JPH0775556B2 - Ｌｄｈアイソザイムのｌｄｈ▲下１▼の分別定量法 - Google Patents
Ｌｄｈアイソザイムのｌｄｈ▲下１▼の分別定量法Info
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- JPH0775556B2 JPH0775556B2 JP63177579A JP17757988A JPH0775556B2 JP H0775556 B2 JPH0775556 B2 JP H0775556B2 JP 63177579 A JP63177579 A JP 63177579A JP 17757988 A JP17757988 A JP 17757988A JP H0775556 B2 JPH0775556 B2 JP H0775556B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、主として臨床検査の分野での利用を目的とし
たLDHアイソザイムのLDH1の分別定量法に関する。
たLDHアイソザイムのLDH1の分別定量法に関する。
（従来の技術） LDH（乳酸脱水素酵素）アイソザイムには、LDH1〜LDH5
の５つの分画からなるアイソザイムがあり、臓器により
構成パターンが異なることから、臨床的には血清LDHア
イソザイムの分別定量によって臓器診断の手がかりにな
るとされている。
の５つの分画からなるアイソザイムがあり、臓器により
構成パターンが異なることから、臨床的には血清LDHア
イソザイムの分別定量によって臓器診断の手がかりにな
るとされている。
中でも、心筋に最も多く含まれているLDH1は、心筋梗塞
症になると心筋から血液中に逸脱して来るため、血清中
のLDH1の測定は心筋梗塞の発作や予後の観察における臨
床的意義が高い。
症になると心筋から血液中に逸脱して来るため、血清中
のLDH1の測定は心筋梗塞の発作や予後の観察における臨
床的意義が高い。
従来LDHアイソザイムの測定法として最もよく知られて
いるものに電気泳動法がある。電気泳動法では易動度が
早い順にLDH1〜LDH5が分別される。この電気泳動法のほ
かには免疫化学的方法が知られているが、最近では補酵
素の誘導体を用いる方法（特公昭58−6477号）やアルカ
リ処理をする方法（特公昭60−28280号および特開昭62
−278997号）などがある。
いるものに電気泳動法がある。電気泳動法では易動度が
早い順にLDH1〜LDH5が分別される。この電気泳動法のほ
かには免疫化学的方法が知られているが、最近では補酵
素の誘導体を用いる方法（特公昭58−6477号）やアルカ
リ処理をする方法（特公昭60−28280号および特開昭62
−278997号）などがある。
（発明が解決しようとする課題） しかしながら、このような電気泳動法や免疫化学的方法
では、測定のための操作が煩雑である上、その操作に要
する時間も長いため、臨床検査で日常用いる自動分析装
置には適用できないという問題がある。更に、電気泳動
法は、アイソザイムの分別精度が低いということも指摘
されており、アイソザイムを分別定量する上で問題とな
っている。
では、測定のための操作が煩雑である上、その操作に要
する時間も長いため、臨床検査で日常用いる自動分析装
置には適用できないという問題がある。更に、電気泳動
法は、アイソザイムの分別精度が低いということも指摘
されており、アイソザイムを分別定量する上で問題とな
っている。
次に、補酵素の誘導体を用いる方法は、Ｈサブユニット
とＭサブユニットの存在比を測定するのに適した方法で
あり、厳密な意味でのLDHアイソザイムの分別測定とは
異なる。アルカリ処理をする方法では、LDH1以外のLDH
アイソザイムを失活させる際にLDH1も50％以下に失活さ
せてしまう問題が残ると共に、反応時間が長く操作が煩
雑であるという欠点もみられる。
とＭサブユニットの存在比を測定するのに適した方法で
あり、厳密な意味でのLDHアイソザイムの分別測定とは
異なる。アルカリ処理をする方法では、LDH1以外のLDH
アイソザイムを失活させる際にLDH1も50％以下に失活さ
せてしまう問題が残ると共に、反応時間が長く操作が煩
雑であるという欠点もみられる。
本発明の目的は、このような問題を解決し、日常の臨床
検査を有用なものとして利用できるLDHアイソザイムのL
DH1の分別定量の方法を供することにある。
検査を有用なものとして利用できるLDHアイソザイムのL
DH1の分別定量の方法を供することにある。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは、このような問題点を解決し、上述の目的
を達成するために鋭意研究をすすめた結果、蛋白質変性
剤の存在下でプロテアーゼの作用によりLDHアイソザイ
ムのLDH2、LDH3、LDH4およびLDH5を特異的に阻害する反
応系を用いることにより、LDH1が分別定量できることを
見い出し、本発明を完成した。
を達成するために鋭意研究をすすめた結果、蛋白質変性
剤の存在下でプロテアーゼの作用によりLDHアイソザイ
ムのLDH2、LDH3、LDH4およびLDH5を特異的に阻害する反
応系を用いることにより、LDH1が分別定量できることを
見い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明の要旨は、試料、とりわけ臨床検査で
用いるような血清、血漿などの検体中に含まれているLD
HアイソザイムのLDH1を分別定量するにあたり、蛋白質
変性剤の存在下でプロテアーゼ作用によりLDHアイソザ
イム群中のLDH2、LDH3、LDH4およびLDH5を特異的に阻害
する反応系を用いることを特徴とするLDHアイソザイム
のLDH1の分別定量法に存する。
用いるような血清、血漿などの検体中に含まれているLD
HアイソザイムのLDH1を分別定量するにあたり、蛋白質
変性剤の存在下でプロテアーゼ作用によりLDHアイソザ
イム群中のLDH2、LDH3、LDH4およびLDH5を特異的に阻害
する反応系を用いることを特徴とするLDHアイソザイム
のLDH1の分別定量法に存する。
本発明の方法に用いるプロテアーゼとしては、本発明の
作用を有するものならば公知のすべてのものが使用でき
る。そのようなプロテアーゼの例として、α−キモトリ
プシン（α−chymotrypsin）、トリプシン（trypsi
n）、トロンビン（thrombin）、エラスターゼ（elastas
e）、エンドプロテアーゼ（endoprotease）、ズブチリ
シン（subtilisin）、ブロメライン（bromelain）、パ
パイン（papain）、カルボキシペプシターゼ（carboxy
peptidase）、プロナーゼ（pronase）などが挙げられ
る。更に、特開昭60−149399号公報に開示されたプロテ
アーゼ類も使用できる。
作用を有するものならば公知のすべてのものが使用でき
る。そのようなプロテアーゼの例として、α−キモトリ
プシン（α−chymotrypsin）、トリプシン（trypsi
n）、トロンビン（thrombin）、エラスターゼ（elastas
e）、エンドプロテアーゼ（endoprotease）、ズブチリ
シン（subtilisin）、ブロメライン（bromelain）、パ
パイン（papain）、カルボキシペプシターゼ（carboxy
peptidase）、プロナーゼ（pronase）などが挙げられ
る。更に、特開昭60−149399号公報に開示されたプロテ
アーゼ類も使用できる。
本発明で用いるプロテアーゼの量は、測定条件によって
変化させることができるが、例えばα−キモトリプシン
の場合では10〜1,000単位/mlを用いることができる。
変化させることができるが、例えばα−キモトリプシン
の場合では10〜1,000単位/mlを用いることができる。
また本発明は蛋白質変性剤の存在下で当該阻害反応をす
すめるものである。このような蛋白質変性剤としては、
本発明の作用を有するものならば公知のすべてのものが
使用できる。そのような蛋白質変性剤の例として、コー
ル酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオ
キシコール酸、グアニジン（塩酸塩）、トリクロロ酢
酸、尿素、チオ尿素、チオシアン酸塩等が好ましい。こ
のような蛋白質変性剤は単独又は複数個を組合せて用い
ることができる。
すめるものである。このような蛋白質変性剤としては、
本発明の作用を有するものならば公知のすべてのものが
使用できる。そのような蛋白質変性剤の例として、コー
ル酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオ
キシコール酸、グアニジン（塩酸塩）、トリクロロ酢
酸、尿素、チオ尿素、チオシアン酸塩等が好ましい。こ
のような蛋白質変性剤は単独又は複数個を組合せて用い
ることができる。
本発明で用いる蛋白質変性剤の量は、測定条件によって
変化させることができるが、例えばグアニジンの場合で
は、0.05〜5Mを用いることができる。
変化させることができるが、例えばグアニジンの場合で
は、0.05〜5Mを用いることができる。
本発明の方法によりLDHアイソザイムのLDH1を分別定量
するにあたり、阻害されずに残った目的とするLDH1を定
量するには、公知の酵素活性の定量法が利用できる。そ
れには発色性の色原体を用いたり、又は縮合反応による
色素の生成を用いたりすることによる可視部域での吸光
度を測定する方法と、補酵素NADHなどを用いて紫外部域
での吸光度を測定する方法等に種別できる。これらの方
法は臨床検査の分野でも現在広く使われており、それら
は操作上簡易でかつその反応時間も短く、また測定精
度、感度、正確度等、性能上でも優れているものが多く
知られており、これらのうちから適切なものを選択して
本発明に適応することができる。
するにあたり、阻害されずに残った目的とするLDH1を定
量するには、公知の酵素活性の定量法が利用できる。そ
れには発色性の色原体を用いたり、又は縮合反応による
色素の生成を用いたりすることによる可視部域での吸光
度を測定する方法と、補酵素NADHなどを用いて紫外部域
での吸光度を測定する方法等に種別できる。これらの方
法は臨床検査の分野でも現在広く使われており、それら
は操作上簡易でかつその反応時間も短く、また測定精
度、感度、正確度等、性能上でも優れているものが多く
知られており、これらのうちから適切なものを選択して
本発明に適応することができる。
（実施例） 以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明
はこれらに限定されるものではない。
はこれらに限定されるものではない。
実施例１ 検体としてヒト血液を精製して調製したLDH1〜LDH5各ア
イソザイムの標準品を各0.04mlとり、それぞれにα−キ
モトリプシン450単位/mlと0.65Mグアニジンを含む各種
のpH（pH6、７、８、９、10、11）に調整した緩衝液（M
ES、PIPES、Tris、CHES、CAPS等で調製）を0.2ml加え、
37℃で５分間反応させた。反応後、2mMピルビン酸ナト
リウム及び0.2mM−NADHを含む0.1M Tris緩衝液からなる
酵素定量用試薬を2.5ml加えてpH7.8に補正し、波長340n
mにおける１分間あたりの吸光度変化量を求めた。そし
て、それぞれの残存活性率（％）を計算することにより
第１表のような結果が得られた。
イソザイムの標準品を各0.04mlとり、それぞれにα−キ
モトリプシン450単位/mlと0.65Mグアニジンを含む各種
のpH（pH6、７、８、９、10、11）に調整した緩衝液（M
ES、PIPES、Tris、CHES、CAPS等で調製）を0.2ml加え、
37℃で５分間反応させた。反応後、2mMピルビン酸ナト
リウム及び0.2mM−NADHを含む0.1M Tris緩衝液からなる
酵素定量用試薬を2.5ml加えてpH7.8に補正し、波長340n
mにおける１分間あたりの吸光度変化量を求めた。そし
て、それぞれの残存活性率（％）を計算することにより
第１表のような結果が得られた。
この結果、本発明の方法は広いpH域でLDH1が分別できる
ことがわかり、公知の酵素活性定量法として最も良く知
られ、反応は中性付近で行うロブレウスキー（Wroblews
ki）法にも本発明の方法はpHを補正せずにそのまま用い
ることができることが示された。
ことがわかり、公知の酵素活性定量法として最も良く知
られ、反応は中性付近で行うロブレウスキー（Wroblews
ki）法にも本発明の方法はpHを補正せずにそのまま用い
ることができることが示された。
実施例２ 検体として実施例１で用いたLDH1〜LDH5各アイソザイム
の標準品を各0.04mlとり、それぞれにズブチリシン５単
位/mlとデオキシコール酸ナトリウム1.5％を含む0.1M T
ris緩衝液（pH7.8）を0.2ml加え、37℃で５分間反応さ
せた。反応後、2mMピルビン酸ナトリウム及び0.2mM−NA
DHを含む0.1M Tris緩衝液（pH7.8）からなる酵素定量用
試薬を0.5ml加え、波長340nmにおける１分間あたりの吸
光度変化量を求めた。そして、それぞれの残存活性率
（％）を計算することにより第２表のような結果が得ら
れ、LDH1が分別定量できることがわかった。
の標準品を各0.04mlとり、それぞれにズブチリシン５単
位/mlとデオキシコール酸ナトリウム1.5％を含む0.1M T
ris緩衝液（pH7.8）を0.2ml加え、37℃で５分間反応さ
せた。反応後、2mMピルビン酸ナトリウム及び0.2mM−NA
DHを含む0.1M Tris緩衝液（pH7.8）からなる酵素定量用
試薬を0.5ml加え、波長340nmにおける１分間あたりの吸
光度変化量を求めた。そして、それぞれの残存活性率
（％）を計算することにより第２表のような結果が得ら
れ、LDH1が分別定量できることがわかった。
実施例３ 検体として総LDH活性値が既知のヒト血清15例を各0.04m
lとり、以下実施例２と同様にして吸光度変化量を求め
た。そしてこれをあらかじめ活性既知のLDHの検量線か
ら活性に換算した。ここで分別定量したLDH1に対して公
知の免疫化学的方法（ロッシュ社：アイソミューン（Is
omune）−LDを使用）で測定したLDH1の活性を比較した
ところ、第３表のような良好な相関関係が得られた。
lとり、以下実施例２と同様にして吸光度変化量を求め
た。そしてこれをあらかじめ活性既知のLDHの検量線か
ら活性に換算した。ここで分別定量したLDH1に対して公
知の免疫化学的方法（ロッシュ社：アイソミューン（Is
omune）−LDを使用）で測定したLDH1の活性を比較した
ところ、第３表のような良好な相関関係が得られた。
実施例４ 0.5M グアニジン塩酸塩、２％ トリトン Ｘ−405お
よび各種プロテアーゼ類を含む50mM MES緩衝液（pH6.
0）75μに、LDH1〜５の標準品10μを加え、37℃で
５分間反応させた。
よび各種プロテアーゼ類を含む50mM MES緩衝液（pH6.
0）75μに、LDH1〜５の標準品10μを加え、37℃で
５分間反応させた。
反応後、2mMピルビン酸ナトリウムおよび0.2mM NADHを
含む0.1Mトリス緩衝液（pH8.0）からなる酵素定量用試
薬を400μ加え、波長340nmにおける１分間あたりの吸
光度変化量を求めた。そして、それぞれの残存活性率
（％）を計算することにより次表に示す結果を得た。こ
の結果から、LDHが分別定量できることがわかった。
含む0.1Mトリス緩衝液（pH8.0）からなる酵素定量用試
薬を400μ加え、波長340nmにおける１分間あたりの吸
光度変化量を求めた。そして、それぞれの残存活性率
（％）を計算することにより次表に示す結果を得た。こ
の結果から、LDHが分別定量できることがわかった。
実施例５ 実施例１の条件中α−キモトリプシンのみを使用した場
合とグアニジンのみを使用した場合を比較検討するため
に、pH8.0の0.1M Tirs緩衝液を用いて同様な実験をし
た。
合とグアニジンのみを使用した場合を比較検討するため
に、pH8.0の0.1M Tirs緩衝液を用いて同様な実験をし
た。
即ち、LDH1〜LDH5の各アイソザイムの標準品を0.04mlと
り、それぞれに0.65Mのグアニジンあるいは450単位のα
−キモトリプシンを含む緩衝液を0.2ml加え、37℃で５
分間反応させた。更に、2mMピルビン酸ナトリウム及び
0.2mM−NADHを含む0.1M Tris緩衝液からなる酵素定量用
試薬を各々に2.5ml加えて、pH7.8に補正し、波長340nm
における１分間当たりの吸光度変化量を求めた。そし
て、それぞれの残存活性率（％）を計算することにより
第５表のような結果が得られた。いずれの場合もLDH2〜
LDH5の明らかな失活が見られず、本発明において蛋白変
性剤の存在下でプロテアーゼを作用させる必要があるこ
とが確認された。
り、それぞれに0.65Mのグアニジンあるいは450単位のα
−キモトリプシンを含む緩衝液を0.2ml加え、37℃で５
分間反応させた。更に、2mMピルビン酸ナトリウム及び
0.2mM−NADHを含む0.1M Tris緩衝液からなる酵素定量用
試薬を各々に2.5ml加えて、pH7.8に補正し、波長340nm
における１分間当たりの吸光度変化量を求めた。そし
て、それぞれの残存活性率（％）を計算することにより
第５表のような結果が得られた。いずれの場合もLDH2〜
LDH5の明らかな失活が見られず、本発明において蛋白変
性剤の存在下でプロテアーゼを作用させる必要があるこ
とが確認された。
（発明の効果） 本発明の方法である蛋白質変性剤の存在下でのプロテア
ーゼ作用に係る反応系はそれ自体操作が簡易でかつ短時
間で行うことができるものである上、広いpH域で反応さ
せることができるので、公知の酵素活性の定量法との組
合せを容易にすることができる。例えば、最もよく知ら
れているロブレウスキー（Wroblewski）法のような中性
付近で反応させる方法に対しても、アルカリ処理による
方法のように煩雑なpHの補正を行なわずに最初からpHを
一致させた条件に設定できる。そのため本発明は、LDH
アイソザイムのLDH1の分別定量法として一連の操作も簡
易で短時間に行うことができる。
ーゼ作用に係る反応系はそれ自体操作が簡易でかつ短時
間で行うことができるものである上、広いpH域で反応さ
せることができるので、公知の酵素活性の定量法との組
合せを容易にすることができる。例えば、最もよく知ら
れているロブレウスキー（Wroblewski）法のような中性
付近で反応させる方法に対しても、アルカリ処理による
方法のように煩雑なpHの補正を行なわずに最初からpHを
一致させた条件に設定できる。そのため本発明は、LDH
アイソザイムのLDH1の分別定量法として一連の操作も簡
易で短時間に行うことができる。
従って本発明によりアイソザイムを分別定量する方法
は、臨床検査の分野で利用するとき自動分析装置へも応
用できる。特に近年、臨床検査は自動化がすすみ、自動
分析装置の使用頻度が高まっているため、本発明は日常
の臨床検査で有用なものとしての効果が大きい。
は、臨床検査の分野で利用するとき自動分析装置へも応
用できる。特に近年、臨床検査は自動化がすすみ、自動
分析装置の使用頻度が高まっているため、本発明は日常
の臨床検査で有用なものとしての効果が大きい。
Claims (1)
- 【請求項１】蛋白質変性剤の存在下でプロテアーゼ作用
によりLDHアイソザイムのLDH2、LDH3、LDH4およびLDH5
を特異的に阻害する反応系を用いて該アイソザイムを阻
害し、阻害されずに残ったLDH1を定量することを特徴と
するLDHアイソザイムのLDH1の分別定量法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63177579A JPH0775556B2 (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | Ｌｄｈアイソザイムのｌｄｈ▲下１▼の分別定量法 |
| DE68919144T DE68919144T2 (de) | 1988-07-15 | 1989-07-12 | Nachweis von LDH1. |
| EP89112729A EP0352547B1 (en) | 1988-07-15 | 1989-07-12 | LDH1 assay |
| KR1019890010104A KR910005633B1 (ko) | 1988-07-15 | 1989-07-15 | Ldh₁의 분석법 |
| US08/235,238 US6242208B1 (en) | 1988-07-15 | 1994-05-02 | LDH1 assay |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63177579A JPH0775556B2 (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | Ｌｄｈアイソザイムのｌｄｈ▲下１▼の分別定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0227997A JPH0227997A (ja) | 1990-01-30 |
| JPH0775556B2 true JPH0775556B2 (ja) | 1995-08-16 |
Family
ID=16033440
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63177579A Expired - Fee Related JPH0775556B2 (ja) | 1988-07-15 | 1988-07-15 | Ｌｄｈアイソザイムのｌｄｈ▲下１▼の分別定量法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0352547B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0775556B2 (ja) |
| KR (1) | KR910005633B1 (ja) |
| DE (1) | DE68919144T2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5158873A (en) * | 1987-05-28 | 1992-10-27 | Abbott Laboratories | Method and reagent for determining LD-1 isoenzyme |
| US5364765A (en) * | 1987-05-28 | 1994-11-15 | Abbott William A | Method and reagent system for assaying isoenzyme profiles |
| IE920779A1 (en) * | 1991-03-13 | 1992-09-23 | Du Pont | Selective stabilization of lactate dehydrogenase isoenzyme¹ld1 by high molecular weight polyols |
| KR101788865B1 (ko) | 2010-12-13 | 2017-10-20 | 두산공작기계 주식회사 | 툴 매거진의 툴 캐리어 유닛 |
| CN114381494B (zh) * | 2021-12-01 | 2023-12-22 | 天津中成佳益生物科技有限公司 | 一种乳酸脱氢酶同工酶1的检测试剂及检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2513407A1 (de) * | 1975-03-26 | 1976-10-14 | Schmidt Karlheinz | Ein verfahren zur differenzierung der leber- und herzspezifischen lactatdehydrogenase im blutserum |
| US4224406A (en) * | 1978-02-27 | 1980-09-23 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunochemical LDH1 assay |
| JPH0644879B2 (ja) * | 1986-09-04 | 1994-06-15 | 栄研化学株式会社 | ヒト血清中のグルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナ−ゼアイソザイムの測定法 |
| ES2036234T3 (es) * | 1987-05-28 | 1993-05-16 | Abbott Laboratories | Un metodo para determinar la actividad de la isoenzima dl-1 de fluidos biologicos. |
-
1988
- 1988-07-15 JP JP63177579A patent/JPH0775556B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1989
- 1989-07-12 EP EP89112729A patent/EP0352547B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-07-12 DE DE68919144T patent/DE68919144T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-07-15 KR KR1019890010104A patent/KR910005633B1/ko not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE68919144T2 (de) | 1995-03-09 |
| KR900001859A (ko) | 1990-02-27 |
| JPH0227997A (ja) | 1990-01-30 |
| EP0352547A3 (en) | 1991-07-31 |
| DE68919144D1 (de) | 1994-12-08 |
| KR910005633B1 (ko) | 1991-08-01 |
| EP0352547A2 (en) | 1990-01-31 |
| EP0352547B1 (en) | 1994-11-02 |
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