JPH0777559B2 - フラクトシルトランスフェラーゼおよびその使用方法 - Google Patents
フラクトシルトランスフェラーゼおよびその使用方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明はフラクトシルジサツカライド、特にハロスクロ
ース甘味剤特に4,1′,6′−トリクロロ−4,1′−６′−
トリデオキシ−ガラクトスクロース（TGSとして知られ
る）を酵素反応により製造する方法に関する。
ース甘味剤特に4,1′,6′−トリクロロ−4,1′−６′−
トリデオキシ−ガラクトスクロース（TGSとして知られ
る）を酵素反応により製造する方法に関する。
4,1′,6′−トリクロロ−4,1′−６′−トリデオキシ−
ガラクトスクロースは英国特許第1543167号明細書に他
のクロロスクロース誘導体と共に開示されている強力な
甘味剤である。６−ヒドロキシ基がエーテル化されてい
るか存在しない類似化合物はEP0103479AおよびGB212780
6Aに記述されている。その他のハロゲン置換基を有する
類似化合物はGB2104063Aに記述されている。TGSの一製
造法はGB2079749Aおよび米国特許第4,380,476号明細書
に記載されている。この方法はスクロースの６−エステ
ル、又はスクロースの６−エステルを主として含有する
混合物を調製し、ついでこの６−置換化合物を選択的に
塩素化するものである。続いてこの６−位で脱エステル
化するとTGSが得られる。実際、化学的手段を使う場
合、特定の方法でスクロース６−エステルを好収量で得
るのは難しい。相当する６−置換グルコースおよびフラ
クトシド糖から出発して酵素反応を行ない、他の位置に
置換基を有する他のスクロースを含まない６−置換スク
ロースを得、ついで出発物質とグルコースから容易に分
離できる、６−置換スクロース誘導体からTGSを難なく
製造することができる。
ガラクトスクロースは英国特許第1543167号明細書に他
のクロロスクロース誘導体と共に開示されている強力な
甘味剤である。６−ヒドロキシ基がエーテル化されてい
るか存在しない類似化合物はEP0103479AおよびGB212780
6Aに記述されている。その他のハロゲン置換基を有する
類似化合物はGB2104063Aに記述されている。TGSの一製
造法はGB2079749Aおよび米国特許第4,380,476号明細書
に記載されている。この方法はスクロースの６−エステ
ル、又はスクロースの６−エステルを主として含有する
混合物を調製し、ついでこの６−置換化合物を選択的に
塩素化するものである。続いてこの６−位で脱エステル
化するとTGSが得られる。実際、化学的手段を使う場
合、特定の方法でスクロース６−エステルを好収量で得
るのは難しい。相当する６−置換グルコースおよびフラ
クトシド糖から出発して酵素反応を行ない、他の位置に
置換基を有する他のスクロースを含まない６−置換スク
ロースを得、ついで出発物質とグルコースから容易に分
離できる、６−置換スクロース誘導体からTGSを難なく
製造することができる。
問題の酵素はフラクトシルトランスフエラーゼである。
これは周知の酵素である。代表的酵素は所謂レバンスク
ラーゼであり、スクロース又はラフイノースを分解して
レバン、ポリフラクトース誘導体を製造するものであ
る。その通常の作用機作は、レバンスクラーゼはスクロ
ース中のグルコース−フラクトース結合を分解し、フラ
クトースをアクセプター糖例えばスクロース自体に転換
するものである。この方法は反復され、フラクトース鎖
が完成される。スクロース以外に他の糖例えばＤ−キシ
ロースが存在すると、レバンの生成が抑えられるかある
いは少なくとも減少し、その代りフラクトースは新規の
フラクトシドを製造するためにアクセプターとして作用
する他の拮抗糖（competing sugar）に転換する。この
新規フラクトシドはドナーとしても作用し、実際所望の
方向で均衡を増すために、過量のドナーが使われて来
た。
これは周知の酵素である。代表的酵素は所謂レバンスク
ラーゼであり、スクロース又はラフイノースを分解して
レバン、ポリフラクトース誘導体を製造するものであ
る。その通常の作用機作は、レバンスクラーゼはスクロ
ース中のグルコース−フラクトース結合を分解し、フラ
クトースをアクセプター糖例えばスクロース自体に転換
するものである。この方法は反復され、フラクトース鎖
が完成される。スクロース以外に他の糖例えばＤ−キシ
ロースが存在すると、レバンの生成が抑えられるかある
いは少なくとも減少し、その代りフラクトースは新規の
フラクトシドを製造するためにアクセプターとして作用
する他の拮抗糖（competing sugar）に転換する。この
新規フラクトシドはドナーとしても作用し、実際所望の
方向で均衡を増すために、過量のドナーが使われて来
た。
ある糖が良好なフラクトース−アクセプターとして作用
し、レバンの生成を抑制する傾向にあることをHestrin
とAuigad（Biochem.J.69（1958）388〜398）は示した。
第３群は明かに不活性であり、レバンの生成を抑制しな
かつた。Ｄ−グルコース６−リン酸塩は最後のカテゴリ
ーにあつた。この論文で言及されている他のすべての糖
は誘導化されていない糖であつた。しかし、Bacillus s
ubtilis Marburg株168の変異株由来の酵素の存在下でグ
ルコース６−リン酸塩とスクロースとの反応が記述され
ている（Kunst等、Eur.J.Biochem.42、611〜620（197
4））。これらのおよび他の著者（例えばDedonder,Meth
ods Enzymol.,8、500〜505）は常にフラクトースドナー
（例えばシユクロース）／アクセプターの高比、例えば
5:1〜10:1および工業規模で実施不可能な低濃度を使用
した。類似の反応は英国特許出願第2046757Aに記述さ
れ、各種アルドース出発物質をActinomyces uiscosusと
B.subtilis（株ATCC 6051、即ちMarburg株）を含むある
微生物由来のレバンスクラーゼの存在下スクロース又は
ラフイノースと反応させる方法である。しかし、この特
許出願では、アルドースは常に未誘導の糖であり、多分
鎖形成反応を最小にするために、ドナー対アクセプター
のモル比は1:5である。
し、レバンの生成を抑制する傾向にあることをHestrin
とAuigad（Biochem.J.69（1958）388〜398）は示した。
第３群は明かに不活性であり、レバンの生成を抑制しな
かつた。Ｄ−グルコース６−リン酸塩は最後のカテゴリ
ーにあつた。この論文で言及されている他のすべての糖
は誘導化されていない糖であつた。しかし、Bacillus s
ubtilis Marburg株168の変異株由来の酵素の存在下でグ
ルコース６−リン酸塩とスクロースとの反応が記述され
ている（Kunst等、Eur.J.Biochem.42、611〜620（197
4））。これらのおよび他の著者（例えばDedonder,Meth
ods Enzymol.,8、500〜505）は常にフラクトースドナー
（例えばシユクロース）／アクセプターの高比、例えば
5:1〜10:1および工業規模で実施不可能な低濃度を使用
した。類似の反応は英国特許出願第2046757Aに記述さ
れ、各種アルドース出発物質をActinomyces uiscosusと
B.subtilis（株ATCC 6051、即ちMarburg株）を含むある
微生物由来のレバンスクラーゼの存在下スクロース又は
ラフイノースと反応させる方法である。しかし、この特
許出願では、アルドースは常に未誘導の糖であり、多分
鎖形成反応を最小にするために、ドナー対アクセプター
のモル比は1:5である。
６−置換スクロース誘導体は相当する６−置換グルコー
ス又はガラクトースとフラクトシルトランフエラーゼと
スクロース、ラフイノース又はスタキオースの存在下で
反応させて製造できることを本発明者は見出した。つい
でこの生成物を4,1′および６′−位置でハロゲン化
し、必要なら６−置換基を除いて、目的のハロ糖を得る
ことができる。最初の反応はレバンの生成なしで良収量
で進行する。
ス又はガラクトースとフラクトシルトランフエラーゼと
スクロース、ラフイノース又はスタキオースの存在下で
反応させて製造できることを本発明者は見出した。つい
でこの生成物を4,1′および６′−位置でハロゲン化
し、必要なら６−置換基を除いて、目的のハロ糖を得る
ことができる。最初の反応はレバンの生成なしで良収量
で進行する。
本発明によれば、一般式 （式中、Ａは水素原子又は基CH2Ｘ（但し、Ｘは水素原
子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す）であり、Ｙ
はハロゲン原子である）を有するハロデオキシスクロー
ス又はガラクトスクロース誘導体の製造法を供し、一般
式 （式中、Ａは水素原子又は基CH2Ｘ（但し、Ｘは水素原
子、アルコキシ基又は保護されたヒドロキシ基である）
である）を有するアルドースをフラクトシルジ−又はオ
リゴサツカライドとフラクトシルトランスフエラーゼの
存在下反応させて、一般式 （式中、Ａは式IIについて記載した通りである）を有す
る化合物を得、ついで分離し、ハロゲン化し、そしてＡ
がCH2ＸでありかつＸがヒドロキシ基である式Ｉの化合
物については、保護ヒドロキシ基を脱保護するものであ
る。
子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基を示す）であり、Ｙ
はハロゲン原子である）を有するハロデオキシスクロー
ス又はガラクトスクロース誘導体の製造法を供し、一般
式 （式中、Ａは水素原子又は基CH2Ｘ（但し、Ｘは水素原
子、アルコキシ基又は保護されたヒドロキシ基である）
である）を有するアルドースをフラクトシルジ−又はオ
リゴサツカライドとフラクトシルトランスフエラーゼの
存在下反応させて、一般式 （式中、Ａは式IIについて記載した通りである）を有す
る化合物を得、ついで分離し、ハロゲン化し、そしてＡ
がCH2ＸでありかつＸがヒドロキシ基である式Ｉの化合
物については、保護ヒドロキシ基を脱保護するものであ
る。
本発明に係る反応で使用するフラクトシルトランスフエ
ラーゼはB.subtilis又はErwinia sp.（以前はAerobacte
r levanicumとして知られていた）由来のものが望まし
い。B.subtilisは特に望ましく、ある菌株は常法の発酵
で大規模によく生育し、工業用酵素（例えばα−アミラ
ーゼとβ−ラクタマーゼ）源として十分認容されてい
る。更に、フラクトシルトランスフエラーゼは主に更
に、フラクトシルトランスフエラーゼは主として細胞外
酵素であるから、一層容易に得かつ精製することができ
る。使用酵素はインベルターゼ活性がないことが肝要で
ある。必要な場合、選択的インベルターゼインヒビター
例えばｐ−ヒドロキシマーキユリベンゾエートを使用せ
ねばならない。B.subtilis酵素は選択的沈澱又はその他
の簡便技術によりB.subtilis液体培養物から採ることが
できる。例えば、この培養物を遠心分離して細胞や細胞
片を除き、硫酸アンモニウムで約65％にし、再度遠心分
離して、インベルターゼその他タン白系不純物を除いて
から、硫酸アンモニウムで約95％にもつていく。ついで
粗レバンスクラーゼを沈澱させ、更にこれをリン酸塩バ
ツフアー中に再溶解し、透析して精製することができ
る。
ラーゼはB.subtilis又はErwinia sp.（以前はAerobacte
r levanicumとして知られていた）由来のものが望まし
い。B.subtilisは特に望ましく、ある菌株は常法の発酵
で大規模によく生育し、工業用酵素（例えばα−アミラ
ーゼとβ−ラクタマーゼ）源として十分認容されてい
る。更に、フラクトシルトランスフエラーゼは主に更
に、フラクトシルトランスフエラーゼは主として細胞外
酵素であるから、一層容易に得かつ精製することができ
る。使用酵素はインベルターゼ活性がないことが肝要で
ある。必要な場合、選択的インベルターゼインヒビター
例えばｐ−ヒドロキシマーキユリベンゾエートを使用せ
ねばならない。B.subtilis酵素は選択的沈澱又はその他
の簡便技術によりB.subtilis液体培養物から採ることが
できる。例えば、この培養物を遠心分離して細胞や細胞
片を除き、硫酸アンモニウムで約65％にし、再度遠心分
離して、インベルターゼその他タン白系不純物を除いて
から、硫酸アンモニウムで約95％にもつていく。ついで
粗レバンスクラーゼを沈澱させ、更にこれをリン酸塩バ
ツフアー中に再溶解し、透析して精製することができ
る。
重要な酵素はB.subtilis NCIB 11871から得たフラクト
シルトランスフエラーゼであるが、NCIB 11872と11873
株も興味がある。これら菌株からの酵素も広い特異性を
有するから、６−置換誘導体に一層容易に使用できる。
シルトランスフエラーゼであるが、NCIB 11872と11873
株も興味がある。これら菌株からの酵素も広い特異性を
有するから、６−置換誘導体に一層容易に使用できる。
本発明の別の特徴によれば、アクセプターアルドースの
不存在下で少なくとも0.1Mのkm/スクロースを有し、ア
クセプターアルドースの不存在下でフラクトースドナー
から有意量のアルコール沈澱性物質を生成せず、かつ界
面活性剤に影響されず、約30℃で最適の活性を示し、45
℃までで少なくとも20分間活性であるが、フラクトシル
トランスフエラーゼを供する。
不存在下で少なくとも0.1Mのkm/スクロースを有し、ア
クセプターアルドースの不存在下でフラクトースドナー
から有意量のアルコール沈澱性物質を生成せず、かつ界
面活性剤に影響されず、約30℃で最適の活性を示し、45
℃までで少なくとも20分間活性であるが、フラクトシル
トランスフエラーゼを供する。
これらの酵素に関して引用した２つの定数（Ｋ）はkm、
ミカエリスーメントン定数であり、これは酵素反応の最
大率（レバン等を生成）の半分がおきる基質濃度であ
り、そしてKi、インヒビター定数であり、これは酵素活
性の観察可能な最大阻害（レバン生成せず）の半分を生
成するインヒビター濃度である。
ミカエリスーメントン定数であり、これは酵素反応の最
大率（レバン等を生成）の半分がおきる基質濃度であ
り、そしてKi、インヒビター定数であり、これは酵素活
性の観察可能な最大阻害（レバン生成せず）の半分を生
成するインヒビター濃度である。
株NCIB 11871酵素のkmはアクセプターの不存在下でスク
ロースについて約0.2Mであり、「B.subtilis BS5」（B.
subtilis var.nigraからのクローン）からのDedonderの
レバンスクラーゼについて報告されたkmはわずか0.02M
であつた。
ロースについて約0.2Mであり、「B.subtilis BS5」（B.
subtilis var.nigraからのクローン）からのDedonderの
レバンスクラーゼについて報告されたkmはわずか0.02M
であつた。
B.subtilis NCIB 11871とNCIB 11872および11873はB.su
btilisの変種株である。すなわち、分類試験（Barkley
とGoodfellow、「The Aerobic Endospore-forming Bact
eria:Classification and Identification」（1981）、
Academic Press、ロンドン、Gordon,HaynesとPang、「T
he Genus Bacillus」、Agricultural Handbook No.427
（1973）、米国農務省、ワシントン州）およびAPI 50 C
HBとAPI 20Eシステム（API system S.A.La Balme les G
roltes-38390 Montalieu Verciew,FranceおよびLogan
等、J.Appl.Bact.1978、28〜29）において、種同の殆ん
どすべての要件を満たしている。これらの試験では、多
くのB.subtilis株との主な有意な差は、NCIB 11871株が
ラクトース陰性株で、キシロースから各種酸生成を示す
ことである。NCIB 11872株はラクトース陰性で、Ｄ−マ
ンノース、メルビオースおよびトレハロース、およびON
PG反応において負の結果を示す。NCIB 11873株はラクト
ース陽性で、Ｄ−マンノースやイヌリンで負の結果を与
える。
btilisの変種株である。すなわち、分類試験（Barkley
とGoodfellow、「The Aerobic Endospore-forming Bact
eria:Classification and Identification」（1981）、
Academic Press、ロンドン、Gordon,HaynesとPang、「T
he Genus Bacillus」、Agricultural Handbook No.427
（1973）、米国農務省、ワシントン州）およびAPI 50 C
HBとAPI 20Eシステム（API system S.A.La Balme les G
roltes-38390 Montalieu Verciew,FranceおよびLogan
等、J.Appl.Bact.1978、28〜29）において、種同の殆ん
どすべての要件を満たしている。これらの試験では、多
くのB.subtilis株との主な有意な差は、NCIB 11871株が
ラクトース陰性株で、キシロースから各種酸生成を示す
ことである。NCIB 11872株はラクトース陰性で、Ｄ−マ
ンノース、メルビオースおよびトレハロース、およびON
PG反応において負の結果を示す。NCIB 11873株はラクト
ース陽性で、Ｄ−マンノースやイヌリンで負の結果を与
える。
B.subtilisやErwina spの多くの菌株から誘導したフラ
クトシルトランスフエラーゼは一般にレバンスクラーゼ
であると見なされている。すなわち、スクロースの存在
下で、この酵素はレバン、アルコール沈澱性であるポリ
フラクトース物質を生成させる。フラクトースジサツカ
ライドの生成に使用する場合、レバン生成拮抗反応は、
任意の有用な物質が得られる時に抑えられねばならない
から、高割合のアクセプター分子を含有する反応混合物
にGB2046757A中のこれらの酵素を限定する。しかし、こ
こで使用するB.subtilis NCIB 11871,11872および11873
酵素は余りレバンを生成しない。「レバン」生成につい
てスクロースのkmは約0.2Mである。これはDedonder（lo
c.cit）BS5株酵素の約0.02Mのkmと匹敵する。均等濃度
のアクセプターとドナー分子を使用しかつ田中B.subtil
is酵素による高分子量レバンの合成（すなわち、レバン
プライマーの添加、低イオン強度溶液の使用および低温
度の反応（J.Biochem 90、921、1981）を促進すること
が分つた条件を使用する場合でも、非常にわずか高分子
量レバンが生成されるに過ぎない。ピーク収量のジサツ
カライドに達した後、中間分子量のポリマーが生成し
た。更に、他の真のレバンスクラーゼと違つて、B.subt
ilis NCIB 11871由来の酵素は不均合反応（すなわち、
低分子量オリゴサツカライドを高分子量レバンに転換し
ない）に触媒反応を示さないようである。例えば、トリ
サツカライドが検出できるが、酵素が不均合反応を行な
う場合、存在させるべきでない。Aerobacter levanicum
（Sigma）から得た標準的レバンは高分子および中間分
子量物質に相当する２つのピークに分画することができ
る。Dedonder（loc.cit.）酵素は37℃で約3.6×10-2の
平衡定数（レバンとグルコース／スクロース）を有し、
DP40のレバンが生成される。全く反対に、NCIB 11871,1
1872および11873株はスクロース単独から実質量のアル
コール沈澱性ポリサツカライドを産生しない酵素を生
じ、11871株の生育細胞でもレバンを生成しない。した
がつて、生成したフラクトシルトランスフエラーゼは有
効に「レバンスクラーゼ」では全くない。この明細書で
は、フラクトシルトランスフエラーゼと呼ぶ。
クトシルトランスフエラーゼは一般にレバンスクラーゼ
であると見なされている。すなわち、スクロースの存在
下で、この酵素はレバン、アルコール沈澱性であるポリ
フラクトース物質を生成させる。フラクトースジサツカ
ライドの生成に使用する場合、レバン生成拮抗反応は、
任意の有用な物質が得られる時に抑えられねばならない
から、高割合のアクセプター分子を含有する反応混合物
にGB2046757A中のこれらの酵素を限定する。しかし、こ
こで使用するB.subtilis NCIB 11871,11872および11873
酵素は余りレバンを生成しない。「レバン」生成につい
てスクロースのkmは約0.2Mである。これはDedonder（lo
c.cit）BS5株酵素の約0.02Mのkmと匹敵する。均等濃度
のアクセプターとドナー分子を使用しかつ田中B.subtil
is酵素による高分子量レバンの合成（すなわち、レバン
プライマーの添加、低イオン強度溶液の使用および低温
度の反応（J.Biochem 90、921、1981）を促進すること
が分つた条件を使用する場合でも、非常にわずか高分子
量レバンが生成されるに過ぎない。ピーク収量のジサツ
カライドに達した後、中間分子量のポリマーが生成し
た。更に、他の真のレバンスクラーゼと違つて、B.subt
ilis NCIB 11871由来の酵素は不均合反応（すなわち、
低分子量オリゴサツカライドを高分子量レバンに転換し
ない）に触媒反応を示さないようである。例えば、トリ
サツカライドが検出できるが、酵素が不均合反応を行な
う場合、存在させるべきでない。Aerobacter levanicum
（Sigma）から得た標準的レバンは高分子および中間分
子量物質に相当する２つのピークに分画することができ
る。Dedonder（loc.cit.）酵素は37℃で約3.6×10-2の
平衡定数（レバンとグルコース／スクロース）を有し、
DP40のレバンが生成される。全く反対に、NCIB 11871,1
1872および11873株はスクロース単独から実質量のアル
コール沈澱性ポリサツカライドを産生しない酵素を生
じ、11871株の生育細胞でもレバンを生成しない。した
がつて、生成したフラクトシルトランスフエラーゼは有
効に「レバンスクラーゼ」では全くない。この明細書で
は、フラクトシルトランスフエラーゼと呼ぶ。
反応のフラクトース源はスクロース（β−Ｄ−フラクト
フラノシルα−Ｄ−グルコピラノシド）、ラフイノース
（Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）β−Ｄ−フラク
トフラノシド）又はスタキオースのようにリンク（１→
２）によりアルドースのアノマー炭素に結合する望まし
くは不飽和β−フラクトシル環を含む任意のオリゴー又
はジ−サツカライドでよい。
フラノシルα−Ｄ−グルコピラノシド）、ラフイノース
（Ｏ−α−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→６）−Ｏ−
α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）β−Ｄ−フラク
トフラノシド）又はスタキオースのようにリンク（１→
２）によりアルドースのアノマー炭素に結合する望まし
くは不飽和β−フラクトシル環を含む任意のオリゴー又
はジ−サツカライドでよい。
式IIの６−置換アルドース出発物質は続く塩素化反応に
耐性でありかつ６−ヒドロキシ基を放出するのに除去で
きる６−位置の任意の置換基を保護ヒドロキシ基として
有してもよい。６−カルボン酸エステル例えば６−アセ
テート又はベンゾエートが望ましい。グルコース６−ア
セテートは各種方法（例えばDuff,J.Chem.Soc.p4730〜
４、1957;Reeve等、J.Am.Chem.Soc.,79、6041〜3;Frohw
ein等Nature、p153、1960;Duff等、Nature、p103、195
7;同じく、Biochem J.515〜520、70、1958）により容易
に製造することができる。
耐性でありかつ６−ヒドロキシ基を放出するのに除去で
きる６−位置の任意の置換基を保護ヒドロキシ基として
有してもよい。６−カルボン酸エステル例えば６−アセ
テート又はベンゾエートが望ましい。グルコース６−ア
セテートは各種方法（例えばDuff,J.Chem.Soc.p4730〜
４、1957;Reeve等、J.Am.Chem.Soc.,79、6041〜3;Frohw
ein等Nature、p153、1960;Duff等、Nature、p103、195
7;同じく、Biochem J.515〜520、70、1958）により容易
に製造することができる。
式IIのアルドース出発物質の６−置換基は水素化により
容易に除去できるベンジルエーテルの如きエーテルある
いはGB2127806Aに記載される塩素化６−エーテルをその
まゝ供しうる脂肪族エーテルであつてもよい。この出発
物質は例えば４−クロロ置換基を有して、既に部分的に
塩素化して４−クロロ−４−デオキシ−ガラクトース６
−アセテートの如きジサツカライドを得ることができ
る。
容易に除去できるベンジルエーテルの如きエーテルある
いはGB2127806Aに記載される塩素化６−エーテルをその
まゝ供しうる脂肪族エーテルであつてもよい。この出発
物質は例えば４−クロロ置換基を有して、既に部分的に
塩素化して４−クロロ−４−デオキシ−ガラクトース６
−アセテートの如きジサツカライドを得ることができ
る。
フラクトースドナーとフラクトースアクセプター間の反
応は水性系望ましくは酵素の最適pHすなわち約30℃の最
適温度でpH5.4〜6.0で緩衝化させて行なうべきである。
この２種の反応体は一般に水溶性で、酵素は相互の溶液
中で分散させることができ、あるいは不溶性担体に固定
化するのがよい。固定化は例えばDEAEセルロースの如き
イオン交換樹脂を使い、それに酵素を強力に吸着させる
ことができる。その他多くの固定化担体として例えば米
国特許第4,421,850号明細書に記載の骨炭を使うことが
できる。
応は水性系望ましくは酵素の最適pHすなわち約30℃の最
適温度でpH5.4〜6.0で緩衝化させて行なうべきである。
この２種の反応体は一般に水溶性で、酵素は相互の溶液
中で分散させることができ、あるいは不溶性担体に固定
化するのがよい。固定化は例えばDEAEセルロースの如き
イオン交換樹脂を使い、それに酵素を強力に吸着させる
ことができる。その他多くの固定化担体として例えば米
国特許第4,421,850号明細書に記載の骨炭を使うことが
できる。
反応混合物中のフラクトースドナー対フラクトースアク
セプター比は重要である。余り低いと、収量が減少す
る。余り高いと、特に高固形含量の基質を使う場合、可
能なレバン反応が抑制されなくなる。一般に、約2:1の
モル比（ドナー−アクセプター）が最適である。この反
応は、溶解性又は粘度に問題はないので、高濃度で行な
うことができる。一般には、約40重量％の反応体濃度が
うまくいくが、反応体の溶解性例えばグルコース６−ア
セテートでは約75％までにより更に高濃度も使用でき
る。酵素濃度は当然活性に依るが、溶液ml当りB.subtil
is NCIB 11871培養物33mlから誘導した酵素を含む水溶
液を使う場合、約50ml/lの濃度がうまくいく。
セプター比は重要である。余り低いと、収量が減少す
る。余り高いと、特に高固形含量の基質を使う場合、可
能なレバン反応が抑制されなくなる。一般に、約2:1の
モル比（ドナー−アクセプター）が最適である。この反
応は、溶解性又は粘度に問題はないので、高濃度で行な
うことができる。一般には、約40重量％の反応体濃度が
うまくいくが、反応体の溶解性例えばグルコース６−ア
セテートでは約75％までにより更に高濃度も使用でき
る。酵素濃度は当然活性に依るが、溶液ml当りB.subtil
is NCIB 11871培養物33mlから誘導した酵素を含む水溶
液を使う場合、約50ml/lの濃度がうまくいく。
式IIIの化合物の続く塩素化は、4,1′−および６′−位
置で選択的に塩素でヒドロキシを置換することができる
試薬を使つて行なうことができる。この試薬はビルスマ
イヤー試薬で、ジアルキルアミドと塩素化試薬との反応
例えばジメチルホルムアミドと五塩化燐、ホスゲン又は
塩化チオニルと反応させて得られる。スクロース６−エ
ステルの塩素化の詳細はGB2079749Aおよび米国特許第4,
380,476号明細書に記載されている。同様に、６−エス
テルの脱保護は同一刊行物に記述され、例えばメタノー
ル中のナトリウムメトキシドを使う。６−ベンジルエー
テル基は水素化により除くことができる。
置で選択的に塩素でヒドロキシを置換することができる
試薬を使つて行なうことができる。この試薬はビルスマ
イヤー試薬で、ジアルキルアミドと塩素化試薬との反応
例えばジメチルホルムアミドと五塩化燐、ホスゲン又は
塩化チオニルと反応させて得られる。スクロース６−エ
ステルの塩素化の詳細はGB2079749Aおよび米国特許第4,
380,476号明細書に記載されている。同様に、６−エス
テルの脱保護は同一刊行物に記述され、例えばメタノー
ル中のナトリウムメトキシドを使う。６−ベンジルエー
テル基は水素化により除くことができる。
更に、フラクトース−アクセプターアルコール（特にア
ルドース）とフラクトシルジ−又はオリゴマーサツカラ
イドとを、アクセプターアルドースの不存在下少なくと
も0.1Mのkm/スクロースを有し、アクセプターアルドー
スの不存在下フラクトースドナーからアルコール沈澱性
物質の実質量を生成せず、界面活性剤の存在により影響
を受けず、約30℃で最適活性を有しかつ45℃までで少な
くとも20分間活性であるフラクトシルトランスフエラー
ゼの存在下反応させてフラクトシドを製造する方法が供
される。フラクトースアクセプターは一般に、ピラノー
ス、フラノース糖又は置換糖でよく、フラクトシルジサ
ツカライドに加えるのが好ましい。例には６−置換グル
コース誘導体例えばグルコース６−エステルとエーテル
および６−デオキシ−Ｄ−グルコース（TGSおよびその
甘味類似物の製造上）、又は英国特許出願GB2046757A
（下記参照）のレバンスクラーゼと併用するのに示唆さ
れた物質を含む。フラクトシルジ−又はオリゴ−サツカ
ライドはスクロース、ラフイノース又はスタキオースを
含んでよい。
ルドース）とフラクトシルジ−又はオリゴマーサツカラ
イドとを、アクセプターアルドースの不存在下少なくと
も0.1Mのkm/スクロースを有し、アクセプターアルドー
スの不存在下フラクトースドナーからアルコール沈澱性
物質の実質量を生成せず、界面活性剤の存在により影響
を受けず、約30℃で最適活性を有しかつ45℃までで少な
くとも20分間活性であるフラクトシルトランスフエラー
ゼの存在下反応させてフラクトシドを製造する方法が供
される。フラクトースアクセプターは一般に、ピラノー
ス、フラノース糖又は置換糖でよく、フラクトシルジサ
ツカライドに加えるのが好ましい。例には６−置換グル
コース誘導体例えばグルコース６−エステルとエーテル
および６−デオキシ−Ｄ−グルコース（TGSおよびその
甘味類似物の製造上）、又は英国特許出願GB2046757A
（下記参照）のレバンスクラーゼと併用するのに示唆さ
れた物質を含む。フラクトシルジ−又はオリゴ−サツカ
ライドはスクロース、ラフイノース又はスタキオースを
含んでよい。
B.subtilis 11871由来の酵素の基質特異性を更に詳述す
る。初期の研究の示すところでは、B.subtilis（Marbur
g）のフラクトシルトランスフエラーゼ活性は、リン酸
塩又はカルボン酸基の如き極性基がＣ−６の位置で置換
されない限り、アルドースのＣ−６における変化により
修復されない。特に、アクセプターのＣ−６位置での次
の変化はレバンスクラーゼ、還元（Ｌ−ガラクトースか
らＬ−フコース）、OHのＯ−グルコシルへの置換（Ｄ−
グルコースからイソマルトース）およびＣ上のＨのヒド
ロキシアルキル（Ｄ−ガラクトースからＤ−グリセロ−
Ｄ−ガラクトヘプトース）（Hestrin等、1958）を抑制
しない。スクロースのように同じグリコシド結合により
アルコシル基に結合した非置換フラクトース基を有する
唯一の分子はドナーとして働くから、スクロース６−ア
セテートはスクロース又はラフイノースの代りにフラク
トースドナーとして作用しうる。
る。初期の研究の示すところでは、B.subtilis（Marbur
g）のフラクトシルトランスフエラーゼ活性は、リン酸
塩又はカルボン酸基の如き極性基がＣ−６の位置で置換
されない限り、アルドースのＣ−６における変化により
修復されない。特に、アクセプターのＣ−６位置での次
の変化はレバンスクラーゼ、還元（Ｌ−ガラクトースか
らＬ−フコース）、OHのＯ−グルコシルへの置換（Ｄ−
グルコースからイソマルトース）およびＣ上のＨのヒド
ロキシアルキル（Ｄ−ガラクトースからＤ−グリセロ−
Ｄ−ガラクトヘプトース）（Hestrin等、1958）を抑制
しない。スクロースのように同じグリコシド結合により
アルコシル基に結合した非置換フラクトース基を有する
唯一の分子はドナーとして働くから、スクロース６−ア
セテートはスクロース又はラフイノースの代りにフラク
トースドナーとして作用しうる。
しかし、本発明の新規酵素の場合に、非常に広範囲の糖
類はスクロース又はラフイノースからフラクトースのア
クセプターとしていろいろ働く。アクセプターの多く
は、ヘキソース又はペントース例えばリボース、ソルボ
ース、リキソース、アラビノースおよびキシロースであ
る。反応しないことが分つている唯一のペントースはキ
シロースである。反応性アクセプターの多くはピラノー
ス環構造を応用しうるが、キシリトールとグルコン酸も
反応するようである。環構造が存在する時、酵素又は硫
黄を含むに違いないから、イノシトールは反応せず、５
−チオグルコースが反応する。
類はスクロース又はラフイノースからフラクトースのア
クセプターとしていろいろ働く。アクセプターの多く
は、ヘキソース又はペントース例えばリボース、ソルボ
ース、リキソース、アラビノースおよびキシロースであ
る。反応しないことが分つている唯一のペントースはキ
シロースである。反応性アクセプターの多くはピラノー
ス環構造を応用しうるが、キシリトールとグルコン酸も
反応するようである。環構造が存在する時、酵素又は硫
黄を含むに違いないから、イノシトールは反応せず、５
−チオグルコースが反応する。
炭素３および４の構造上、例えばグルコースの代りにガ
ラクトース、３−Ｏ−メチルグルコース、４−クロロガ
ラクトースおよびＤ−アラビノースのすべての態様は定
性的反応性に影響しない。炭素１例えばメチルα−Ｄ−
グルコピラノシド、１−チオグルコースおよびソルボー
スのような置換基は反応する。炭素２で、マンノースの
ように各種変化に耐えるが、２−デオキシグルコースや
グルコサミンは非反応性である。炭素６では多くの構造
上の変化は６−リン酸塩、クロライド、アセテート、６
−デオキシグルコース、６−Ｏ−メチルグルコース、６
−Ｏ−メチルガラクトースおよびラムノースの６−Ｈの
ように耐えるが、グルコヘプトースのCH2OH、CHOH−基
は反応性を抑制する。
ラクトース、３−Ｏ−メチルグルコース、４−クロロガ
ラクトースおよびＤ−アラビノースのすべての態様は定
性的反応性に影響しない。炭素１例えばメチルα−Ｄ−
グルコピラノシド、１−チオグルコースおよびソルボー
スのような置換基は反応する。炭素２で、マンノースの
ように各種変化に耐えるが、２−デオキシグルコースや
グルコサミンは非反応性である。炭素６では多くの構造
上の変化は６−リン酸塩、クロライド、アセテート、６
−デオキシグルコース、６−Ｏ−メチルグルコース、６
−Ｏ−メチルガラクトースおよびラムノースの６−Ｈの
ように耐えるが、グルコヘプトースのCH2OH、CHOH−基
は反応性を抑制する。
メリビオース、ラクトース、イソマルトースおよびセロ
ビオースを含むジ−サツカライドの多くは反応性アクセ
プターであるが、ラクチユロースやイソマルチユロース
の如きあるジサツカライドは非反応性である。オリゴサ
ツカライドアクセプターを使用する場合、アクセプター
活性は類似のマルトース、マルトトリオース、マルトテ
トラオース等のように、大きさが増すにつれて減少す
る。
ビオースを含むジ−サツカライドの多くは反応性アクセ
プターであるが、ラクチユロースやイソマルチユロース
の如きあるジサツカライドは非反応性である。オリゴサ
ツカライドアクセプターを使用する場合、アクセプター
活性は類似のマルトース、マルトトリオース、マルトテ
トラオース等のように、大きさが増すにつれて減少す
る。
最後に、多くの場合、１炭素原子以上で構造上の変化
（グルコースの）は反応を抑制しない、例えばガラクト
ース６−アセテート。反応性アクセプター分子の混合物
が例えば加水分解したホエイに使用されると、フラクト
シル化ジサツカライドの混合物が生成される。
（グルコースの）は反応を抑制しない、例えばガラクト
ース６−アセテート。反応性アクセプター分子の混合物
が例えば加水分解したホエイに使用されると、フラクト
シル化ジサツカライドの混合物が生成される。
次の糖類はアクセプターとして作用することが分つた。
Ｄ−アラビノース、フコース、６−デオキシグルコー
ス、６−Ｏ−メチルガラクトース、ラクトース、ガラク
トース６−アセテート、マンノース、５−チオ−Ｄ−グ
ルコース、マルトース、１−チオ−グルコース、マルト
トリオース、３−Ｏ−メチルα−Ｄ−グルコース、マル
トペンタオース、Ｄ（−）アラビノース、マルトヘキソ
ース、６−クロロ−６−デオキシグルコース、メリビオ
ース、ガラクトース、キシロース、イソマルトース、Ｌ
−アラビノース、ホエイ透過液（ラクトース）、４−ク
ロロガラクトース、リボース、リキソース、グルコース
６−アセテート、グルコン酸、グルコース６−リン酸
塩、Ｌ−ラムノース、６−Ｏ−メチルグルコース、メチ
ル−Ｏ−グルコシド、キシリトール、グルセロールおよ
びエタノール。
Ｄ−アラビノース、フコース、６−デオキシグルコー
ス、６−Ｏ−メチルガラクトース、ラクトース、ガラク
トース６−アセテート、マンノース、５−チオ−Ｄ−グ
ルコース、マルトース、１−チオ−グルコース、マルト
トリオース、３−Ｏ−メチルα−Ｄ−グルコース、マル
トペンタオース、Ｄ（−）アラビノース、マルトヘキソ
ース、６−クロロ−６−デオキシグルコース、メリビオ
ース、ガラクトース、キシロース、イソマルトース、Ｌ
−アラビノース、ホエイ透過液（ラクトース）、４−ク
ロロガラクトース、リボース、リキソース、グルコース
６−アセテート、グルコン酸、グルコース６−リン酸
塩、Ｌ−ラムノース、６−Ｏ−メチルグルコース、メチ
ル−Ｏ−グルコシド、キシリトール、グルセロールおよ
びエタノール。
特に興味あるアクセプターは、キシルスクロースとして
知られるβ,D−フラクトフラノシル（２→１）α−Ｄ−
キシロピラノシドを産生するキシロースである。他の興
味あるアクセプターはガラクトースで、β−Ｄ−フラク
トフラノシル（２→１）−Ｄ−ガラクトピラノシド（ガ
ラクトスクロース）を産生する。このタイプの生成物は
フ蝕性低く、過剰の甘味が問題となつている分野では、
スクロースの代替品として興味がある。ガラクトスクロ
ースは糖蜜や加水分解ホエイ透過液から得ることがで
き、また容易に入手できることから、特に興味がもたれ
る。これはほんの僅かの甘味を有するに過ぎない（スク
ロースの約10〜15％）。
知られるβ,D−フラクトフラノシル（２→１）α−Ｄ−
キシロピラノシドを産生するキシロースである。他の興
味あるアクセプターはガラクトースで、β−Ｄ−フラク
トフラノシル（２→１）−Ｄ−ガラクトピラノシド（ガ
ラクトスクロース）を産生する。このタイプの生成物は
フ蝕性低く、過剰の甘味が問題となつている分野では、
スクロースの代替品として興味がある。ガラクトスクロ
ースは糖蜜や加水分解ホエイ透過液から得ることがで
き、また容易に入手できることから、特に興味がもたれ
る。これはほんの僅かの甘味を有するに過ぎない（スク
ロースの約10〜15％）。
ドナー特異性について、絶対的要件としてα（１→２）
結合をもつたスクロースに基づく糖は反応性で、活性は
分子の大きさにつれて減少する。酵素作用により生成す
る新規のジサツカライド例えばキシルスクロースはドナ
ーとして作用する。
結合をもつたスクロースに基づく糖は反応性で、活性は
分子の大きさにつれて減少する。酵素作用により生成す
る新規のジサツカライド例えばキシルスクロースはドナ
ーとして作用する。
酵素触媒反応の生成物に常法の物理化学的手段例えばク
ロマトグラフイ特性に高圧液体クロマトグラフイ（HPL
C）およびイオン交換樹脂クロマトグラフイにより副生
物と出発物質から分離できる。特に、アルドース環に６
−ヒドロキシ基をもたない生成物、例えばスクロース６
−エステルやエーテル、キシロース誘導体および６−デ
オキシスクロースは驚く程低い極性を有し、これがイオ
ン交換樹脂クロマトグラフイを容易かつ効果的分離方法
にする。ジビニルベンゼンで架橋したポリスチレン樹脂
例えばアンバーライトXAD樹脂は特に適している。この
分離は、スクロース６−誘導体を化学的方法により製造
する時に必要な各種置換したスクロース誘導体の分離よ
りはるかに容易である。
ロマトグラフイ特性に高圧液体クロマトグラフイ（HPL
C）およびイオン交換樹脂クロマトグラフイにより副生
物と出発物質から分離できる。特に、アルドース環に６
−ヒドロキシ基をもたない生成物、例えばスクロース６
−エステルやエーテル、キシロース誘導体および６−デ
オキシスクロースは驚く程低い極性を有し、これがイオ
ン交換樹脂クロマトグラフイを容易かつ効果的分離方法
にする。ジビニルベンゼンで架橋したポリスチレン樹脂
例えばアンバーライトXAD樹脂は特に適している。この
分離は、スクロース６−誘導体を化学的方法により製造
する時に必要な各種置換したスクロース誘導体の分離よ
りはるかに容易である。
スクロースの如きグルコシルフラクシドを使うフラクト
ース転換反応の副生物はグルコース自体である。グルコ
ースは勿論有力なアクセプターであり、望ましいアクセ
プターと拮抗し、出発物質を再生成する。したがつて、
フラクトースに転換することによりグルコースを除くの
は望ましい。これはグルコースイソメラーゼを添加して
達成することができる。
ース転換反応の副生物はグルコース自体である。グルコ
ースは勿論有力なアクセプターであり、望ましいアクセ
プターと拮抗し、出発物質を再生成する。したがつて、
フラクトースに転換することによりグルコースを除くの
は望ましい。これはグルコースイソメラーゼを添加して
達成することができる。
次の例により本発明を説明する。
例１ TGSの製造 ａ） 酵素の調製 β−フラクトシルトランスフエラーゼをBacillus subti
lis NCIB 11871株から得た最小スクロース培地（100ml/
フラスコ）を含む振盪フラスコ（250ml容、４個のフラ
スコ）に細胞が生育中酵素をスクロースにより誘導し
た。培養物は指数期まで培養し、30℃で振盪し、ついで
４つの振盪フラスコの中味を一緒にし、生育培地を遠心
分離（5000g/5分間）により細胞から分離した。全酵素
の20〜30％は細胞に結合したまゝであつた。生成した清
澄液に固形硫酸アンモニウムを加えて65％の飽和にし、
０℃で45分間放置した。この操作により望ましくないイ
ンベルターゼと他のタン白不純物の殆んどが沈澱した
が、多くの酵素は溶液中に残つた。ついでこの試料を再
遠心分離（20,000g/30分間）し、インベルターゼ活性を
含む沈澱物を除いた。更に硫酸アンモニウムをこの溶液
に加え、95％飽和度にし、０℃で45分間更に放置した。
主としてフラクトシルトランスフエラーゼである２番目
の沈澱物が生成し、遠心分離（40,000g/45分間）により
集取し、50mMリン酸塩バツフアー、pH6に再溶解した。
２回の沈澱の正味効果と２番目の沈澱物の再溶解により
実質的精製と酵素の濃縮をし、タン白帯だけがポリアク
リルアミドゲル電気泳動により検出できた。最後に、残
渣の硫酸アンモニウムを50mMリン酸塩バツフアーに対し
透析（０℃/4時間）して、酵素調製物から除いた。
lis NCIB 11871株から得た最小スクロース培地（100ml/
フラスコ）を含む振盪フラスコ（250ml容、４個のフラ
スコ）に細胞が生育中酵素をスクロースにより誘導し
た。培養物は指数期まで培養し、30℃で振盪し、ついで
４つの振盪フラスコの中味を一緒にし、生育培地を遠心
分離（5000g/5分間）により細胞から分離した。全酵素
の20〜30％は細胞に結合したまゝであつた。生成した清
澄液に固形硫酸アンモニウムを加えて65％の飽和にし、
０℃で45分間放置した。この操作により望ましくないイ
ンベルターゼと他のタン白不純物の殆んどが沈澱した
が、多くの酵素は溶液中に残つた。ついでこの試料を再
遠心分離（20,000g/30分間）し、インベルターゼ活性を
含む沈澱物を除いた。更に硫酸アンモニウムをこの溶液
に加え、95％飽和度にし、０℃で45分間更に放置した。
主としてフラクトシルトランスフエラーゼである２番目
の沈澱物が生成し、遠心分離（40,000g/45分間）により
集取し、50mMリン酸塩バツフアー、pH6に再溶解した。
２回の沈澱の正味効果と２番目の沈澱物の再溶解により
実質的精製と酵素の濃縮をし、タン白帯だけがポリアク
リルアミドゲル電気泳動により検出できた。最後に、残
渣の硫酸アンモニウムを50mMリン酸塩バツフアーに対し
透析（０℃/4時間）して、酵素調製物から除いた。
透析した酵素はｐ−ヒドロキシマーキユリベンゾエート
（インベルターゼを阻害するが、フラクトシルトランス
フエラーゼ活性に悪影響を及ぼさない）の添加前後に試
験した。この方法により、フラクトシルトランスフエラ
ーゼ調製品は通常インベルターゼを含まないことが分つ
た。調製品のタン白含量は280nmの吸収度を測定して0.4
5mg/mlであつた。精製した酵素調製品にもしばしば黒い
色素が見られたが、調製品の活性に悪影響はない。
（インベルターゼを阻害するが、フラクトシルトランス
フエラーゼ活性に悪影響を及ぼさない）の添加前後に試
験した。この方法により、フラクトシルトランスフエラ
ーゼ調製品は通常インベルターゼを含まないことが分つ
た。調製品のタン白含量は280nmの吸収度を測定して0.4
5mg/mlであつた。精製した酵素調製品にもしばしば黒い
色素が見られたが、調製品の活性に悪影響はない。
ｂ） スクロース６−アセテート グルコース６−アセテート（真空乾燥恒量80g）と粒化
スクロース（160g）をpH5.4、マキルベンバツフアー100
mlに室温で溶解し、脱イオン水600ml（40％w/v）で稀釈
した。ついでこの溶液を十分濾過し、酵素溶液28mlを加
えた。ついで反応混合物を30℃で培養し、HPLC分析によ
りスクロース６−アセテートがそれ以上生成されなくな
ることが認められるまで、一定間隔でサンプリングし、
スクロース６−アセテートの最大濃度は約120gl-1であ
つた。酵素を吸着するDEAEセルロースカラムに通して反
応混合物を濾過して酵素を取つた。別法には、65℃/1時
間加熱して変性させることもできる。酵素はスクロース
６−アセテートをゆつくり加水分解してフラクトースを
遊離するように作用するので、酵素を除くことは重要で
ある。
スクロース（160g）をpH5.4、マキルベンバツフアー100
mlに室温で溶解し、脱イオン水600ml（40％w/v）で稀釈
した。ついでこの溶液を十分濾過し、酵素溶液28mlを加
えた。ついで反応混合物を30℃で培養し、HPLC分析によ
りスクロース６−アセテートがそれ以上生成されなくな
ることが認められるまで、一定間隔でサンプリングし、
スクロース６−アセテートの最大濃度は約120gl-1であ
つた。酵素を吸着するDEAEセルロースカラムに通して反
応混合物を濾過して酵素を取つた。別法には、65℃/1時
間加熱して変性させることもできる。酵素はスクロース
６−アセテートをゆつくり加水分解してフラクトースを
遊離するように作用するので、酵素を除くことは重要で
ある。
ついで、生成物を分取HPLCにより単離して、少なくとも
85％純度のスクロース６−アセテートを得、全体の約50
％の収率であつた。酵素反応の初期速度は244.5mgスク
ロース６−アセテート/mg酵素／時間を生成することで
あつた。酵素工程の収率はグルコース６−アセテート消
費で58％、スクロース６−アセテート生成で48％であつ
た。
85％純度のスクロース６−アセテートを得、全体の約50
％の収率であつた。酵素反応の初期速度は244.5mgスク
ロース６−アセテート/mg酵素／時間を生成することで
あつた。酵素工程の収率はグルコース６−アセテート消
費で58％、スクロース６−アセテート生成で48％であつ
た。
ｃ） スクロース６−アセテートの塩素化 ｉ） ビルスマイヤー試薬の調製 五塩化燐（140g）を激しく撹拌しながらビーカー中無水
ジメチルホルムアミド（250ml）に加え、温度は70〜80
℃に保ち、撹拌は１時間続け、反応混合物を冷却、濾過
した。結晶生成物をdmf（２×20ml）とジエチルエーテ
ル（40ml）で洗い、デシケーター中で乾燥し、白色結晶
としてビルスマイヤー試薬（93g）を得た。
ジメチルホルムアミド（250ml）に加え、温度は70〜80
℃に保ち、撹拌は１時間続け、反応混合物を冷却、濾過
した。結晶生成物をdmf（２×20ml）とジエチルエーテ
ル（40ml）で洗い、デシケーター中で乾燥し、白色結晶
としてビルスマイヤー試薬（93g）を得た。
（ii） スクロース６−アセテート溶液の調製 スクロース６−アセテートシラツプ（41g、実際のスク
ロース６−アセテート含量28g）をdmfに溶解し稀釈して
86mlとした。この溶液を分子フルイで脱水し濾過した。
ロース６−アセテート含量28g）をdmfに溶解し稀釈して
86mlとした。この溶液を分子フルイで脱水し濾過した。
（iii） 塩素化 ビルスマイヤー試薬（31g）をdmf（80ml）に加え、混合
物を０℃に冷却した。スクロース６−アセテート溶液
（21ml、スクロース６−アセテート7g）をゆつくり加
え、温度を20℃以下に維持した。反応混合物を０℃で15
分間撹拌してから、60℃の油浴に30分移した。この浴を
120℃30分加熱し、この温度で２時間維持した。ついで
反応混合物を20℃に冷却し、メタノール−880アンモニ
ア（2:1、80ml）を添加して中和し、50℃以下に保持し
た。混合物をシラツプ状に濃縮し、ピリジン（100ml）
と無水酢酸（100ml）を加えてアセチル化した。50℃/2
時間撹拌後、混合物を20℃に冷却し、温度を60℃以下に
保ちながらメタノール（80ml）を加えた。ついで混合物
をシラツプ状に濃縮し、熱トルエン（４×100ml）で抽
出した。トルエン抽出液をシラツプ状に濃縮し、エチル
アセテート（100ml）に溶解した。エチルアセテート溶
液を水（３×100ml）で洗い、その水はエチルアセテー
ト（２×50ml）で逆抽出した。一緒にしたこのエチルア
セテート抽出液を硫酸マグネシウムで脱水し、活性炭で
脱色し、シラツプ状に濃縮し、工業用メチル化スピリツ
トより結晶化して、4,1′,6′−トリクロロ−4,1′,6′
−トリデオキシガラクトスクロースペンタアセテート
（4.42、39％）を得た。
物を０℃に冷却した。スクロース６−アセテート溶液
（21ml、スクロース６−アセテート7g）をゆつくり加
え、温度を20℃以下に維持した。反応混合物を０℃で15
分間撹拌してから、60℃の油浴に30分移した。この浴を
120℃30分加熱し、この温度で２時間維持した。ついで
反応混合物を20℃に冷却し、メタノール−880アンモニ
ア（2:1、80ml）を添加して中和し、50℃以下に保持し
た。混合物をシラツプ状に濃縮し、ピリジン（100ml）
と無水酢酸（100ml）を加えてアセチル化した。50℃/2
時間撹拌後、混合物を20℃に冷却し、温度を60℃以下に
保ちながらメタノール（80ml）を加えた。ついで混合物
をシラツプ状に濃縮し、熱トルエン（４×100ml）で抽
出した。トルエン抽出液をシラツプ状に濃縮し、エチル
アセテート（100ml）に溶解した。エチルアセテート溶
液を水（３×100ml）で洗い、その水はエチルアセテー
ト（２×50ml）で逆抽出した。一緒にしたこのエチルア
セテート抽出液を硫酸マグネシウムで脱水し、活性炭で
脱色し、シラツプ状に濃縮し、工業用メチル化スピリツ
トより結晶化して、4,1′,6′−トリクロロ−4,1′,6′
−トリデオキシガラクトスクロースペンタアセテート
（4.42、39％）を得た。
（iv） 脱エステル化 ペンタアセテートを無水メタノールに溶解し、室温で５
時間触媒量のナトリウムメトキシドで処理した。ついで
この溶液を脱イオン化し蒸発させて、4,1′,6′−トリ
クロロ−4,1′,6′−トリデオキシガラクトスクロース
（90％）を得た。
時間触媒量のナトリウムメトキシドで処理した。ついで
この溶液を脱イオン化し蒸発させて、4,1′,6′−トリ
クロロ−4,1′,6′−トリデオキシガラクトスクロース
（90％）を得た。
例２ 4,1′,6′−トリクロロ−4,6,1′,6′−テトラデオキシ
ガラクトスクロース（６−デオキシ−TGS）（類似の甘
味度を有するTGSの関連体）の製造。
ガラクトスクロース（６−デオキシ−TGS）（類似の甘
味度を有するTGSの関連体）の製造。
（１） ６−デオキシスクロース 単離、精製および結晶化 ６−デオキシ−Ｄ−グルコース（Ｄ−キノボース、20
g）とスクロースを、例１と同じ反応条件に供し、６−
デオキシスクロース、Ｄ−キノボース、スクロースおよ
びグルコースの混合物、全容量140mlを得た。６−デオ
キシスクロースは、Waters Prepak 500-c18（逆相カラ
ム）と水を溶離剤として使つて、分取HPLCにより混合物
から分別した。混合物中の６−デオキシスクロースと他
の成分間に驚く程保持時間に大きな差異がみられた。Ｄ
−キノボース、スクロースおよびＤ−グルコースを注入
後４〜９分間で溶離され、６−デオキシスクロースにわ
ずか29分（極大ピーク）であつた。大きな分離は材料の
分別を一層可能にした。６−デオキシスクロースを含む
溶離剤を減圧下蒸発乾固（浴温度50℃）して、きれいな
シラツプ（16.7g、42％）を得、室温で放置して結晶化
させた。この生成物をエタノールから再結し、融点は18
0〜181℃、〔α〕D＋57.6°（c2.5、水）、マススペク
トル、m/e293（M+−CH3−H2O）、13C−NMRスペクトル
（0ppmで内部DSSについてのD2O溶液）炭素原子 化学シフト、ppm ２′ 106.32 １ 94.70 ５′ 84.01 ３′ 79.04 ５ 77.74 ４′ 76.73 ３ 74.93 ２ 73.95 ４ 71.09 ６′ 65.02 １′ 63.77 ６ 19.36 （２） ６−デオキシスクロースの選択的塩素化 ６−デオキシスクロース（2.8g）をDMF（10ml）に溶解
し、その溶液をDMF（30ml）中ビルスマイヤー試薬（15
g）のサスペンジヨンに添加し、温度を10℃以下に保つ
た。混合物を室温で10分間撹拌し、ついで撹拌しながら
120℃で２時間加熱した。混合物を室温に冷却し、メタ
ノール−水酸化アンモニウム溶液（1:1、20ml）を加え
た。混合物を70℃で濃縮し、トルエン（２×20ml）を残
渣から蒸発させ、ピリジン（30ml）中無水酢酸で60℃/3
時間アセチル化した。メタノール（50ml）を加え、混合
物を蒸発濃縮して、撹拌と傾瀉によりトルエン（４×50
ml）で60℃抽出した。一緒にしたトルエン抽出液を蒸発
乾固し、残渣をシリカゲル（石油エーテル−エーテル、
2:1、ついで1:1）でクロマトグラフにかけ、溶媒蒸発後
淡黄色シラツプとして中間の4,1′,6′−トリクロロ−
4,6,1′,6′−テトラデオキシガラクトスクローステト
ラアセテート（3.1g、64％）を得た。MS、m/e 283、28
5、287（9:6:1、ジクロロ−ジ−Ｏ−アセチルフラクト
ース残渣）および継続ロスに相当するピーク60（CH3CO2
H）、42（CH2＝Ｃ＝０）および36（HCl）;249、251（CH
2のロスで3:1、−モノクロロ−ジデオキシ−ジ−Ｏ−ア
セチルガラクトース残渣）および60と42の継続ロスに相
当するピーク。
g）とスクロースを、例１と同じ反応条件に供し、６−
デオキシスクロース、Ｄ−キノボース、スクロースおよ
びグルコースの混合物、全容量140mlを得た。６−デオ
キシスクロースは、Waters Prepak 500-c18（逆相カラ
ム）と水を溶離剤として使つて、分取HPLCにより混合物
から分別した。混合物中の６−デオキシスクロースと他
の成分間に驚く程保持時間に大きな差異がみられた。Ｄ
−キノボース、スクロースおよびＤ−グルコースを注入
後４〜９分間で溶離され、６−デオキシスクロースにわ
ずか29分（極大ピーク）であつた。大きな分離は材料の
分別を一層可能にした。６−デオキシスクロースを含む
溶離剤を減圧下蒸発乾固（浴温度50℃）して、きれいな
シラツプ（16.7g、42％）を得、室温で放置して結晶化
させた。この生成物をエタノールから再結し、融点は18
0〜181℃、〔α〕D＋57.6°（c2.5、水）、マススペク
トル、m/e293（M+−CH3−H2O）、13C−NMRスペクトル
（0ppmで内部DSSについてのD2O溶液）炭素原子 化学シフト、ppm ２′ 106.32 １ 94.70 ５′ 84.01 ３′ 79.04 ５ 77.74 ４′ 76.73 ３ 74.93 ２ 73.95 ４ 71.09 ６′ 65.02 １′ 63.77 ６ 19.36 （２） ６−デオキシスクロースの選択的塩素化 ６−デオキシスクロース（2.8g）をDMF（10ml）に溶解
し、その溶液をDMF（30ml）中ビルスマイヤー試薬（15
g）のサスペンジヨンに添加し、温度を10℃以下に保つ
た。混合物を室温で10分間撹拌し、ついで撹拌しながら
120℃で２時間加熱した。混合物を室温に冷却し、メタ
ノール−水酸化アンモニウム溶液（1:1、20ml）を加え
た。混合物を70℃で濃縮し、トルエン（２×20ml）を残
渣から蒸発させ、ピリジン（30ml）中無水酢酸で60℃/3
時間アセチル化した。メタノール（50ml）を加え、混合
物を蒸発濃縮して、撹拌と傾瀉によりトルエン（４×50
ml）で60℃抽出した。一緒にしたトルエン抽出液を蒸発
乾固し、残渣をシリカゲル（石油エーテル−エーテル、
2:1、ついで1:1）でクロマトグラフにかけ、溶媒蒸発後
淡黄色シラツプとして中間の4,1′,6′−トリクロロ−
4,6,1′,6′−テトラデオキシガラクトスクローステト
ラアセテート（3.1g、64％）を得た。MS、m/e 283、28
5、287（9:6:1、ジクロロ−ジ−Ｏ−アセチルフラクト
ース残渣）および継続ロスに相当するピーク60（CH3CO2
H）、42（CH2＝Ｃ＝０）および36（HCl）;249、251（CH
2のロスで3:1、−モノクロロ−ジデオキシ−ジ−Ｏ−ア
セチルガラクトース残渣）および60と42の継続ロスに相
当するピーク。
テトラアセテートをメタノール（30ml）に溶解し、室温
でナトリウムメトキサイド（1M、pH9）により脱アセチ
ル化した。溶液をAmberlyst15（H+）カチオン交換樹脂
で中和し、濾過し、蒸発乾固した。白色固体の生成物が
得られた。
でナトリウムメトキサイド（1M、pH9）により脱アセチ
ル化した。溶液をAmberlyst15（H+）カチオン交換樹脂
で中和し、濾過し、蒸発乾固した。白色固体の生成物が
得られた。
〔α〕D＋87.1°（c1.0、アセトン）、13c−NMRスペク
トル（0ppmの内部DSSについてD2O溶液）炭素原子 化学シフト、ppm ２′ 106.02 １ 95.41 ５′ 83.75 ３′ 78.89 ４′ 78.04 ５ 70.95 ４ 70.03 ２ 69.78 ３ 69.28 １′ 47.46 ６′ 45.99 ６ 19.61 4,1′,6′−トリクロロ−4,6,1′,6′−テトラデオキシ
ガラクトスクロースはスクロースの400倍の甘味がある
ことが分つた（８％溶液）。
トル（0ppmの内部DSSについてD2O溶液）炭素原子 化学シフト、ppm ２′ 106.02 １ 95.41 ５′ 83.75 ３′ 78.89 ４′ 78.04 ５ 70.95 ４ 70.03 ２ 69.78 ３ 69.28 １′ 47.46 ６′ 45.99 ６ 19.61 4,1′,6′−トリクロロ−4,6,1′,6′−テトラデオキシ
ガラクトスクロースはスクロースの400倍の甘味がある
ことが分つた（８％溶液）。
例３ 例１の方法を繰り返えしたが、ｂ）段階で６−アセテー
トの代りにグルコース６−ベンゾエートを用いた。類似
の結果が得られた。段階ｃ）は前のように行なつて、類
似の収率でTGSを得た。
トの代りにグルコース６−ベンゾエートを用いた。類似
の結果が得られた。段階ｃ）は前のように行なつて、類
似の収率でTGSを得た。
例４ B.subtilis Marburg株168、NCIB 11872株又はNCIB 1187
3株から誘導した酵素を段階ｂ）で使つて、例１の方法
を改変することができる。反応は同じように進行した
が、反応速度は低かつた。
3株から誘導した酵素を段階ｂ）で使つて、例１の方法
を改変することができる。反応は同じように進行した
が、反応速度は低かつた。
例５ DEAEイオン交換セルロースを使つてB.subtilis NCIB 11
871由来のフラクトシルトランスフエラーゼの固定化と
精製およびキシルスクロースの製造。
871由来のフラクトシルトランスフエラーゼの固定化と
精製およびキシルスクロースの製造。
DEAEイオン交換セルロース（DE52）を50mMマキルベンバ
ツフアーpH5.4で完全に洗い、ついで緩衝化した基質
（スクロース−キシロース2:1、40％w/v、全糖）で洗つ
た。ブフナーフイルターで殆んど乾燥するまで濾過した
後、例１のようにB.subtilis由来のフラクトシルトラン
スフエラーゼ標品8mlとDEAEセルロース（10g）を撹拌下
30℃/15分間混合した。DEAEセルロースと酵素の混合物
を10mlジヤケツト付きカラム（19×1cm）に詰め、チヤ
ーチルサーモサーキユレーターで30℃に保つた。DEAEセ
ルロースを落下流出させ、落下物を集めた。基質を約1.
0mlh-1の流速で、ワトソン−マーロウポンプを使いカラ
ムまで送り、溶離剤を一定間隔で集め、フラクトシルト
ランスフエラーゼ活性について試験した。280nmの吸光
度（OD280）も測定した。試料を試験するために、0.1ml
の液体試料又は0.1gの固定化酵素（DE52に）を基質2ml
と共に30℃/4時間培養した。「キシルスクロース」製造
用キシロース／スクロース基質を使つて、固定化処理後
に残つている沽濁溶液のタン白濃度と活性を最初の酵素
調製物のタン白濃度と活性とを比較した。細胞抽出液に
最初に存在する酵素の68.5％は最初に存在するタン白質
の83％と共に固定化されたことが分つた。この固定化酵
素は遊離酵素の均等量と比較して80.2％の初期活性を示
した。２つの調製物の活性は夫々0.38gキシルスクロー
ス/g固定化酵素／時間および0.865gキシルスクロース/m
l酵素抽出液／時間であつた。
ツフアーpH5.4で完全に洗い、ついで緩衝化した基質
（スクロース−キシロース2:1、40％w/v、全糖）で洗つ
た。ブフナーフイルターで殆んど乾燥するまで濾過した
後、例１のようにB.subtilis由来のフラクトシルトラン
スフエラーゼ標品8mlとDEAEセルロース（10g）を撹拌下
30℃/15分間混合した。DEAEセルロースと酵素の混合物
を10mlジヤケツト付きカラム（19×1cm）に詰め、チヤ
ーチルサーモサーキユレーターで30℃に保つた。DEAEセ
ルロースを落下流出させ、落下物を集めた。基質を約1.
0mlh-1の流速で、ワトソン−マーロウポンプを使いカラ
ムまで送り、溶離剤を一定間隔で集め、フラクトシルト
ランスフエラーゼ活性について試験した。280nmの吸光
度（OD280）も測定した。試料を試験するために、0.1ml
の液体試料又は0.1gの固定化酵素（DE52に）を基質2ml
と共に30℃/4時間培養した。「キシルスクロース」製造
用キシロース／スクロース基質を使つて、固定化処理後
に残つている沽濁溶液のタン白濃度と活性を最初の酵素
調製物のタン白濃度と活性とを比較した。細胞抽出液に
最初に存在する酵素の68.5％は最初に存在するタン白質
の83％と共に固定化されたことが分つた。この固定化酵
素は遊離酵素の均等量と比較して80.2％の初期活性を示
した。２つの調製物の活性は夫々0.38gキシルスクロー
ス/g固定化酵素／時間および0.865gキシルスクロース/m
l酵素抽出液／時間であつた。
固定化酵素（10gw/w）をカラムに詰め、30℃で約２週間
連続して作用させ、溶離液のpHの変化又は微生物のコン
タミの徴候はみられなかつた。少しのタン白質と酵素が
最初の操作３日で脱着し、最初に吸着したタン白質の24
％および最初に吸着した酵素活性の2.3％となつた。固
定化酵素活性は処理半減期95時間で駄目になり、基質を
生成物に転換する程度とカラムを通る流速間の通常の逆
関係を示した。使用した最低の流速では、0.086空カラ
ム容量（ecv）h-1、80％キシルスクロースへの転換率が
達成され、カラム溶離液には21gl-1キシルスクロースを
含有する。この収率はバツチ反応で得られたものより高
く、生成物は連続的にカラムから取り出され、蓄積せず
かつ生成物の阻害を来たさないから、カラムのプラグ・
フローはキシルスクロースの生成には有利である。全体
にこれらの操作中、20〜25gのキシルスクロースがそこ
で生成され、純粋のキシルスクロースは容易に得られ
る。
連続して作用させ、溶離液のpHの変化又は微生物のコン
タミの徴候はみられなかつた。少しのタン白質と酵素が
最初の操作３日で脱着し、最初に吸着したタン白質の24
％および最初に吸着した酵素活性の2.3％となつた。固
定化酵素活性は処理半減期95時間で駄目になり、基質を
生成物に転換する程度とカラムを通る流速間の通常の逆
関係を示した。使用した最低の流速では、0.086空カラ
ム容量（ecv）h-1、80％キシルスクロースへの転換率が
達成され、カラム溶離液には21gl-1キシルスクロースを
含有する。この収率はバツチ反応で得られたものより高
く、生成物は連続的にカラムから取り出され、蓄積せず
かつ生成物の阻害を来たさないから、カラムのプラグ・
フローはキシルスクロースの生成には有利である。全体
にこれらの操作中、20〜25gのキシルスクロースがそこ
で生成され、純粋のキシルスクロースは容易に得られ
る。
最初に使用した易溶性酵素と違つて、固定化酵素は若干
の副産物を導き、反応中に生成される。フラクトースは
少し生成されるが、固定化に使つた最初の酵素抽出液に
より生成されるより少ない。多分抽出液を汚染するイン
ベルターゼ活性がDE52にほんの一部吸着されたからであ
ろう。13〜20分の保持時間でHPLCカラムから非常に遅く
溶離された少量の化合物は固定化酵素から溶離液中に見
られるが、可溶性酵素反応の分析中気が付かなかつた。
これらは多分酵素により反応体分子のホールド・アツプ
は酵素との接触時間を増すから、重合化の可能性がおき
る。
の副産物を導き、反応中に生成される。フラクトースは
少し生成されるが、固定化に使つた最初の酵素抽出液に
より生成されるより少ない。多分抽出液を汚染するイン
ベルターゼ活性がDE52にほんの一部吸着されたからであ
ろう。13〜20分の保持時間でHPLCカラムから非常に遅く
溶離された少量の化合物は固定化酵素から溶離液中に見
られるが、可溶性酵素反応の分析中気が付かなかつた。
これらは多分酵素により反応体分子のホールド・アツプ
は酵素との接触時間を増すから、重合化の可能性がおき
る。
基質のキシロース含量は133gl-1であるから、最大可能
キシルスクロース濃度は266gl-1であつた。0.086ecvh-1
で観察された最大濃度はこれの80％、すなわち210gl-1
であつたが、反応中に消費されたキシロースを基準にし
て計算して、69.5％の反応を示した。収率はバツチ反応
より高く、本方法の「フロー・スルー」性がコンスタン
トに生成物が除かれた原因となりかつ生成物が基質と比
較して非極性だから、正電荷した固定化担体から離れて
分配される。両方の効果はキシルスクロースの生成に有
利であろう。
キシルスクロース濃度は266gl-1であつた。0.086ecvh-1
で観察された最大濃度はこれの80％、すなわち210gl-1
であつたが、反応中に消費されたキシロースを基準にし
て計算して、69.5％の反応を示した。収率はバツチ反応
より高く、本方法の「フロー・スルー」性がコンスタン
トに生成物が除かれた原因となりかつ生成物が基質と比
較して非極性だから、正電荷した固定化担体から離れて
分配される。両方の効果はキシルスクロースの生成に有
利であろう。
グルコース６−アセテートからスクロース６−アセテー
ト、６−Ｏ−メチルグルコースから６−Ｏ−メチルスク
ロース、および６−Ｏ−ベンジルグルコースから６−Ｏ
−ベンジルスクロースを製造するのに同一方法を使用し
た。
ト、６−Ｏ−メチルグルコースから６−Ｏ−メチルスク
ロース、および６−Ｏ−ベンジルグルコースから６−Ｏ
−ベンジルスクロースを製造するのに同一方法を使用し
た。
例１にしたがつて調製した酵素（0.1ml）をスクロース
とキシロース（1:1）の４％w/v溶液2mlと混合し、pH5で
30℃で緩衝化した。キシルスクロースをHPLCにより確認
した。レバン生成を光学的に確認した。各種酵素による
比較結果は次の通りである。
とキシロース（1:1）の４％w/v溶液2mlと混合し、pH5で
30℃で緩衝化した。キシルスクロースをHPLCにより確認
した。レバン生成を光学的に確認した。各種酵素による
比較結果は次の通りである。
したがつて、本発明の酵素はMarburg株酵素より少なく
とも10倍のキシルスクロースを生成した。NCIB 11871酵
素の場合には少なくとも100倍である。レバンの拮抗的
産生は少ない。
とも10倍のキシルスクロースを生成した。NCIB 11871酵
素の場合には少なくとも100倍である。レバンの拮抗的
産生は少ない。
例６ ガラクトスクロースの製造。
リン酸塩、クエン酸塩バツフアー（pH5.9）に溶解した
等重量のスクロースとガラクトースを含む基質40％（w/
v）15mlは、酵素を95％硫酸アンモニウム飽和溶液で沈
澱させ、この沈澱物を再溶解しついで不純物を65％硫酸
アンモニウム飽和溶液で沈澱させて一部精製した少容量
のS.subtilis NCIB 11871フラクトシルトランスフエラ
ーゼと共に30℃で培養した。
等重量のスクロースとガラクトースを含む基質40％（w/
v）15mlは、酵素を95％硫酸アンモニウム飽和溶液で沈
澱させ、この沈澱物を再溶解しついで不純物を65％硫酸
アンモニウム飽和溶液で沈澱させて一部精製した少容量
のS.subtilis NCIB 11871フラクトシルトランスフエラ
ーゼと共に30℃で培養した。
約24時間の培養後、生成物は逆相カラム（多孔性黒鉛炭
素、５μ直径、溶離剤５％水性アセトニトリル）でHPLC
クロマトグラフイにより分離した。ガラクトスクロース
の収率では更に増加は、それ以上培養を続けてもあるい
は新しい酵素を加えても得られなかつた。ガラクトスク
ロースの最大収率は約0.33g/gガラクトースと約0.45g/g
消費スクロースであつた。
素、５μ直径、溶離剤５％水性アセトニトリル）でHPLC
クロマトグラフイにより分離した。ガラクトスクロース
の収率では更に増加は、それ以上培養を続けてもあるい
は新しい酵素を加えても得られなかつた。ガラクトスク
ロースの最大収率は約0.33g/gガラクトースと約0.45g/g
消費スクロースであつた。
例７ 4,1′,6′−トリブロモ−4,1′,6′−トリデオキシガラ
クトスクロース。
クトスクロース。
（ａ） ビスマイヤー試薬の調製 臭化チオニル（280ml）を激しく撹拌しながら、無水冷
ジメチルホルムアミド（260ml）に加えた。混合物を70
〜80℃/30分間撹拌し、更に１時間撹拌し、周囲温度に
冷却した。混合物を濾過し、残渣をジメチルホルムアミ
ド（２×50ml）とジエチルエーテル（100ml）で洗い、
デシケーター中で脱水し、320gの試薬を得た。
ジメチルホルムアミド（260ml）に加えた。混合物を70
〜80℃/30分間撹拌し、更に１時間撹拌し、周囲温度に
冷却した。混合物を濾過し、残渣をジメチルホルムアミ
ド（２×50ml）とジエチルエーテル（100ml）で洗い、
デシケーター中で脱水し、320gの試薬を得た。
（ｂ） スクロースアセテートのブロム化 DMF（20ml）中スクロース６−アセテート（5g）の溶液
を例１のように調製し、撹拌下温度を20℃以下/30分間
保ちながら、DMF（50ml）中ビスマイヤー試薬（25g）の
冷サスペンジヨンで処理した。ついで、撹拌混合物を周
囲温度/30分間撹拌し、110℃に加熱しついで更に1.75時
間撹拌した。それを20℃に冷却し、メタノールと濃アン
モニア（0.880）の2:1混合物を添加して中和し、そして
40℃以下に保つた。混合物をシラツプに濃縮し、ピリジ
ン（100ml）中無水酢酸（100ml）で50℃/2時間アセチル
化した。生成物はGB2101989Aと同じトリブロムガラクト
スクロースペンタアセテート（4.2g）として例１のよう
に回収した。これを周囲温度で５時間ナトリウムメトキ
サイド（メタノール中１モル、pH9）で脱アセチル化
し、ついでAmberlyst 15（H+）イオン交換樹脂で脱イオ
ン化した。上澄液を蒸発乾固し、GB2101989Aと同じ純粋
のトリブロム糖を得た。
を例１のように調製し、撹拌下温度を20℃以下/30分間
保ちながら、DMF（50ml）中ビスマイヤー試薬（25g）の
冷サスペンジヨンで処理した。ついで、撹拌混合物を周
囲温度/30分間撹拌し、110℃に加熱しついで更に1.75時
間撹拌した。それを20℃に冷却し、メタノールと濃アン
モニア（0.880）の2:1混合物を添加して中和し、そして
40℃以下に保つた。混合物をシラツプに濃縮し、ピリジ
ン（100ml）中無水酢酸（100ml）で50℃/2時間アセチル
化した。生成物はGB2101989Aと同じトリブロムガラクト
スクロースペンタアセテート（4.2g）として例１のよう
に回収した。これを周囲温度で５時間ナトリウムメトキ
サイド（メタノール中１モル、pH9）で脱アセチル化
し、ついでAmberlyst 15（H+）イオン交換樹脂で脱イオ
ン化した。上澄液を蒸発乾固し、GB2101989Aと同じ純粋
のトリブロム糖を得た。
例８ キシルスクロースの塩素化 キシルスクロース（例５から）（3g）を10℃でDMFに溶
解し、撹拌下10℃以下に維持したDMF（25ml）中例１の
ビルスマイヤー試薬（13g）の冷サスペンジヨンに加え
た。混合物を室温に30分かけて加温し、ついで120℃に
し、撹拌下３時間保つた。混合物を冷却し、メタノール
／濃（0.880）アンモニア1:1で中和し、70℃で濃縮し
た。続いてトルエンを蒸発させて水分を除き、残渣をピ
リジン（30ml）中無水酢酸（30ml）で60℃/3時間アセチ
ル化した。混合物をメタノール（50ml）で処理し、蒸発
乾固した。残渣を熱トルエン（60℃、４×50ml）で抽出
し、傾瀉した抽出液を一緒にして蒸発した。残渣をシリ
カゲル（石油エーテル：ジメチルエーテル2:1、ついで
1:1）でクロマトグラフにかけ、シラツプとしてトリク
ロロアラビノスクローステトラアセテート（2.6g）を得
た。MS m/e283、285、287（9:6:1、ジクロロ−ジ−Ｏ−
アセチルフラクトース残渣）:60（CH3CO2H）、42（CH2
＝Ｃ＝Ｏ）および36（HCl）の継続ロスに相当するピー
ク。235、237（3:1、モノクロロ−ジ−Ｏ−アセチルア
ラビノ残渣）および60と42の継続ロスに相当するピー
ク。
解し、撹拌下10℃以下に維持したDMF（25ml）中例１の
ビルスマイヤー試薬（13g）の冷サスペンジヨンに加え
た。混合物を室温に30分かけて加温し、ついで120℃に
し、撹拌下３時間保つた。混合物を冷却し、メタノール
／濃（0.880）アンモニア1:1で中和し、70℃で濃縮し
た。続いてトルエンを蒸発させて水分を除き、残渣をピ
リジン（30ml）中無水酢酸（30ml）で60℃/3時間アセチ
ル化した。混合物をメタノール（50ml）で処理し、蒸発
乾固した。残渣を熱トルエン（60℃、４×50ml）で抽出
し、傾瀉した抽出液を一緒にして蒸発した。残渣をシリ
カゲル（石油エーテル：ジメチルエーテル2:1、ついで
1:1）でクロマトグラフにかけ、シラツプとしてトリク
ロロアラビノスクローステトラアセテート（2.6g）を得
た。MS m/e283、285、287（9:6:1、ジクロロ−ジ−Ｏ−
アセチルフラクトース残渣）:60（CH3CO2H）、42（CH2
＝Ｃ＝Ｏ）および36（HCl）の継続ロスに相当するピー
ク。235、237（3:1、モノクロロ−ジ−Ｏ−アセチルア
ラビノ残渣）および60と42の継続ロスに相当するピー
ク。
テトラアセテートをメタノール（30ml）に溶解し、周囲
温度pH9でメタノール中１モルナトリウムメトキサイド
で脱アセチル化した。
温度pH9でメタノール中１モルナトリウムメトキサイド
で脱アセチル化した。
混合物をAmberlyst 15（H+）樹脂で脱イオン化し、濾
過、蒸発させた。生成物は固形フオームとして単離し
た。〔α〕D＋101.9°（c1.1アセトン）、13C−NMRスペ
クトルD2溶液、0ppmで内部DSSについて）。炭素原子 化学シフト、ppm ２′ 106.0 １ 95.8 ５′ 83.9 ３′ 78.8 ４′ 77.9 ２ 70.6 ３ 70.4 ５ 66.4 ４ 63.9 １′ 47.3 ６′ 45.9 この化合物は２％溶液でスクロースの甘味の25倍である
ことが分つた。
過、蒸発させた。生成物は固形フオームとして単離し
た。〔α〕D＋101.9°（c1.1アセトン）、13C−NMRスペ
クトルD2溶液、0ppmで内部DSSについて）。炭素原子 化学シフト、ppm ２′ 106.0 １ 95.8 ５′ 83.9 ３′ 78.8 ４′ 77.9 ２ 70.6 ３ 70.4 ５ 66.4 ４ 63.9 １′ 47.3 ６′ 45.9 この化合物は２％溶液でスクロースの甘味の25倍である
ことが分つた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ピーター サムエル ジエームス チーサ ム イギリス国バークシヤー，リーデイング, スタンホープ ロード，42 (56)参考文献 特開 昭59−46995（ＪＰ，Ａ) 特公 昭57−58905（ＪＰ，Ｂ２)
Claims (9)
- 【請求項１】一般式 （式中、Ａは水素原子又は基CH2Ｘ（但し、Ｘは水素原
子、アルコキシ基又は保護されたヒドロキシ基である）
である）を有するアルドースを、フラクトシルジ−サッ
カライド又はオリゴサッカライドと反応させて、一般式 （式中、Ａは式IIについて記載した通りである）を有す
る化合物を得、式IIIの化合物を分離し、ついでこの化
合物をハロゲン化し、式Ｉ（ＡがCH2Ｘを示し、Ｘがヒ
ドロキシ基である）の化合物の場合、保護されたヒドロ
キシ基を脱保護する一般式 （式中、Ａは水素原子又は基CH2Ｘ（但し、Ｘは水素原
子、ヒドロキシ基又はアルコキシ基である）であり、Ｙ
はハロゲン原子である）を有するハロデオキシスクロー
ス又はガラクトスクロース誘導体の製造において、アク
セプターアルドースの不存在下で少なくとも0.1Mのkm対
シュクロース比を有し、アクセプタースルドースの不存
在下でフラクトースドナーから有意量のアルコール沈澱
可能な物質を形成せず、界面活性剤の存在により影響さ
れず、約30℃で最適活性を有しかつ45℃までで少なくと
も20分間活性である、フラクトシルトランスフェラーゼ
を使用する方法。 - 【請求項２】フラクトシルトランスフェラーゼはバチル
ス・ズブチルス（B.subtilis）又はエルウイニア種（Er
winia sp.）由来のものである、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】フラクトシルトランスフェラーゼはバチル
ス・ズブチルス（B.subtilis）株、NCIB11871、NCIB118
72又はNCIB11873由来のものである、請求項２記載の方
法。 - 【請求項４】フラクトシルサッカライドはスクロース、
ラフイノース又はスタキオースである、請求項１記載の
方法。 - 【請求項５】ビルスマイヤー試薬を使って塩素化を行
う、請求項１記載の方法。 - 【請求項６】保護されたヒドロキシ基は脂肪族又は芳香
族カルボニルオキシ基であり、加水分解により脱保護さ
れるか、あるいはアリールアルコキシ基であり、還元開
裂により脱保護する、請求項１記載の方法。 - 【請求項７】アクセプターアルドースの不存在下で少な
くとも0.1Mのkm対シュクロース比を有し、アクセプター
アルドースの不存在下でフラクトースドナーから有意量
のアルコール沈澱可能な物質を形成せず、界面活性剤の
存在により影響されず、約30℃で最適活性を有しかつ45
℃までで少なくとも20分間活性である、フラクトシルト
ランスフェラーゼ。 - 【請求項８】バチルス・ズブチルス（B.subtilis）由来
の、請求項８記載のフラクトシルトランスフェラーゼ。 - 【請求項９】バチルス・ズブチルス（B.subtilis）株NC
IB11871、11872又は11873由来の、請求項８記載のフラ
クトシルトランスフェラーゼ。
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