JPH0779772A

JPH0779772A - 細胞培養液及びその培養液を用いたスフェロイドの製造方法

Info

Publication number: JPH0779772A
Application number: JP5227006A
Authority: JP
Inventors: Kanetomo Kobayashi; 謙友小林; Michiko Tsuchida; 路子土田; Manabu Yamazaki; 学山崎; Yuichi Mori; 森　　有一
Original assignee: WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co
Current assignee: WR Grace and Co Conn; WR Grace and Co
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1993-09-13
Publication date: 1995-03-28

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、大量の同じ大きさの機能細胞集合体
（スフェロイド）を形成するのに適した細胞培養液、な
らびに、大量の同じ大きさのスフェロイドを形成する方
法を提供することを目的とする。【構成】ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリド
ン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等
の水溶性高分子化合物を含有し、粘度が５ｃＰ以上であ
る細胞培養液を用いて、回転培養法、還流培養法及び、
浮遊培養法により動物細胞を培養することにより、目的
とするサイズ（目的とする細胞数）のスフェロイドを大
量に、しかも短時間に製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、大量の同じ大きさの機
能細胞集合体（スフェロイド）を形成するのに適した細
胞培養液に関する。また、大量の同じ大きさのスフェロ
イドを形成するのに適した細胞培養方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】今日、細胞培養技術は、バイオテクノロ
ジーを支える上での重要な基礎技術の１つであると共
に、インターフェロンなどの細胞産生物の生産や、薬剤
の毒性及び薬理活性評価のシュミレーターとして既に広
く利用されており、今後その重要性はますます高まるも
のと考えられている。

【０００３】この様に、広く利用されている細胞培養技
術ではあるが、従来の細胞培養法（単層培養法）には、
いくつかの問題点があった。その１つは、細胞が生体内
で有している特異的な機能を長期間維持することができ
ない点であり、もう１つは、生体内と同様な組織を再構
築する事ができない、という点であった。

【０００４】これらの問題点を解決するための培養方法
として、スフェロイド培養法が、非常に注目を集めてい
る。スフェロイド培養法では、細胞が３次元集合体を形
成しているため、単層培養法と比較して、細胞の特異的
な機能を長期間維持でき、かつ、生体内と類似の３次元
構造を作ることができる。この特性を生かし、１）薬剤
の毒性及び薬理活性評価用のシュミレーター、２）ハイ
ブリッド型人工臓器、３）バイオリアクターなどの分野
で、スフェロイド培養法を利用した研究開発が活発に行
われている。

【０００５】しかしながら、従来のスフェロイド形成法
は、細胞非接着性基質［たとえば、アガロース、寒天な
どをコートした培養皿など（Ｊ．Ｃａｒｌｓｓｏｎａ
ｎｄＪ．Ｍ．Ｙｕｎｈａｓ．ｐ．ｐ．１−２３．ＲＲＣ
Ｒ９５：ＳｐｈｅｒｏｉｄｓｉｎＣａｎｃｅｒ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｄｓ：Ｈ．Ａｃｋｅｒ．Ｊ．Ｃ
ａｒｌｓｓｏｎＲ．ＤｕｒａｎｄａｎｄＲ．Ｍ．
Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ．１９８４）］、または、細胞半接着性基質［たとえ
ば、プロテオグリカンをコートした培養皿、陽性電荷を
付与した培養皿など（Ｎ．Ｋｏｉｄｅｅｔａｌ．，
Ｅｘｐ．ＣｅｌｌＲｅｓ．，１８６，２２７，１９９
０）］上で細胞を培養し、細胞が偶発的、または、自発
的に凝集して、スフェロイドを形成するものであった。
従って、スフェロイドを形成する細胞の種類は主に癌細
胞、胎児細胞、肝細胞に限定され、かつ、スフェロイド
の大きさをコントロールすることはできず、形成される
スフェロイドの大きさは非常に広い分布を持っていた。

【０００６】スフェロイドの大きさは、スフェロイドを
構成する細胞の数に依存する。（竹沢、森、吉里：応用
細胞生物学研究、９：１−１１．１９９１）即ち、従来
のスフェロイド形成法では、細胞数が制御されたスフェ
ロイドを作ることはできなかった。

【０００７】以下には細胞数が制御されたスフェロイド
の必要性を述べる。生体は細胞の集合体であるが、毛細
血管が全身をくまなく覆っているために、生体のどの部
分の細胞も、栄養分や酸素の補給と老廃物の除去という
点において、十分な状態に保たれている。しかしなが
ら、現在、形成することのできるスフェロイドの大多数
は、生体の毛細血管に当たる、輸送のための管腔構造を
持たない。従って、大きなスフェロイド（例えば１ｍｍ
以上）においては、スフェロイドの中心部の細胞と外表
面の細胞では、酸素、栄養分の供給と老廃物の除去にお
いて大きな差がでてくると考えられる。スフェロイドを
或大きさ（例えば２００μｍ）以下にすれば、スフェロ
イドを構成するすべての細胞をほぼ同じ状態にすること
が可能である。また、同じ大きさのスフェロイドを大量
に作成することができれば、スフェロイド間の細胞の状
態の差をなくすこともできる。

【０００８】この様な大きさのそろった（細胞数が制御
された）スフェロイドを多量に製造することができれ
ば、従来の単層培養法に代わる応用分野を開発すること
もできる。

【０００９】例えば、薬剤の毒性及び薬理活性評価用シ
ュミレーターを例にとってみると、従来の単層培養法で
は、細胞の生または死によってのみ、薬剤の毒性または
薬理活性を評価してきた。従って、細胞死に至らないよ
うな毒性を正確に評価することができなかった。しかし
ながら、スフェロイドを用いることにより、スフェロイ
ドの生死は勿論のこと、スフェロイド内の細胞の有する
特異的な機能の向上または低下、更に、スフェロイドが
形成する生体と類似の３次元構造に対する組織学的な検
査等により、従来法に代わる、非常に感度の高い薬剤の
毒性及び薬理活性評価用シュミレーターになると考えら
れる。仮にこの様な新しい評価方法が開発されると、現
在行われている動物実験を大幅に削減できるものと期待
される。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】細胞数が制御されたス
フェロイドの形成方法として、特開平０４−２７８０８
３と特開平０４−２７８０７５が提案されている。これ
らの方法は、温度感応性高分子化合物と細胞接着性物質
の混合物を細胞培養基材として用い、かつ細胞の接着、
増殖できる面積を制御することにより、細胞数が制御さ
れたスフェロイドを大量に作成する事ができるという画
期的なものである。しかしながら、これらの方法に記載
された培養基材より回収される多数の細胞シートを、そ
のまま回転培養法、還流培養法及び、浮遊培養法などの
既存の大量培養法に応用すると、回収した細胞シートが
スフェロイドを形成する過程において、お互いに接着、
凝集して大きなスフェロイドになってしまい、目的とす
る細胞数が制御されたスフェロイドをうまく作成するこ
とができない、と言う欠点を有していた。そこで本発明
はこれらの欠点を改良した、細胞培養液及び培養方法を
提供することを目的としている。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記目的は水溶性高分子
化合物を含有する培養液において、その粘度が５ｃＰ以
上である細胞培養液を用いることにより達成された。こ
こで言う粘度とは、３７℃における粘度を指す［粘度
（ｃＰ）＝動粘度（ｃＳｔ）×密度（ｇ／ｃｍ³）］。
ただし、粘度は２０００ｃＰ以下であることが望まし
い。なぜならこれ以上の粘度になると操作性が著しく悪
くなるためである。望ましくは、１０ｃＰから５００ｃ
Ｐである。この範囲であれば、培養液の操作性も良好で
ある。更に望ましくは、１０ｃＰから１００ｃＰであ
る。この範囲内では、培養液の操作性も非常に良好で、
かつ目的とするサイズのスフェロイドを確実に大量生産
できる。

【００１２】水溶性高分子化合物は、培養する細胞に毒
性を示さないようなものであればどのようなものでもよ
い。例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロ
リドン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール／
プロピレングリコール共重合体、ポリエチレンイミンポ
リビニルメチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリビ
ニルアルコール、ポリアクリル酸、マレイン酸共重合
体、デキストラン、アルギン酸、カラゲーナン、デンプ
ン、ゼラチン、コラーゲンなどがあげられる。これら水
溶性高分子の単体でもよいし、何種類かの水溶性高分子
の混合物でもよい。また、これら水溶性高分子の共重合
体でもよい。ここにあげたのは水溶性高分子化合物の例
でありこれらに限定されるものではない。望ましくは、
ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、メチ
ルセルロース、カルボキシメチルセルロースの何れか、
または、それらの混合物である。

【００１３】一般に、培養液の粘度は添加される血清の
濃度に支配されるが、粘度が細胞の増殖などに影響を与
えることはほとんど無い。しかしながら、懸濁培養の場
合、撹拌による細胞へのダメージを軽減するために、カ
ルボキシメチルセルロースやポリビニルピロリドンなど
を少量添加して培養液の粘度を上げることがある。この
方法は、血清の濃度が低い場合や、血清を加えない場合
に応用される（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，“Ｃｕｌｔ
ｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ”，ｐ．７
１．ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ．Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏ
ｒｋ）。

【００１４】本発明では、細胞数の制御された細胞シー
トから、同じ大きさのスフェロイドを大量に製造する過
程において、高粘度の培養液を用いることにより、細胞
シート、またはスフェロイド同士の接触をなくし、細胞
数の制御されたスフェロイドを大量に製造することを目
的としている。従って、本発明の目的は、上記細胞に対
するダメージの軽減とは本質的に異なるものである。

【００１５】また、本発明は、上記高粘度の細胞培養液
を用い、動物細胞を回転培養法、還流培養法及び、浮遊
培養法により培養することにより達成される。ここで言
う動物細胞とは、細胞数の制御された細胞シートまた
は、スフェロイドを指す。細胞シートの大きさは、０．
０１ｃｍ²から１０ｃｍ²で、細胞数は５０から１０
⁶個、スフェロイドの大きさは（直径）５０μｍから１
５００μｍの範囲に含まれるものとする。ただし、細胞
シートまたはスフェロイドを構成する細胞の種類は、複
数であってもよく、特に限定されない。また、回転培養
法、還流培養法及び浮遊培養法とは、一般的に接着依存
性細胞、または接着非依存性細胞の大量培養法として既
に用いられている方法で、これらの範疇に含まれるもの
はすべて含まれ、特に限定されるものではない。

【００１６】本発明の細胞培養液、及び培養方法を用い
ることにより、目的とするサイズ（目的とする細胞数）
のスフェロイドを大量に、しかも短時間に製造すること
ができる。また本発明は、既存の培養装置に適用できる
ため非常に経済的である。

【００１７】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明する。本発明の範囲は請求の範囲により画定され
るものであり、以下の実施例により限定されるものでは
ない。

【００１８】１．ディッシュのコート０．５％（ｗ／ｖ）牛真皮ペプシン可溶化タイプＩコラ
ーゲン溶液（ｐＨ３）（ＫＯＫＥＮＣＥＬＬＧＥＮ
Ｉ−ＰＣ，（株）高研製）と０．５％（ｗ／ｖ）ポリ
−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（以下ＰＮＩＰＡＡ
ｍ、Ｍｎ＝３．５×１０⁶）水溶液（塩酸でｐＨ３に調
整、この溶液はオートクレーブ処理後再溶解したもの）
を、コラーゲンとＰＮＩＰＡＡｍの混合比１対１９、に
なるように混合しキャスティング溶液を調整した。これ
らキャスティング溶液の０．８ｍｌを、市販のφ６０ｍ
ｍディッシュ（Ｆａｌｃｏｎ＃３００２，日本ベクト
ン製）に分注し、すばやく均一にのばしてコーティング
した。その後、１０℃のインキュベーター内で約１０時
間乾燥させた。φ６０ｍｍのポリエチレンシートにφ５
ｍｍの穴を２４個開けた紫外線照射マスクをつくり、こ
れをディッシュにのせて紫外線照射装置（ＸＸ−１０
０，波長２５４ｎｍ，フナコシ製）で紫外線を照射し
た。紫外線は、マスクのφ５ｍｍの穴を通過してのみ照
射され、他の部分は紫外線を透過しない。紫外線照射エ
ネルギーは２０００Ｊ／ｍ²とした。コーティング及び
紫外線の照射は、無菌的な環境下で行った。

【００１９】２．細胞シートの作成ヒト真皮由来の線維芽細胞をダルベッコ改変イーグル培
地（Ｄ−ＭＥＭ，１０％牛胎児血清含有、ＧＩＢＣＯ社
製）を用いて、最終細胞濃度が約２×１０⁵細胞／ｍｌ
になるように細胞分散液を作成し、３７℃に保温した。
また、コートディッシュは、あらかじめ３７℃に保温し
ておいたプレート（マイクロウォームプレート、北里サ
プライ製）の上にのせ保温し、細胞分散液を４ｍｌ注入
した。これを素早く３７℃の炭酸ガスインキュベーター
（５％炭酸ガス）内に移し３日間培養した。

【００２０】３日後ディッシュをインキュベーターより
出し、細胞の接着を直ちに確認した。細胞は紫外線が照
射されたφ５ｍｍの円の部分にのみに接着し、コンフル
エントの状態となっていた。この様なφ５ｍｍの細胞の
モノレーヤーを１枚のディッシュの中に２４個確認する
ことができた。ディッシュを冷蔵庫に入れ、１０分間放
置し、その後冷蔵庫より取り出し細胞の剥離を確認し
た。冷却することにより、コートしたＰＮＩＰＡＡｍが
完全に溶解し、接着した細胞はφ５ｍｍの細胞シートと
して、１枚のディッシュから２４個回収することができ
た。回収された細胞シートは直ちにスフェロイドの大量
製造実験に用いられた。

【００２１】３．スフェロイドの大量製造表１に示したような濃度の水溶性高分子を含む培養液６
ｍｌを予め分注した培養チューブ（Ｆａｌｃｏｎ＃２
０５９，日本ベクトン製）１本に、１枚のディッシュよ
り回収された２４個の細胞シートを、ピペットを用いす
べて移した。培養チューブは回転培養機（ＭＢＳ−１
Ｂ，東京理科器械製）にセットし、３７℃で２日間培養
した。培養条件は、角度水平、３０回転／分とした。

【００２２】２日後、培養液をチューブから取り出し、
形成されたスフェロイドの数をカウントした。すべての
スフェロイドが同じ大きさで、かつ細胞数が制御されて
いる場合には、回収されるスフェロイドの数は２４個と
なる。また、細胞シートがスフェロイドの形成する過程
において、お互いに接触し、目的とするサイズのスフェ
ロイドが形成されなかった場合には、回収される数は２
４個より少なくなる。結果を表１に示した。培養液の粘
度を適度に上げることにより、目的とするサイズのスフ
ェロイドを大量に製造することができた。

【００２３】

【表１】培養液に添加濃度培養液の粘度回収したスフェした高分子 (％) （ｃＰ）ロイドの数（個）１ − ００．７１２メチルセルロース０．２２．２４３メチルセルロース０．５１１．５２４４メチルセルロース１．０８３．６２４５メチルセルロース１．３２９３１８６メチルセルロース１．５３８７１５７メチルセルロース２．０１２４１２０８ポリエチレングリコール１．３２００１７

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者土田路子神奈川県厚木市戸室671−１ＳＡＴＩＩＩＡＴＳＵＧＩ 306 (72)発明者山崎学神奈川県秦野市鶴巻北２丁目５−37−405 (72)発明者森有一神奈川県横浜市金沢区釜利谷町1642−212 Ｂ−４

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】水溶性高分子化合物を含有し、粘度が５ｃ
Ｐ以上である細胞培養液。
【請求項２】前記水溶性高分子化合物が、ポリエチレン
グリコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロースの何れか、または、そ
れらの混合物である請求項１記載の細胞培養液。
【請求項３】請求項１または２記載の細胞培養液を用
い、回転培養法、還流培養法及び、浮遊培養法により動
物細胞を培養することを特徴とする、スフェロイドの製
造方法。