JPH0779656A - 不定胚の増殖方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 農業上、均質な苗の生産に利用が期待されて
いる不定胚の実用化を促進するための効率的な不定胚の
増殖方法を提供する。 【構成】 ａ；不定胚の液体培地中にアブシジン酸（１
０〜３０ｍｇ／Ｌ）を添加して冷蔵処理（約４℃、１〜
２ヶ月間、暗黒下）を行う。ｂ；冷蔵処理した不定胚の
振盪培養による小細胞塊の形成及び増殖を行う。ｃ；小
細胞塊の回転振盪培養による不定胚の形成を行う。とい
う三つの培養ステップからなる不定胚の増殖方法は、ａ
ステップの冷蔵処理により、その後のｂステップにおけ
る小細胞塊の増殖率、及びｃステップにおける小細胞塊
から不定胚への形成率が大きく向上するため、少量の不
定胚から小細胞塊を介して新しい大量の不定胚を作り出
すことができ、また、培養ステップの循環（ａ→ｂ→ｃ
→ａ→・・・）により不定胚の維持・保存が可能で、１
回の外植片の培養で長期間にわたって繰り返して不定胚
を得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物組織培養によって
得られた不定胚の増殖方法に関し、さらに詳細には、農
業上、均質な苗の生産に利用が期待されている不定胚の
実用化を促進するための効率的な不定胚の増殖方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】外植片（葉片等）から細胞培養によって
得られる不定胚は、将来芽になる生長点と根になる生長
点が最初から備わっているため、ごく小さな植物体とも
いえ、また、遺伝的に安定していて性質が揃っているこ
とから、不定胚の形成技術及び増殖技術は、バイオテク
ノロジ−による種苗の大量増殖技術として注目されてい
る。

【０００３】この不定胚の形成及び増殖には、従来下記
のような方法が行われていた。

【０００４】すなわち、外植片（葉片等）からカルスを
形成させた後、培地を替えて不定胚を形成させたり（図
２の経路Ａ）、形成したカルスから振盪培養により小細
胞塊を形成・増殖させた後、篩により一定の大きさの小
細胞塊だけを集めて回転振盪培養等により不定胚を形成
させていた（図２の経路Ｂ）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前記従
来の不定胚の形成及び増殖方法においては、以下に記す
ような様々な問題点があった。

【０００６】すなわち、図２の経路Ａによる方法では、
不定胚の形成率が低くて多数の外植片からごく少数の不
定胚しか得られず、大量の不定胚を形成・増殖させるた
めには、コストや時間を要し、また、不定胚の保存も困
難であり、不定胚利用の実用化が困難であるという問題
点があった。

【０００７】また、図２の経路Ｂによる方法では、カル
スから小細胞塊がなかなか得られず、また、得られても
不定胚の形成率が低いため、図の経路Ａによる方法の場
合と同様に、大量の不定胚を形成・増殖させるためには
コストや時間を要し、また、不定胚の保存も困難であ
り、不定胚利用の実用化が困難であるという問題点があ
った。

【０００８】結局のところ、図２の経路Ａ及びＢによる
両方法においては、図３に示すように、多数の外植片
（葉片等）を培養しても少量の不定胚しか得られず、そ
の保存も不可能というのが実情である。

【０００９】このため、不定胚利用の実用化による均質
な苗の大量生産のための効率的で低コストの増殖技術や
保存技術の出現が期待されていた。

【００１０】本発明は上記の事情に鑑みてなされたもの
であり、少量の不定胚から小細胞塊を介して新しい大量
の不定胚を作り出すとともに不定胚の維持・保存を可能
とする不定胚増殖方法を提供するものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記課題を達成するた
め、本発明は、不定胚の液体培地中にアブシジン酸を添
加して冷蔵処理した後、振盪培養することを特徴とする
不定胚の増殖方法を提供するものである。

【００１２】また、上記不定胚の増殖方法において、ア
ブシジン酸の添加濃度を液体培地中で１０〜３０ｍｇ／
Ｌとすることを特徴とする不定胚の増殖方法、及び約４
℃で１〜２ヶ月間の冷蔵処理をすることを特徴とする不
定胚の増殖方法を提供するものである。

【００１３】

【実施例】以下本発明を実施例によって更に具体的に説
明する。

【００１４】まず、本発明の不定胚の増殖方法の基本工
程を、図を用いて概略的に説明する。

【００１５】該基本工程は、図１に示すように、大きく
分けて、以下の三つの培養ステップ（ａ〜ｃ）から構成
されている。

【００１６】ａ；不定胚１０の液体培地中にアブシジン
酸を添加して冷蔵処理を行う。 ｂ；冷蔵処理した不定胚の振盪培養による小細胞塊１２
の形成及び増殖を行う。 ｃ；小細胞塊１２の回転振盪培養による不定胚１０の形
成を行う。

【００１７】上記ａステップは、本発明の根幹となる工
程であり、この処理を行うことにより、その後のｂステ
ップにおける小細胞塊１２の増殖率、及びｃステップに
おける小細胞塊から不定胚１０への形成率が大きく向上
する。

【００１８】アブシジン酸は、植物ホルモンの一種であ
り、その生理作用として休眠促進、老化促進、植物の成
長抑制、種子の発芽抑制等が広く知られているが、本発
明における不定胚の増殖方法は、以下に示すようにアブ
シジン酸が有する生理作用に着目して完成させたもので
あり、その効果を最も効率的に発揮することができる条
件を見い出したものである。

【００１９】なお、ａステップの前には、外植片（葉
片、生長点、茎、葉鞘、葯、花粉等）からカルスを形成
する工程と、カルスから不定胚を形成して誘導する工程
とを要するが、この工程は、図２における従来の不定胚
の形成の場合と同様の工程であり、これらの工程におけ
る培地には、従来の植物組織培養において使用される培
地、すなわち無機成分及び炭素源の必須成分とともにビ
タミン類、アミノ酸類や寒天等のゲル化剤等を必要に応
じて添加した培地（液体培地または固体培地）が使用さ
れ、例えば、下記実施例におけるようなムラシゲ（T．M
urashige）とスク−グ（F.Skoog）による培地（ＭＳ培
地）、シェンク（R.U.Schenk） とヒルデブラント（A.
C.Hildebrandt）による培地（ＳＨ培地）等が使用され
る。

【００２０】また、上記培地は、上記ａ〜ｃステップに
おける培地としても使用され、ａステップを除いて、通
常２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（以下２，４−Ｄと
表記する。）、α−ナフタレン酢酸等のオ−キシン類
や、カイネチン、ベンジルアデニン等のサイトカイニン
類等の植物ホルモンや植物生長調節物質が添加されてい
る。

【００２１】これらの植物ホルモンは、細胞伸長、細胞
分裂の促進、発根作用（以上オ−キシン類）、細胞分裂
の誘起・促進（サイトカイニン類）等の生理作用を示す
物質であり、上記アブシジン酸の生理作用と本質的に異
なる作用を示す物質である。

【００２２】このため、アブシジン酸を不定胚の増殖に
利用することは従来考えられていなかったが、本発明者
は、アブシジン酸の休眠作用、早期発芽抑制作用、胚成
熟促進作用等を積極的に利用すべく鋭意研究した結果、
植物生理学的な機構は明らかではないが、不定胚の液体
培地中にアブシジン酸を添加して冷蔵処理を行う（ａス
テップ）ことにより、不定胚の効率的増殖が可能となる
ことを見い出したものである。

【００２３】なお、ａステップにおける冷蔵処理は、暗
黒下で行うことが望ましい。

【００２４】また、上記ｂステップやｃステップは、図
２における従来の不定胚の形成の場合（経路Ｂ）と同様
の工程であり、これらの工程における培地にもオ−キシ
ン類やサイトカイニン類等の植物ホルモンを添加するこ
とがしばしば行われる。

【００２５】ｃステップの後、得られた不定胚を固体培
地等に移し、完全な植物体にまで育成することにより幼
苗を得ることができる。この工程における培地にもサイ
トカイニン類等の植物ホルモンを添加することがある。

【００２６】また、上記ａ，ｂ，ｃステップの循環（ａ
→ｂ→ｃ→ａ→・・・）により、不定胚の維持及び保存
ができ、１回の外植片の培養で長期間にわたって繰り返
して均質な不定胚を得ることができるため、従来の技術
では困難であった不定胚の保存の問題を容易に解決する
ことができる。

【００２７】さて、つぎに上記培養ステップをウド（ウ
コギ科）の不定胚増殖に適用した実施例を以下に示す。

【００２８】１．不定胚の誘導工程（前工程） ウドの若葉を有効塩素濃度１％の次亜塩素酸ナトリウム
水溶液で１５分間殺菌した後、滅菌水で３回洗浄した。
殺菌した葉を約５ｍｍ四方に切断し、２，４−Ｄ１ｍｇ
／Ｌ及び寒天８ｇ／Ｌを添加したムラシゲ（T．Murashi
ge）とスク−グ（F.Skoog）による培地（以下ＭＳ培地
と表記する。）に置床した。本実施例におけるＭＳ培地
の組成と濃度（ｍｇ／Ｌ）を表１に示す。

【００２９】

【表１】

【００３０】２５℃，３０００ルクス，１６時間明／８
時間暗の条件下で１ヶ月間培養し、カルスを形成させ
た。形成したカルスを寒天８ｇ／Ｌを添加したＭＳ培地
に移植し、２５℃，３０００ルクス，１６時間明／８時
間暗の条件下で１ヶ月間培養し、不定胚を形成させた。

【００３１】形成した不定胚を１００ｍＬのＭＳ液体培
地の入った３００ｍＬ三角フラスコに入れ、７日間、１
００rpm で振盪培養を行った（２５℃，２０００ルク
ス，１６時間明／８時間暗）。遊離してきた不定胚をス
テンレス製の篩に通し、７１０μｍのメッシュの篩を通
り、３５５μｍのメッシュの篩の上に残った不定胚だけ
を集めた。

【００３２】 ２．冷蔵及びアブシジン酸処理（ａステップ） ＭＳ液体培地５ｍＬの入った１５ｍＬスクリュ−キャッ
プ付き試験管（内径１５ｍｍ）に得られた不定胚を容積
０．０１ｍＬずつ入れた後、あらかじめフィルタ−滅菌
しておいたアブシジン酸水溶液を添加した。アブシジン
酸の濃度は、それぞれ０，３．０，１０，３０ｍｇ／Ｌ
になるようにした。試験管を水平にして４℃，暗黒下で
１，２，４ヶ月間それぞれ冷蔵した。

【００３３】３．小細胞塊の誘導（ｂステップ） 冷蔵処理後、不定胚を新しいＭＳ液体培地で洗い、２，
４−Ｄ１．０ｍｇ／Ｌ含むＭＳ液体培地３０ｍＬの入っ
た１００ｍＬ三角フラスコに入れ、１００rpmで振盪培
養を行った（２５℃，２０００ルクス，１６時間明／８
時間暗）。不定胚から誘導された小細胞塊がフラスコ内
で一杯になったときには、小細胞塊の一部を２，４−Ｄ
１．０ｍｇ／Ｌ含む新しいＭＳ液体培地１００ｍＬの入
った３００ｍＬ三角フラスコに移した。

【００３４】２，４−Ｄ１．０ｍｇ／Ｌ含むＭＳ液体培
地１００ｍＬに各処理区の小細胞塊を０．２ｍＬずつ入
れて振盪培養をし、７日ごとに小細胞塊容積を測定して
冷蔵処理期間及びアブシジン酸の添加濃度が小細胞塊の
増殖量に及ぼす影響を調べた結果を表２に示す。

【００３５】

【表２】

【００３６】表２に示すように、アブシジン酸の添加濃
度１０ｍｇ／Ｌ、冷蔵期間２ヶ月の処理区、及びアブシ
ジン酸の添加濃度３０ｍｇ／Ｌ、冷蔵期間２ヶ月の処理
区では、１４日後で小細胞塊の容積が１５倍以上になっ
ている。

【００３７】これに対して、対照区（アブシジン酸無添
加、冷蔵期間０ヶ月）を含めたその他の区では、１４日
後で２〜２．５倍程度しか増加していない。

【００３８】 ４．小細胞塊からの不定胚の誘導（ｃステップ） 得られた小細胞塊をステンレス製の篩に通し、２５０μ
ｍのメッシュの篩を通り、１５０μｍのメッシュの篩の
上に残った小細胞塊を集めた。小細胞塊を新しいＭＳ液
体培地で洗い、ＭＳ液体培地３０ｍＬの入った１００ｍ
Ｌ三角フラスコに小細胞塊を容積０．０１ｍＬずつ入
れ、２rpm で回転振盪培養を行った（２５℃，２０００
ルクス，１６時間明／８時間暗）。２０日後、形成した
不定胚の数を測定した。上記のようにして、小細胞塊
（０．１５〜０．２５ｍｍ） ０.０１ｍＬから２０日
後に形成した不定胚数を測定した結果を表３に示す。

【００３９】

【表３】

【００４０】表３に示すように、小細胞塊からの不定胚
形成数は、アブシジン酸の添加濃度１０ｍｇ／Ｌ、冷蔵
期間２ヶ月の処理区が最大（３．９×１０³）で、対照
区（アブシジン酸無添加、冷蔵期間０ヶ月）の約１００
０倍となっている。

【００４１】同様に、アブシジン酸の添加濃度３０ｍｇ
／Ｌ、冷蔵期間２ヶ月の処理区は、対照区の約１００倍
となっており、上記表２の結果と併せてアブシジン酸の
添加濃度の最適範囲は、１０〜３０ｍｇ／Ｌであること
が推察される。

【００４２】また、冷蔵期間が長期（４ヶ月以上）に渡
ると小細胞塊が形成せず、その最適期間は上記表２の結
果と併せて、１〜２ヶ月程度であることが推察される。

【００４３】以上実施例に基づいて本発明を説明してき
たが、本発明はこれらに限定されるわけではない。

【００４４】例えば、上記実施例は、ウド（ウコギ科）
の不定胚増殖に適用した場合であるが、適用植物はウド
に限定されるものではなく、カルスから不定胚を誘導で
きる植物種であれば適用できるものである。

【００４５】また上記実施例においては、アブシジン酸
の添加濃度の最適範囲を１０〜３０ｍｇ／Ｌとしている
が、この範囲外においても冷蔵処理をしない場合よりも
小細胞塊の増殖量及び不定胚の形成数の大きい場合があ
るものである。

【００４６】同様に、冷蔵処理期間においても、最適期
間を１〜２ヶ月程度としているが、この範囲外において
も冷蔵処理をしない場合よりも小細胞塊の増殖量及び不
定胚の形成数の大きい場合があるものである。

【００４７】また、冷蔵温度は、上記実施例において
は、４℃としているが、４℃に限定されるわけではなく
０〜１０℃程度であればよいものであり、冷蔵温度の相
違により冷蔵処理の最適期間等も変動するものである。

【００４８】

【発明の効果】本発明に係る不定胚の増殖方法は、上記
のように構成されているので、以下に記すような効果を
有する。

【００４９】（１）少量の不定胚から、小細胞塊を介し
て、新しい大量の不定胚を作り出すことができ効率的で
あるとともに特別な装置を必要とせず低コストなため、
不定胚を利用した均質な苗生産の実用化を大きく前進さ
せることができるという優れた効果を有する。

【００５０】（２）上記三つの培養ステップの循環（ａ
→ｂ→ｃ→ａ→・・・）により、不定胚の維持・保存が
できるため、１回の外植片の培養で長期間にわたって繰
り返して、固体差の殆どない品質の安定した不定胚を得
ることができるという優れた効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る不定胚の増殖方法の概略を示す工
程図。

【図２】従来の不定胚の形成及び増殖方法を示す工程
図。

【図３】従来の不定胚の形成の概念を示す工程図。

【符号の説明】 １０ 不定胚 １２ 小細胞塊

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 不定胚の液体培地中にアブシジン酸を添
   加して冷蔵処理した後、振盪培養することを特徴とする
   不定胚の増殖方法。
2. 【請求項２】 アブシジン酸の添加濃度を液体培地中で
   １０〜３０ｍｇ／Ｌとすることを特徴とする請求項１記
   載の不定胚の増殖方法。
3. 【請求項３】 約４℃で１〜２ヶ月間の冷蔵処理をする
   ことを特徴とする請求項１記載の不定胚の増殖方法。