく、全
ゲノムＤＮＡから、所望のmＲＮＡを、次いでそれか
ら、発現ベクターに使用するためのcＤＮＡを生産する
方法は独特のものである。
【０００７】この方法は、ヒト、哺乳動物またはその他
の真核性生物の遺伝子を含む染色体ＤＮＡの一部からm
ＲＮＡおよびそれからcＤＮＡを得ることができる一般
的なものである。この方法は、遺伝子は単離できるが、
この遺伝子から導かれるmＲＮＡは単離することができ
ない場合に有用である。これは、先に述べた理由で遺伝
子発現の生産物が検出できない時に起る。所望の遺伝子
を持った染色体ＤＮＡの小さな断片は、適当なＤＮＡ雑
種形成プローブによってゲノムライブラリーから単離す
ることができる。このＤＮＡを、その遺伝子の効率的な
発現を保証する数多くの現在利用し得る技術の１つで、
適当な組織培養細胞の核に導入する。この遺伝子は転写
され、一次転写生成物は加工されてイントロン配列が除
去され、キャッピング（capping）とポリアデニル化が
起り、最終転写生成物たるmＲＮＡが蛋白質合成のため
の型板として細胞質中に現れる。従って、この様な細胞
からのポリアデニル化されたmＲＮＡから誘導されるcＤ
ＮＡバンクは、所望の遺伝子から導かれるクローンされ
たcＤＮＡを含んでおり、このcＤＮＡを標準的な方法
で、微生物学的発現用に加工することができる。
【０００８】細胞の核に外来遺伝子を挿入する方法は既
にいくつか知られている（マイクロ注射、遺伝子マーカ
ーおよび動物ウイルスのゲノムから導かれる真核性ベク
ターを使った同時形質転換）。導入された遺伝子の効率
的な発現がみられたのは極く僅かである。この様な性質
を持った１つの系は、細胞中に導入されたＳＶ４０複製
起源を含有しているＤＮＡが高いコピー数で複製する様
に、その染色体中にＳＶ４０Ｔ抗原遺伝子を持っている
ＣＯＳ細胞である。この起源に物理的に結合したＤＮＡ
の効率的な発現は、ＳＶ４０遅発（late）プロモーター
機能を利用することによって可能である。
【０００９】本発明のこの様子は、以下のチャートによ
って示すことができる。
【化３】 遺伝子バンク ↓ 特異プローブ 染色体遺伝子 ↓ ＣＯＳ細胞および大腸菌用のシャトルベクターへのクローン ＣＯＳ細胞用遺伝子発現ベクター ↓ ＣＯＳ細胞にトランスフェクト ↓ ＣＯＳ細胞からmＲＮＡの単離 ↓ cＤＮＡをクローン cＤＮＡバンク ↓ 特異プローブ 染色体遺伝子から導かれたクローンcＤＮＡ
【００１０】本発明は更に、ヒト成長ホルモンの変異体
の発見に基づくものである。詳しくは、ＨＧＨ変異蛋白
質を暗号化しており、４個の介在配列を含んでいる代表
的な遺伝子がヒトゲノムライブラリーから単離された。
この蛋白質を生産する組織は知られていない：事実、Ｈ
ＧＨ変異（ＨＧＨ−Ｖ）蛋白質が存在することは、これ
まで報告されていない。この蛋白質を組換えＤＮＡ技術
によって生産するには、この遺伝子のmＲＮＡの、クロ
ーンしたcＤＮＡコピーを得ることが必要である。上記
の方法により、所望のmＲＮＡ（cＤＮＡ合成のための出
発物質）を生産するのに組織培養系を用いた。ＳＶ４０
複製起源および遅発プロモーター機能を持った細菌ベク
ター（プラスミドpＭＬ）にこの遺伝子をクローンす
る。この組み立てでＨＧＨ−Ｖ遺伝子がＳＶ４０プロモ
ーターと連結し、正しい鎖の転写が保証される。細菌培
養から十分な量のこのＤＮＡを得た後、これを使ってＣ
ＯＳをトランスフェクトする。トランスフェクトされた
細胞中でのＨＧＨ−Ｖ遺伝子の発現をＲＮＡ分析および
ＲＩＡによってモニターする。細胞を感染させてから約
５日後にＲＮＡを抽出し、ポリアデニル化ＲＮＡを調製
する。２本鎖cＤＮＡを合成し、標準的な方法で、トラ
ンスフェクトしたＣＯＳ細胞cＤＮＡのクローン化バン
クを確立する。このバンクを適当な核酸プローブを用い
てプローブし、ＨＧＨ変異体mＲＮＡから導かれるクロ
ーンcＤＮＡを持ったコロニーを検出する。ＤＮＡ配列
を分析することによって、クローンされたＨＧＨ−Ｖc
ＤＮＡがイントロン配列を失なっているか（これはＣＯ
Ｓ細胞中で一次遺伝子転写体が正しくスプライシング
「よりつなぎ」されたことを示す）どうかを調べる。ク
ローンcＤＮＡから出発する、ＨＧＨ変異蛋白質のため
の細菌発現ベクターの組み立てには、標準的技術を使
う。
【００１１】本発明はmＲＮＡの単離法およびあらゆる
意味での一連のＨＧＨ変異体に関するものであって、本
発明の一般概念の範囲に包含される本明細書に詳細に開
示された特定の態様に限定されるものと解釈してはなら
ない。この変異体類は、特に下垂体機能低下小人症の治
療に有用であることが知られているヒト成長ホルモン
（ＨＧＨ）の変種であるので、これらの物質がＨＧＨ自
体が関与している一般的な蛋白同化過程および他の代謝
活性に関係していることは疑いない。従って、これらは
ＨＧＨに帰因する一般的な蛋白同化およびその他の代謝
活性の領域内での活性を惹起するのに有用であろうし、
ＨＧＨと共通する部分以外の異なった活性を持っている
ことが判明するかもしれない。
【００１２】本発明の好ましい態様について以下に述べ
る。 Ａ．微生物／細胞培養 １．細菌株／プロモーター ここに記載の研究は微生物Ｅ.coli（大腸菌）Ｋ−１２
株２９４（end Ａ,thi-,hsr-,khsm+）を使って行なっ
た。この株はＡmerican Ｔype Ｃulture Ｃollectionに
寄託されており、ＡＴＣＣＮo.３１４４６で入手可能で
ある。しかし、その他の種々の微生物も使用することが
できる。例えば既知のＥ.coli株、例えばＥ.coli Ｂ、
Ｅ.coli×１７７６（ＡＴＣＣＮo.３１５３７）および
認可された微生物寄託機関（例えばＡmerican Ｔype Ｃ
ulture Ｃollection（ＡＴＣＣ））に寄託されており、
そこから入手し得るその他の微生物株（ＡＴＣＣカタロ
グ参照）などが利用できる。これらのその他の微生物に
は、例えばバチルス（Ｂacillus）、例えばＢacillus s
ubtilisおよびその他の腸内細菌、例えばＳalmonellaty
phimuriumおよびＳerratia marcesansなどが含まれ、こ
れらは、そこで複製することができ、かつ異種遺伝子配
列を発現し得るプラスミドを用いる。
【００１３】異種ポリペプチドの微生物生産を開始、維
持するのに、実際例として、ベーターラクタマーゼおよ
びラクトースプロモーター系が好適に使用されて来た。
最近、トリプトファンオペロンに基づく系、いわゆるtr
pプロモーター系が開発された。その他の多数のプロモ
ーター系が発見、利用されており、当業者がそれらをプ
ラスミドベクター中に機能的に結合させるのに必要なそ
のヌクレオチド配列に関する詳しい情報が知られてい
る。
【００１４】２．酵母株／酵母プロモーター 本発明の発現系は、Ｅ.coliおよび酵母、Ｓaccharomyce
s cerevisiaeの両方で選択および複製が可能なプラスミ
ドを使用してもよい。有用な株の１つは、前記ＡＴＣＣ
に、ＡＴＣＣＮo.４４０７６で寄託されているＲＨ２１
８株である。しかし、あらゆるＳaccharomyces cerevis
iae株も使用し得ることがわかるであろう。
【００１５】非酵母遺伝子の５'側におかれた酵母遺伝
子由来の５'−末端側（flanking）ＤＮＡ配列（プロモ
ーター）は、酵母を形質転換するのに使用されるプラス
ミド中に置かれると、酵母中で外来遺伝子の発現を促進
することができる。プロモーターの他に、酵母中で非酵
母遺伝子を適切に発現させるためには、酵母中で適切な
転写終了およびポリアデニル化が可能な様に、プラスミ
ド上の非酵母遺伝子の３'末端に置かれた第２の酵母配
列が必要である。このプロモーターは、その他のものと
同様に、本発明で好適に使用することができる（下記参
照）。
【００１６】酵母の５'−末端側配列（３'酵母終止ＤＮ
Ａと共に）（下記）は、酵母中で外来遺伝子の発現を促
進する様に機能するので、あらゆる高発現の酵母遺伝子
の５'−末端側配列が、重要な遺伝子生産物の発現に使
用することができそうである。これらの遺伝子の３'−
末端側配列も、全て、この様な発現系で適切な終止およ
びmＲＮＡポリアデニル化に使用することができる。
【００１７】酵母プロモーターの多くはまた、転写コン
トロールを含んでおり、従ってそれらは、増殖条件の変
化によって作働したり停止したりする。この様な酵母プ
ロモーターの例は以下の蛋白質を生産する遺伝子であ
る：アルコール・デヒドロゲナーゼII、イソチトクロー
ムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝に関係する分解酵
素、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート・デヒドロ
ゲナーゼおよびマルトース並びにガラクトースの利用に
関係する酵素など。この様なコントロール領域は、蛋白
質生成物の発現をコントロールするのに、特にその生成
物が酵母にとって有害である場合に有用であろう。１つ
の５'−末端側配列のコントロール領域に、高発現遺伝
子からのプロモーターを含有する５'−末端側配列を置
くことも可能なはずである。こうすれば、ハイブリッド
（交雑）プロモーターになるであろうし、コントロール
領域とプロモーターとは物理的に異なるＤＮＡ配列であ
る様だから、これは可能なはずである。
【００１８】３．細胞培養系／細胞培養ベクター 培養（組織培養）での増殖細胞の増殖は、最近の常套手
段となって来た。サルの腎臓の線維芽細胞のＣＯＳ−７
ラインは、動物のインターフェロン生産の為の宿主とな
り得る（１）。しかし、ここに記載する実験は、適合ベ
クターが複製および発現し得る全ゆるセルライン、例え
ばＷＩ３８、ＢＨＫ、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＶＥＲＯおよび
ＨeＬaセルライン中で行なうことができる。更に、発現
ベクターに要求されることは、必要なリボゾーム結合サ
イト、ＲＮＡスプライシングサイト、ポリアデニル化サ
イト、転写停止配列と共に、発現されるべき遺伝子の前
に位置するプロモーターおよび複製起源である。本明細
書では、ＳＶ４０のこれらの必須要素が利用されている
が、これは好ましい態様の形で記載されているのであっ
て、本発明は、これらの配列に限定されるものではな
い。例えば、他のビールス（例えばポリオーマ、アデ
ノ、ＶＳＶ、ＢＰＶなど）の複製起源も使用することが
でき、非統合状態（nonintegrated state）で機能し得
る細胞のＤＮＡ複製起源も使用できる。
【００１９】Ｂ．ベクター系 発現させるための有用なベクターは、Ｅ.coli中で選択
するための選択マーカー（アンピシリン耐性）および
Ｅ.coliのＤＮＡ複製起源を持っているpＢＲ３２２配列
からなっている。これらの配列はプラスミドpＭＬ−１
から導かれ（２）、ＥcoＲＩおよびＢamＨＩ制限サイト
にまたがる領域を包含している。ＳＶ４０起源は、この
領域を含む３４２塩基対のＰvuII−ＨindIIIフラグメン
ト（両端はＥcoＲＩ末端に変換されている）から誘導さ
れる。これらの配列は、ウイルスのＤＮＡ複製起源を含
む他、初期（early）および後期（late）転写単位の両
者のためのプロモーターを暗号化している。ＳＶ４０起
源領域の位置は、後期転写単位の為のプロモーターがイ
ンターフェロンを暗号化している遺伝子の近くに位置し
ている関係にある。
【００２０】以下に添付の図面について説明する。図１
は、ＨＧＨ遺伝子系統群（family）のメンバーを含んで
いる３個のヒトのゲノムＤＮＡフラグメントの機能編制
および制限地図を示している。図２、図３、図４、図５
は末端側（flanking）領域を持つ、２個のＨＧＨ遺伝子
および１個のＨＣＳ遺伝子のヌクレオチド配列を示して
いる。ヌクレオチド番号はＨＧＨ−Ｎ遺伝子配列を表わ
し、その番号はいづれも、最初の１桁がその相当するヌ
クレオチドの上に位置している。正の数のヌクレオチド
は推定キャップサイト（capsite）から始まっており、
負の数のヌクレオチドは５'末端側配列とする。負の数
のトリプレットはそれぞれの信号ペプチドを暗号化して
おり、正の数のものは成熟ペプチド用のコドンである。
真核性構造遺伝子の特徴であるＴＡＴＡＡＡおよびＡＡ
ＴＡＡＡ配列には下線を引いてある。２個のＨＧＨ遺伝
子の３'−末端側領域のヒトＡlu系統群配列は、ヌクレ
オチドの上に線を引いて示した。このＡlu系統群配列の
１端に相同のＨＣＳ遺伝子の短い領域には下線を引い
た。
【００２１】図６は１個のＨＧＨ変異アミノ酸およびヌ
クレオチドの配列を示している。この蛋白質の一次構造
は、ＨＧＨ−Ｖ遺伝子（図２〜５参照）中のエクソン
（構造配列）暗号部分だけから導かれたものである。Ｈ
ＧＨ−Ｎ遺伝子に対するヌクレオチド配列における違
い、およびＨＧＨ蛋白質配列（３）に対する違いを、そ
の変異配列の下に示した。ＨＧＨにおけるアミノ酸残基
９は、cＤＮＡ配列決定（４）で決定された様にプロリ
ンであってもロイシンであってもよい。
【００２２】図７は、ＨＧＨ変異蛋白質を暗号化してい
る遺伝子を担持している細胞培養発現ベクター、即ちp
ＳＶ−ＨＧＨ−Ｖの組み立てを示している。以下に本発
明を詳細に説明する。
【００２３】遺伝子の単離および特徴づけ バクテリオファージλ中のヒトのゲノムライブラリー
（genomic library）（５）を、クローンしたＨＧＨcＤ
ＮＡ配列との系中でのプラーク・ハイブリジデーション
（雑種交雑法）（６）により、ヒトＨＧＨ遺伝子系統群
についてスクリーンした（４、７）。ヒトのゲノムＤＮ
Ａ（８）の類似の分析から期待された様に、このフラグ
メントは２.６、２.９または９.５kbの長さであった。
雑種形成フラグメントをプラスミドpＢＲ３２５（９）
のＥcoＲＩサイトにサブクローンし、３個（２.６、２.
６および２.９kb）を完全なＤＮＡ配列決定のために選
んだ。２個の小さい方のフラグメントとは異なったファ
ージ単離物（isolates）由来のものであり、異なった制
限地図を持っていた。
【００２４】配列分析のために、この３個のゲノムＤＮ
ＡフラグメントをプラスミドＤＮＡから切り取り、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって単離した。いくつ
かの特異なエンドヌクレアーゼに対する制限地図を常法
に従って作成し、図１に示した。決定した制限フラグメ
ントに相当する重複セグメントをファージＭ１３mp７Ｒ
Ｆ−ＤＮＡ（１０）に挿入し、１本鎖組換えファージＤ
ＮＡを、万能プライマー（１０）として合成ヌクレオチ
ドを使用した酵素的配列反応（１１）における鋳型とし
て使用した。
【００２５】互いに整列しており、エクソン、イントロ
ンおよび非転写（末端側）領域に分割した３個のゲノム
ＤＮＡフラグメントの全ヌクレオチド配列を図２、図
３、図４、図５に示す。この分割は、ＨＧＨおよびＨＣ
ＳcＤＮＡの一次構造と比較することにより行なった
が、３つの配列が近似的に相同であることによって容易
に行なわれた。ＨＧＨmＲＮＡの全ヌクレオチド配列
（５'−非翻訳領域の一部を除いて）は知られているが
（４,７）、ＨＣＳmＲＮＡの配列は、その大部分が報告
されているだけである（１２、１３）。本発明を実施し
得る様にする為、以下に更に詳細に本発明を説明する。
【００２６】ヒト染色体ＤＮＡを保有する約１０6組換
えλ４Ａファージを２０ １５０mmペトリ皿に置き、放
射活性で標識したクローンＨＧＨcＤＮＡ（７）（比活
性＞１０8cpm／μg、約１０6cpm／フィルター）でスク
リーンした（６）。このプローブの調製は記載された通
りである（８）。１２のファージを分離し、ファージ精
製の為の２回のスクリーニングにかけ、Ｅ.coli株ＤＰ
５０supＦ（ＡＴＣＣＮo.３９０６１、１９８２年３月
５日寄託）中で増殖させ、記載された方法（１４）で溶
解カルチャー（培養物）から調製した。各ファージＤＮ
Ａの一部（１μg）をエンドＥcoＲＩで消化し、消化物
のサウザンブロット（Ｓouthern blots）（１５）をク
ローンしたＨＧＨcＤＮＡプローブと交雑させた。交雑
フラグメントは９.５、２.９または２.６kbの長さであ
った。これらを、クロラムフェニコール感受性クローン
におけるコロニー雑種交雑法（１６）におけると同じＨ
ＧＨプローブを使って、プラスミドpＢＲ３２５（９）
のＥcoＲＩサイトにサブクローンした。２.６、２.６お
よび２.９kbの長さであって２個のＨＧＨ遺伝子および
１個のＨＣＳ遺伝子を含有している３個のサブクローン
したＥcoＲＩフラグメントを、おおまかな制限分析にか
けた。対数増殖期にクロラムフェニコール（２００μg
／ml）と共に増幅させた１Ｌの培養からプラスミドＤＮ
Ａを抽出した。ＤＮＡの抽出および澄明溶解質技術によ
る精製は記載されたもの（１７）と基本的に同じであ
る。ＲＮＡase（１０μg／ml）による消化およびアガロ
ースＡ５０ｍ上のクロマトグラフィーによりＲＮＡを除
去した。プラスミドＤＮＡをエンドＥcoＲＩで完全に切
断し、クローンＤＮＡフラグメントを６％ポリアクリル
アミドゲルから切り取って単離した。地図作成の為に、
ゲル−単離ＤＮＡフラグメントを以下の制限エンドヌク
レアーゼ（供給者ＢＲＬ）の１種またはそれ以上で切断
した：ＢamＨＩ、ＢgＩII、ＰvuII、ＰstＩ、ＳmaＩお
よびＸbaＩ。通常、反応はＤＮＡ５００mgおよび酵素２
Ｕを含んでいる２０μlの１０mＭトリス塩酸、pＨ７.
５、０.１mＭ ＥＤＴＡ、７mＭ ＭgＣl2、１０mＭ
ＤＴＴ中で行ない、３７℃で１時間インキュベートし
た。消化物を、サイズ（寸法）マーカーとして、エンド
ＨinfまたはＨaeIIIで切断したプラスミドpＢＲ３２２
ＤＮＡと平行的に、６または８％ポリアクリルアミドゲ
ル上で分離した。ゲル中のＤＮＡはエチジウムブロミド
染色とＵＶ光によって目に見える様にした。
【００２７】上に示した酵素認識サイトの正確な位置
は、最終的なＤＮＡ配列から得た（図２〜５参照）。エ
クソンの位置は、本明細書に記載した様にクローンした
cＤＮＡ配列との比較から決定した。２個のＨＧＨ遺伝
子の３'末端側領域の点刻した箱は、ヒトＡlu系統群の
メンバーの位置を示している。矢印は３個のゲノムＤＮ
Ａフラグメントの９５％以上を配列化するのに使った戦
法（strategy）を示している。重複が生じた配列は選択
したゲル−単離制限フラグメントの配列化によって確認
した。
【００２８】図１において矢印で示した配列化戦法で、
上に示したＤＮＡ配列の９５％以上が得られた。必要な
重複が生じ、不明確なゲルデータは、選択されたゲル分
離部分を配列化することにより解決した。プラスミド−
クローンし、ゲル−分離したゲノムＥcoＲＩフラグメン
ト（３００ng）を、地図作成に使用した１または２種の
制限エンドヌクレアーゼで切断した（図１の矢印も参
照）。反応条件は、ファージベクターに好適に挿入でき
る様に、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート
（それぞれ５０μＭ）およびＥ.coliＤＮＡポリメラー
ゼＩ大型フラグメント（０.５ｕ、Ｂoehringer Ｍannhe
im）を加えて鈍感末端（blunt-ended）ＤＮＡ片を生成
させる他は、図１の説明に記載した通りであった。消化
したＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し、エタ
ノールで沈澱させ、ＨincII−開裂ファージＭ１３mp７
ＲＦ−ＤＮＡ（１０）に結合（リゲーション）させた。
リゲーション反応液（２０μl）は２０ngのＲＦ−ＤＮ
Ａ、１００ngの消化したゲノムＤＮＡフラグメントおよ
び５０mＭのトリス塩酸（pＨ８.００、０.１mＭ ＥＤ
ＴＡ、１０mＭ ＭgＣl2、１０mＭ ＤＴＴ、および５
００μＭrＡＴＰ）中の２ＵＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎe
w Ｅngland Ｂiolabs）を含んでいた。反応物を常温で
４時間インキュベートリスし、これを使ってＥ.coliを
形質転換した。形質転換混合物の植え付け、プラーク選
択、ファージの増殖および配列化の為の１本鎖ＤＮＡ鋳
型の調製は記載されている（１０）通りであった。重剰
性を避ける為に、完全な配列化の前にシングル・トラッ
ク・アナリシス（１８）によって鋳型を選り分けた。選
択したＤＮＡ鋳型を、長さ１５のヌクレオチド合成プラ
イマー（１０）を使ってジデオキシヌクレオチド・ター
ミネーション法（１１）によって配列化した。配列化反
応（５μl、３００ngの鋳型ＤＮＡ）を、１０μlの９８
％脱イオンホルムアミド、１０mＭ ＥＤＴＡ、０.２％
ブロモフェノールブルーおよび０.２％キシレンシアノ
ール（cyanol）を加えて停止させた。停止させた反応混
合物を１００℃で３分間加熱し、その１μlを４０cmの
５％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素“thin”ゲル（１
９）上、３０mＡ／１.８ＫＶで２〜６時間電気泳動し
た。次いでゲルをワットマン３ＭＭ濾紙に移し、減圧乾
燥し、平均１２時間Ｘ線フイルムに感光させた。
【００２９】ゲノムフラグメント内の配列の機能および
編成 ３つのフラグメント内の高度に相同性の配列の機能的編
成は、最初の全２,２００塩基対が同一である。各フラ
グメントは、全ての現在知られている配列特性（後記）
についてはそのままであり、非転写配列の数百の塩基対
が遺伝子の末端側を構成している。各フラグメントの
５'−末端から約４７０塩基対に、真核性プロモーター
に特徴的なＴＡＴＡＡＡ配列がある（２０）。エクソン
Ｉ（キャップサイト（頭側））の始まりは、この調整配
列から３０ヌクレオチド下流のＡ残渣と仮に決められ
た。このキャップサイトの位置は、多くの真核性遺伝子
（２１〜２５）のそれとよく一致しており、３つのフラ
グメントの全てに存在するＢamＨＩサイトに１ヌクレオ
チド先行している。各遺伝子は、最初の２６個が信号ペ
プチドを構成している２１７アミノ酸の蛋白質を暗号化
する可能性を持っている。暗号部分は、サイズが２６０
塩基対（イントロンＡ）〜９０塩基対（ｃ）の小さいイ
ントロンにより、同じ位置で４回中断されている。全て
の介在配列は、報告されている他のスプライシング配列
（２６）と同様、ＧＴジヌクレオチドで始まりＡＧで終
わっている。
【００３０】最初のエクソン（エクソンＩ）は、５'−
非翻訳配列の約６０ヌクレオチド、信号ペプチドの最初
の３コドンおよび４番目のコドンの最初のヌクレオチド
を含んでいる。第２のエクソンは第４番目コドンの残り
の２個の塩基から始まるその信号ペプチドの暗号領域の
残り、および成熟蛋白質のための３１コドンを含んでい
る。第３番目のエクソンは４０個のトリプレット（３２
〜７１のアミノ酸）、第４番目のエクソンは５５（７２
〜１２６）、第５番目は６５（１２７〜１７１）からな
っている。最後のエクソンは翻訳停止信号から約１００
ヌクレオチド過ぎたところまで延びており、転写終了サ
イトと思われるところから約２０塩基上流に、大抵のポ
リアデニル化mＲＮＡ（２７）に共通のＡＡＴＡＡＡ配
列で特徴づけられている。
【００３１】３'−末端側領域は、約１００ヌクレオチ
ドがほぼ相同であり、この点で両方の２.６kbＥcoＲＩ
フラグメントの配列は２.６kbＤＮＡと異なっている。
これらは、制限化ヒトＤＮＡをプローブ（probe）する
のに使用した時のサウザン・ブロット（Ｓouthern blo
t）での強いしみによって明らかな様に、中央の繰り返
し配列（ヌクレオチド１７３２〜２００５）のブロック
を含んでいる。コンセンサス配列（consensus sequenc
e）（２８）と比較すると、これらの配列はＤＮＡの複
製に於ける期限（origin）として機能すると思われる
（２９）ヒトＡlu系統群の長さ２７０塩基対のメンバー
であることがわかる。Ａlu系統群配列は、ＲＮＡポリメ
ラーゼIII（３０）によって転写されることが知られて
おり、転写はＨＧＨ遺伝子のそれと反対の鎖から始まる
様に挿入される。この領域と、他のヒトの遺伝子におけ
る類似のそれとの比較は別に提供されている（３１）。
【００３２】２.６kbフラグメントの配列の残りは未知
の機能を持っている。２.９kbフラグメントの最後の７
００ヌクレオチドを構成している配列の機能も知られて
いない。ヒトのゲノムＤＮＡをこれらの後者の配列でプ
ローブすると、それらは２.９および９.５kbゲノムＥco
ＲＩフラグメントには存在するが２.６kbフラグメント
には存在しないことがわかる。全ての３つの寸法級のＥ
coＲＩフラグメントは、全２.９kbＤＮＡをプローブと
して使用すると、雑種形成を行なう。このことは、この
ＤＮＡに繰り返し配列がないことを示している。
【００３３】遺伝子とその生産物 全ての３つの非対立遺伝子フラグメントは、プロモータ
ーおよびポリアデニル化信号が存在すること、正しいイ
ントロン−エクソン接合、および不完全な翻訳産物を生
じることとなるエクソンにおけるコドン異常（例えば脱
落、挿入、余分の終止コドン）が存在しないことから判
断される様に、機能遺伝子を含んでいる。発現により、
約１６５０塩基のhnＲＮＡが産生し、これは、５'およ
び３'−非翻訳領域のそれぞれ６０および１００塩基を
含む８００ヌクレオチド長さのmＲＮＡ（３'−ポリＡ尾
部は数えない）に加工され得る。これらのmＲＮＡの一
次翻訳生産物は、２６残渣のＮ−末端信号を含む２１７
アミノ酸の蛋白質である。
【００３４】図２、図３、図４、図５における最初の配
列に含まれているエクソンがクローンしたＨＧＨcＤＮ
Ａ（４、７）と同じヌクレオチドであるということは、
相当するゲノムフラグメントが、脳下垂体で発現される
ソマトトロピンを生産するヒト成長ホルモン遺伝子を含
んでいることを示している。このことは、同じ地図特性
を持った２.６kbＥcoＲＩフラグメントにまたがる染色
体１７の脱落に苦しむ個体では、ＨＧＨが産生されない
ことを見い出すことによって確認される。２つのＢamＨ
Ｉサイトを含んでいる非対立遺伝子ＥcoＲＩフラグメン
トは、この脱落（削除）によって影響を受けず、この遺
伝子が存在しても成長を回復させることができない（３
２）。図５に示した様に、この遺伝子の蛋白質生成物は
preＨＧＨと１５アミノ酸だけ異なっている。この違い
の２つは信号ペプチド中にあり、保存的な性質のもので
ある。蛋白質の熟成した部分におけるアミノ酸の変化の
多くは非保存的であり、蛋白質の性質を著しく変えるも
のであると考えられることに注意すべきである。この様
な変化は１８位（Ｈis→Ａrg）、２１位（Ｈis→Ｔy
r）、６５位（Ｇln→Ｖal）、６６位（Ｇlu→Ｌys）、
１１２位（Ａsp→Ａrg）、１１３位（Ｌeu→Ｈis）、１
２６位（Ｇly→Ｔrp）、１４０位（Ｌys→Ａsn）、およ
び１４９位（Ａsn→Ｌys）におこる。即ち、この蛋白質
は、ＨＧＨと比較して２個の酸性アミノ酸を失ない、３
個の塩基性アミノ酸を獲得している。従って、この変異
体の等電点は、ＨＧＨが５.５であるのに対して８.９と
増加している。
【００３５】これらの変化の結果、ＨＧＨ抗体（３３）
に対する交差反応性（corss−reactivity）が２０倍低
くなり、等電点が著しく高くなると思われる。不思議な
ことに、そのレセプター結合能はＨＧＨに匹敵する様で
あり（３３）、従ってこの変異体を、ＨＧＨ作用の拮抗
的阻害物質にしている。後者の結果は、ＳＶ４０発現系
を使用して変異体遺伝子から生産された蛋白質を特徴づ
けることにより得られた。この遺伝子の転写は、主とし
てウイルスプロモーター（３３）によって調節される
が、ＨＧＨ−ＶおよびＨＧＨ−Ｎ遺伝子の両方の５'−
末端側配列が機能的プロモーター（３４）を含んでいる
ことは、ＨＧＨ−Ｖ遺伝子がインビボで発現される機能
的遺伝子であることを示唆している。
【００３６】変異蛋白質がインビボに於いて実際に生産
されるかどうか、もしされるとすれば、どの組織で生産
されるかについては知られていない。脳下垂体がその蛋
白質の生産サイトである可能性があるが、よく知られて
いるＨＧＨおよびＨＣＳ遺伝子発現の組織特異性が、身
体の別のどこかで合成されるかもしれないＨＧＨ遺伝子
系統群の他のメンバーについても当てはまるかも知れな
いことに留意していなければならない。
【００３７】ＨＧＨおよびＨＣＳ、並びに既知の全ての
動物成長ホルモン（３５）と違って、ＨＧＨ変異体は第
２のトリプトファン残基を特徴としている。このアミノ
酸の変化に加えて、１７のヌクレオチドの相異は同じ意
味のコドンとなり、５'および３'−非翻訳領域では、そ
れぞれ２および４の変化がある。ＨＧＨ−Ｖ遺伝子はま
た、上記の１９１アミノ酸長さの生成物より１５残基少
ない蛋白質を暗号化しているかもしれないということを
指摘することは重要なことである。これは、脳下垂体生
産ホルモンの約１０％が、アミノ酸残基３１〜４５を失
なっている、より短いＨＧＨの変形（２０Ｋ変異体）
（３６）からなっている、ＨＧＨの生合成に形式的に類
似している。ＨＧＨおよびその脱落変異体は、同じ一次
転写体の異なったスプライシングの結果として生じると
いう仮説がＷallisによって提案されており（３７）、
最近のデーターはこの考えを立証している様に思われる
（２５）。残基３１〜４５の暗号配列はエクソンIIIの
始まりを構成しており、ＨＧＨ−ＮおよびＨＧＨ−Ｖ遺
伝子に於いて同じである。両配列は標準的なスプライシ
ングサイト（ヌクレオチド７３０〜７４５、図２〜５参
照）を持っているので、ＨＧＨ−Ｖ遺伝子の一次転写体
はエクソンIIIの内部でスプライシングする可能性があ
り、ＨＧＨ脱落変異体を暗号化しているものと類似して
いるより短いmＲＮＡを生じるのかもしれない。ＨＧＨ
−Ｖ遺伝子がインビボで発現されることは証明されてい
ないが、その本来の性質、ＨＧＨ遺伝子系統群のその内
の染色体位置およびそれはインビトロでは発現され得る
こと（３３）から、それは機能的であることを示してい
る。
【００３８】可能な制御配列 ＨＧＨ遺伝子の発現は糖質コルチコイドおよび甲状腺ホ
ルモンによってコントロールされている。培養ラット脳
下垂体細胞では、両タイプのホルモンはラットＧＨおよ
びそのmＲＮＡの生産に関して協力作用を持っている
（３８、３９）。この様なホルモンの作用は、応答遺伝
子の近くに位置している特定のＤＮＡ配列に相互作用す
ると思われるレセプター蛋白質によって媒介される。最
近、ホルモンによるＨＧＨ−Ｎ遺伝子の転写およびＨＧ
Ｈ合成が、それぞれヒトゲノム２.６kbＥcoＲＩフラグ
メントで形質転換したネズミの繊維芽細胞で立証され得
る様になった（３４）。ホルモン誘発に関与する配列
は、２.６kbＤＮＡからの相当する断片をチミジンキナ
ーゼ遺伝子に融合し、この遺伝子をデキサメタゾン（de
xamethasone）応答性とする（３４）ことによって示さ
れる様に、５'−末端側領域の５００塩基対の内に含ま
れている。
【００３９】最近のモデルによれば、この領域は糖質コ
ルチコイドレセプター−ホルモン複合体の特異的結合の
為の配列要素を提供している（４０）。この様な特異な
相互作用はＭＭＴＶ ＤＮＡおよび純化レセプター蛋白
質（４１）で立証することができたが、それぞれの結合
サイトは未だ分析されておらず、該当する配列の性質は
推測の域を出ない。この様に、ＨＧＨ−Ｎ遺伝子の５'
−末端側配列にある顕著な特徴はいずれも、レセプター
認識に於いて役割を果たしていよう。これらの特徴は、
プリンに富んだヌクレオチド連鎖および回文構造にあ
る。
【００４０】ゴールドシュタイン−ホグネス（Ｇoldste
in−Ｈogness）ボックスは、例えば、その１４だけがピ
リミジンである６２ヌクレオチド（−８１〜−２０、図
２〜５）の連鎖末端の近くにある。この様な平均してい
ないプリンとピリミジンの分布によってヘリックス（ら
せん）が不安定化し、ホルモンによって媒介される転写
誘導に関与している可能性のあるＤＮＡ鎖の局部的融解
（melting）が促進されるのかもしれない。この領域
は、他の遺伝子に見られるＣＡＴボックスの位置にまた
がっているが（２１）、ＴＡＴＡボックスから適当な位
置での、コンセンサス配列との良好な適合性は検出する
ことができない。この位置での配列は転写開始の速度
（rate）と関係していると思われるので（４２、４
３）、他の系との相同性に欠けることが、ＨＧＨ−Ｎ遺
伝子の転写制御の特別な形となって現われているのかも
知れない。
【００４１】回文および反転反復のある長い領域は、−
３０４〜−１９８ヌクレオチドの間にある。中央付近に
１５（−２７８〜−２６４）および１７（−２３８〜−
２２２）塩基対の２つの不完全な反転反復配列があり、
これはプリンに非常に富んでいる部分を含有している２
５塩基対によって分離されている。各々の反転反復は２
つの部分、即ちその対応物と完全な相同性の６および７
塩基長さであるが、１つの反復では２ヌクレオチド、他
の反復では４ヌクレオチド離れているものから構成され
ている。その近く（−２９０〜−２８５、−２６５〜−
２６０および−２１３〜−２０５）に３つの回文が存在
し、その２つが、全領域の始まりおよび終りに位置する
１５ヌクレオチド長さの不完全反転反復（−３０４〜−
２９０および−１９８〜−２１２）と重複している。
【００４２】約８０塩基対上流に、３４ヌクレオチドの
内３１がプリンである、もう１つの極めてプリンに富ん
だ配列（−３７１〜−３５８）がある。この領域の中央
に、配列ＧＧＡＴＡＧの繰り返しがあり、その単一のコ
ピーが３８塩基対下流（−３２１〜−３２８）の相補鎖
に存在する。回文構造や反転反復の様な一対の対称を見
せる配列要素は、その様なＤＮＡ構造が原核細胞の遺伝
子発現の制御に関係していることが知られているので
（４４）、ホルモンレセプターと相互作用する可能性の
ある１つの候補である。
【００４３】プリンに富んだ領域は、ＨＧＨ遺伝子のイ
ントロンにも見い出され、それらのあるものは他のホル
モン−応答配列（例えばＭＭＴＶ（４５）、ラットＧＨ
遺伝子（２４）およびマウスのメタロチオニン遺伝子
（２２）など）の小さな領域と相同を示すことは注目に
値する。この様な相同性が偶然によるものかホルモン−
応答遺伝子発現に関係しているものかは明らかにされて
いない。
【００４４】細胞培養に於ける遺伝子の発現 以下に発現ベクター、psv−ＨＧＨ−Ｖによる、ＨＧＨ
−ＶmＲＮＡの単離法および手段について説明する。Ｓ
Ｖ４０起源を含む３４２塩基対ＨindIII-ＰvuIIフラグ
メントをＥcoＲＩ制限サイト境界（bound）フラグメン
トに変換した。ＨindIIIサイトを、合成オリゴマー
（５'dＡＧＣＴＧＡＡＴＴＣ）を付加して変換し、Ｐvu
IIサイトは鈍感末端リゲーションにより変換し、ポリメ
ラーゼＩを用いて満たしたＥcoＲＩサイトにした（Ｋle
nowフラグメント）。得られたＥcoＲＩフラグメントをp
ＭＬ−１（２）のＥcoＲＩサイトに挿入した。ampR遺伝
子から離れて位置するＳＶ４０遅発（late）プロモータ
ーを持ったプラスミドを、pＭＬ−１のampR遺伝子（４
６）に最も近いＥcoＲＩサイトを除去することにより更
に改変した。
【００４５】クローンしたＨＢＶ ＤＮＡの１０２３塩
基対ＨpaＩ−ＢglIIフラグメント（４７）を単離し、肝
炎Ｂウイルス（ＨＶＢ）のＨpaＩサイトを、合成オリゴ
マー（５'−dＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣ）でＥcoＲＩサイト
に変換した。このＥcoＲＩ−ＢglII境界フラグメント
を、ＳＶ４０の起源を保持している上記プラスミドのＥ
coＲＩ−ＢamＨＩサイトに直接クローンした。残ってい
るＥcoＲＩサイトに、ＰstＩ末端をＥcoＲＩ末端に変換
した後、ｐ６９の１２５０塩基対ＰstＩフラグメント上
のＨＧＨ−Ｖ遺伝子を挿入した。ＳＶ４０の遅発プロモ
ーターがＨＧＨ−Ｖの構造遺伝子の前にあるクローンを
単離した。次いで、ＤＥＡＥ−デキストランの存在下で
のトランスフェクションを８時間行なう様に改良したＤ
ＥＡＥ−デキストラン技術（４８）を使って、得られた
プラスミドを組織培養細胞に導入した（Ｇluzmanら、Ｇ
old Ｓpring Ｈarbor Ｓym.Ｑuant.Ｂiol.４４、２９
３、（１９８０））。細胞培質は２〜３日毎に交換し
た。バイオアッセイ用として、毎日２００μlを採取し
た。トランスフェクション３〜４日後に分析した試料の
代表的収量は３００〜５００ng／mlであった。
【００４６】ヒト成長ホルモン変異体を暗号化している
ＤＮＡは、酵素的に合成したＤＮＡと共に化学的に合成
したＤＮＡを使って組みたてることができ、細胞培養で
蛋白質を発現するのに使用することができる。異種ポリ
ペプチドを暗号化しているこの雑種ＤＮＡは、mＲＮＡ
の逆転写によってその実質的な部分、好ましくは大部分
が供給されるが、残りは化学合成によって供給される。
好ましい態様では、ヒト成長ホルモン変異体（ＨＧＨ−
Ｖ）の最初の２４アミノ酸を暗号化している合成ＤＮＡ
を、ＨＧＨ−Ｖアミノ酸２３および２４に相当するＤＮ
Ａにエンドヌクレアーゼ制限サイトを挿入するという計
画に従って組み立てる。これは、下流のＨＧＨ−ＶcＤ
ＮＡ配列との連結を促進する為に行なう。このＤＮＡの
合成部分を作り上げる種々のオリゴヌクレオチドフラグ
メントは、遺伝子合成のための既知の基準に従って選択
される：フラグメントの、互いの不適当な相補性を避け
ること（勿論、２本鎖配列の反対区分を占めることが決
められているものは除く）；転写終了を最小限にするた
めにＡＴに富んだ領域を避けること；および微生物にと
って好ましいコドンを選ぶこと。合成に続いて、フラグ
メントを相補的に水素結合させ、自体既知の方法で結合
（リゲーション）させる。
【００４７】このＤＮＡ暗号配列の大部分は、記述した
様にゲノムＤＮＡから得ることができる。この部分はポ
リペプチドのＣ−末端を暗号化しており、本明細書に従
い、適当な場所に位置する翻訳開始信号および停止信
号、リボゾーム結合サイトを含む上流ＤＮＡおよび、得
られるメッセンジャーＲＮＡの最初のヌクレオチド（＋
１）を所望により包含している化学合成によって得られ
る残りの暗号配列に結合させる。この合成フラグメント
は、翻訳に際して制限を課せられる二次構造を避けるた
めに、相当するメッセンジャーＲＮＡのコンフォメーシ
ョンに従ってヌクレオチドを選択することにより設計す
ることができる。
【００４８】以下に本明細書中で引用した文献を列挙す
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Ｇoodman,Ｈ.Ｍ.およびＢaxter,Ｊ.Ｄ.，Ｐroc.Ｎatn.
Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.，７４,４２９３−４２９５（１
９７７）． ４０．Ｙamamoto,Ｋ.Ｒ.およびＡlberts,Ｂ.Ｍ.，Ａnnu
al Ｒev.Ｂiochem.，４５,７２１−７４６（１９７
６）．
【００５２】４１．Ｐayvar,Ｆ.ら，Ｐroc.Ｎatn.Ａca
d.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.，７８,６６２８−６６３２（１９８
１）． ４２．Ｇrosschedl,Ｒ.およびＢirnstiel,Ｍ.Ｌ.，Ｐro
c.Ｎatn.Ａcad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.，７７,１４３２−１４
３６（１９８０）． ４３．Ｍcknight,Ｓ.Ｌ.,Ｇavis,Ｅ.Ｒ.,Ｋingsbury,
Ｒ.およびＡxel.Ｒ.，Ｃell ２５,３８５−３９８（１
９８１）． ４４．Ｇilbert,Ｗ.およびＭaxam,Ａ.，Ｐroc.Ｎatn.Ａ
cad.Ｓci.Ｕ.Ｓ.Ａ.，７０,３５８１−３５８５（１９
７３）． ４５．Ｄonehower,Ｌ.Ａ.,Ｈuang,Ａ.Ｌ.およびＨager,
Ｇ.Ｌ.，Ｊ.Ｖirology３７,２２６−２３８（１９８
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Ｆieldsら），Ａcademic Ｐress,ＮＹ（１９８０），
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５１（１９６８）．
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＨＧＨ遺伝子系統群のメンバーを含んでいる
３個のヒトのゲノムＤＮＡフラグメントの機能編制およ
び制限地図を示す模式図。
【図２】 ２個のＨＧＨ遺伝子および１つのＨＣＳ遺伝
子のヌクレオチド配列を示す模式図。
【図３】 ２個のＨＧＨ遺伝子および１つのＨＣＳ遺伝
子のヌクレオチド配列を示す模式図。
【図４】 ２個のＨＧＨ遺伝子および１つのＨＣＳ遺伝
子のヌクレオチド配列を示す模式図。
【図５】 ２個のＨＧＨ遺伝子および１つのＨＣＳ遺伝
子のヌクレオチド配列を示す模式図。
【図６】 １個のＨＧＨ変異アミノ酸およびヌクレオチ
ドの配列を示す模式図。
【図７】 ＨＧＨ変異蛋白質を暗号化している遺伝子を
担持している細胞培養発現ベクターの組み立てを示す模
式図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/27 ＡＥＦ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＥＦ

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下に示すアミノ酸配列を持ったヒト成
    長ホルモン変異蛋白質をコードしているＤＮＡを得る方
    法であって、 ａ）ゲノムＤＮＡをプローブして該蛋白質の遺伝子を含
    むゲノム部分を得、 ｂ）工程ａ）のゲノム部分を細菌宿主細胞に挿入し、こ
    れを相当するmＲＮＡに転写せしめ、 ｃ）工程ｂ）のmＲＮＡからcＤＮＡバンクを創造し、該
    ヒト成長ホルモン変異蛋白質をコードしているＤＮＡ配
    列をプローブすることにより該ヒト成長ホルモン変異蛋
    白質をコードしているＤＮＡを単離することからなる方
    法： 【化４】 phe pro thr ile pro leu ser arg leu phe asp asn ala met leu arg ala arg arg leu tyr gln leu ala tyr asp thr tyr gln glu phe glu glu ala tyr ile leu lys glu gln lys tyr ser phe leu gln asn pro gln thr ser leu cys phe ser glu ser ile pro thr pro ser asn arg val lys thr gln gln lys ser asn leu glu leu leu arg ile ser leu leu leu ile gln ser trp leu glu pro val gln leu leu arg ser val phe ala asn ser leu val tyr gly ala ser asp ser asn val tyr arg his leu lys asp leu glu glu gly ile gln thr leu met trp arg leu glu asp gly ser pro arg thr gly gln ile phe asn-グリコシル化部位 gln ser tyr ser lys phe asp thr lys ser his asn asp asp ala leu leu lys asn tyr gly leu leu tyr cys phe arg lys asp met asp lys val glu thr phe leu arg ile val gln cys arg ser val glu gly ser cys gly phe.
  2. 【請求項２】 ＨＧＨ−ＶcＤＮＡを産生するのに有用
    な請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 工程ａ）のゲノム部分を許容Ｃos細胞ベ
    クター内に統合する請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 以下に示すアミノ酸配列を持ったヒト成
    長ホルモン変異蛋白質をコードしているＤＮＡ。 【化１】 phe pro thr ile pro leu ser arg leu phe asp asn ala met leu arg ala arg arg leu tyr gln leu ala tyr asp thr tyr gln glu phe glu glu ala tyr ile leu lys glu gln lys tyr ser phe leu gln asn pro gln thr ser leu cys phe ser glu ser ile pro thr pro ser asn arg val lys thr gln gln lys ser asn leu glu leu leu arg ile ser leu leu leu ile gln ser trp leu glu pro val gln leu leu arg ser val phe ala asn ser leu val tyr gly ala ser asp ser asn val tyr arg his leu lys asp leu glu glu gly ile gln thr leu met trp arg leu glu asp gly ser pro arg thr gly gln ile phe asn-グリコシル化部位 gln ser tyr ser lys phe asp thr lys ser his asn asp asp ala leu leu lys asn tyr gly leu leu tyr cys phe arg lys asp met asp lys val glu thr phe leu arg ile val gln cys arg ser val glu gly ser cys gly phe.
  5. 【請求項５】 以下に示すアミノ末端前配列をもコード
    している請求項４に記載のＤＮＡ。 【化２】 met ala ala gly ser arg thr ser leu leu leu ala phe gly leu leu cys leu ser trp leu gln glu gly ser ala.
  6. 【請求項６】 以下に示すアミノ酸配列を持ったヒト成
    長ホルモン変異蛋白質をコードしているＤＮＡを含有し
    ている複製可能なクローニングビヒクル： 【化５】 phe pro thr ile pro leu ser arg leu phe asp asn ala met leu arg ala arg arg leu tyr gln leu ala tyr asp thr tyr gln glu phe glu glu ala tyr ile leu lys glu gln lys tyr ser phe leu gln asn pro gln thr ser leu cys phe ser glu ser ile pro thr pro ser asn arg val lys thr gln gln lys ser asn leu glu leu leu arg ile ser leu leu leu ile gln ser trp leu glu pro val gln leu leu arg ser val phe ala asn ser leu val tyr gly ala ser asp ser asn val tyr arg his leu lys asp leu glu glu gly ile gln thr leu met trp arg leu glu asp gly ser pro arg thr gly gln ile phe asn-グリコシル化部位 gln ser tyr ser lys phe asp thr lys ser his asn asp asp ala leu leu lys asn tyr gly leu leu tyr cys phe arg lys asp met asp lys val glu thr phe leu arg ile val gln cys arg ser val glu gly ser cys gly phe.
  7. 【請求項７】 発現をもたらすＤＮＡ配列に作働し得る
    様に結合させた、翻訳の開始および停止信号を側端に持
    つ、以下に示すアミノ酸配列を持ったヒト成長ホルモン
    変異蛋白質をコードしているＤＮＡを含有してなる発現
    ベクター： 【化６】 phe pro thr ile pro leu ser arg leu phe asp asn ala met leu arg ala arg arg leu tyr gln leu ala tyr asp thr tyr gln glu phe glu glu ala tyr ile leu lys glu gln lys tyr ser phe leu gln asn pro gln thr ser leu cys phe ser glu ser ile pro thr pro ser asn arg val lys thr gln gln lys ser asn leu glu leu leu arg ile ser leu leu leu ile gln ser trp leu glu pro val gln leu leu arg ser val phe ala asn ser leu val tyr gly ala ser asp ser asn val tyr arg his leu lys asp leu glu glu gly ile gln thr leu met trp arg leu glu asp gly ser pro arg thr gly gln ile phe asn-グリコシル化部位 gln ser tyr ser lys phe asp thr lys ser his asn asp asp ala leu leu lys asn tyr gly leu leu tyr cys phe arg lys asp met asp lys val glu thr phe leu arg ile val gln cys arg ser val glu gly ser cys gly phe.
  8. 【請求項８】 発現をもたらすＤＮＡ配列に作働し得る
    様に結合させた、翻訳の開始および停止信号を側端に持
    つ、以下に示すアミノ酸配列を持ったヒト成長ホルモン
    変異蛋白質をコードしているＤＮＡを含有してなる発現
    ベクターで形質転換された生育可能な哺乳動物細胞： 【化７】 phe pro thr ile pro leu ser arg leu phe asp asn ala met leu arg ala arg arg leu tyr gln leu ala tyr asp thr tyr gln glu phe glu glu ala tyr ile leu lys glu gln lys tyr ser phe leu gln asn pro gln thr ser leu cys phe ser glu ser ile pro thr pro ser asn arg val lys thr gln gln lys ser asn leu glu leu leu arg ile ser leu leu leu ile gln ser trp leu glu pro val gln leu leu arg ser val phe ala asn ser leu val tyr gly ala ser asp ser asn val tyr arg his leu lys asp leu glu glu gly ile gln thr leu met trp arg leu glu asp gly ser pro arg thr gly gln ile phe asn-グリコシル化部位 gln ser tyr ser lys phe asp thr lys ser his asn asp asp ala leu leu lys asn tyr gly leu leu tyr cys phe arg lys asp met asp lys val glu thr phe leu arg ile val gln cys arg ser val glu gly ser cys gly phe.
  9. 【請求項９】 以下に示すアミノ酸配列を持ったヒト成
    長ホルモン変異蛋白質を生産し得る請求項８に記載の哺
    乳動物細胞： 【化８】 phe pro thr ile pro leu ser arg leu phe asp asn ala met leu arg ala arg arg leu tyr gln leu ala tyr asp thr tyr gln glu phe glu glu ala tyr ile leu lys glu gln lys tyr ser phe leu gln asn pro gln thr ser leu cys phe ser glu ser ile pro thr pro ser asn arg val lys thr gln gln lys ser asn leu glu leu leu arg ile ser leu leu leu ile gln ser trp leu glu pro val gln leu leu arg ser val phe ala asn ser leu val tyr gly ala ser asp ser asn val tyr arg his leu lys asp leu glu glu gly ile gln thr leu met trp arg leu glu asp gly ser pro arg thr gly gln ile phe asn-グリコシル化部位 gln ser tyr ser lys phe asp thr lys ser his asn asp asp ala leu leu lys asn tyr gly leu leu tyr cys phe arg lys asp met asp lys val glu thr phe leu arg ile val gln cys arg ser val glu gly ser cys gly phe.
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