JPH0236237B2 - Pphidorokishiansokukosansokuteiyoshakusoseibutsu - Google Patents
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- JPH0236237B2 JPH0236237B2 JP1131782A JP1131782A JPH0236237B2 JP H0236237 B2 JPH0236237 B2 JP H0236237B2 JP 1131782 A JP1131782 A JP 1131782A JP 1131782 A JP1131782 A JP 1131782A JP H0236237 B2 JPH0236237 B2 JP H0236237B2
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はｐ―ヒドロキシ安息香酸測定用試薬組
成物に関するものである。
成物に関するものである。
最近、臨床検査薬の分野では血清コリンエステ
ラーゼの測定用試薬の開発が期待されている。従
来の血清コリンエステラーゼの測定法としては、
コリンエステラーゼをコリンエステルに作用さ
せ、有機酸とコリンを生成させ、またはコリンエ
ステルを残存させ、これらに従つていくつかの測
定法が見出されている。例えば、ｍ―ニトロフエ
ノール法として、コリンエステラーゼにより、ア
セチルコリンを加水分解し、生成した酢酸のため
に系のPHが下がることを利用し、基質添加後、一
定時間加温した後、発色剤としてｍ―ニトロフエ
ノールの混合液を加えて、その黄色の褪色度を測
定してコリンエステラーゼ活性を求める方法があ
る。ところが該方法は試料中の妨害物質、たとえ
ば有機酸類、緩衝化物質等の影響を受けやすい。
また反応を停止させて測定するため信頼性に欠
け、さらに反応時間を長く要するため多検体処理
には不向きである。
ラーゼの測定用試薬の開発が期待されている。従
来の血清コリンエステラーゼの測定法としては、
コリンエステラーゼをコリンエステルに作用さ
せ、有機酸とコリンを生成させ、またはコリンエ
ステルを残存させ、これらに従つていくつかの測
定法が見出されている。例えば、ｍ―ニトロフエ
ノール法として、コリンエステラーゼにより、ア
セチルコリンを加水分解し、生成した酢酸のため
に系のPHが下がることを利用し、基質添加後、一
定時間加温した後、発色剤としてｍ―ニトロフエ
ノールの混合液を加えて、その黄色の褪色度を測
定してコリンエステラーゼ活性を求める方法があ
る。ところが該方法は試料中の妨害物質、たとえ
ば有機酸類、緩衝化物質等の影響を受けやすい。
また反応を停止させて測定するため信頼性に欠
け、さらに反応時間を長く要するため多検体処理
には不向きである。
また、合成基質としてアセチルチオコリン、ブ
チリルチオコリン、プロピオニルチオコリン等の
コリンチオエステルを使用し、コリンエステラー
ゼの作用により生成するチオコリンを５，5′―ジ
チオビスニトロ安息香酸（DTNB）で発色させ、
比色定量するDTNB法がある。ところが、該方
法はDTNBがチオールと反応するため試料中に
チオール基が共存する場合、例えば血清中にグル
タチオンが添加される場合、影響を受けやすい。
チリルチオコリン、プロピオニルチオコリン等の
コリンチオエステルを使用し、コリンエステラー
ゼの作用により生成するチオコリンを５，5′―ジ
チオビスニトロ安息香酸（DTNB）で発色させ、
比色定量するDTNB法がある。ところが、該方
法はDTNBがチオールと反応するため試料中に
チオール基が共存する場合、例えば血清中にグル
タチオンが添加される場合、影響を受けやすい。
さらに基質ベンゾイルコリンとコリンエステラ
ーゼにより加水分解し、生成されるコリンにコリ
ンエステラーゼを作用させて過酸化水素とベタイ
ンに分解し、生成した過酸化水素をペルオキシダ
ーゼの作用により、フエノールと４―アミノアン
チピリンと酸化的に縮合させ赤色キノン色素を形
成する酵素（コリンオキシダーゼ）法がある。と
ころが該方法も還元剤、例えばアスコルビン酸、
ビリルビンまたはグルタチオンの影響を受けやす
い。また発色剤であるキノン色素の分子吸光係数
が各社市販測定用試薬により、かなりバラツキが
あり、標準法として問題を持つている。
ーゼにより加水分解し、生成されるコリンにコリ
ンエステラーゼを作用させて過酸化水素とベタイ
ンに分解し、生成した過酸化水素をペルオキシダ
ーゼの作用により、フエノールと４―アミノアン
チピリンと酸化的に縮合させ赤色キノン色素を形
成する酵素（コリンオキシダーゼ）法がある。と
ころが該方法も還元剤、例えばアスコルビン酸、
ビリルビンまたはグルタチオンの影響を受けやす
い。また発色剤であるキノン色素の分子吸光係数
が各社市販測定用試薬により、かなりバラツキが
あり、標準法として問題を持つている。
上記方法以外に基質であるベンゾイルコリンの
240nmにおける吸光度の減少速度を測定するUV
法や基質にアセチルコリンを用いてFe8+とヒド
ロキシルアミンを作用させて比色する方法があ
る。しかしこれらの方法は多数検体の処理には難
しい欠点がある。
240nmにおける吸光度の減少速度を測定するUV
法や基質にアセチルコリンを用いてFe8+とヒド
ロキシルアミンを作用させて比色する方法があ
る。しかしこれらの方法は多数検体の処理には難
しい欠点がある。
前述の従来の方法に比べて、コリンエステラー
ゼ活性をより正確に測定する方法として基質とし
てｐ―ヒドロキシベンゾイルコリンを用い、生成
したｐ―ヒドロキシ安息香酸をｐ―ヒドロキシ安
息香酸水酸化酵素およびNADPHによりプロト
カテキユ酸に変換し、この際のNADPHの減少
を、340nmにてレート・アツセイすることによ
り、コリンエステラーゼ活性を測定する方法が提
案されている（日本臨床検査自動化学会誌第６巻
補冊第166頁、1981年）。この方法は以下の反応を
利用する。
ゼ活性をより正確に測定する方法として基質とし
てｐ―ヒドロキシベンゾイルコリンを用い、生成
したｐ―ヒドロキシ安息香酸をｐ―ヒドロキシ安
息香酸水酸化酵素およびNADPHによりプロト
カテキユ酸に変換し、この際のNADPHの減少
を、340nmにてレート・アツセイすることによ
り、コリンエステラーゼ活性を測定する方法が提
案されている（日本臨床検査自動化学会誌第６巻
補冊第166頁、1981年）。この方法は以下の反応を
利用する。
ところが該方法において、一定量のコリンエス
テラーゼを含む試料に上記酵素および試薬を作用
させると、酵素量の増加に従い、コリンエステラ
ーゼ活性の測定量が増加する現象が見出された。
テラーゼを含む試料に上記酵素および試薬を作用
させると、酵素量の増加に従い、コリンエステラ
ーゼ活性の測定量が増加する現象が見出された。
本発明者等は上記方法では生成したプロトカテ
キユ酸が下記反応式で示されるようにｐ―ヒドロ
キシ安息香酸水酸化酵素の脱共役剤（アンカツプ
ラー）として作用し、NADPHの酸化をさらに
促進してしまう結果、測定値が実際より正誤差と
なることを見出した。
キユ酸が下記反応式で示されるようにｐ―ヒドロ
キシ安息香酸水酸化酵素の脱共役剤（アンカツプ
ラー）として作用し、NADPHの酸化をさらに
促進してしまう結果、測定値が実際より正誤差と
なることを見出した。
そして本発明者等はこれらの結果を考慮して、
基質としてｐ―ヒドロキシベンゾイルコリンを用
いるコリンエステラーゼの測定法において、生成
したｐ―ヒドロキシ安息香酸を正確に測定する方
法を見出すため、種々鋭意検討した結果、本発明
に到達した。
基質としてｐ―ヒドロキシベンゾイルコリンを用
いるコリンエステラーゼの測定法において、生成
したｐ―ヒドロキシ安息香酸を正確に測定する方
法を見出すため、種々鋭意検討した結果、本発明
に到達した。
すなわち本発明はｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸
化酵素、還元型補酵素およびプロトカテキユ酸
３，４―ジオキシゲナーゼまたはプロトカテキユ
酸、４，５―ジオキシゲナーゼを含有することを
特徴とするｐ―ヒドロキシ安息香酸測定用試薬組
成物である。
化酵素、還元型補酵素およびプロトカテキユ酸
３，４―ジオキシゲナーゼまたはプロトカテキユ
酸、４，５―ジオキシゲナーゼを含有することを
特徴とするｐ―ヒドロキシ安息香酸測定用試薬組
成物である。
本発明ではプロトカテキユ酸３，４―ジオキシ
ゲナーゼまたはプロトカテキユ酸４，５―ジオキ
シゲナーゼを使用することにより、ｐ―ヒドロキ
シ安息香酸水酸化酵素の脱共役剤（アンカツプラ
ー）として作用し、NADPHの酸化をさらに促
進するプロトカテキユ酸を系外へ除去し、正確に
ｐ―ヒドロキシ安息香酸を測定することが可能と
なる。また基質としてｐ―ヒドロキシベンゾイル
コリンを用いるコリンエステラーゼ活性測定にお
いて、本発明の試薬組成物を用いると、従来の測
定法に比べて還元剤（アスコルビン酸、ビリルビ
ン、グルタチオンなど）の影響がなく、還元型補
酵素の分子吸光係数も明確であり、正確にコリン
エステラーゼ活性測定を行なうことができ、今後
の標準法として期待されるのである。
ゲナーゼまたはプロトカテキユ酸４，５―ジオキ
シゲナーゼを使用することにより、ｐ―ヒドロキ
シ安息香酸水酸化酵素の脱共役剤（アンカツプラ
ー）として作用し、NADPHの酸化をさらに促
進するプロトカテキユ酸を系外へ除去し、正確に
ｐ―ヒドロキシ安息香酸を測定することが可能と
なる。また基質としてｐ―ヒドロキシベンゾイル
コリンを用いるコリンエステラーゼ活性測定にお
いて、本発明の試薬組成物を用いると、従来の測
定法に比べて還元剤（アスコルビン酸、ビリルビ
ン、グルタチオンなど）の影響がなく、還元型補
酵素の分子吸光係数も明確であり、正確にコリン
エステラーゼ活性測定を行なうことができ、今後
の標準法として期待されるのである。
本発明に使用するｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸
化酵素とはフラビン関与の外部電子供与体要求性
―原子酸素添加酵素に属し、酵素番号
EC1.14.13.2で示されるものを含む。その作用は
下記式で示される。
化酵素とはフラビン関与の外部電子供与体要求性
―原子酸素添加酵素に属し、酵素番号
EC1.14.13.2で示されるものを含む。その作用は
下記式で示される。
該酵素は細菌、特にシユードモナス属の菌、例
えばシユードモナス・デスモリテイカ、シユード
モナス・フルオレツセンス、シユードモナス・プ
チダなどから得られたものがある。
えばシユードモナス・デスモリテイカ、シユード
モナス・フルオレツセンス、シユードモナス・プ
チダなどから得られたものがある。
本発明に使用する還元型補酵素としては
NADPH，NADHなどがある。
NADPH，NADHなどがある。
本発明に使用するプロトカテキユ酸３，４―ジ
オキシゲナーゼとは、プロトカテキユ酸を３―カ
ルボキシ―シス―シス―ムコン酸（β―カルボキ
シムコン酸）に変換する酵素であり、非ヘム鉄関
与の二原子酸素添加酵素に属し、酵素番号
EC1.13.1.3のことである。該酵素の作用は下記式
で示される。
オキシゲナーゼとは、プロトカテキユ酸を３―カ
ルボキシ―シス―シス―ムコン酸（β―カルボキ
シムコン酸）に変換する酵素であり、非ヘム鉄関
与の二原子酸素添加酵素に属し、酵素番号
EC1.13.1.3のことである。該酵素の作用は下記式
で示される。
該酵素は細菌、特にシユードモナス属、ノカル
ジア属の菌およびノイロスポアから得られたもの
がある。
ジア属の菌およびノイロスポアから得られたもの
がある。
本発明に使用するプロトカテキユ酸４，５―ジ
オキシゲナーゼとはプロトカテキユ酸を２―ハイ
ドロキシ―４―カルボキシムコン酸セミアルデヒ
ドに変換する酵素であり、非ヘム鉄関与の二原子
酸素添加酵素に属し、酵素番号EC1.13.11.8のこ
とである。該酵素の作用は下記式で示される。
オキシゲナーゼとはプロトカテキユ酸を２―ハイ
ドロキシ―４―カルボキシムコン酸セミアルデヒ
ドに変換する酵素であり、非ヘム鉄関与の二原子
酸素添加酵素に属し、酵素番号EC1.13.11.8のこ
とである。該酵素の作用は下記式で示される。
該酵素は細菌、特にシユードモナス属の菌から
得られたものがある。
得られたものがある。
本発明の試薬組成物はｐ―ヒドロキシ安息香酸
水酸化酵素、還元型補酵素およびプロトカテキユ
酸３，４―ジオキシゲナーゼまたはプロトカテキ
ユ酸４，５―ジオキシゲナーゼを含有するもので
ある。酵素および補酵素の量は試料に応じて任意
に選択されるものである。
水酸化酵素、還元型補酵素およびプロトカテキユ
酸３，４―ジオキシゲナーゼまたはプロトカテキ
ユ酸４，５―ジオキシゲナーゼを含有するもので
ある。酵素および補酵素の量は試料に応じて任意
に選択されるものである。
本発明の試薬組成物を用いて測定するｐ―ヒド
ロキシ安息香酸はいかなる起源から由来したもの
でもよく、ｐ―ヒドロキシベンゾイルコリンにコ
リンエステラーゼを作用させて得られるｐ―ヒド
ロキシ安息香酸でもよい。
ロキシ安息香酸はいかなる起源から由来したもの
でもよく、ｐ―ヒドロキシベンゾイルコリンにコ
リンエステラーゼを作用させて得られるｐ―ヒド
ロキシ安息香酸でもよい。
コリンエステラーゼ活性を測定する場合には、
本発明の試薬組成物に、ｐ―ヒドロキシベンゾイ
ルコリン、緩衝液および必要によりフラビンアデ
ニンジヌクレオチド（FAD）を加える。緩衝液
はPH5.0〜11.0、好ましくはPH7.5〜9.0である。ま
た緩衝剤はリン酸、有機酸、その他生化学の分野
で広く用いられているもので良い。濃度は0.5M
〜0.01M程度が良い。
本発明の試薬組成物に、ｐ―ヒドロキシベンゾイ
ルコリン、緩衝液および必要によりフラビンアデ
ニンジヌクレオチド（FAD）を加える。緩衝液
はPH5.0〜11.0、好ましくはPH7.5〜9.0である。ま
た緩衝剤はリン酸、有機酸、その他生化学の分野
で広く用いられているもので良い。濃度は0.5M
〜0.01M程度が良い。
基質であるｐ―ヒドロキシベンゾイルコリンは
その塩であつても良く、濃度は0.01mM〜
100mM、好ましくは0.1〜10mMが良い。
その塩であつても良く、濃度は0.01mM〜
100mM、好ましくは0.1〜10mMが良い。
還元型補酵素はその塩でもよく、濃度は
0.05mM〜1mM程度、好ましくは0.1〜0.3mMが
良い。
0.05mM〜1mM程度、好ましくは0.1〜0.3mMが
良い。
FADはその塩でも良く、濃度は0.001〜0.1mM
程度、好ましくは0.01〜0.05mMが良い。FADに
代えてFMN、リボフラビン、リボフラビン4′，
5′―環状リン酸、フランビンペプチド、リボフラ
ビングルコシド、脂溶性リボフラビン誘導体を用
いてもよい。
程度、好ましくは0.01〜0.05mMが良い。FADに
代えてFMN、リボフラビン、リボフラビン4′，
5′―環状リン酸、フランビンペプチド、リボフラ
ビングルコシド、脂溶性リボフラビン誘導体を用
いてもよい。
ｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素は0.01〜50
単位／ml程度、特に0.2〜５単位／mlが良い。
単位／ml程度、特に0.2〜５単位／mlが良い。
プロトカテキユ酸３，４―ジオキシゲナーゼま
たはプロトカテキユ酸４，５―ジオキシゲナーゼ
は、0.001〜10単位／ml程度が良く、特に0.02〜
１単位／mlが良い。
たはプロトカテキユ酸４，５―ジオキシゲナーゼ
は、0.001〜10単位／ml程度が良く、特に0.02〜
１単位／mlが良い。
コリンエステラーゼの測定法としては上記試薬
を含有する反応混液をあらかじめ恒温にし、試料
を適量添加し、還元型補酵素の変化あるいは消費
された酸素量を測定する。
を含有する反応混液をあらかじめ恒温にし、試料
を適量添加し、還元型補酵素の変化あるいは消費
された酸素量を測定する。
反応温度は10〜45℃程度、特に20〜40℃が良
い。PHは5.0〜11.0程度、特にPH7.5〜9.0が好まし
い。
い。PHは5.0〜11.0程度、特にPH7.5〜9.0が好まし
い。
試料は生物化学的な物質なら何れでもよく、特
に血清、尿などが利用される。
に血清、尿などが利用される。
還元型補酵素の変化を測定する方法としては、
NADPHの吸光度の変化（340nm付近）や、その
他、螢光法、発光法、免疫法、電極法などが利用
される。
NADPHの吸光度の変化（340nm付近）や、その
他、螢光法、発光法、免疫法、電極法などが利用
される。
消費される酸素量は酸素電極等、ポーラロメト
リー法により測定できる。
リー法により測定できる。
反応はまず試料中のコリンエステラーゼにより
基質のｐ―ヒドロキシベンゾイルコリンが加水分
解され、ｐ―ヒドロキシ安息香酸が遊離される
（第１反応）。次にｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸化
酵素により、ｐ―ヒドロキシ安息香酸はプロトカ
テキユ酸となり、その際、同時に等モルの酸素分
子を消費し、同じく等モルの還元型補酵素が酸化
されて酸化型補酵素となる（第２反応）。生成し
たプロトカテキユ酸はプロトカテキユ酸３，４―
ジオキシゲナーゼにより３―カルボキシ―シス―
シス―ムコン酸を生成する。その際、、同時に等
モルの酸素分子を消費する（第３反応）。
基質のｐ―ヒドロキシベンゾイルコリンが加水分
解され、ｐ―ヒドロキシ安息香酸が遊離される
（第１反応）。次にｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸化
酵素により、ｐ―ヒドロキシ安息香酸はプロトカ
テキユ酸となり、その際、同時に等モルの酸素分
子を消費し、同じく等モルの還元型補酵素が酸化
されて酸化型補酵素となる（第２反応）。生成し
たプロトカテキユ酸はプロトカテキユ酸３，４―
ジオキシゲナーゼにより３―カルボキシ―シス―
シス―ムコン酸を生成する。その際、、同時に等
モルの酸素分子を消費する（第３反応）。
これらの反応は全て同時進行を行なつても良
く、また第１反応と第２反応以下に分離して行な
つてもよい。
く、また第１反応と第２反応以下に分離して行な
つてもよい。
本発明の試薬組成物を用いることにより、コリ
ンエステラーゼ活性測定において正確にまたは再
現性良く測定できる。又、ｐ―ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素の添加量も少なくて済む。
ンエステラーゼ活性測定において正確にまたは再
現性良く測定できる。又、ｐ―ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素の添加量も少なくて済む。
以下、本発明を実施例により説明する。
なお各酵素の活性測定法は以下の通りである。
ｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素：
トリス・マレート緩衝液 mM（PH8.2）
ｐ―ヒドロキシ安息香酸 0.5mM
NADPH 0.3mM
FAD 0.02mM
の反応液3.0ml（37℃）に酵素希釈液50μlを添加
し、340nmにおける吸光度の減少を測定する。１
分間当り1μmoleのNADPHを変化させる酵素量
を１単位とする。（NADPHの分子吸光係数6.22
cm3／micromole） プロトカテキユ酸３，４―ジオキシゲナーゼ： プロトカテキユ酸 0.4mM トリス・酢酸緩衝液 50mM（PH7.5） の反応液3.0mlに（24℃）に酵素希釈液50μlを添
加し、290nmにおける吸光度の減少を測定する。
１分間当り1μmoleのプロトカテキユ酸を変化さ
せる酵素量を１単位とする（プロトカテキユ酸分
子吸光係数3.8cm2／micromole）。
し、340nmにおける吸光度の減少を測定する。１
分間当り1μmoleのNADPHを変化させる酵素量
を１単位とする。（NADPHの分子吸光係数6.22
cm3／micromole） プロトカテキユ酸３，４―ジオキシゲナーゼ： プロトカテキユ酸 0.4mM トリス・酢酸緩衝液 50mM（PH7.5） の反応液3.0mlに（24℃）に酵素希釈液50μlを添
加し、290nmにおける吸光度の減少を測定する。
１分間当り1μmoleのプロトカテキユ酸を変化さ
せる酵素量を１単位とする（プロトカテキユ酸分
子吸光係数3.8cm2／micromole）。
プロトカテキユ酸４，５―ジオキシゲナーゼ：
プロトカテキユ酸 0.33mM
リン酸緩衝液 50mM（PH7.0）
の反応液3.0ml（24℃）に酵素希釈液（50mMリ
ン酸緩衝液、10％メタノール含有）0.1mlを添加
し、250nmにおける吸光度の減少を測定する。１
分間当り1μmoleのプロトカテキユ酸を変化させ
る酵素量を１単位とする（プロトカテキユ酸分子
吸光係数8.0cm2／micromole）。
ン酸緩衝液、10％メタノール含有）0.1mlを添加
し、250nmにおける吸光度の減少を測定する。１
分間当り1μmoleのプロトカテキユ酸を変化させ
る酵素量を１単位とする（プロトカテキユ酸分子
吸光係数8.0cm2／micromole）。
実施例 １
以下の様な反応混液を調製し、ｐ―ヒドロキシ
安息香酸を測定した。
安息香酸を測定した。
50mM トリス・マレート緩衝液 PH8.2
0.3mM NADPH
0.02mM FAD
ｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素 1U／ml
プロトカテキユ酸４，５―ジオキシゲナーゼ
0.1U 上記、反応混液4.0mlを37℃にて10分間予備加
温した。340nmにおける吸光度が一定になつた時
点で、ｐ―ヒドロキシ安息香酸水溶液を50μl添加
した。340nmにおける吸光度が減少し、15分後の
吸光度の変化を記録した。
0.1U 上記、反応混液4.0mlを37℃にて10分間予備加
温した。340nmにおける吸光度が一定になつた時
点で、ｐ―ヒドロキシ安息香酸水溶液を50μl添加
した。340nmにおける吸光度が減少し、15分後の
吸光度の変化を記録した。
ｐ―ヒドロキシ安息香酸水溶液濃度は０，
0.25，0.50，0.75，1.0mMとした。
0.25，0.50，0.75，1.0mMとした。
第１図に示す様に無添加のものは正確な値を示
さず正互差を生じるが、プロトカテキユ酸４，５
―ジハイドロオキシゲナーゼ添加のものは理論値
と一致した。
さず正互差を生じるが、プロトカテキユ酸４，５
―ジハイドロオキシゲナーゼ添加のものは理論値
と一致した。
実施例 ２
以下の様な反応混液を調整し血清コリンエステ
ラーゼの力価を測定した。
ラーゼの力価を測定した。
50mM トリス・マレート緩衝液 PH8.2
0.75mM ヒドロキシベンジルコリン
0.3mM NADPH
0.02mM FAD
ｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素
０〜2U／ml （プロトカテキユ酸３，４―ジオキシゲナー
ゼ 0.1U／ml） 上記、反応混液4.0mlを37℃にて10分間予備加
温した。340nmにおける吸光度が一定になつた時
点で、管理血清（モニ・トロール、DADE社）
50μlを添加し反応を開始した。５〜10分間の
340nmにおける吸光度の変化を記録した。１分間
当り1μmoleのNADPHを変化させる酵素量を１
単位としてコリンエステラーゼの力価を表示した
（NADPHの分子吸光係数6.22cm2／micr―
omole）。
０〜2U／ml （プロトカテキユ酸３，４―ジオキシゲナー
ゼ 0.1U／ml） 上記、反応混液4.0mlを37℃にて10分間予備加
温した。340nmにおける吸光度が一定になつた時
点で、管理血清（モニ・トロール、DADE社）
50μlを添加し反応を開始した。５〜10分間の
340nmにおける吸光度の変化を記録した。１分間
当り1μmoleのNADPHを変化させる酵素量を１
単位としてコリンエステラーゼの力価を表示した
（NADPHの分子吸光係数6.22cm2／micr―
omole）。
本測定法によりｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸化
酵素の量を変えると第２図に示す様にｐ―ヒドロ
キシ安息香酸水酸化酵素の量により血清コリンエ
ステラーゼの値が変化することが解つた。そこに
プロトカテキユ酸３，４―ジオキシゲナーゼを
0.1U／mlを添加させると血清コリンエステラー
ゼの値が一定となつた。又、反応がすみやかにす
すみ、ｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の添加
量も少なくできた。
酵素の量を変えると第２図に示す様にｐ―ヒドロ
キシ安息香酸水酸化酵素の量により血清コリンエ
ステラーゼの値が変化することが解つた。そこに
プロトカテキユ酸３，４―ジオキシゲナーゼを
0.1U／mlを添加させると血清コリンエステラー
ゼの値が一定となつた。又、反応がすみやかにす
すみ、ｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の添加
量も少なくできた。
参考例 １
コリンオキシダーゼ法は次の様に行つた。
反応混液
50mM トリス・マレート緩衝液 PH8.2
フエノール 100mg／dl
４―アミノアンチピリン 20mg／dl
ペルオキシダーゼ
1000U／dl（プルプロガリン単位） コリンオキシダーゼ 100U／dl 塩化ベンゾイルコリン 50mg／dl 反応混液2.0mlをあらかじめ37℃に10分間予備
加温しておき、その後試料を20μlを添加した。正
確に５分37℃加温したのち停止液（硫酸ネオスチ
グミン100mg／dl）を2.0ml加え、10分、37℃加温
したのち、500nmにて測定した。盲検は試料を添
加せず同様の操作を行なつた。
1000U／dl（プルプロガリン単位） コリンオキシダーゼ 100U／dl 塩化ベンゾイルコリン 50mg／dl 反応混液2.0mlをあらかじめ37℃に10分間予備
加温しておき、その後試料を20μlを添加した。正
確に５分37℃加温したのち停止液（硫酸ネオスチ
グミン100mg／dl）を2.0ml加え、10分、37℃加温
したのち、500nmにて測定した。盲検は試料を添
加せず同様の操作を行なつた。
本法Ｘ（実施例２）とコリンオキシダーゼ法Ｙ
の相関は Ｙ＝1.82×36 γ＝0.995（ｎ＝48）となり良好
であつた。
の相関は Ｙ＝1.82×36 γ＝0.995（ｎ＝48）となり良好
であつた。
第１図はｐ―ヒドロキシ安息香酸を測定するに
当り、プロトカテキユ酸４，５―ジオキシゲナー
ゼを添加した場合（●―――●）と無添加の場合
（○―――○）の340nmの吸光度変化を示す。第２
図はコリンエステラーゼ活性とｐ―ヒドロキシ安
息香酸水酸化酵素との関係をプロトカテキユ酸
３，４―ジオキシゲナーゼ（0.1単位／ml）添加
した場合（●―――●）と無添加の場合（○―――
○）を示す。
当り、プロトカテキユ酸４，５―ジオキシゲナー
ゼを添加した場合（●―――●）と無添加の場合
（○―――○）の340nmの吸光度変化を示す。第２
図はコリンエステラーゼ活性とｐ―ヒドロキシ安
息香酸水酸化酵素との関係をプロトカテキユ酸
３，４―ジオキシゲナーゼ（0.1単位／ml）添加
した場合（●―――●）と無添加の場合（○―――
○）を示す。
Claims (1)
- １ ｐ―ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素、還元型
補酵素およびプロトカテキユ酸３，４―ジオキシ
ゲナーゼまたはプロトカテキユ酸４，５―ジオキ
シゲナーゼを含有することを特徴とするｐ―ヒド
ロキシ安息香酸測定用試薬組成物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1131782A JPH0236237B2 (ja) | 1982-01-26 | 1982-01-26 | Pphidorokishiansokukosansokuteiyoshakusoseibutsu |
| DE19833302360 DE3302360A1 (de) | 1982-01-26 | 1983-01-25 | Reagenszusammensetzung zur bestimmung von p-hydroxybenzoesaeure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1131782A JPH0236237B2 (ja) | 1982-01-26 | 1982-01-26 | Pphidorokishiansokukosansokuteiyoshakusoseibutsu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58129999A JPS58129999A (ja) | 1983-08-03 |
| JPH0236237B2 true JPH0236237B2 (ja) | 1990-08-16 |
Family
ID=11774636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1131782A Expired - Lifetime JPH0236237B2 (ja) | 1982-01-26 | 1982-01-26 | Pphidorokishiansokukosansokuteiyoshakusoseibutsu |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0236237B2 (ja) |
| DE (1) | DE3302360A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0662521B2 (ja) * | 1988-02-24 | 1994-08-17 | 日東紡績株式会社 | 新規コリン誘導体及びそれを用いた血清コリンエステラーゼ活性測定法 |
| JP2008206491A (ja) * | 2007-02-28 | 2008-09-11 | Toyobo Co Ltd | ｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の安定化方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5935599B2 (ja) * | 1980-12-25 | 1984-08-29 | 株式会社 シノテスト研究所 | コリンエステラ−ゼ活性測定法 |
| DE3265517D1 (en) * | 1981-03-04 | 1985-09-26 | Fujirebio Kk | Method for determining the activity of cholinesterase and diagnostic solution for use therein |
-
1982
- 1982-01-26 JP JP1131782A patent/JPH0236237B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1983
- 1983-01-25 DE DE19833302360 patent/DE3302360A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3302360A1 (de) | 1983-08-04 |
| JPS58129999A (ja) | 1983-08-03 |
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