JPH0779714B2 - Ｎａｄｈ及び／又はｎａｄｐｈの可視部吸光法による定量法 - Google Patents
Ｎａｄｈ及び／又はｎａｄｐｈの可視部吸光法による定量法Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、NADH及び／又はNADPH（以下両者を総括して
述べるときにはNAD（Ｐ）Ｈと記す）を可視部吸光法に
よって高感度に測定する方法に関するものである。
述べるときにはNAD（Ｐ）Ｈと記す）を可視部吸光法に
よって高感度に測定する方法に関するものである。
［従来の技術］ NADHやNADPHの定量法としては、紫外部吸光法が最も一
般的な方法である。
般的な方法である。
［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら上述した紫外部吸光法では、濁質の影響を
受けやすいこと、NAD（Ｐ）Ｈの分子吸光係数が小さい
為十分な感度が得られないこと等といった欠点を有して
いた。
受けやすいこと、NAD（Ｐ）Ｈの分子吸光係数が小さい
為十分な感度が得られないこと等といった欠点を有して
いた。
そこでNAD（Ｐ）Ｈをジアホラーゼやフエナジンメトチ
ルサルフェート（PMS）等の触媒によって還元性発色色
素（ホルマザン発色法）に導き、感度を増加させたり或
は可視部域で測定することを可能とする様な技術の開発
が数多く試みられている。
ルサルフェート（PMS）等の触媒によって還元性発色色
素（ホルマザン発色法）に導き、感度を増加させたり或
は可視部域で測定することを可能とする様な技術の開発
が数多く試みられている。
しかしながらこの様なホルマザン発色法においても、生
じた発色物質が分析機器の流路を汚染するという別の問
題があった。またこの方法では還元された色素物質が不
溶化して十分な発色を示さなくなることがある為、反応
液に適当な分散剤を添加しておく必要があり、反応組成
液上も手間においても煩雑な方法である。更にNAD
（Ｐ）Ｈの酸化触媒としてPMSを用いる場合は、PMSが易
還元性である為反応系中に混在している他の還元物質も
PMSに直接作用して高いバックグラウンド吸収を示すこ
とが知られている。従って以後の工程でいずれの手順を
採用するにしても、高感度の定量法を実現するという所
期の目的に鑑みれば、酸化触媒としてPMSを用いること
は好ましいことではない。
じた発色物質が分析機器の流路を汚染するという別の問
題があった。またこの方法では還元された色素物質が不
溶化して十分な発色を示さなくなることがある為、反応
液に適当な分散剤を添加しておく必要があり、反応組成
液上も手間においても煩雑な方法である。更にNAD
（Ｐ）Ｈの酸化触媒としてPMSを用いる場合は、PMSが易
還元性である為反応系中に混在している他の還元物質も
PMSに直接作用して高いバックグラウンド吸収を示すこ
とが知られている。従って以後の工程でいずれの手順を
採用するにしても、高感度の定量法を実現するという所
期の目的に鑑みれば、酸化触媒としてPMSを用いること
は好ましいことではない。
本発明はこうした従来技術のもつ問題点を解決する為に
なされたものであって、その目的とするところは、分析
機器の流路を汚染する様な問題を生じることなく、高感
度にNADH及び／又はNADPHを定量できる様な方法を提供
することにある。
なされたものであって、その目的とするところは、分析
機器の流路を汚染する様な問題を生じることなく、高感
度にNADH及び／又はNADPHを定量できる様な方法を提供
することにある。
［問題点を解決する為の手段］ 上記目的を達成し得た本発明とは、NADH及び／又はNADP
Hを含む試料に、フラビン類の存在下で、NAD（Ｐ）Ｈ−
FMNオキシドレダクターゼ、NADH−FMNオキシドレダクタ
ーゼ、NADPH−FMNオキシドレダクターゼよりなる群から
選ばれた少なくとも１種の酵素を作用させ、生成する還
元型フラビン類を酸素の存在下で自動酸化させることに
よって過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素に色
原体及びペルオキシダーゼを作用させて酸化発色させ、
その吸光度を測定することによって試料中のNADH及び／
又はNADPHを定量する点に要旨を有するNADH及び／又はN
ADPHの可視部吸光法による定量法である。
Hを含む試料に、フラビン類の存在下で、NAD（Ｐ）Ｈ−
FMNオキシドレダクターゼ、NADH−FMNオキシドレダクタ
ーゼ、NADPH−FMNオキシドレダクターゼよりなる群から
選ばれた少なくとも１種の酵素を作用させ、生成する還
元型フラビン類を酸素の存在下で自動酸化させることに
よって過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素に色
原体及びペルオキシダーゼを作用させて酸化発色させ、
その吸光度を測定することによって試料中のNADH及び／
又はNADPHを定量する点に要旨を有するNADH及び／又はN
ADPHの可視部吸光法による定量法である。
［作用］ 本発明は上述の如く構成されるが、要は分析機器を汚染
するという問題を回避する為に過酸化水素の生成を経て
ペルオキシダーゼによる酸化発色に導く方法を基本的に
採用することとし、更に過酸化水素を生成させる手段と
してPMSの代りに、フラビン類の存在下でNADH−FMNオキ
シドレダクターゼ、NADPH−FMNオキシドレダクターゼ、
NAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクターゼよりなる群から
選ばれた少なくとも１種の酵素を用い、NADHやNADPH等
の定量を実現したものである。即ちNAD（Ｐ）Ｈを含む
測定系にフラビンを存在させた状態で、上記各種のオキ
シドレダクターゼを作用させ、生成する還元型フラビン
を分子状酸素によって自動酸化させて過酸化水素を生成
せしめ、NAD（Ｐ）Ｈを全て過酸化水素に転換させるも
のである。そしてこの生成した過酸化水素に色原体及び
ペルオキシダーゼを作用させることによって酸化発色を
行なわせるものであるが、このときの理論回収率も100
％であることを見出した。
するという問題を回避する為に過酸化水素の生成を経て
ペルオキシダーゼによる酸化発色に導く方法を基本的に
採用することとし、更に過酸化水素を生成させる手段と
してPMSの代りに、フラビン類の存在下でNADH−FMNオキ
シドレダクターゼ、NADPH−FMNオキシドレダクターゼ、
NAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクターゼよりなる群から
選ばれた少なくとも１種の酵素を用い、NADHやNADPH等
の定量を実現したものである。即ちNAD（Ｐ）Ｈを含む
測定系にフラビンを存在させた状態で、上記各種のオキ
シドレダクターゼを作用させ、生成する還元型フラビン
を分子状酸素によって自動酸化させて過酸化水素を生成
せしめ、NAD（Ｐ）Ｈを全て過酸化水素に転換させるも
のである。そしてこの生成した過酸化水素に色原体及び
ペルオキシダーゼを作用させることによって酸化発色を
行なわせるものであるが、このときの理論回収率も100
％であることを見出した。
尚NADH−FMNオキシドレダクターゼとはNADH−FMN系に特
異的に作用して酸化還元反応を進行させる酵素であり、
NADPH−FMNオキシドレダクターゼとはNADPH−FMN系に特
異的に作用して酸化還元反応を進行させる酵素の意味で
ある。又NAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクターゼとはNA
DH−FMN系及びNADPH−FMN系の両者に特異的に作用して
酸化還元反応を進行させる酵素の意味である。
異的に作用して酸化還元反応を進行させる酵素であり、
NADPH−FMNオキシドレダクターゼとはNADPH−FMN系に特
異的に作用して酸化還元反応を進行させる酵素の意味で
ある。又NAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクターゼとはNA
DH−FMN系及びNADPH−FMN系の両者に特異的に作用して
酸化還元反応を進行させる酵素の意味である。
本発明で用いるフラビン類としては、フラビンアデニン
ジヌクレオチド（FAD），フラビンモノヌクレオチド（F
MN），リボフラビン等があるがFMNが最適である。又本
発明で用いる各種オキシドレダクターゼは一般的に発光
細菌から分離されるが、特にビブリオ・ハーベアイから
得られるものが本発明方法に最適である。
ジヌクレオチド（FAD），フラビンモノヌクレオチド（F
MN），リボフラビン等があるがFMNが最適である。又本
発明で用いる各種オキシドレダクターゼは一般的に発光
細菌から分離されるが、特にビブリオ・ハーベアイから
得られるものが本発明方法に最適である。
本発明方法において、フラビン類としてFMNを用い、NAD
Hを定量する場合の反応系を例示すると下記（１）〜
（３）式の如く表わされる。
Hを定量する場合の反応系を例示すると下記（１）〜
（３）式の如く表わされる。
FMNH2＋O2→H2O2＋FMN …（２） 但し、上記（３）式は色原体として４−アミノアンチビ
リン（４−AA）とＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）ｍ−トルイジンナトリウム（TOO
S）を用いた場合を示したものであるが、上記（２）式
による過酸化水素（H2O2）の生成は非酵素的に極めて早
い速度で進行することが分かった。尚生成する発色物質
であるキノンイミンダイは波長555nmにおいて極大の吸
収を有するので、上記波長において吸光度の測定を行な
えば良い。
リン（４−AA）とＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）ｍ−トルイジンナトリウム（TOO
S）を用いた場合を示したものであるが、上記（２）式
による過酸化水素（H2O2）の生成は非酵素的に極めて早
い速度で進行することが分かった。尚生成する発色物質
であるキノンイミンダイは波長555nmにおいて極大の吸
収を有するので、上記波長において吸光度の測定を行な
えば良い。
次に本発明方法において、フラビン類としてFMNを用
い、NADPHを定量する場合の反応系を例示すると下記
（４）〜（６）式の如く表われるが、この反応系はNADH
の反応系の場合とほぼ同様に理解すれば良い。
い、NADPHを定量する場合の反応系を例示すると下記
（４）〜（６）式の如く表われるが、この反応系はNADH
の反応系の場合とほぼ同様に理解すれば良い。
FMNH2＋O2→H2O2＋FMN …（５） 上記の趣旨から明らかな様に、NADH−FMNオキシドレダ
クターゼ又はNADPH−FMNオキシドレダクターゼのいずれ
かを用いることによって、NADHやNADPHの夫々を個別的
に定量できるが、NAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクター
ゼを用いた場合はNADHとNADPHの混合物を総和として定
量することができる。
クターゼ又はNADPH−FMNオキシドレダクターゼのいずれ
かを用いることによって、NADHやNADPHの夫々を個別的
に定量できるが、NAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクター
ゼを用いた場合はNADHとNADPHの混合物を総和として定
量することができる。
本発明方法を実施するに当たっては、使用される酵素及
び基質並びに試薬等の濃度範囲は場合に応じて設定すれ
ばよく、何ら限定するものではないが、好ましい範囲を
例示すると下記の如くである。
び基質並びに試薬等の濃度範囲は場合に応じて設定すれ
ばよく、何ら限定するものではないが、好ましい範囲を
例示すると下記の如くである。
各種オキシドレダクターゼ …５〜1000mU/ml ペルオキシダーゼ …0.5〜10U/ml FMN …１〜10μＭ ４−AA …0.01〜0.1％ TOOS …0.02〜0.2％ 尚使用する緩衝液についても何ら限定するものではな
く、測定する対象や測定系に応じて従来使用されている
ものを選択すればよいが、pHは５〜９の範囲に設定すべ
きである。又上記４−AAやTOOS等は、ペルオキシダーゼ
反応における水素供与体としての色原体であり、設定し
たpHや選択した緩衝液に応じて他の色原体を用いること
もできる。
く、測定する対象や測定系に応じて従来使用されている
ものを選択すればよいが、pHは５〜９の範囲に設定すべ
きである。又上記４−AAやTOOS等は、ペルオキシダーゼ
反応における水素供与体としての色原体であり、設定し
たpHや選択した緩衝液に応じて他の色原体を用いること
もできる。
［実施例］ 以下本発明を実施例によって更に詳細に説明するが、下
記実施例は本発明を限定する性質のものではない。
記実施例は本発明を限定する性質のものではない。
実施例１ 胆汁酸（コール酸ナトリウム）をNADH−FMNオキシドレ
ダクターゼを用いて定量した。即ち下記（７）式によっ
て生成したNADHを、前記（１）〜（３）式に従って測定
することによって、コール酸ナトリウムが定量できる。
ダクターゼを用いて定量した。即ち下記（７）式によっ
て生成したNADHを、前記（１）〜（３）式に従って測定
することによって、コール酸ナトリウムが定量できる。
このときに使用した試薬は下記の如くである。
試薬１ 燐酸緩衝液（100mM）,pH7.0 …0.185ml ３α−ヒドロキシステロイド デヒドロゲナーゼ（75U/ml） …0.1ml NAD+（30mM） …0.1ml NADH−FMNオキシドレダクターゼ （0.6U/ml） …0.1ml FMN（1mM） …15μｌ 試薬２ ペルオキシダーゼ（90U/ml） …0.1ml TOOS（0.4％） …0.3ml ４−AA（0.2％） …0.3ml 燐酸緩衝液（pH7,100mM） …1.7ml 上記の試薬１に0.1mlのコール酸ナトリウムを加えた
後、１分以上経過してから試薬２を混合した。そして37
℃の温度下で、波長555nmにおける吸光度を測定した。
後、１分以上経過してから試薬２を混合した。そして37
℃の温度下で、波長555nmにおける吸光度を測定した。
尚上述の色原体がペルオキシダーゼの作用によって生成
するキノンイミンダイの分子吸光係数は、既存濃度の過
酸化水素及びウリカーゼ（3U/ml）並びに尿酸標準液の
添加実験の結果から、14.66mM-1cm-1であることが示さ
れた。また測定時のpH7.0は３α−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼの至適pHではないが、酵素量を増や
すことによって反応は５分以内に終結した。
するキノンイミンダイの分子吸光係数は、既存濃度の過
酸化水素及びウリカーゼ（3U/ml）並びに尿酸標準液の
添加実験の結果から、14.66mM-1cm-1であることが示さ
れた。また測定時のpH7.0は３α−ヒドロキシステロイ
ドデヒドロゲナーゼの至適pHではないが、酵素量を増や
すことによって反応は５分以内に終結した。
色原体としてのTOOSをフェノール系化合物に替えてアル
カリ条件下で反応を進行させれば、３α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼ量を減らすこともできる。
カリ条件下で反応を進行させれば、３α−ヒドロキシス
テロイドデヒドロゲナーゼ量を減らすこともできる。
実施例１に従って作成された検量線を第１図に示す。即
ち第１図はコール酸ナトリウム濃度と吸光度（555nm）
との関係を示すグラフである。
ち第１図はコール酸ナトリウム濃度と吸光度（555nm）
との関係を示すグラフである。
第１図に示した検量線によって、コール酸ナトリウムは
最終濃度が0.2〜50μＭの範囲で正確に測定できた。又
この結果から、本発明方法は血清中のごく微量のコール
酸をも測定できる感度を有していることが分かる。更に
このときの回収率は、前記分子吸光係数の値から100％
であることが確認された。
最終濃度が0.2〜50μＭの範囲で正確に測定できた。又
この結果から、本発明方法は血清中のごく微量のコール
酸をも測定できる感度を有していることが分かる。更に
このときの回収率は、前記分子吸光係数の値から100％
であることが確認された。
実施例２ グルコース−６−燐酸（以下Ｇ−６−Ｐと記す）をNADP
H−FMNオキシドレダクターゼを用いて定量した。即ち下
記（８）式によって生成したNADPHを、前記（４）〜
（６）式に従って測定することによってＧ−６−Ｐが定
量できる。
H−FMNオキシドレダクターゼを用いて定量した。即ち下
記（８）式によって生成したNADPHを、前記（４）〜
（６）式に従って測定することによってＧ−６−Ｐが定
量できる。
このときに使用した試薬は下記の如くである。
試薬１ 燐酸緩衝液（100mM）,pH7.0 …0.185ml Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナーゼ（30U/ml） …0.1ml NADP+（30mM） …0.1ml NADPH−FMNオキシドレダクターゼ （0.6U/ml） …0.1ml FMN（1mM） …15μｌ 試薬２ ペルオキシダーゼ（90U/ml） …0.1ml TOOS（0.4％） …0.3ml ４−AA（0.2％） …0.3ml 燐酸緩衝液（ph7,100mM） …1.7ml 上記の試薬１に0.1mlのＧ−６−Ｐを加えた後、１分以
上経過してから試薬２を混合した。そして波長555nmに
おける吸光度を測定した。分子吸光係数14.66mM-1cm-1
から求めた回収率は100％であった。
上経過してから試薬２を混合した。そして波長555nmに
おける吸光度を測定した。分子吸光係数14.66mM-1cm-1
から求めた回収率は100％であった。
実施例２に従って作成した検量線を第２図に示す。即ち
第２図はＧ−６−Ｐ濃度と吸光度の関係を示すグラフで
ある。第２図の結果からも明らかであるが、Ｇ−６−Ｐ
濃度が0.5〜40μＭの範囲で直線性を示しているのが分
かる。この様にして本発明方法に従ってＧ−６−Ｐ濃度
を高感度に測定することができる。
第２図はＧ−６−Ｐ濃度と吸光度の関係を示すグラフで
ある。第２図の結果からも明らかであるが、Ｇ−６−Ｐ
濃度が0.5〜40μＭの範囲で直線性を示しているのが分
かる。この様にして本発明方法に従ってＧ−６−Ｐ濃度
を高感度に測定することができる。
［発明の効果］ 上記の結果からも明らかであるが、NADH及び／又はNADP
Hを過不足なく過酸化水素に転換してペルオキシダーゼ
反応による酸化発色に導くことによって、分析機器の流
路を汚染する様な問題を生じることなく、高感度にNADH
及び／又はNADPHを定量できることになった。
Hを過不足なく過酸化水素に転換してペルオキシダーゼ
反応による酸化発色に導くことによって、分析機器の流
路を汚染する様な問題を生じることなく、高感度にNADH
及び／又はNADPHを定量できることになった。
第１図及び第２図は実施例1,2の夫々で求められた検量
線を示す。
線を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】NADH及び／又はNADPHを含む試料に、フラ
ビン類の存在下で、NAD（Ｐ）Ｈ−FMNオキシドレダクタ
ーゼ、NADH−FMNオキシドレダクターゼ、NADPH−FMNオ
キシドレダクターゼよりなる群から選ばれた少なくとも
１種の酵素を作用させ、生成する還元型フラビン類を酸
素の存在下で自動酸化させることによって過酸化水素を
生成させ、得られた過酸化水素に色原体及びペルオキシ
ダーゼを作用させて酸化発色させ、その吸光度を測定す
ることによって試料中のNADH及び／又はNADPHを定量す
ることを特徴とするNADH及び／又はNADPHの可視部吸光
法による定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9818287A JPH0779714B2 (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | Ｎａｄｈ及び／又はｎａｄｐｈの可視部吸光法による定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9818287A JPH0779714B2 (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | Ｎａｄｈ及び／又はｎａｄｐｈの可視部吸光法による定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63263097A JPS63263097A (ja) | 1988-10-31 |
| JPH0779714B2 true JPH0779714B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=14212878
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9818287A Expired - Lifetime JPH0779714B2 (ja) | 1987-04-20 | 1987-04-20 | Ｎａｄｈ及び／又はｎａｄｐｈの可視部吸光法による定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0779714B2 (ja) |
-
1987
- 1987-04-20 JP JP9818287A patent/JPH0779714B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63263097A (ja) | 1988-10-31 |
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