JPH0780780B2 - 細胞外マトリックスの蓄積防止のためのトランスフォーミング増殖因子βの阻害 - Google Patents
細胞外マトリックスの蓄積防止のためのトランスフォーミング増殖因子βの阻害Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、増殖因子一般に関し、さらに詳細には、細胞
外マトリックスの過剰産生に対するトランスフォーミン
グ増殖因子−βの影響に関する。
外マトリックスの過剰産生に対するトランスフォーミン
グ増殖因子−βの影響に関する。
種々の病気は、細胞外マトリックス物質の有害な蓄積に
より特徴付けられる。例えば、進行性の糸球体の疾患で
は、細胞外マトリックスが糸球体あるいは糸球体の基底
膜に蓄積し、遂には、末期症状および尿毒症を引き起こ
す。同様に、成人性呼吸困難症候群（ARDS）には、肺中
でのマトリックス物質の蓄積が関与し、一方、肝硬変
は、肝臓でのマトリックスの有害な蓄積により特徴付け
られる。
より特徴付けられる。例えば、進行性の糸球体の疾患で
は、細胞外マトリックスが糸球体あるいは糸球体の基底
膜に蓄積し、遂には、末期症状および尿毒症を引き起こ
す。同様に、成人性呼吸困難症候群（ARDS）には、肺中
でのマトリックス物質の蓄積が関与し、一方、肝硬変
は、肝臓でのマトリックスの有害な蓄積により特徴付け
られる。
細胞外マトリックスは、複雑なスーパーストラクチャー
に集積した、プロテオグリカン、糖タンパク質およびコ
ラーゲンの混合物である。多くの免疫学的、血流力学的
および毒性の因子が、糸球体疾患を誘起するために実験
的に用いられてきたが、これらの因子のいずれも細胞外
マトリックス成分の合成あるいは分解に直接影響を与え
ることが示されなかった。従って、急性の細胞損傷と糸
球体での細胞外マトリックスの蓄積との間には、他の介
在プロセスが存在すると推測される。
に集積した、プロテオグリカン、糖タンパク質およびコ
ラーゲンの混合物である。多くの免疫学的、血流力学的
および毒性の因子が、糸球体疾患を誘起するために実験
的に用いられてきたが、これらの因子のいずれも細胞外
マトリックス成分の合成あるいは分解に直接影響を与え
ることが示されなかった。従って、急性の細胞損傷と糸
球体での細胞外マトリックスの蓄積との間には、他の介
在プロセスが存在すると推測される。
そのため、腎臓疾患のような病的状態でマトリックス成
分の有害な蓄積を調節する因子を調べる必要がある。さ
らに、不適切なマトリックス蓄積を含む病的状態を、阻
止、制限、あるいは処置するために、この様な物質を制
御する必要がある。本発明はこれらの必要を満足し、そ
して関連した利点をも提供する。
分の有害な蓄積を調節する因子を調べる必要がある。さ
らに、不適切なマトリックス蓄積を含む病的状態を、阻
止、制限、あるいは処置するために、この様な物質を制
御する必要がある。本発明はこれらの必要を満足し、そ
して関連した利点をも提供する。
発明の要約 本発明は、細胞外マトリックスの蓄積により特徴付けら
れる疾患の進行を、同化性で線維症および脈管形成を導
く増殖因子ペプチドであるトランスフォーミング増殖因
子β（TGF−β）の活性を抑制する物質を提供すること
で、処置あるいは停止する方法を提供する。一つの実施
態様では、この様な物質は抗TGF−β抗体である。この
様に処置され得る病気は、種々の線維症疾患を含む。本
発明はさらに、組織中でのTGF−βのレベルを調べて高
いレベルがこの様な病気の指標であるとすることで、組
織中での細胞外マトリックス成分の蓄積により特徴付け
られる病気あるいは初期の病気を診断する方法を提供す
る。
れる疾患の進行を、同化性で線維症および脈管形成を導
く増殖因子ペプチドであるトランスフォーミング増殖因
子β（TGF−β）の活性を抑制する物質を提供すること
で、処置あるいは停止する方法を提供する。一つの実施
態様では、この様な物質は抗TGF−β抗体である。この
様に処置され得る病気は、種々の線維症疾患を含む。本
発明はさらに、組織中でのTGF−βのレベルを調べて高
いレベルがこの様な病気の指標であるとすることで、組
織中での細胞外マトリックス成分の蓄積により特徴付け
られる病気あるいは初期の病気を診断する方法を提供す
る。
図面の簡単な説明 図１は、プロテオグリカン産生に対するTGF−βの投与
量応答効果のSDS−PAGEによる分析を示している。ラッ
トの糸球体間質細胞培養を、TGF−βと共に48時間処理
し、そして35Ｓ硫酸塩で代謝により標識した。等量の調
整培地を、SDS−PAGEおよび蛍光写真で分析した。0.25n
g/ml（レーン２）から始まり、PGIおよびPGIIのバンド
が増大している。2.5ng/ml（レーン４）では、電気泳動
の移動度のシフトが見られ、そして75および150ng/ml
（レーン７および８）の高濃度では阻害効果が見られ
る。レーン１はコントロールであり、レーン２−８は0.
25、0.75、2.5、25、75および150ng/mlのTGF−βでの結
果を示している。
量応答効果のSDS−PAGEによる分析を示している。ラッ
トの糸球体間質細胞培養を、TGF−βと共に48時間処理
し、そして35Ｓ硫酸塩で代謝により標識した。等量の調
整培地を、SDS−PAGEおよび蛍光写真で分析した。0.25n
g/ml（レーン２）から始まり、PGIおよびPGIIのバンド
が増大している。2.5ng/ml（レーン４）では、電気泳動
の移動度のシフトが見られ、そして75および150ng/ml
（レーン７および８）の高濃度では阻害効果が見られ
る。レーン１はコントロールであり、レーン２−８は0.
25、0.75、2.5、25、75および150ng/mlのTGF−βでの結
果を示している。
図２は、糸球体間質細胞により分泌されるタンパク質の
合成に対するTGF−βの効果を示している。ラットの糸
球体間質細胞をTGF−βと共に48時間処理し、そして35
Ｓメチオニンで代謝により標識した。等量の調整培地
を、SDS−PAGEおよび蛍光写真で分析した。TGF−βは、
分泌されたタンパク質の一般的パターンには影響を与え
なかった。
合成に対するTGF−βの効果を示している。ラットの糸
球体間質細胞をTGF−βと共に48時間処理し、そして35
Ｓメチオニンで代謝により標識した。等量の調整培地
を、SDS−PAGEおよび蛍光写真で分析した。TGF−βは、
分泌されたタンパク質の一般的パターンには影響を与え
なかった。
図３は、プロテオグリカン産生に対する成長の因子の効
果を示している。ラットの糸球体間質細胞の培養物を成
長因子と共に48時間処理し、そして35Ｓ硫酸塩で代謝に
より標識した。等量の調整培地を、SDS−PAGEおよび蛍
光写真で分析した。TGF−βは、220kD（バイグリカン
（biglycan））および120kD（デコリン）に中心を有す
る二つのブロードなバンドを増大させ、そして電気泳動
の移動度のシフトとして検出される構造的変化を誘導す
る。PDGF、IL−１およびTNFは、有意な効果を有さなか
った。
果を示している。ラットの糸球体間質細胞の培養物を成
長因子と共に48時間処理し、そして35Ｓ硫酸塩で代謝に
より標識した。等量の調整培地を、SDS−PAGEおよび蛍
光写真で分析した。TGF−βは、220kD（バイグリカン
（biglycan））および120kD（デコリン）に中心を有す
る二つのブロードなバンドを増大させ、そして電気泳動
の移動度のシフトとして検出される構造的変化を誘導す
る。PDGF、IL−１およびTNFは、有意な効果を有さなか
った。
図４は、TGF−βにより誘導されたプロテオグリカンの
合成増大に対するPDGFの効果を示している。35Ｓ硫酸塩
で標識され、そして種々の増殖因子の組み合わせで処理
された培養物からの等量の培地を、SDS−PAGEおよび蛍
光写真で分析した。（レーン1:コントロール；レーン2:
TGF−β、25ng/ml;レーン3:TGF−β25ng/ml＋PDGF1U/m
l;レーン4:TGF−β25ng/ml＋PDGF0.5U/ml）。
合成増大に対するPDGFの効果を示している。35Ｓ硫酸塩
で標識され、そして種々の増殖因子の組み合わせで処理
された培養物からの等量の培地を、SDS−PAGEおよび蛍
光写真で分析した。（レーン1:コントロール；レーン2:
TGF−β、25ng/ml;レーン3:TGF−β25ng/ml＋PDGF1U/m
l;レーン4:TGF−β25ng/ml＋PDGF0.5U/ml）。
図５は、TGF−βにより影響を受けたプロテオグリカン
の免疫学的同定を示している。等量のコントロール（レ
ーン１および３）あるいはTGF−β処理（レーン２およ
び４）の調整培地を、バイグリカン（レーン１および
２）およびデコリン（レーン３および４）のヒトコアタ
ンパク質の合成ペプチドに対する抗血清で、免疫沈降さ
せた。TGF−βは、コントロールと比較し、バイグリカ
ンおよびデコリンのバンド（レーン２および４）を特異
的に増大させた。
の免疫学的同定を示している。等量のコントロール（レ
ーン１および３）あるいはTGF−β処理（レーン２およ
び４）の調整培地を、バイグリカン（レーン１および
２）およびデコリン（レーン３および４）のヒトコアタ
ンパク質の合成ペプチドに対する抗血清で、免疫沈降さ
せた。TGF−βは、コントロールと比較し、バイグリカ
ンおよびデコリンのバンド（レーン２および４）を特異
的に増大させた。
図６は、TGF−βにより調節されたプロテオグリカンの
特徴付けを示している。代謝により標識された調整培地
を、特異的酵素消化に供した。レーン１−４はコントロ
ールであり、レーン５−８は、TGF−β（25ng/ml）処理
された培養物からの培地である。各レーンは、生理食塩
水（レーン１および５）、ヘパリナーゼ（レーン２およ
び６）、コンドロイチナーゼABC（レーン３および７）
およびコンドロイチナーゼAC（レーン４および８）で処
理したものである。レーン３および７でバンドが消化さ
れており、コンドロイチン／デルマタン硫酸プロテオグ
リカンの存在を示している。TGF−βにより増大したコ
アタンパク質バンド（レーン７）の出現を記しておく。
特徴付けを示している。代謝により標識された調整培地
を、特異的酵素消化に供した。レーン１−４はコントロ
ールであり、レーン５−８は、TGF−β（25ng/ml）処理
された培養物からの培地である。各レーンは、生理食塩
水（レーン１および５）、ヘパリナーゼ（レーン２およ
び６）、コンドロイチナーゼABC（レーン３および７）
およびコンドロイチナーゼAC（レーン４および８）で処
理したものである。レーン３および７でバンドが消化さ
れており、コンドロイチン／デルマタン硫酸プロテオグ
リカンの存在を示している。TGF−βにより増大したコ
アタンパク質バンド（レーン７）の出現を記しておく。
図７は、実験的糸球体腎炎での細胞外マトリックスを示
している。細胞外マトリックスに占有された糸球体の面
積の％を、抗胸腺細胞血清の注射により誘起された糸球
体腎炎の経過期間半定量した（ｎ＝30、各時間点で各６
体の動物で糸球体のスコアを調べた）。有意に腎炎の動
物であるかどうかの有意性は、正常コントロールと比較
して、*:P＜0.001、**:p＜0.01で判断した。値は平均値
±SDである。
している。細胞外マトリックスに占有された糸球体の面
積の％を、抗胸腺細胞血清の注射により誘起された糸球
体腎炎の経過期間半定量した（ｎ＝30、各時間点で各６
体の動物で糸球体のスコアを調べた）。有意に腎炎の動
物であるかどうかの有意性は、正常コントロールと比較
して、*:P＜0.001、**:p＜0.01で判断した。値は平均値
±SDである。
図８は、実験的糸球体腎炎における糸球体の超微細構造
を示している。電顕写真は、コントロール動物中の正常
な糸球体間質マトリックスの領域（Ａ）、および、抗胸
腺細胞血清の注射により誘導した糸球体腎炎の動物の第
14日における増大した糸球体間質マトリックスの領域
（Ｂ）を示している（x6,000）。
を示している。電顕写真は、コントロール動物中の正常
な糸球体間質マトリックスの領域（Ａ）、および、抗胸
腺細胞血清の注射により誘導した糸球体腎炎の動物の第
14日における増大した糸球体間質マトリックスの領域
（Ｂ）を示している（x6,000）。
図９は、培養した糸球体により産生されたプロテオグリ
カンを示している。抗胸腺細胞血清の注射後、０日目
（コントロール）、あるいは１日目、４日目、７日目、
14日目、および28日目に動物から単離した同じ数の糸球
体（各時間点でｎ＝２）を、24時間培養し、そして35Ｓ
硫酸で生合成により標識した。調整培地をSDS−PAGEに
よりフルオログラフィーで分析した。０日と比較し、バ
イグリカンおよびデコリン産生が、４日目には17倍に増
大し、７日目には49倍に増大し、14日目には20倍に増大
し、そして28日目には５倍に増大した。
カンを示している。抗胸腺細胞血清の注射後、０日目
（コントロール）、あるいは１日目、４日目、７日目、
14日目、および28日目に動物から単離した同じ数の糸球
体（各時間点でｎ＝２）を、24時間培養し、そして35Ｓ
硫酸で生合成により標識した。調整培地をSDS−PAGEに
よりフルオログラフィーで分析した。０日と比較し、バ
イグリカンおよびデコリン産生が、４日目には17倍に増
大し、７日目には49倍に増大し、14日目には20倍に増大
し、そして28日目には５倍に増大した。
図10は、腎炎糸球体からの調整培地の、正常な培養糸球
体間質細胞によるプロテオグリカン産生への、影響を示
している。細胞は生合成により標識され、そして調整培
地はSDS−PAGEによりフルオログラフィーで分析した。
腎炎糸球体からの調整培地は、１日目に始まり、７日目
にピークとなる様に、バイグリイカンおよびデコリンの
産生を刺激し、そして28日目までにコントロールレベル
に産生が減少する。
体間質細胞によるプロテオグリカン産生への、影響を示
している。細胞は生合成により標識され、そして調整培
地はSDS−PAGEによりフルオログラフィーで分析した。
腎炎糸球体からの調整培地は、１日目に始まり、７日目
にピークとなる様に、バイグリイカンおよびデコリンの
産生を刺激し、そして28日目までにコントロールレベル
に産生が減少する。
図11は、腎炎糸球体からの調整培地によるプロテオグリ
カン産生の刺激に対する、抗TGF−β合成ペプチド抗体
の効果を示している。抗TGF−β抗体（Ab）正常な免疫
前血清（NS）を、抗胸腺細胞血清の注射後、４日目（GN
4）および７日目（GN7）に単離された腎炎糸球体からの
調整培地と混合した。この抗体はプロテオグリカンの産
生を、77％（GN4）および68％（GN7）減少させた。
カン産生の刺激に対する、抗TGF−β合成ペプチド抗体
の効果を示している。抗TGF−β抗体（Ab）正常な免疫
前血清（NS）を、抗胸腺細胞血清の注射後、４日目（GN
4）および７日目（GN7）に単離された腎炎糸球体からの
調整培地と混合した。この抗体はプロテオグリカンの産
生を、77％（GN4）および68％（GN7）減少させた。
図12は、抗TGF−β抗体のブロック効果の特異性を示し
ている。抗胸腺細胞血清の注射後、７日目の腎炎糸球体
からの調整培地を、正常な免疫前血清（NS）、抗TGF−
β抗体（AB）あるいは免疫用ペプチド（Ｐ）プラス抗体
と混合した。このペプチドは、プロテオグリカン産生刺
激をブロックする抗体の能力を消失させた。
ている。抗胸腺細胞血清の注射後、７日目の腎炎糸球体
からの調整培地を、正常な免疫前血清（NS）、抗TGF−
β抗体（AB）あるいは免疫用ペプチド（Ｐ）プラス抗体
と混合した。このペプチドは、プロテオグリカン産生刺
激をブロックする抗体の能力を消失させた。
図13は、抗胸腺細胞血清の注射後、７日目の腎炎糸球体
からの調整培地に誘導されたプロテオグリカンの酵素的
同定を示している。レーン１は、生理食塩水で処理され
たコントロールである。各レーンは、ヘパリナーゼII
（レーン２）、コンドロイチナーゼABC（レーン３）、
およびコンドロイチナーゼAC（レーン４）で処理されて
いる。レーン３においては、220kDおよび120kDのバンド
の完全な消化が見られ、そして、レーン４においては部
分的消化が見られ、コンドロイチン／デルマタン硫酸プ
ロテオグリカンの存在を示唆している。
からの調整培地に誘導されたプロテオグリカンの酵素的
同定を示している。レーン１は、生理食塩水で処理され
たコントロールである。各レーンは、ヘパリナーゼII
（レーン２）、コンドロイチナーゼABC（レーン３）、
およびコンドロイチナーゼAC（レーン４）で処理されて
いる。レーン３においては、220kDおよび120kDのバンド
の完全な消化が見られ、そして、レーン４においては部
分的消化が見られ、コンドロイチン／デルマタン硫酸プ
ロテオグリカンの存在を示唆している。
図14は、図13に示した調整培地からのプロテオグリカン
の免疫学的同定を示している。コントロールあるいは腎
炎糸球体からの等量の調整培地を、バイグリカン（レー
ン１および２）およびデコリン（レーン３および４）の
ヒトコアタンパク質の合成ペプチドに対する抗血清で、
免疫沈降させた。バイグリカン（レーン２）およびデコ
リン（レーン４）のバンドは、コントロール（レーン１
および３）に比較して、腎炎糸球体からの調整培地（レ
ーン２および４）中で特異的に増大した。
の免疫学的同定を示している。コントロールあるいは腎
炎糸球体からの等量の調整培地を、バイグリカン（レー
ン１および２）およびデコリン（レーン３および４）の
ヒトコアタンパク質の合成ペプチドに対する抗血清で、
免疫沈降させた。バイグリカン（レーン２）およびデコ
リン（レーン４）のバンドは、コントロール（レーン１
および３）に比較して、腎炎糸球体からの調整培地（レ
ーン２および４）中で特異的に増大した。
図15は、腎臓中におけるTGF−βの発現を示している。
抗胸腺細胞血清の注射後TGF−βを産生する糸球体細胞
を螢光抗体法で検出した（ｎ＝30、各時間点で各６体の
動物の糸球体を計数した）。正常コントロールと比較し
て、腎炎の動物であるかどうかの有意性は、*:P＜0.001
で判断した。値は平均値±SDである。
抗胸腺細胞血清の注射後TGF−βを産生する糸球体細胞
を螢光抗体法で検出した（ｎ＝30、各時間点で各６体の
動物の糸球体を計数した）。正常コントロールと比較し
て、腎炎の動物であるかどうかの有意性は、*:P＜0.001
で判断した。値は平均値±SDである。
図16は、抗TGF−β抗体で染色した糸球体の蛍光抗体法
による顕微鏡写真を示している。糸球体腎炎の誘起後７
日目でのTGF−βに対する染色では（Ｂ）、コントロー
ル（Ａ）と比較して、糸球体細胞の数が著しく増大して
いる（x500）。
による顕微鏡写真を示している。糸球体腎炎の誘起後７
日目でのTGF−βに対する染色では（Ｂ）、コントロー
ル（Ａ）と比較して、糸球体細胞の数が著しく増大して
いる（x500）。
図17は、腎炎の腎臓中の糸球体の拡大を示した顕微鏡写
真を示している。抗胸腺細胞血清の注射により腎炎にさ
れたマウスからの腎臓を、注射後14日目に調べた。写真
Ａは、抗胸腺細胞血清の注射の日から、４日間連続して
正常ウサギ血清を注射されたラットからのものである。
写真Ｂは、同様のスケジュールで、ウサギ抗TGF−βを
注射されたラットからのものである。X500の倍率。
真を示している。抗胸腺細胞血清の注射により腎炎にさ
れたマウスからの腎臓を、注射後14日目に調べた。写真
Ａは、抗胸腺細胞血清の注射の日から、４日間連続して
正常ウサギ血清を注射されたラットからのものである。
写真Ｂは、同様のスケジュールで、ウサギ抗TGF−βを
注射されたラットからのものである。X500の倍率。
図18は、TGF−βで処理した腎炎ラットからの糸球体に
よるプロテオグリカン合成を示している。抗胸腺細胞血
清の注射後、４日目（GN4）および７日目（GN7）に糸球
体を単離し、次いで図17の説明文に記載したのと同様な
処理を行い、そして培養した。プロテオグリカン合成
は、35SO4で培養物を標識し、次いで分泌産物をSDS−PA
GEおよびオートラジオグラフィーにより分析し、調べ
た。N3は、正常ウサギ血清αTGF−βで処理された腎炎
ラット;ISは、ウサギ抗TGF−βで処理されたラット。コ
ントロールレーン（Ｎ）は、正常腎臓からの糸球体での
プロテオグリカン産生を示し、そして分子量マーカーの
位置は左に示されている。
よるプロテオグリカン合成を示している。抗胸腺細胞血
清の注射後、４日目（GN4）および７日目（GN7）に糸球
体を単離し、次いで図17の説明文に記載したのと同様な
処理を行い、そして培養した。プロテオグリカン合成
は、35SO4で培養物を標識し、次いで分泌産物をSDS−PA
GEおよびオートラジオグラフィーにより分析し、調べ
た。N3は、正常ウサギ血清αTGF−βで処理された腎炎
ラット;ISは、ウサギ抗TGF−βで処理されたラット。コ
ントロールレーン（Ｎ）は、正常腎臓からの糸球体での
プロテオグリカン産生を示し、そして分子量マーカーの
位置は左に示されている。
発明の詳細な説明 本発明は、組織中の細胞外マトリックスの蓄積により特
徴付けられる病気を処置する方法であって、トランスフ
ォーミング増殖因子β（TGF−β）の細胞外マトリック
ス産生活性を抑制する物質を、該組織に接触させること
を包含する方法を提供する。この物質は、抗TGF−β抗
体、PDGF、あるいはArg−Gly−Asp−含有ペプチドであ
り得る。このArg−Gly−Asp含有ペプチドは長さが、４
個と50個の間のアミノ酸が好ましい。
徴付けられる病気を処置する方法であって、トランスフ
ォーミング増殖因子β（TGF−β）の細胞外マトリック
ス産生活性を抑制する物質を、該組織に接触させること
を包含する方法を提供する。この物質は、抗TGF−β抗
体、PDGF、あるいはArg−Gly−Asp−含有ペプチドであ
り得る。このArg−Gly−Asp含有ペプチドは長さが、４
個と50個の間のアミノ酸が好ましい。
この病気は、糸球体腎炎、成人性呼吸困難症候群、肝硬
変、線維性の癌、肺線維症、動脈硬化、心筋梗塞後の疾
患、心臓線維症、血管形成述後の再狭窄、腎臓間隙性の
線維症およびはん痕、からなる群から選択し得る。
変、線維性の癌、肺線維症、動脈硬化、心筋梗塞後の疾
患、心臓線維症、血管形成述後の再狭窄、腎臓間隙性の
線維症およびはん痕、からなる群から選択し得る。
本発明はまた、組織中での細胞外マトリックスの蓄積を
阻止する方法であって、組織中のTGF−βの活性を抑制
することを包含する方法を提供する。TGF−βの活性の
抑制は、組織を抗TGF−β抗体、PDGF、あるいはArg−Gl
y−Asp含有ペプチドと接触させる工程を含み得る。この
組織は、腎臓、肺、肝臓、および皮膚の細胞からなる群
から選択される細胞を含み得る。
阻止する方法であって、組織中のTGF−βの活性を抑制
することを包含する方法を提供する。TGF−βの活性の
抑制は、組織を抗TGF−β抗体、PDGF、あるいはArg−Gl
y−Asp含有ペプチドと接触させる工程を含み得る。この
組織は、腎臓、肺、肝臓、および皮膚の細胞からなる群
から選択される細胞を含み得る。
さらに、細胞外マトリックス成分の過度の蓄積により特
徴付けられる、組織の病気を検出する方法であって、該
組織中のTGF−βのレベルを測定し、そして、該組織中
のTGF−βのレベルを、正常組織中のTGF−βのレベルと
比較し、該組織中の増加したTGF−βのレベルを、病気
の指標とする方法が提供される。この病気は、糸球体腎
炎、成人性呼吸困難症候群、肝硬変、線維性の癌、肺線
維症、動脈硬化、心筋梗塞後の疾患、心臓線維症、血管
形成述後の再狭窄、腎臓間隙性の線維症およびはん痕、
からなる群から選択され得る。
徴付けられる、組織の病気を検出する方法であって、該
組織中のTGF−βのレベルを測定し、そして、該組織中
のTGF−βのレベルを、正常組織中のTGF−βのレベルと
比較し、該組織中の増加したTGF−βのレベルを、病気
の指標とする方法が提供される。この病気は、糸球体腎
炎、成人性呼吸困難症候群、肝硬変、線維性の癌、肺線
維症、動脈硬化、心筋梗塞後の疾患、心臓線維症、血管
形成述後の再狭窄、腎臓間隙性の線維症およびはん痕、
からなる群から選択され得る。
さらに、細胞外マトリックス成分を産生する細胞による
細胞外マトリックス成分の産生を減少させる方法であっ
て、該細胞が曝されるTGF−βの量を減少させるか、あ
るいはその活性を阻害することを包含する方法が提供さ
れる。この細胞は、糸球体間質細胞、あるいは上皮細胞
であり得る。細胞外マトリックス成分は、プロテオグリ
カンであり得る。プロテオグリカンは、バイグリカンあ
るいはデコリンであり得る。
細胞外マトリックス成分の産生を減少させる方法であっ
て、該細胞が曝されるTGF−βの量を減少させるか、あ
るいはその活性を阻害することを包含する方法が提供さ
れる。この細胞は、糸球体間質細胞、あるいは上皮細胞
であり得る。細胞外マトリックス成分は、プロテオグリ
カンであり得る。プロテオグリカンは、バイグリカンあ
るいはデコリンであり得る。
細胞外マトリックス成分は、フィブロネクチン、ラミニ
ン、およびタイプIVコラーゲンであり得る。
ン、およびタイプIVコラーゲンであり得る。
さらに、TGF−βのプロテオグリカン刺激活性を阻害
し、約108あるいはそれ以上の親和性を有し、そして、
ラジオイムノアッセイによる測定で1:30,000あるいはそ
れ以上の力価である抗体が提供される。この抗体は、TG
F−βからの直鎖ペプチドで動物を免疫することで産生
され得る。この抗体を産生する細胞もまた提供される。
し、約108あるいはそれ以上の親和性を有し、そして、
ラジオイムノアッセイによる測定で1:30,000あるいはそ
れ以上の力価である抗体が提供される。この抗体は、TG
F−βからの直鎖ペプチドで動物を免疫することで産生
され得る。この抗体を産生する細胞もまた提供される。
先に述べたように、本発明では、組織中のTGF−βの活
性を抑制することにより、組織中での細胞外マトリック
スの蓄積を阻止する方法が提供される。さらに、TGF−
βの活性を抑制することにより、組織中の細胞外マトリ
ックスの蓄積により特徴付けられる病気を処置する方法
もまた提供される。TGF−βは、各々112個のアミノ酸の
２つの鎖からなる。TGF−βは、種々の病気で観察され
る細胞外マトリックス合成の増加に関与している。TGF
−βのアミノ酸配列を以下に示す： 多くの増殖因子が細胞外マトリックス産生に関与してい
ることが示唆されている。しかし、これらの病的なマト
リックス成分の蓄積に対する影響は不明である。本発明
は、マトリックスの病的な蓄積を行う傾向がある組織
が、特別なプロテオグリカンを合成するという新たな発
見に基づいている。TGF−βと反応性のある抗体のよう
な、TGF−β活性を阻害する物質が、TGF−βのプロテオ
グリカン産生に対する刺激作用をブロックすることが見
いだされた。この点に関して、試験した増殖因子中で、
TGF−βは特異であり、そのため、TGF−βのこの特異的
な作用の操作は、種々の病気中におけるマトリックス成
分の不適切かつ望ましくない蓄積の、制御および処置に
有用である。
性を抑制することにより、組織中での細胞外マトリック
スの蓄積を阻止する方法が提供される。さらに、TGF−
βの活性を抑制することにより、組織中の細胞外マトリ
ックスの蓄積により特徴付けられる病気を処置する方法
もまた提供される。TGF−βは、各々112個のアミノ酸の
２つの鎖からなる。TGF−βは、種々の病気で観察され
る細胞外マトリックス合成の増加に関与している。TGF
−βのアミノ酸配列を以下に示す： 多くの増殖因子が細胞外マトリックス産生に関与してい
ることが示唆されている。しかし、これらの病的なマト
リックス成分の蓄積に対する影響は不明である。本発明
は、マトリックスの病的な蓄積を行う傾向がある組織
が、特別なプロテオグリカンを合成するという新たな発
見に基づいている。TGF−βと反応性のある抗体のよう
な、TGF−β活性を阻害する物質が、TGF−βのプロテオ
グリカン産生に対する刺激作用をブロックすることが見
いだされた。この点に関して、試験した増殖因子中で、
TGF−βは特異であり、そのため、TGF−βのこの特異的
な作用の操作は、種々の病気中におけるマトリックス成
分の不適切かつ望ましくない蓄積の、制御および処置に
有用である。
糸球体間質細胞は、腎臓糸球体を形成するタイプの細胞
の一つである。正常な糸球体では、糸球体間質細胞は細
胞外マトリックスに取り囲まれている。糸球体間質の過
度の細胞充実を伴ったあるいは伴わない、糸球体間質マ
トリックスの量の増加は、糸球体腎炎の多くの形態およ
び糖尿病性腎症に早期に見られる組織学的徴候である。
培養した糸球体間質細胞は、プロテオグリカン、フィブ
ロネクチン、ラミニン、エンタクチン、スロンボスポン
ジン、およびコラーゲンタイプＩ、III、IVおよびＶを
含む幾つかのマトリックス成分を分泌することが知られ
ている。しかし、正確な組成および糸球体間質マトリッ
クスの超分子の構成、および、その合成組立および分解
を制御する因子に関しては未知である。
の一つである。正常な糸球体では、糸球体間質細胞は細
胞外マトリックスに取り囲まれている。糸球体間質の過
度の細胞充実を伴ったあるいは伴わない、糸球体間質マ
トリックスの量の増加は、糸球体腎炎の多くの形態およ
び糖尿病性腎症に早期に見られる組織学的徴候である。
培養した糸球体間質細胞は、プロテオグリカン、フィブ
ロネクチン、ラミニン、エンタクチン、スロンボスポン
ジン、およびコラーゲンタイプＩ、III、IVおよびＶを
含む幾つかのマトリックス成分を分泌することが知られ
ている。しかし、正確な組成および糸球体間質マトリッ
クスの超分子の構成、および、その合成組立および分解
を制御する因子に関しては未知である。
糸球体間質マトリックスを制御する因子を研究するため
に、培養糸球体間質細胞を、IL−１、PDGF、TNFおよびT
GF−βと共に処理した。培養培地の分析によって、バイ
グリカンおよびデコリンのプロテオグリカンと同定され
た二つの成分の量を、TGF−βが増加させたことが示さ
れた。PDGF、IL−１およびTNFは、コントロールに比
べ、有意な影響を示さなかった。
に、培養糸球体間質細胞を、IL−１、PDGF、TNFおよびT
GF−βと共に処理した。培養培地の分析によって、バイ
グリカンおよびデコリンのプロテオグリカンと同定され
た二つの成分の量を、TGF−βが増加させたことが示さ
れた。PDGF、IL−１およびTNFは、コントロールに比
べ、有意な影響を示さなかった。
糸球体腎炎は、糸球体間質細胞に対する特定の免疫学的
損傷により誘導し得る。単離された糸球体では、バイグ
リカンおよびデコリンの産生の増加が示される。さら
に、培養腎炎糸球体間質細胞からの調整培地は、正常な
糸球体間質細胞によるバイグリカンおよびデコリンの合
成を刺激する。同様の刺激効果が、外来のTGF−βの添
加により起こり得る。さらに、抗血清のようなTGF−β
の効果をブロックする物質は、外来TGF−βの刺激効果
をブロックする。モノクローナル抗体あるいはポリクロ
ーナル抗体、PDGF、およびArg−Gly−Asp含有ペプチド
を含む、この様な物質は、有害なマトリックスプロテオ
グリカン合成を、特異的に制御あるいは処置するために
使用され得る。従って、このような物質は、TGF−β活
性を抑制する物質に組織を接触させることにより、例え
ばはん痕のような、細胞外マトリックスの蓄積に伴う任
意の症状の防止、あるいは組織中の細胞外マトリックス
の蓄積により特徴付けられる病気の処置に、使用し得
る。処置可能な病気は、細胞外マトリックスの蓄積によ
り特徴付けられる。これらの疾患は一般に線維形成疾患
であり、糸球体腎炎、成人性呼吸困難症候群および肝硬
変を含む。さらに、線維細胞性の疾患である、線維硬化
症および線維症、および、フィブロイド、線維腫、線維
腺腫および線維内腫を含む、胸部、子宮あるいは膵臓な
どの線維性の癌が含まれる。本発明の方法はまた、肺線
維症、動脈硬化、心筋梗塞後の疾患、心臓線維症、およ
び血管形成術後の再狭窄および腎臓間隙性の線維症、の
ような線維症的な症状を処置するために使用し得る。加
えて本発明の方法は、ケロイド状のはん痕のような重度
のはん痕を処置、あるいは防止するために使用し得る。
しかし、これらの病気は単なる代表例に過ぎず、本方法
が細胞外マトリックスの蓄積を伴う全ての病気に有用で
あると、当業者は容易に認識し得る。
損傷により誘導し得る。単離された糸球体では、バイグ
リカンおよびデコリンの産生の増加が示される。さら
に、培養腎炎糸球体間質細胞からの調整培地は、正常な
糸球体間質細胞によるバイグリカンおよびデコリンの合
成を刺激する。同様の刺激効果が、外来のTGF−βの添
加により起こり得る。さらに、抗血清のようなTGF−β
の効果をブロックする物質は、外来TGF−βの刺激効果
をブロックする。モノクローナル抗体あるいはポリクロ
ーナル抗体、PDGF、およびArg−Gly−Asp含有ペプチド
を含む、この様な物質は、有害なマトリックスプロテオ
グリカン合成を、特異的に制御あるいは処置するために
使用され得る。従って、このような物質は、TGF−β活
性を抑制する物質に組織を接触させることにより、例え
ばはん痕のような、細胞外マトリックスの蓄積に伴う任
意の症状の防止、あるいは組織中の細胞外マトリックス
の蓄積により特徴付けられる病気の処置に、使用し得
る。処置可能な病気は、細胞外マトリックスの蓄積によ
り特徴付けられる。これらの疾患は一般に線維形成疾患
であり、糸球体腎炎、成人性呼吸困難症候群および肝硬
変を含む。さらに、線維細胞性の疾患である、線維硬化
症および線維症、および、フィブロイド、線維腫、線維
腺腫および線維内腫を含む、胸部、子宮あるいは膵臓な
どの線維性の癌が含まれる。本発明の方法はまた、肺線
維症、動脈硬化、心筋梗塞後の疾患、心臓線維症、およ
び血管形成術後の再狭窄および腎臓間隙性の線維症、の
ような線維症的な症状を処置するために使用し得る。加
えて本発明の方法は、ケロイド状のはん痕のような重度
のはん痕を処置、あるいは防止するために使用し得る。
しかし、これらの病気は単なる代表例に過ぎず、本方法
が細胞外マトリックスの蓄積を伴う全ての病気に有用で
あると、当業者は容易に認識し得る。
上昇したレベルのTGF−βの存在は、細胞外マトリック
スの蓄積に由来する病気の存在あるいは初期の存在を診
断的に調べるために使用し得る。例えば、抗TGF−β抗
体を用いたイムノアッセイは、このような診断試験を提
供する。このようなアッセイの種々の方式は当業者に良
く知られており、よく利用される。これには、RIA、ELI
SAおよび蛍光抗体法が含まれる。概要は、Ruoslahtiら,
M.Enz.,82:803−831（1982）（本明細書では参考文献と
して援用する）を参照。あるいは、核酸プローブを同じ
目的で、TGF−β mRNAの検出および定量に使用し得る。
このような方法は、当分野では良く知られている。
スの蓄積に由来する病気の存在あるいは初期の存在を診
断的に調べるために使用し得る。例えば、抗TGF−β抗
体を用いたイムノアッセイは、このような診断試験を提
供する。このようなアッセイの種々の方式は当業者に良
く知られており、よく利用される。これには、RIA、ELI
SAおよび蛍光抗体法が含まれる。概要は、Ruoslahtiら,
M.Enz.,82:803−831（1982）（本明細書では参考文献と
して援用する）を参照。あるいは、核酸プローブを同じ
目的で、TGF−β mRNAの検出および定量に使用し得る。
このような方法は、当分野では良く知られている。
加えて、プロテオグリカンを産生する細胞によるプロテ
オグリカンの産生を減少させる方法が提供される。この
方法は、細胞が曝されているTGF−βの量を減少させる
ことを含む。このようなTGF−βの量は、簡単に調べる
ことができる。すなわち、正常な細胞のプロテオグリカ
ン産生が減少する時に存在している量である。あるい
は、細胞によるプオテオグリカンの産生は、TGF−βの
プロテオグリカン産生活性を阻害することにより減少さ
れ得る。この阻害は、例えばTGF−βをリガンドと結合
させる等の本発明の教示する方法で行い得る。加えて、
その本質的機能を変化させずに、TGF−βの特定の改変
あるいはアミノ酸置換を行い得ることも判明した。従っ
て、「TGF−β」とは、細胞外マトリックス産生を増加
させる本質的機能が保持されている限りは、TGF−βの
全ての改変体を意味する。TGF−β１およびTGF−β２の
両者はこの機能を示す、例えば、IgnotzおよびMassagu
e,J.Biol.Chem.261:4337−4345（1986）、および、Bass
olsおよびMassague,J.Biol.Chem.263:3083−3095（198
6）（本明細書ではこの両者を参考文献として援用す
る）を参照。
オグリカンの産生を減少させる方法が提供される。この
方法は、細胞が曝されているTGF−βの量を減少させる
ことを含む。このようなTGF−βの量は、簡単に調べる
ことができる。すなわち、正常な細胞のプロテオグリカ
ン産生が減少する時に存在している量である。あるい
は、細胞によるプオテオグリカンの産生は、TGF−βの
プロテオグリカン産生活性を阻害することにより減少さ
れ得る。この阻害は、例えばTGF−βをリガンドと結合
させる等の本発明の教示する方法で行い得る。加えて、
その本質的機能を変化させずに、TGF−βの特定の改変
あるいはアミノ酸置換を行い得ることも判明した。従っ
て、「TGF−β」とは、細胞外マトリックス産生を増加
させる本質的機能が保持されている限りは、TGF−βの
全ての改変体を意味する。TGF−β１およびTGF−β２の
両者はこの機能を示す、例えば、IgnotzおよびMassagu
e,J.Biol.Chem.261:4337−4345（1986）、および、Bass
olsおよびMassague,J.Biol.Chem.263:3083−3095（198
6）（本明細書ではこの両者を参考文献として援用す
る）を参照。
以下の実施例は、説明を意図したものであり、本発明を
限定するものではない。
限定するものではない。
実施例１ 糸球体間質細胞培養に対するTGF−βの影響 糸球体間質細胞は、４から６週齢のSprague−Dawleyラ
ットの正常な糸球体から、Harperらの,Kidney Internat
ional 26:875（1984）（本明細書では参考文献として援
用する）の方法に従って得た。使用した生育培地は、20
％の熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone,Logan,U
T）、50U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイ
シン、0.66U/mlのインシュリン、および300mg/mlのＬ−
グルタミンを補ったRPMI1640（Cell−Gro,Washington,
D.C.）である。15日目と20日目との間に、一次培養物を
0.025％のトリプシン−0.5mMのEDTA（Flow Labs,McLea
n,VA）で剥離し、そして、2x106個の細胞をフラスコに
加えた。細胞を７日毎に継代し、そして実験は全て第３
から第７代の間の継代の細胞で行った。
ットの正常な糸球体から、Harperらの,Kidney Internat
ional 26:875（1984）（本明細書では参考文献として援
用する）の方法に従って得た。使用した生育培地は、20
％の熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）（Hyclone,Logan,U
T）、50U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイ
シン、0.66U/mlのインシュリン、および300mg/mlのＬ−
グルタミンを補ったRPMI1640（Cell−Gro,Washington,
D.C.）である。15日目と20日目との間に、一次培養物を
0.025％のトリプシン−0.5mMのEDTA（Flow Labs,McLea
n,VA）で剥離し、そして、2x106個の細胞をフラスコに
加えた。細胞を７日毎に継代し、そして実験は全て第３
から第７代の間の継代の細胞で行った。
位相差および蛍光抗体法の顕微鏡観察は、プラスチック
ウエル中のカバースリップ上で細胞をサブコンフルーエ
ンシー（半集密:subconfluence）まで生育させ行った。
細胞は、3.7％のパラホルムアルデヒドで22℃で10分間
固定した。リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄した後、細
胞を特異的抗体を共にインキュベートし、そして洗浄
し、そしてFITC−抗ウサギIgGと共に再インキュベート
した。位相差顕微鏡および蛍光抗体法顕微鏡にカバース
リップを載せ、そして調べた。この方法により、以下の
知見により糸球体間質細胞であると確認された細胞の均
一な集団であることが判明した:1）紡錘型の形態の存
在、２）多角形型の細胞の欠如、３）ミオシン、アクチ
ン、デスミン、および抗thy1.1抗体による明るい蛍光抗
体法、および、白血球共通抗原、サイトケラチンおよび
第VIII因子に対する陰性染色。またこの細胞は、プロマ
イシンのアミノヌクレオシド（Sigma,St.Louis,MO）に
曝しても毒性を受けた様な形態変化は見られなかった。
ウエル中のカバースリップ上で細胞をサブコンフルーエ
ンシー（半集密:subconfluence）まで生育させ行った。
細胞は、3.7％のパラホルムアルデヒドで22℃で10分間
固定した。リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄した後、細
胞を特異的抗体を共にインキュベートし、そして洗浄
し、そしてFITC−抗ウサギIgGと共に再インキュベート
した。位相差顕微鏡および蛍光抗体法顕微鏡にカバース
リップを載せ、そして調べた。この方法により、以下の
知見により糸球体間質細胞であると確認された細胞の均
一な集団であることが判明した:1）紡錘型の形態の存
在、２）多角形型の細胞の欠如、３）ミオシン、アクチ
ン、デスミン、および抗thy1.1抗体による明るい蛍光抗
体法、および、白血球共通抗原、サイトケラチンおよび
第VIII因子に対する陰性染色。またこの細胞は、プロマ
イシンのアミノヌクレオシド（Sigma,St.Louis,MO）に
曝しても毒性を受けた様な形態変化は見られなかった。
プロテオグリカン合成を調べるため、同数の細胞を６−
ウエルのマルチウエルプレートあるいはペトリ皿に入
れ、サブコンフルーエンシーにまで生育させた。24時間
の間培養物から血清を除き、細胞分裂を防止した。細胞
層を無菌のPBSで３回洗浄し、そして血清および抗生物
質無しのRPMIを、35Ｓメチオニン標識用の低硫酸生育培
地として加えた。以下の増殖因子を48時間の間培地に加
えた：ウシあるいはブタのTGF−β（Ｒ＆D Systems,In
c.,Minneapoljs,MN）、ヒトPBGF（Collaborative Resea
rch,Inc.,Bedford,MA）、ヒト組換えIL−１α（Collabo
rative Reseasrch,Inc.,Bedford,MA）、および組換えヒ
トTNF（Amgen,Thousand Oaks,CA）。選定した濃度は:TG
F−β（25ng/ml）、PDGF（10U/ml）、IL−１（5U/ml）
およびTNF（500U/ml）である。実験の終了の18時間前
に、タンパク質標識用の35Ｓメチオニン（150μCi/m
l）、あるいはプロテオグリカン標識用の35Ｓ硫酸（200
μCi/ml）を培養物中に加えた。放射性同位元素は、New
England Nuclear（Boston,MA）から入手した。培養培
地を除去し、フェニルメチルスルフォニルフルオライド
（PMSF）、ペプスタチンおよびアプロチニン（Sigma,S
t.Louis,MO）をプロテアーゼインヒビターとして加え、
そしてこの混合物を20分間遠心し、細胞断片を除いた。
残った細胞単層培養物は、PBSで２回洗浄し、次いで300
μｌのSDS−PAGEサンプルバッファーでインキュベート
し、除去した。この層を攪拌により剥離した。サンプル
をすぐに電気泳動し、残りは−20℃で貯蔵した。
ウエルのマルチウエルプレートあるいはペトリ皿に入
れ、サブコンフルーエンシーにまで生育させた。24時間
の間培養物から血清を除き、細胞分裂を防止した。細胞
層を無菌のPBSで３回洗浄し、そして血清および抗生物
質無しのRPMIを、35Ｓメチオニン標識用の低硫酸生育培
地として加えた。以下の増殖因子を48時間の間培地に加
えた：ウシあるいはブタのTGF−β（Ｒ＆D Systems,In
c.,Minneapoljs,MN）、ヒトPBGF（Collaborative Resea
rch,Inc.,Bedford,MA）、ヒト組換えIL−１α（Collabo
rative Reseasrch,Inc.,Bedford,MA）、および組換えヒ
トTNF（Amgen,Thousand Oaks,CA）。選定した濃度は:TG
F−β（25ng/ml）、PDGF（10U/ml）、IL−１（5U/ml）
およびTNF（500U/ml）である。実験の終了の18時間前
に、タンパク質標識用の35Ｓメチオニン（150μCi/m
l）、あるいはプロテオグリカン標識用の35Ｓ硫酸（200
μCi/ml）を培養物中に加えた。放射性同位元素は、New
England Nuclear（Boston,MA）から入手した。培養培
地を除去し、フェニルメチルスルフォニルフルオライド
（PMSF）、ペプスタチンおよびアプロチニン（Sigma,S
t.Louis,MO）をプロテアーゼインヒビターとして加え、
そしてこの混合物を20分間遠心し、細胞断片を除いた。
残った細胞単層培養物は、PBSで２回洗浄し、次いで300
μｌのSDS−PAGEサンプルバッファーでインキュベート
し、除去した。この層を攪拌により剥離した。サンプル
をすぐに電気泳動し、残りは−20℃で貯蔵した。
無菌のPBSで1:100に希釈した3Ｈ−チミジン（84Ci/μMo
l）の1mCi/mlの溶液を、ウエル当り10μｌ加え、3Ｈ−
チミジンの取り込みを細胞分裂の指標として評価した。
24時間あるいは48時間インキュベートし、その後、細胞
を、細胞収穫器（Skatron,Lierbyen,Norway）を用い
て、ガラス繊維フィルターマット上に回収した。細胞を
回収する前に、培地を吸引除去し、そして細胞をHank's
のバランス塩溶液で二回洗浄した。細胞DNAへの3Ｈ−チ
ミジンの取り込みは、液体シンチレーションカウンター
（Beckman,Irvine,CA）中でフィルターマットを計数し
測定した。別の実験で、細胞のアリコートを血球計数器
で光学的に計数し、3Ｈ−チミジンの取り込みが、細胞
数の変化を伴っていることを確認した。回収の前に、細
胞は位相差顕微鏡により、細胞障害性に関して調べた。
さらに、細胞の生存能力もトリパンブルー排除試験によ
り評価した。
l）の1mCi/mlの溶液を、ウエル当り10μｌ加え、3Ｈ−
チミジンの取り込みを細胞分裂の指標として評価した。
24時間あるいは48時間インキュベートし、その後、細胞
を、細胞収穫器（Skatron,Lierbyen,Norway）を用い
て、ガラス繊維フィルターマット上に回収した。細胞を
回収する前に、培地を吸引除去し、そして細胞をHank's
のバランス塩溶液で二回洗浄した。細胞DNAへの3Ｈ−チ
ミジンの取り込みは、液体シンチレーションカウンター
（Beckman,Irvine,CA）中でフィルターマットを計数し
測定した。別の実験で、細胞のアリコートを血球計数器
で光学的に計数し、3Ｈ−チミジンの取り込みが、細胞
数の変化を伴っていることを確認した。回収の前に、細
胞は位相差顕微鏡により、細胞障害性に関して調べた。
さらに、細胞の生存能力もトリパンブルー排除試験によ
り評価した。
培養した糸球体間質細胞の、プロテオグリカン用の35Ｓ
硫酸による、およびタンパク質用の35Ｓメチオニンによ
る生合成的標識によって、TGF−βの添加がプロテオグ
リカンの産生の著しい増加を誘起したことが示された。
コントロールの条件下では、糸球体間質細胞は培地中に
これらは、２つの別々の小さなプロテオグリカンを分泌
するSDS−PAGE上で220および120kDに中心を有する広い
バンドとして確認される（図１）。加えて、ゲル中に入
らなかった標識物が幾らかあった。これらのバンドの各
々の強度は、TGF−β処理により増加し、そしてバンド
は少し高めの分子量の位置に現れた。TGF−βの最大の
影響は、25ng/mlで現れ、コントロールレベルに比較し
プロテオグリカンの産生が８から10倍に増加している。
より高い濃度では、TGF−βのプロテオグリカン産生に
対する効果の作用は減少し、150ng/mlでは消失する。細
胞層の抽出および平行した分析による、細胞外マトリッ
クスへのプロテオグリカンの取り込みの試験で、質的に
同じTGF−βの影響が示された。しかしながら、バンド
は非常に強度が小さく、プロテオグリカンは殆ど培地中
に分泌されていることを示している。35Ｓメチオニン標
識し、次いでSDS−PAGEにかけ（図２）、そしてゲルを
レーザーデンシトメーターで分析した結果、採用した実
験条件下では、タンパク質合成のパターンに対して示さ
れる効果は見られなかった。他の増殖因子、PGDF、IL−
１あるいはTNFのいずれも、TGF−βに類似したプロテオ
グリカン誘導を引き起こさなかった（図３）。
硫酸による、およびタンパク質用の35Ｓメチオニンによ
る生合成的標識によって、TGF−βの添加がプロテオグ
リカンの産生の著しい増加を誘起したことが示された。
コントロールの条件下では、糸球体間質細胞は培地中に
これらは、２つの別々の小さなプロテオグリカンを分泌
するSDS−PAGE上で220および120kDに中心を有する広い
バンドとして確認される（図１）。加えて、ゲル中に入
らなかった標識物が幾らかあった。これらのバンドの各
々の強度は、TGF−β処理により増加し、そしてバンド
は少し高めの分子量の位置に現れた。TGF−βの最大の
影響は、25ng/mlで現れ、コントロールレベルに比較し
プロテオグリカンの産生が８から10倍に増加している。
より高い濃度では、TGF−βのプロテオグリカン産生に
対する効果の作用は減少し、150ng/mlでは消失する。細
胞層の抽出および平行した分析による、細胞外マトリッ
クスへのプロテオグリカンの取り込みの試験で、質的に
同じTGF−βの影響が示された。しかしながら、バンド
は非常に強度が小さく、プロテオグリカンは殆ど培地中
に分泌されていることを示している。35Ｓメチオニン標
識し、次いでSDS−PAGEにかけ（図２）、そしてゲルを
レーザーデンシトメーターで分析した結果、採用した実
験条件下では、タンパク質合成のパターンに対して示さ
れる効果は見られなかった。他の増殖因子、PGDF、IL−
１あるいはTNFのいずれも、TGF−βに類似したプロテオ
グリカン誘導を引き起こさなかった（図３）。
増殖因子間の潜在的な相互作用を調べるために、上述の
ようにTGF−βを添加する前に、糸球体間質細胞をIL−
１、PDGFおよびTNFに曝した。これら３つの増殖因子の
いずれも、単独ではプロテオグリカン産生を変化させな
かった。しかし、PDGFをTGF−βの前に細胞に添加する
と、予測されるプロテオグリカンの産生の増加をブロッ
クした（図４）。このブロック効果は、IL−１あるいは
TNFでは起こらなかった。GRGDSPペプチドもまた、TGF−
βの糸球体間質培養物への添加により引き起こされるプ
ロテオグリカン合成の増加をブロックし、一方、GRGESP
ペプチドはブロックしない（PierschbacherおよびRuosl
ahti,Nature309:30−33（1984）、本明細書では参考文
献として援用する）。
ようにTGF−βを添加する前に、糸球体間質細胞をIL−
１、PDGFおよびTNFに曝した。これら３つの増殖因子の
いずれも、単独ではプロテオグリカン産生を変化させな
かった。しかし、PDGFをTGF−βの前に細胞に添加する
と、予測されるプロテオグリカンの産生の増加をブロッ
クした（図４）。このブロック効果は、IL−１あるいは
TNFでは起こらなかった。GRGDSPペプチドもまた、TGF−
βの糸球体間質培養物への添加により引き起こされるプ
ロテオグリカン合成の増加をブロックし、一方、GRGESP
ペプチドはブロックしない（PierschbacherおよびRuosl
ahti,Nature309:30−33（1984）、本明細書では参考文
献として援用する）。
実施例２ プロテオグリカン種の同定 1.免疫沈降 添加した増殖因子が存在する、あるいは存在しない二つ
のウエルから回収した、500μｌの調整培地あるいは300
μｌの細胞抽出物に、100μｌの抗血清を加えること
で、免疫沈降を行った。二つのウエルは、細胞数の均一
性を保証するため、細胞を剥離しそして計数した。免疫
前の血清を、平行したコントロール実験に用いた。サン
プルを、ウシ血清アルブミン（BSA）で予めコートした4
mlのコニカルチューブ中で攪拌しながら、４℃で一晩イ
ンキュベートした。プロテイン−Ａ−セファロースビー
ズ（Sigma,St.Louis,MO）を、新鮮なRPMIと共に22℃で6
0分間プレインキュベートした。抗原抗体複合体を沈降
させるために、50μｌの懸濁させたプロテイン−Ａ−セ
ファローズをサンプルに加え、そして４℃で120分間混
合した。この試料を10分間200xGで遠心し、そして上清
を除去した。ペレットを、0.5MのNaClおよび0.1％のTri
tonX−100を含んだ氷冷した1mlのPBS、pH7.4で10回洗浄
した。最後に、このペレットを、氷冷したPBSで洗浄
し、新しいチューブに移し、再遠心し、PBSで３回洗浄
した。このペレットを、３％のSDSおよび10％のβメル
カプトエタノール（Sigma,St.Louis,MO）を含んだ40μ
ｌのSDS−PAGEサンプルバッファーに溶解し、５分間煮
沸した。
のウエルから回収した、500μｌの調整培地あるいは300
μｌの細胞抽出物に、100μｌの抗血清を加えること
で、免疫沈降を行った。二つのウエルは、細胞数の均一
性を保証するため、細胞を剥離しそして計数した。免疫
前の血清を、平行したコントロール実験に用いた。サン
プルを、ウシ血清アルブミン（BSA）で予めコートした4
mlのコニカルチューブ中で攪拌しながら、４℃で一晩イ
ンキュベートした。プロテイン−Ａ−セファロースビー
ズ（Sigma,St.Louis,MO）を、新鮮なRPMIと共に22℃で6
0分間プレインキュベートした。抗原抗体複合体を沈降
させるために、50μｌの懸濁させたプロテイン−Ａ−セ
ファローズをサンプルに加え、そして４℃で120分間混
合した。この試料を10分間200xGで遠心し、そして上清
を除去した。ペレットを、0.5MのNaClおよび0.1％のTri
tonX−100を含んだ氷冷した1mlのPBS、pH7.4で10回洗浄
した。最後に、このペレットを、氷冷したPBSで洗浄
し、新しいチューブに移し、再遠心し、PBSで３回洗浄
した。このペレットを、３％のSDSおよび10％のβメル
カプトエタノール（Sigma,St.Louis,MO）を含んだ40μ
ｌのSDS−PAGEサンプルバッファーに溶解し、５分間煮
沸した。
糸球体間質細胞により産生され、そしてTGF−βにより
調節される２つのプロテオグリカンの分子量サイズおよ
びタイプは、２つのプロテオグリカン、バイグリカン
（PGI）およびデコリン（PGII）のそれに相当する。こ
れらのプロテオグリカンは、45kDのコアタンパク質を有
することが知られており、その配列はcDNAから推定され
ている（Krusius,TおよびRuoslahti,E.の,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,USA 83:7683−7687（1986）、およびFisherら
の,J.Biol.Chem.264:4571−4576（1989）、本明細書で
は参考文献として援用する）。これらのプロテオグリカ
ンのＮ−末端配列からの合成ペプチドに対して製造した
ポリクローナル抗体を、系球体間質細胞の培養培地中の
プロテオグリカンの同定に用いた。コントロール細胞お
よびTGF−β処理細胞からの35Ｓ硫酸標識した調整培地
を免疫沈降に供し、次いでSDS−PAGEにかけると、220kD
のバンドがバイグリカン、120kDのバンドがデコリンで
あると同定された（図５）。35Ｓ標識した細胞からの調
整培地と、抗フィブロネクチン、抗ラミニンおよび抗タ
イプIVコラーゲン抗体との免疫沈降、および免疫沈降物
のSDS−PAGE分析では、これらのタンパク質のレベルに
対するTGF−βの効果は見られなかった（データは示し
ていない）。
調節される２つのプロテオグリカンの分子量サイズおよ
びタイプは、２つのプロテオグリカン、バイグリカン
（PGI）およびデコリン（PGII）のそれに相当する。こ
れらのプロテオグリカンは、45kDのコアタンパク質を有
することが知られており、その配列はcDNAから推定され
ている（Krusius,TおよびRuoslahti,E.の,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,USA 83:7683−7687（1986）、およびFisherら
の,J.Biol.Chem.264:4571−4576（1989）、本明細書で
は参考文献として援用する）。これらのプロテオグリカ
ンのＮ−末端配列からの合成ペプチドに対して製造した
ポリクローナル抗体を、系球体間質細胞の培養培地中の
プロテオグリカンの同定に用いた。コントロール細胞お
よびTGF−β処理細胞からの35Ｓ硫酸標識した調整培地
を免疫沈降に供し、次いでSDS−PAGEにかけると、220kD
のバンドがバイグリカン、120kDのバンドがデコリンで
あると同定された（図５）。35Ｓ標識した細胞からの調
整培地と、抗フィブロネクチン、抗ラミニンおよび抗タ
イプIVコラーゲン抗体との免疫沈降、および免疫沈降物
のSDS−PAGE分析では、これらのタンパク質のレベルに
対するTGF−βの効果は見られなかった（データは示し
ていない）。
2.酵素消化 グリコサミノグリカン分解酵素による消化を、TGF−β
により調節されているプロテオグリカンのタイプを調べ
るために使用した。消化は、生合成的標識後の調整培地
に対して行った。培地のアリコート（25μｌ）を、各
々、100mMのTris−HCl、pH7.5、10mMの酢酸カルシウ
ム、2mg/mlのBSAに含まれる100mUのコンドロイチナーゼ
ABCあるいはコンドロイチナーゼAC、あるいは、50mMのT
ris−HCl、pH7.4、1mMの塩化カルシウム、5mMの酢酸カ
ルシウムに含まれる100mUのヘパリナーゼII、と混合し
た。全てのサンプルにさらに、1mMのPMSF、5mMのベンズ
アミジン、100μg/mlの大豆トリプシンインヒビター、1
0μg/mlのロイペプチン、および10μg/mlのアンチペイ
ンを加えた。全ての物質はSigmaから入手した。コンド
ロイチナーゼを含む混合物は、37℃で1.5時間インキュ
ベートした。反応停止後、試料をSDS−PAGE用に調製し
た。
により調節されているプロテオグリカンのタイプを調べ
るために使用した。消化は、生合成的標識後の調整培地
に対して行った。培地のアリコート（25μｌ）を、各
々、100mMのTris−HCl、pH7.5、10mMの酢酸カルシウ
ム、2mg/mlのBSAに含まれる100mUのコンドロイチナーゼ
ABCあるいはコンドロイチナーゼAC、あるいは、50mMのT
ris−HCl、pH7.4、1mMの塩化カルシウム、5mMの酢酸カ
ルシウムに含まれる100mUのヘパリナーゼII、と混合し
た。全てのサンプルにさらに、1mMのPMSF、5mMのベンズ
アミジン、100μg/mlの大豆トリプシンインヒビター、1
0μg/mlのロイペプチン、および10μg/mlのアンチペイ
ンを加えた。全ての物質はSigmaから入手した。コンド
ロイチナーゼを含む混合物は、37℃で1.5時間インキュ
ベートした。反応停止後、試料をSDS−PAGE用に調製し
た。
コントロール細胞およびTGF−β処理した細胞からの小
さなプロテオグリカンは、コンドロイチナーゼABCによ
り分解したが、コンドロイチナーゼACおよびヘパリナー
ゼには反応しなかった（図６）。ゲルの上端の標識され
た物質は（（単数あるいは複数の）大きなプロテオグリ
カン）は、コンドロイチナーゼABCおよびヘパリナーゼ
の両者による消化に対し部分的に感受性である。これら
の結果から、糸球体間質細胞により産生された主なプロ
テオグリカンは、コンドロイチン／デルマタン硫酸プロ
テオグリカンであることが示される。グリコサミノグリ
カンのタイプの同定に加えて、TGF−β調整培地とコン
ドロイチナーゼABCとをインキュベートすると新たな45k
Dのバンドが出現した（図６）。このバンドは、コンド
ロイチン／デルマタン硫酸鎖の部分の除去後のプロテオ
グリカンコアタンパク質を表しているようである。コン
トロール細胞からの調整培地の酵素処理では、視認し得
るコアタンパク質は得られなかった。このことは、TGF
−βの調節作用の一部分は、プロテオグリカンコアタン
パク質の新たな合成の刺激であることを示している。
さなプロテオグリカンは、コンドロイチナーゼABCによ
り分解したが、コンドロイチナーゼACおよびヘパリナー
ゼには反応しなかった（図６）。ゲルの上端の標識され
た物質は（（単数あるいは複数の）大きなプロテオグリ
カン）は、コンドロイチナーゼABCおよびヘパリナーゼ
の両者による消化に対し部分的に感受性である。これら
の結果から、糸球体間質細胞により産生された主なプロ
テオグリカンは、コンドロイチン／デルマタン硫酸プロ
テオグリカンであることが示される。グリコサミノグリ
カンのタイプの同定に加えて、TGF−β調整培地とコン
ドロイチナーゼABCとをインキュベートすると新たな45k
Dのバンドが出現した（図６）。このバンドは、コンド
ロイチン／デルマタン硫酸鎖の部分の除去後のプロテオ
グリカンコアタンパク質を表しているようである。コン
トロール細胞からの調整培地の酵素処理では、視認し得
るコアタンパク質は得られなかった。このことは、TGF
−βの調節作用の一部分は、プロテオグリカンコアタン
パク質の新たな合成の刺激であることを示している。
実施例３ 実験的糸球体腎炎の誘導、組織学的検査、糸球体培養物
の調製、培養培地、および抗体産生 a.実験的糸球体腎炎の誘導 in vivoでの糸球体のプロテオグリカン合成におけるTGF
−βの役割を研究するために、ニュージーランドホワイ
トラビットに、1X106個のラット胸腺細胞を含むフロイ
ントの完全アジュバントで免疫し、次いで２週間および
４週間後に1X106の胸腺細胞を静脈から投与してブース
トすることによって、抗胸腺細胞血清（ATS）を疾患を
誘導した糸球体腎炎モデルを作成した。同じ動物から免
疫前の血清を採り、そして正常ウサギ血清としてコント
ロール実験で用いた。使用する前に、ATSおよび正常血
清は、各々３回、ラット赤血球の血餅およびラット肝臓
粉末（power）で、吸着した。次にこの血清を56℃で30
分間加熱して不活性化した。体重100g当り1mlのATSおよ
び補体の原料として1mlの正常ウサギ血清を静脈投与
し、Sprague Dawleyラット（４−６週齢）に糸球体腎炎
を誘導した。コントロールの動物には、ATSの代わりに
等量の正常血清を投与した。ATSの投与後１日目、４日
目、７日目、14日目および28日目に、腎臓組織の組織学
的検査および培養用の糸球体の単離のために、動物を殺
した。殺す日に、レコーダー（Pharmacia,Uppsala,Swed
en）をつないだtail−cuff血圧測定器（Narco Biosyste
ms,Houston,TX）を用いて、意識のある状態で心収縮期
血圧を測定し、そしてSigma Diagnosticsのクレアチニ
ン測定試薬（Sigma,St.Louis,MO）を用いて血清クレア
チニンを測定した。動物はメタボリックケージに入れ、
そして、最初の週は毎日、そしてその後は週毎に総排泄
尿を回収し、標準法に従ったスルホサリチル酸沈降によ
り、24時間のタンパク質分泌を測定した。例えば、Bord
erら,Kidney International 8:140（1975）（本明細書
では参考文献として援用する）を参照。
の調製、培養培地、および抗体産生 a.実験的糸球体腎炎の誘導 in vivoでの糸球体のプロテオグリカン合成におけるTGF
−βの役割を研究するために、ニュージーランドホワイ
トラビットに、1X106個のラット胸腺細胞を含むフロイ
ントの完全アジュバントで免疫し、次いで２週間および
４週間後に1X106の胸腺細胞を静脈から投与してブース
トすることによって、抗胸腺細胞血清（ATS）を疾患を
誘導した糸球体腎炎モデルを作成した。同じ動物から免
疫前の血清を採り、そして正常ウサギ血清としてコント
ロール実験で用いた。使用する前に、ATSおよび正常血
清は、各々３回、ラット赤血球の血餅およびラット肝臓
粉末（power）で、吸着した。次にこの血清を56℃で30
分間加熱して不活性化した。体重100g当り1mlのATSおよ
び補体の原料として1mlの正常ウサギ血清を静脈投与
し、Sprague Dawleyラット（４−６週齢）に糸球体腎炎
を誘導した。コントロールの動物には、ATSの代わりに
等量の正常血清を投与した。ATSの投与後１日目、４日
目、７日目、14日目および28日目に、腎臓組織の組織学
的検査および培養用の糸球体の単離のために、動物を殺
した。殺す日に、レコーダー（Pharmacia,Uppsala,Swed
en）をつないだtail−cuff血圧測定器（Narco Biosyste
ms,Houston,TX）を用いて、意識のある状態で心収縮期
血圧を測定し、そしてSigma Diagnosticsのクレアチニ
ン測定試薬（Sigma,St.Louis,MO）を用いて血清クレア
チニンを測定した。動物はメタボリックケージに入れ、
そして、最初の週は毎日、そしてその後は週毎に総排泄
尿を回収し、標準法に従ったスルホサリチル酸沈降によ
り、24時間のタンパク質分泌を測定した。例えば、Bord
erら,Kidney International 8:140（1975）（本明細書
では参考文献として援用する）を参照。
b.組織学的検査 各動物からの腎臓組織を、Borderら,Kidney Int.8:140
−148（1975）（本明細書では参考文献として援用す
る）の記載に従い処理し、光学顕微鏡観察、蛍光抗体法
顕微鏡観察および電子顕微鏡観察で検査した。光学顕微
鏡観察用には、組織を中性ホルマリンで固定し、パラフ
ィン中に包埋し、そして２μの切片を過ヨウ素酸シッフ
（PAS）で染色した。糸球体間質マトリックスおよび糸
球体の細胞充実度を定量するために、全ての切片にコー
ドを付し、実験プロトコールを用いている観察者が読み
取った。30の糸球体（直径80−100μｍ）をランダムに
選択し、そして細胞核を計数し、そして公開された方法
（Raij）ら,Kidney Int.26:137−143（1984）（本明細
書では参考文献として援用する）を用いて、糸球体マト
リックスの拡大を測定した。要約すると、腎臓の切片を
40xの顕微鏡対物レンズで観察し、そして糸球体間質マ
トリックスにより占有された糸球体の空間を見積り、１
＝０から25％、２＝25から50％、３＝50から75％、そし
て４＝75から100％としたスコアで評価した。
−148（1975）（本明細書では参考文献として援用す
る）の記載に従い処理し、光学顕微鏡観察、蛍光抗体法
顕微鏡観察および電子顕微鏡観察で検査した。光学顕微
鏡観察用には、組織を中性ホルマリンで固定し、パラフ
ィン中に包埋し、そして２μの切片を過ヨウ素酸シッフ
（PAS）で染色した。糸球体間質マトリックスおよび糸
球体の細胞充実度を定量するために、全ての切片にコー
ドを付し、実験プロトコールを用いている観察者が読み
取った。30の糸球体（直径80−100μｍ）をランダムに
選択し、そして細胞核を計数し、そして公開された方法
（Raij）ら,Kidney Int.26:137−143（1984）（本明細
書では参考文献として援用する）を用いて、糸球体マト
リックスの拡大を測定した。要約すると、腎臓の切片を
40xの顕微鏡対物レンズで観察し、そして糸球体間質マ
トリックスにより占有された糸球体の空間を見積り、１
＝０から25％、２＝25から50％、３＝50から75％、そし
て４＝75から100％としたスコアで評価した。
蛍光抗体法顕微鏡観察は、組織を液体窒素中で急速冷凍
し、アセトン中で固定し、そして４μｍの切片をフルオ
レセインイソチオシアネート標識したウサギのIgGおよ
びC3に対する抗血清（Cooper Biomedical,Malvern,PA）
で染色した。電子顕微鏡観察用には、組織をKarnovsky
の固定剤中に４℃で一晩置き、Epon中に包埋し、そして
超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。
し、アセトン中で固定し、そして４μｍの切片をフルオ
レセインイソチオシアネート標識したウサギのIgGおよ
びC3に対する抗血清（Cooper Biomedical,Malvern,PA）
で染色した。電子顕微鏡観察用には、組織をKarnovsky
の固定剤中に４℃で一晩置き、Epon中に包埋し、そして
超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。
投与したATSの用量で、急性型の、糸球体間質が損傷し
た糸球体腎炎となった。糸球体間質細胞外マトリックス
の顕著な増加があり、それは７日目に始まり、14日目に
最大となり、そしてそれ以降減少した（図７）。１日目
および４日目に起こったマトリックスの減少は、糸球体
間質細胞の一部分の補体仲介溶解による糸球体細胞質充
実度の減少と一致している。超微細構造観察により、糸
球体間質マトリックスの増加が確認された（図８）。糸
球体腎炎のこのモデルの機能的変化は以下からなる:1）
第１週の間の一過的なタンパク質尿、２）血清クレアチ
ニンのレベルの有為な変化がないこと、３）腎炎群で14
日目にのみ、軽微だが有為な心収縮期血圧の上昇。
た糸球体腎炎となった。糸球体間質細胞外マトリックス
の顕著な増加があり、それは７日目に始まり、14日目に
最大となり、そしてそれ以降減少した（図７）。１日目
および４日目に起こったマトリックスの減少は、糸球体
間質細胞の一部分の補体仲介溶解による糸球体細胞質充
実度の減少と一致している。超微細構造観察により、糸
球体間質マトリックスの増加が確認された（図８）。糸
球体腎炎のこのモデルの機能的変化は以下からなる:1）
第１週の間の一過的なタンパク質尿、２）血清クレアチ
ニンのレベルの有為な変化がないこと、３）腎炎群で14
日目にのみ、軽微だが有為な心収縮期血圧の上昇。
c.糸球体培養 体重100g当り10mgのケトアミンHClおよび体重100g当り
0.5mgのキシラジンで筋肉内注射でラットを麻酔した。i
n situでリン酸緩衝溶液（PBS）（pH7.4）で、動脈経由
で腎臓を灌流し、そして次に切り出した。カプセルを除
去し、そして皮質組織を摘出し、剃刀の刃で切り刻ん
だ。等級篩技術を用いて糸球体を単離した。切り刻んだ
皮質を149μｍのナイロンスクリーン（Spectrum,Los Au
geles,CA）に通すのにはスパーテルを用いた。出てきた
組織を次に、105μｍおよび74μｍの篩に連続的に通し
た。74μｍの篩上に残った完全な糸球体を除去し、そし
てPBS、pH7.4で３回洗浄し、そして６−ウエルのマルチ
ウエルプレート中の血清および抗生物質を含まないRPMI
1640（Cell−Gro.Washington,D.C.）中に1ml当り5x103
個の糸球体となるように再懸濁した。インキュベーショ
ンの24時間後、200μCi/mlの35Ｓ硫酸を添加しさらに24
時間インキュベートすることで、培養物を生合成により
標識した。全ての同位体はNew England Nuclear（Bosto
n,MA）から入手した。培養培地を除去し、フェニルメチ
ルスルフォニルフルオライド、ペプタインおよびアプロ
チニン（Sigma,St.Louis,MO）をプロテアーゼインヒビ
ターとして添加し、そしてこの混合物を20分間遠心し、
細胞破砕物を除去した。サンプルを、すぐに電気泳動
し、そして残りを−20℃で保存した。
0.5mgのキシラジンで筋肉内注射でラットを麻酔した。i
n situでリン酸緩衝溶液（PBS）（pH7.4）で、動脈経由
で腎臓を灌流し、そして次に切り出した。カプセルを除
去し、そして皮質組織を摘出し、剃刀の刃で切り刻ん
だ。等級篩技術を用いて糸球体を単離した。切り刻んだ
皮質を149μｍのナイロンスクリーン（Spectrum,Los Au
geles,CA）に通すのにはスパーテルを用いた。出てきた
組織を次に、105μｍおよび74μｍの篩に連続的に通し
た。74μｍの篩上に残った完全な糸球体を除去し、そし
てPBS、pH7.4で３回洗浄し、そして６−ウエルのマルチ
ウエルプレート中の血清および抗生物質を含まないRPMI
1640（Cell−Gro.Washington,D.C.）中に1ml当り5x103
個の糸球体となるように再懸濁した。インキュベーショ
ンの24時間後、200μCi/mlの35Ｓ硫酸を添加しさらに24
時間インキュベートすることで、培養物を生合成により
標識した。全ての同位体はNew England Nuclear（Bosto
n,MA）から入手した。培養培地を除去し、フェニルメチ
ルスルフォニルフルオライド、ペプタインおよびアプロ
チニン（Sigma,St.Louis,MO）をプロテアーゼインヒビ
ターとして添加し、そしてこの混合物を20分間遠心し、
細胞破砕物を除去した。サンプルを、すぐに電気泳動
し、そして残りを−20℃で保存した。
d.糸球体培養からの調整培地の調製 正常ATS糸球体に48時間曝すことにより調整した培地を
回収した。前駆体TGF−βを活性化するために、調整培
地の一部に、1N HC1に加えて１時間pH3.2に酸性化し
た。一過的に酸性化した培地を1N NaOHでpH7.4とし、血
清を含まないRPMIで４℃で24時間透析した。幾つかの実
験では、TGF−βからの合成ペプチドに対して作成され
た100μｌの抗血清を、1mlの活性化調整培地に添加し、
そして連続的に攪拌しながら４℃で一晩インキュベート
した。TGF−β抗血清の特異性を調べるために、100μｇ
の免疫に用いた合成ペプチドを、1mlの抗血清に加え、
そして22℃で２時間連続的に攪拌しながらインキュベー
トした。培養糸球体間質細胞に加える前に、全ての調整
培地は、1000X Gで20分間遠心し、そして0.2μｍのUnif
loフィルター（Schleicher ＆ Schell,Inc.,Keene,NH）
に通した。
回収した。前駆体TGF−βを活性化するために、調整培
地の一部に、1N HC1に加えて１時間pH3.2に酸性化し
た。一過的に酸性化した培地を1N NaOHでpH7.4とし、血
清を含まないRPMIで４℃で24時間透析した。幾つかの実
験では、TGF−βからの合成ペプチドに対して作成され
た100μｌの抗血清を、1mlの活性化調整培地に添加し、
そして連続的に攪拌しながら４℃で一晩インキュベート
した。TGF−β抗血清の特異性を調べるために、100μｇ
の免疫に用いた合成ペプチドを、1mlの抗血清に加え、
そして22℃で２時間連続的に攪拌しながらインキュベー
トした。培養糸球体間質細胞に加える前に、全ての調整
培地は、1000X Gで20分間遠心し、そして0.2μｍのUnif
loフィルター（Schleicher ＆ Schell,Inc.,Keene,NH）
に通した。
e.抗TGF−β抗体 抗TGF−β抗血清はヒト成熟TGF−βの残基78−109位か
らの合成ペプチドに対して調製された。ヒト成熟型のTG
F−βの部分アミノ酸配列は、Derynckら,Nature 316:70
1（1985）（本明細書では参考文献として援用する）に
記載されている。同じペプチドに対して調製され、末端
システイン残基をジスルフィド結合した抗血清は、TGF
−βがそのレセプターに結合するのを阻害することが以
前に示されている（Flandersら,Biochemistry 27:739
（1988）、本明細書では参考文献として援用する）。ペ
プチドは、固相ペプチド合成装置（Applied Biosystem
s,Foster City,CA）中で合成し、そしてHPLCで精製し
た。0.5mgのメチル化しBSA（Benoitら,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA79:917（1982）、本明細書では参考文献として
援用する）と混合し、フロイントの完全アジュバント中
で乳化されたペプチドで、一回の注射当りに2mg用い
て、ウサギを免疫した。注射は通常４週間置いて行い、
そして２回目および引き続く全ての注射の１週間後にウ
サギから採血した。本発明で用いた採血した血液は、イ
ムノブロットでTGF−β１に結合させるラジオイムノア
ッセイで約1:3,000から約1:30,000の力価（50％結合）
を有して、そして培養した糸球体間質細胞中でTGF−β
１により引き起こされるプロテオグリカンの産生の誘導
を阻害した。さらに、この抗体はTGF−β2をも阻害する
ことが予期される。加えて、この抗体は、ラジオイムノ
アッセイで測定し、そしてMuller,J.Imm.Met.34:345−3
52（1980）の記載の様に計算すると、約108あるいはそ
れ以上の親和性を有している。抗体は、109あるいはそ
れ以上の親和性を有することが望ましい。第二のポリク
ローナル抗体（抗LC）は、成熟TGF−βのNH2末端の30個
のアミノ酸に対応する合成ペプチドに対して作成され
た。
らの合成ペプチドに対して調製された。ヒト成熟型のTG
F−βの部分アミノ酸配列は、Derynckら,Nature 316:70
1（1985）（本明細書では参考文献として援用する）に
記載されている。同じペプチドに対して調製され、末端
システイン残基をジスルフィド結合した抗血清は、TGF
−βがそのレセプターに結合するのを阻害することが以
前に示されている（Flandersら,Biochemistry 27:739
（1988）、本明細書では参考文献として援用する）。ペ
プチドは、固相ペプチド合成装置（Applied Biosystem
s,Foster City,CA）中で合成し、そしてHPLCで精製し
た。0.5mgのメチル化しBSA（Benoitら,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA79:917（1982）、本明細書では参考文献として
援用する）と混合し、フロイントの完全アジュバント中
で乳化されたペプチドで、一回の注射当りに2mg用い
て、ウサギを免疫した。注射は通常４週間置いて行い、
そして２回目および引き続く全ての注射の１週間後にウ
サギから採血した。本発明で用いた採血した血液は、イ
ムノブロットでTGF−β１に結合させるラジオイムノア
ッセイで約1:3,000から約1:30,000の力価（50％結合）
を有して、そして培養した糸球体間質細胞中でTGF−β
１により引き起こされるプロテオグリカンの産生の誘導
を阻害した。さらに、この抗体はTGF−β2をも阻害する
ことが予期される。加えて、この抗体は、ラジオイムノ
アッセイで測定し、そしてMuller,J.Imm.Met.34:345−3
52（1980）の記載の様に計算すると、約108あるいはそ
れ以上の親和性を有している。抗体は、109あるいはそ
れ以上の親和性を有することが望ましい。第二のポリク
ローナル抗体（抗LC）は、成熟TGF−βのNH2末端の30個
のアミノ酸に対応する合成ペプチドに対して作成され
た。
実施例４ 糸球体のプロテオグリカン産生とTGF−β ATSの注射後の１日目、４日目、７日目、14日目および2
8日目に、腎炎の動物群を殺した。それらの糸球体を単
離し、培養し、そして生合成により標識して、新たに合
成されたプロテオグリカンを確認した。ATS注射の１日
後、プロテオグリカン合成は正常なコントロールと同じ
であった；しかし、４日目にはプロテオグリカン産生の
顕著な誘導が有り、７日目には49倍に達し、そして次に
14日目および28日目には減少する（図９）。TGF−β
が、プロテオグリカン合成の誘起に関与する調整培地中
のファクターであるかどうかを調べるために、培地を一
過的に酸性化しTGF−βを活性化し、そして次に正常な
培養糸球体間質細胞に加えた。プロテオグリカン産生を
刺激する能力は、TGF−βの比較的特異的な性質である
（Bassolis,A.およびMassague,J.,J.Biol.Chem.263:303
9−3045（1988）、本明細書では参考文献として援用す
る）；従って、培養糸球体細胞の調整培地に対する反応
は、TGF−βに対するバイオアッセイと考えられ得る。
腎炎糸球体からの活性化した調整培地は、正常な糸球体
間質細胞によるプロテオグリカン産生を強く刺激した
（図10）。調整培地により誘導されたプロテオグリカン
産生の経時的パターンは、糸球体培養中で見られたプロ
テオグリカン産生に似ている（図９と図10を比較）。一
過的に酸性化されていない調整培地はプロテオグリカン
産生を刺激しなかった。
8日目に、腎炎の動物群を殺した。それらの糸球体を単
離し、培養し、そして生合成により標識して、新たに合
成されたプロテオグリカンを確認した。ATS注射の１日
後、プロテオグリカン合成は正常なコントロールと同じ
であった；しかし、４日目にはプロテオグリカン産生の
顕著な誘導が有り、７日目には49倍に達し、そして次に
14日目および28日目には減少する（図９）。TGF−β
が、プロテオグリカン合成の誘起に関与する調整培地中
のファクターであるかどうかを調べるために、培地を一
過的に酸性化しTGF−βを活性化し、そして次に正常な
培養糸球体間質細胞に加えた。プロテオグリカン産生を
刺激する能力は、TGF−βの比較的特異的な性質である
（Bassolis,A.およびMassague,J.,J.Biol.Chem.263:303
9−3045（1988）、本明細書では参考文献として援用す
る）；従って、培養糸球体細胞の調整培地に対する反応
は、TGF−βに対するバイオアッセイと考えられ得る。
腎炎糸球体からの活性化した調整培地は、正常な糸球体
間質細胞によるプロテオグリカン産生を強く刺激した
（図10）。調整培地により誘導されたプロテオグリカン
産生の経時的パターンは、糸球体培養中で見られたプロ
テオグリカン産生に似ている（図９と図10を比較）。一
過的に酸性化されていない調整培地はプロテオグリカン
産生を刺激しなかった。
TGF−βの存在に関する別の証拠が、TGF−βからの合成
ペプチド（TGF−β 78−109）に対する抗血清を用いて
得られた。ATSの注射の４日後および７日後の糸球体培
養物から得られた調整培地にこの抗血清を添加した。こ
のTGF−β抗血清は、調整培地のプロテオグリカン産生
を刺激する能力を阻害した（図11）。正常なコントロー
ル糸球体からの調整培地に曝された糸球体間質細胞によ
るプロテオグリカン産生もまた、この抗血清により少し
減少した。免疫用のTGF−β合成ペプチドと共にプレイ
ンキュベートすると、第７日の腎炎糸球体からの調整培
地によるプロテオグリカン産生の誘導に対する抗血清の
阻害効果が喪失される（図12）。別の実験では、このTG
F−β抗血清は、培養糸球体間質細胞に外来TGF−βを添
加した後のプロテオグリカン産生の誘導を阻害した；こ
の効果は、調整培地に添加してもプロテオグリカン誘導
に対して効果を示さない免疫用のペプチドの添加の後に
逆行した。
ペプチド（TGF−β 78−109）に対する抗血清を用いて
得られた。ATSの注射の４日後および７日後の糸球体培
養物から得られた調整培地にこの抗血清を添加した。こ
のTGF−β抗血清は、調整培地のプロテオグリカン産生
を刺激する能力を阻害した（図11）。正常なコントロー
ル糸球体からの調整培地に曝された糸球体間質細胞によ
るプロテオグリカン産生もまた、この抗血清により少し
減少した。免疫用のTGF−β合成ペプチドと共にプレイ
ンキュベートすると、第７日の腎炎糸球体からの調整培
地によるプロテオグリカン産生の誘導に対する抗血清の
阻害効果が喪失される（図12）。別の実験では、このTG
F−β抗血清は、培養糸球体間質細胞に外来TGF−βを添
加した後のプロテオグリカン産生の誘導を阻害した；こ
の効果は、調整培地に添加してもプロテオグリカン誘導
に対して効果を示さない免疫用のペプチドの添加の後に
逆行した。
実施例５ 糸球体のプロテオグリカンの分子同定 糸球体培養物中に存在するプロテオグリカンは、抗体お
よび酵素消化により同定された。７日目の糸球体培養物
からの標識調整培地、あるいは、実施例２に記載した様
に生合成により標識した後の調整培地を、特異的酵素で
消化した。SDS−PAGE用のサンプルは、３％のSDS、1mM
のフェニルメチルスルフォニルフルオライドおよび10％
のβメルカプトエタノールを含んだサンプルバッファー
と混合し、そして上述のように５分間100℃で加熱し
た。アリコート（20μｌずつ）を、４−12％のグラジエ
ントゲル（Novex,Encinitas,CA）に同じように乗せた。
分子サイズマーカーはPharmacia（Uppsala,Sweden）の
ものを用いた。フルオログラフィーはEnlightning（New
England Nuclear）中でゲルをインキュベートして行っ
た。35Ｓ硫酸の場合の典型的な露出時間は３日から５日
である。フルオログラムをプロテオグリカンのバンドの
相対的強度および移動度の比較および定量のため、Ultr
ascan XL Enhanced Laser Densitometer（Pharmacia）
でスキャンした。結果から、誘導された小さなプロテオ
グリカンがコンドロイチナーゼABCに完全に感受性で、
コンドロイチナーゼACにより部分的に分解されることが
示され、このことから、コンドロイチン／デルマタン硫
酸グリコサミノグリカン鎖が存在することが示される
（図13）。同じ培地を特異的抗体で免疫沈降させ、220k
Dのバンドがバイグリカンで、120kDのバンドがデコリン
であると同定された（図14）。この免疫沈降は実施例２
と同様に行われ、そして上述と同様にサンプルをSDS−P
AGEにより分析した。
よび酵素消化により同定された。７日目の糸球体培養物
からの標識調整培地、あるいは、実施例２に記載した様
に生合成により標識した後の調整培地を、特異的酵素で
消化した。SDS−PAGE用のサンプルは、３％のSDS、1mM
のフェニルメチルスルフォニルフルオライドおよび10％
のβメルカプトエタノールを含んだサンプルバッファー
と混合し、そして上述のように５分間100℃で加熱し
た。アリコート（20μｌずつ）を、４−12％のグラジエ
ントゲル（Novex,Encinitas,CA）に同じように乗せた。
分子サイズマーカーはPharmacia（Uppsala,Sweden）の
ものを用いた。フルオログラフィーはEnlightning（New
England Nuclear）中でゲルをインキュベートして行っ
た。35Ｓ硫酸の場合の典型的な露出時間は３日から５日
である。フルオログラムをプロテオグリカンのバンドの
相対的強度および移動度の比較および定量のため、Ultr
ascan XL Enhanced Laser Densitometer（Pharmacia）
でスキャンした。結果から、誘導された小さなプロテオ
グリカンがコンドロイチナーゼABCに完全に感受性で、
コンドロイチナーゼACにより部分的に分解されることが
示され、このことから、コンドロイチン／デルマタン硫
酸グリコサミノグリカン鎖が存在することが示される
（図13）。同じ培地を特異的抗体で免疫沈降させ、220k
Dのバンドがバイグリカンで、120kDのバンドがデコリン
であると同定された（図14）。この免疫沈降は実施例２
と同様に行われ、そして上述と同様にサンプルをSDS−P
AGEにより分析した。
調整培地に反応して培養糸球体間質細胞により産生され
たプロテオグリカンは、バイグリカンおよびデコリンで
あると同定された。これらの結果は、実施例２に記載し
た培養中の正常ラット糸球体間質細胞に外来TGF−βを
添加した後に観察された結果と同じである。図14に見ら
れる抗バイグリカンおよび抗デコリン抗体の僅かな交差
反応性は、２つのコアタンパク質の非常に類似した配列
であることに基づく（Fisherら,J.Biol.Chem.264:4571
−4576（1989）、本明細書では参考文献として援用す
る）。
たプロテオグリカンは、バイグリカンおよびデコリンで
あると同定された。これらの結果は、実施例２に記載し
た培養中の正常ラット糸球体間質細胞に外来TGF−βを
添加した後に観察された結果と同じである。図14に見ら
れる抗バイグリカンおよび抗デコリン抗体の僅かな交差
反応性は、２つのコアタンパク質の非常に類似した配列
であることに基づく（Fisherら,J.Biol.Chem.264:4571
−4576（1989）、本明細書では参考文献として援用す
る）。
実施例６ TGF−β合成糸球体細胞の検出 抗LCは、TGF−βからの合成ペプチドに対して作成され
た抗体で、TGF−βを産生すると考えられる細胞と反応
する（Flandersら,Biochemistry27:739（1988）。抗LC
を、ATSにより誘導された糸球体腎炎の28日の経過を通
じ、糸球体細胞によるTGF−βの産生の検出に用いた。
この抗体で正常なコントロールラットからの糸球体を染
色することで、一つの糸球体当り平均約20個の陽性細胞
が見られた。腎炎動物からの糸球体では、抗LCにより染
色される糸球体細胞の数は、４日目では変化せず、７日
目に増し、糸球体プロテオグリカンの産生のピークとな
る。TGF−βに関して陽性の細胞の数の増加の経時的パ
ターンは、糸球体および調整培地によるプロテオグリカ
ン産生と概ね平行関係にある（図15）。図16Aは、正常
コントロール動物からの糸球体の抗LC染色の代表例と、
ATS注射の７日後の動物のそれとを比較している（図16
B）。
た抗体で、TGF−βを産生すると考えられる細胞と反応
する（Flandersら,Biochemistry27:739（1988）。抗LC
を、ATSにより誘導された糸球体腎炎の28日の経過を通
じ、糸球体細胞によるTGF−βの産生の検出に用いた。
この抗体で正常なコントロールラットからの糸球体を染
色することで、一つの糸球体当り平均約20個の陽性細胞
が見られた。腎炎動物からの糸球体では、抗LCにより染
色される糸球体細胞の数は、４日目では変化せず、７日
目に増し、糸球体プロテオグリカンの産生のピークとな
る。TGF−βに関して陽性の細胞の数の増加の経時的パ
ターンは、糸球体および調整培地によるプロテオグリカ
ン産生と概ね平行関係にある（図15）。図16Aは、正常
コントロール動物からの糸球体の抗LC染色の代表例と、
ATS注射の７日後の動物のそれとを比較している（図16
B）。
実施例７ 抗TGF−β抗体による腎炎の糸球体中のプロテオグリカ
ン産生の阻害 ATSの単回投与でラットに腎炎を誘導し、そして次にそ
のラットを、抗TGF−β（78−109）あるいはコントロー
ルとしての正常ウサギ血清のいずれかで処置した。３つ
の異なる実験で10匹の動物を各群に用いた。図17は、処
置およびコントロール動物の腎臓からの糸球体の代表例
の比較を示している。抗TGF−β処置した群では正常ウ
サギ血清コントロールよりも、膨張が少なく、そして細
胞外マトリックスが少ない。生化学的分析では、損傷さ
れた腎臓からの細胞では高い糸球体細胞によるプロテオ
グリカン産生が、抗TGF−βにより抑制されたことを示
している（図18）。図18のゲルバンドのスキャン、およ
び他の同様の実験から、この疾患プロセスの指標の抑制
は約50から65％であることを示している。これらの結果
は、疾患が抗TGF−β処置により実質的に減衰したこと
を示している。
ン産生の阻害 ATSの単回投与でラットに腎炎を誘導し、そして次にそ
のラットを、抗TGF−β（78−109）あるいはコントロー
ルとしての正常ウサギ血清のいずれかで処置した。３つ
の異なる実験で10匹の動物を各群に用いた。図17は、処
置およびコントロール動物の腎臓からの糸球体の代表例
の比較を示している。抗TGF−β処置した群では正常ウ
サギ血清コントロールよりも、膨張が少なく、そして細
胞外マトリックスが少ない。生化学的分析では、損傷さ
れた腎臓からの細胞では高い糸球体細胞によるプロテオ
グリカン産生が、抗TGF−βにより抑制されたことを示
している（図18）。図18のゲルバンドのスキャン、およ
び他の同様の実験から、この疾患プロセスの指標の抑制
は約50から65％であることを示している。これらの結果
は、疾患が抗TGF−β処置により実質的に減衰したこと
を示している。
抗TGF−β効果のメカニズムに関する情報を得るため
に、TGF−βのmRNAのレベルを、処置およびコントロー
ルラットの腎臓中で調べた。TGF−βは自身の産生を刺
激し得る。そのため、TGF−βの活性を阻害する物質
は、その合成をも減少させ得る。mRNA分析により、抗TG
F−β処置動物を含む腎炎ラット中でTGF−βのmRNAのレ
ベルが上昇していることが判明した。これらの結果は、
抗体がTGF−β活性のパラクリンループ（paracrineloo
p）を阻害していることを示唆している。
に、TGF−βのmRNAのレベルを、処置およびコントロー
ルラットの腎臓中で調べた。TGF−βは自身の産生を刺
激し得る。そのため、TGF−βの活性を阻害する物質
は、その合成をも減少させ得る。mRNA分析により、抗TG
F−β処置動物を含む腎炎ラット中でTGF−βのmRNAのレ
ベルが上昇していることが判明した。これらの結果は、
抗体がTGF−β活性のパラクリンループ（paracrineloo
p）を阻害していることを示唆している。
実施例８ ARG−GLY−ASP含有ペプチドによるプロテオグリカン合
成の阻害 ラットの糸球体間質細胞を６−ウエルのマルチプレート
中で、サブコンフルーエンシーまで生育した。培養条件
および実験のプロトコールは、実施例１に記載したもの
と同じである。培養物を24時間の間血清無しとし、25ng
/mlのTGF−β1を、0.3、0.1、0.03、0.01あるいは0.003
mg/mlのGly−Arg−Gly−Asp−Ser−Pro（GRGDSP）、あ
るいは、0.3mg/mlのGly−Arg−Gly−Glu−Ser−Pro（GR
GESP）と共に添加した。PierschbacherおよびRouslaht
i,J.Bio.Chem.,292:1794−1798（1987）（本明細書では
参考文献として援用する）に記載されたように、Applie
d Biosystemsのペプチド合成装置を製造者のプロトコー
ルに従って使用して、これらのペプチドを合成した。30
時間後、培養物を35Ｓで代謝により標識し、そして18時
間後に調整培地をSDS−PAGEとフルオログラフィーで分
析した。フルオログラムは、レーザーデンシトメーター
でスキャンし、得られたプロテオグリカンバンドの相対
的なデンシトメーターのユニットを以下に示す。コント
ロール:1.9、TGF−β1:4.5、TGF−β1＋GRGDS 0.3mg/m
l:1.3、同0.1mg/ml:2.4、同0.03mg/ml:2.6、同0.01mg/m
l:3.9、同0.003mg/ml:4.0、および、GRGES 0.3mg/ml:4.
3。
成の阻害 ラットの糸球体間質細胞を６−ウエルのマルチプレート
中で、サブコンフルーエンシーまで生育した。培養条件
および実験のプロトコールは、実施例１に記載したもの
と同じである。培養物を24時間の間血清無しとし、25ng
/mlのTGF−β1を、0.3、0.1、0.03、0.01あるいは0.003
mg/mlのGly−Arg−Gly−Asp−Ser−Pro（GRGDSP）、あ
るいは、0.3mg/mlのGly−Arg−Gly−Glu−Ser−Pro（GR
GESP）と共に添加した。PierschbacherおよびRouslaht
i,J.Bio.Chem.,292:1794−1798（1987）（本明細書では
参考文献として援用する）に記載されたように、Applie
d Biosystemsのペプチド合成装置を製造者のプロトコー
ルに従って使用して、これらのペプチドを合成した。30
時間後、培養物を35Ｓで代謝により標識し、そして18時
間後に調整培地をSDS−PAGEとフルオログラフィーで分
析した。フルオログラムは、レーザーデンシトメーター
でスキャンし、得られたプロテオグリカンバンドの相対
的なデンシトメーターのユニットを以下に示す。コント
ロール:1.9、TGF−β1:4.5、TGF−β1＋GRGDS 0.3mg/m
l:1.3、同0.1mg/ml:2.4、同0.03mg/ml:2.6、同0.01mg/m
l:3.9、同0.003mg/ml:4.0、および、GRGES 0.3mg/ml:4.
3。
これらのデータは、高い投与量のGRGDSPが、TGF−β1誘
導のプロテオグリカン産生の阻害を引き起こす際に投与
量反応効果があり、コントロールペプチドGRGESPでは効
果がないことを示している。
導のプロテオグリカン産生の阻害を引き起こす際に投与
量反応効果があり、コントロールペプチドGRGESPでは効
果がないことを示している。
実施例９ 糸球体間質細胞および糸球体上皮細胞による細胞外マト
リックス産生に対する トランスフォーミング増殖因子βの異なった影響 方法 増殖因子および抗体 ブタTGF−β1は、Ｒ＆D Systems,Inc.（Minneapolis,M
N）から入手した。ヒト血小板由来増殖因子（PDGF）お
よび組換えヒトインターロイキン−１（IL−１）のαお
よびβは、Collaborative Research,Inc.（Bedford,M
A）から、組換えヒト腫瘍壊死因子（TNF）は、Amgen（T
housand Oaks,CA）から入手した。ヤギ抗ヒトコラーゲ
ンタイプＩ抗体およびヤギ抗ヒトコラーゲンタイプIII
抗体は、Southern Biotechnology Associates,Inc.（Bi
rmingham,AL）から入手した。ウサギ抗マウスフィブロ
ネクチン抗体、および、ウサギ抗マウスコラーゲンタイ
プＩ、III、IVおよびVI抗体、およびウサギ抗ラットラ
ミニン抗体の作成法は報告されている。要約すると、フ
ロイントの完全アジュバント中に乳化した各々の精製タ
ンパク質を、皮下注射でニュージーランドウサギに注射
っし、ウサギポリクローナル抗体を製造した。初回免疫
の後、３週間後から引続き毎週、フロイントの不完全ア
ジュバント中に乳化した精製タンパク質を、経筋肉注射
した。二次注射と共に、耳動脈から50mlの採血を行っ
た。この血液を凝集させ、遠心分離し血清を回収した。
ラットThy−１に対するモノクローナル抗体は、Accurat
e Chemicals（Westbury,N.Y.）から、そしてヤギ抗ヒト
第VIII因子抗体は、Miles Laboratory Inc・Kankokee,I
L）から入手した。
リックス産生に対する トランスフォーミング増殖因子βの異なった影響 方法 増殖因子および抗体 ブタTGF−β1は、Ｒ＆D Systems,Inc.（Minneapolis,M
N）から入手した。ヒト血小板由来増殖因子（PDGF）お
よび組換えヒトインターロイキン−１（IL−１）のαお
よびβは、Collaborative Research,Inc.（Bedford,M
A）から、組換えヒト腫瘍壊死因子（TNF）は、Amgen（T
housand Oaks,CA）から入手した。ヤギ抗ヒトコラーゲ
ンタイプＩ抗体およびヤギ抗ヒトコラーゲンタイプIII
抗体は、Southern Biotechnology Associates,Inc.（Bi
rmingham,AL）から入手した。ウサギ抗マウスフィブロ
ネクチン抗体、および、ウサギ抗マウスコラーゲンタイ
プＩ、III、IVおよびVI抗体、およびウサギ抗ラットラ
ミニン抗体の作成法は報告されている。要約すると、フ
ロイントの完全アジュバント中に乳化した各々の精製タ
ンパク質を、皮下注射でニュージーランドウサギに注射
っし、ウサギポリクローナル抗体を製造した。初回免疫
の後、３週間後から引続き毎週、フロイントの不完全ア
ジュバント中に乳化した精製タンパク質を、経筋肉注射
した。二次注射と共に、耳動脈から50mlの採血を行っ
た。この血液を凝集させ、遠心分離し血清を回収した。
ラットThy−１に対するモノクローナル抗体は、Accurat
e Chemicals（Westbury,N.Y.）から、そしてヤギ抗ヒト
第VIII因子抗体は、Miles Laboratory Inc・Kankokee,I
L）から入手した。
ウサギ抗ラットFx1A抗体は、Edgingtonの方法に従い、S
prague−Dawleyラットの腎臓からFX1Aで免疫して製造し
た。要約すると、上述と同様に超遠心により調製された
腎細管近傍の刷子縁に富んだ調製物でウサギを免疫し
た。FITCおよびアルカリフォスファターゼ標識した、あ
るいは、抗ウサギIgGおよび抗ヤギIgGは、Cappel（Melv
ern,PA）から入手した。
prague−Dawleyラットの腎臓からFX1Aで免疫して製造し
た。要約すると、上述と同様に超遠心により調製された
腎細管近傍の刷子縁に富んだ調製物でウサギを免疫し
た。FITCおよびアルカリフォスファターゼ標識した、あ
るいは、抗ウサギIgGおよび抗ヤギIgGは、Cappel（Melv
ern,PA）から入手した。
細胞培養 糸球体上皮細胞および糸球体間質細胞は、６から８週齢
のSprague−Dawleyラットから得た完全な糸球体の外殖
により得た。糸球体間質細胞の単離および培養は、以下
のように行った。
のSprague−Dawleyラットから得た完全な糸球体の外殖
により得た。糸球体間質細胞の単離および培養は、以下
のように行った。
雄のSprague/Dawleyラット（100−140グラム、単離毎に
２匹のラット）を、ケトアミン（10mg/100gラット）お
よびRompum（0.5mg/ラット）を用いて麻酔し、ベタジン
を用いて滅菌した。腎臓を外科的に露出させ、そしてリ
ン酸緩衝食塩水を用いて灌流した。次いで腎臓を摘出
し、滅菌した氷冷PBS中に保存した。
２匹のラット）を、ケトアミン（10mg/100gラット）お
よびRompum（0.5mg/ラット）を用いて麻酔し、ベタジン
を用いて滅菌した。腎臓を外科的に露出させ、そしてリ
ン酸緩衝食塩水を用いて灌流した。次いで腎臓を摘出
し、滅菌した氷冷PBS中に保存した。
この腎臓を二分割し、そして副腎を外科的に除去した。
残りの組織を小刀を用いて１mm3の小片に切り刻んだ。
次にこの切り刻んだ腎臓組織を、PBSを用いて連続的に
洗浄しながら、一連の篩（149メッシュおよび105メッシ
ュ）に通した。次に、105メッシュの篩を通り抜けた物
質を、74メッシュの篩上に回収した。これが糸球体画分
である。
残りの組織を小刀を用いて１mm3の小片に切り刻んだ。
次にこの切り刻んだ腎臓組織を、PBSを用いて連続的に
洗浄しながら、一連の篩（149メッシュおよび105メッシ
ュ）に通した。次に、105メッシュの篩を通り抜けた物
質を、74メッシュの篩上に回収した。これが糸球体画分
である。
この画分を臨床用遠心分離機中で10分間遠心し、そして
ペレットを20％のウシ胎児血清、0.66単位/mlのインシ
ュリン、および抗生物質を含んだRPMI培地に再懸濁し
た。この糸球体を、T75フラスコ中の、12mlの培地中に
２つの腎臓分を蒔いた。この付着させた糸球体から、培
養の約３週間後に、糸球体間質細胞が生育し出した。こ
の培養期間中３−４日毎に、新鮮な培地を加えた。
ペレットを20％のウシ胎児血清、0.66単位/mlのインシ
ュリン、および抗生物質を含んだRPMI培地に再懸濁し
た。この糸球体を、T75フラスコ中の、12mlの培地中に
２つの腎臓分を蒔いた。この付着させた糸球体から、培
養の約３週間後に、糸球体間質細胞が生育し出した。こ
の培養期間中３−４日毎に、新鮮な培地を加えた。
上皮細胞を単離するために、Vitrogen（Collagen Corpo
ration,Palo Alto,CA）でコートしたフラスコ中に完全
な糸球体を入れた。生育培地は、20％の熱不活化ウシ胎
児血清（FCS）（Hyclone,Logan,UT）、50U/mlのペニシ
リン、100μg/mlのストレプトマイシン、0.66U/mlのイ
ンシュリンおよび300mg/mlのＬ−グルタミンを補った、
RPMI1640（Cell−Gro,Washington,D.C.）である。７日
後、成長した細胞を0.025％のトリプシン−0.5M EDTA
（Flow Labs,McLean,VA）で剥離した。糸球体の細胞断
片を、30メッシュの篩を通し除去した。間接選択法（in
direct panning technique）を用いて、高度に濃縮され
た上皮細胞集団を作成した。詳細には、糸球体は上述の
ように単離され、そして0.15mg/mlのラットの尾のコラ
ーゲンタイプＩで予めコートしておいた組織培養皿に蒔
いた。この皿は、室温で１時間コートし、そして次にPB
Sで２回洗浄した。培養の１週間後に、成長した細胞
（主に上皮細胞）および糸球体を、0.05％トリプシン−
0.53mM EDTAでリトプシン消化した。細胞懸濁液を30メ
ッシュに通し、糸球体の断片を除去した。残りの細胞懸
濁液を、Thy1抗原に対するモノクローナル抗体で予めコ
ートしたプレートに蒔いた。このプレートは、４℃で24
時間、抗体（約100μg/ml）でコートした。抗Thy1でコ
ートした皿で細胞のインキュベーションは、37℃で１時
間行った。未結合の細胞は回収し再度蒔いた。糸球体間
質細胞は抗原を発現し、上皮細胞は発現しないので、糸
球体間質細胞のみがThy1抗体に結合し、上皮細胞は懸濁
液中に残る。この方法により、Thy−１様エピトープを
その表面に有する上皮細胞ではない糸球体間質細胞を、
抗Thy−１抗体でコートされたプレートに結合すること
で、糸球体間質細胞を選択的に回収できた。糸球体細胞
を、60X15mmのポリスチレンプレートに入れた。このプ
レートは４℃で12時間、マウス抗Thy−１抗体で予めコ
ートしておいた。非吸着細胞を除去し、そして６−ウエ
ルのプレートにラミニン（Collaborative Research,Bed
ford,MA）と共に入れた。
ration,Palo Alto,CA）でコートしたフラスコ中に完全
な糸球体を入れた。生育培地は、20％の熱不活化ウシ胎
児血清（FCS）（Hyclone,Logan,UT）、50U/mlのペニシ
リン、100μg/mlのストレプトマイシン、0.66U/mlのイ
ンシュリンおよび300mg/mlのＬ−グルタミンを補った、
RPMI1640（Cell−Gro,Washington,D.C.）である。７日
後、成長した細胞を0.025％のトリプシン−0.5M EDTA
（Flow Labs,McLean,VA）で剥離した。糸球体の細胞断
片を、30メッシュの篩を通し除去した。間接選択法（in
direct panning technique）を用いて、高度に濃縮され
た上皮細胞集団を作成した。詳細には、糸球体は上述の
ように単離され、そして0.15mg/mlのラットの尾のコラ
ーゲンタイプＩで予めコートしておいた組織培養皿に蒔
いた。この皿は、室温で１時間コートし、そして次にPB
Sで２回洗浄した。培養の１週間後に、成長した細胞
（主に上皮細胞）および糸球体を、0.05％トリプシン−
0.53mM EDTAでリトプシン消化した。細胞懸濁液を30メ
ッシュに通し、糸球体の断片を除去した。残りの細胞懸
濁液を、Thy1抗原に対するモノクローナル抗体で予めコ
ートしたプレートに蒔いた。このプレートは、４℃で24
時間、抗体（約100μg/ml）でコートした。抗Thy1でコ
ートした皿で細胞のインキュベーションは、37℃で１時
間行った。未結合の細胞は回収し再度蒔いた。糸球体間
質細胞は抗原を発現し、上皮細胞は発現しないので、糸
球体間質細胞のみがThy1抗体に結合し、上皮細胞は懸濁
液中に残る。この方法により、Thy−１様エピトープを
その表面に有する上皮細胞ではない糸球体間質細胞を、
抗Thy−１抗体でコートされたプレートに結合すること
で、糸球体間質細胞を選択的に回収できた。糸球体細胞
を、60X15mmのポリスチレンプレートに入れた。このプ
レートは４℃で12時間、マウス抗Thy−１抗体で予めコ
ートしておいた。非吸着細胞を除去し、そして６−ウエ
ルのプレートにラミニン（Collaborative Research,Bed
ford,MA）と共に入れた。
糸球体上皮細胞は、１）特徴的な多角形の形態、２）FX
1A（Heymann抗原）に対する抗体による均一な染色、
３）プロマイシンのアミノヌクレオシドに対する感受
性、および４）抗体Thy−１抗体あるいは抗第VIII因子
抗体で染色されないこと、によって同定される。近傍の
細管細胞による糸球体上皮細胞の汚染を、アルカリフォ
スファターゼ染色により調べ、そして２％より少ない細
胞がアルカリフォスファターゼ陽性であった。対照的
に、糸球体間質細胞は、１）典型的な星型の形態、２）
抗Thy−１抗体による均一な染色、３）抗FX1A抗体ある
いは抗第VIII因子抗体で染色されない、４）プロマイシ
ンのアミノヌクレオシドに対する感受性の欠如、により
同定される。
1A（Heymann抗原）に対する抗体による均一な染色、
３）プロマイシンのアミノヌクレオシドに対する感受
性、および４）抗体Thy−１抗体あるいは抗第VIII因子
抗体で染色されないこと、によって同定される。近傍の
細管細胞による糸球体上皮細胞の汚染を、アルカリフォ
スファターゼ染色により調べ、そして２％より少ない細
胞がアルカリフォスファターゼ陽性であった。対照的
に、糸球体間質細胞は、１）典型的な星型の形態、２）
抗Thy−１抗体による均一な染色、３）抗FX1A抗体ある
いは抗第VIII因子抗体で染色されない、４）プロマイシ
ンのアミノヌクレオシドに対する感受性の欠如、により
同定される。
生合成による放射標識 糸球体上皮細胞および糸球体間質細胞を、普通のあるい
はラミニンコートした６−ウエルマルチウエルプレート
に、ウエル当り5X105細胞の濃度で加え、そして血清を
含まないRPMI 1640培地中で24時間培養し、細胞分裂を
抑止した。非吸着細胞を、リン酸緩衝食塩水（PBS）で
洗浄することで除去した。血清および抗生物質を含まな
いRPMI 1640を、35Ｓ標識用の低硫酸培地として添加
し、そしてメチオニンを含まないRPMI 1640（Flow Lab
s,McLean,VA）を35Ｓ標識用に添加した。この培地に48
時間の間、上記の実施例で使用した濃度で増殖因子を加
えた。選択した濃度は:TGF−β（25ng/ml）、PDGF（2U/
ml）、IL−１α（5U/ml）、IL−１β（5U/ml）およびTN
F（500U/ml）である。実験の終了の18時間前に、タンパ
ク質標識用の35Ｓメチオニン（100μCi/ml）、あるいは
プロテオグリカン染色用の35Ｓ硫酸（200μCi/ml）を、
この培地に添加した。
はラミニンコートした６−ウエルマルチウエルプレート
に、ウエル当り5X105細胞の濃度で加え、そして血清を
含まないRPMI 1640培地中で24時間培養し、細胞分裂を
抑止した。非吸着細胞を、リン酸緩衝食塩水（PBS）で
洗浄することで除去した。血清および抗生物質を含まな
いRPMI 1640を、35Ｓ標識用の低硫酸培地として添加
し、そしてメチオニンを含まないRPMI 1640（Flow Lab
s,McLean,VA）を35Ｓ標識用に添加した。この培地に48
時間の間、上記の実施例で使用した濃度で増殖因子を加
えた。選択した濃度は:TGF−β（25ng/ml）、PDGF（2U/
ml）、IL−１α（5U/ml）、IL−１β（5U/ml）およびTN
F（500U/ml）である。実験の終了の18時間前に、タンパ
ク質標識用の35Ｓメチオニン（100μCi/ml）、あるいは
プロテオグリカン染色用の35Ｓ硫酸（200μCi/ml）を、
この培地に添加した。
放射性同位元素は、New England Nuclear（Boston,MA）
から入手した。調整培地および細胞層を回収し、そして
上述のように処理した。細胞の増殖は、3Ｈ−チミジン
の取り込みにより調べた。ラミニンコートした12ウエル
のプレートに細胞を2X105／ウエルで加えた。血清を含
まない培地中で24時間後に、25μｌの3Ｈ−チミジンの1
0μCi/mlの溶液を各ウエルに添加した。インキュベーシ
ョンを24時間行った。この培養培地を捨て、細胞層を５
％のTCAで２回洗浄し、そして700μｌの6N HC1と15分間
インキュベートした。3Ｈ−チミジンの取り込みは、各
細胞層を液体シンチレーションカウンター（Beckman,Ir
vine,CA）中で計数し測定し、そしてBCAタンパク質アッ
セイキット（Pierce,Rockford,IL）により測定した各細
胞層のタンパク質含量で補正した。
から入手した。調整培地および細胞層を回収し、そして
上述のように処理した。細胞の増殖は、3Ｈ−チミジン
の取り込みにより調べた。ラミニンコートした12ウエル
のプレートに細胞を2X105／ウエルで加えた。血清を含
まない培地中で24時間後に、25μｌの3Ｈ−チミジンの1
0μCi/mlの溶液を各ウエルに添加した。インキュベーシ
ョンを24時間行った。この培養培地を捨て、細胞層を５
％のTCAで２回洗浄し、そして700μｌの6N HC1と15分間
インキュベートした。3Ｈ−チミジンの取り込みは、各
細胞層を液体シンチレーションカウンター（Beckman,Ir
vine,CA）中で計数し測定し、そしてBCAタンパク質アッ
セイキット（Pierce,Rockford,IL）により測定した各細
胞層のタンパク質含量で補正した。
マトリックス分子の同定 マトリックスの糖タンパク質は免疫沈降により、そして
プロテオグリカンは上述の酵素消化により同定した。
プロテオグリカンは上述の酵素消化により同定した。
大きなプロテオグリカンはゲル濾過により特徴付けた。
セファロースCL−6Bカラムからの35Ｓ硫酸標識画分を、
蒸留水で透析し、そして凍結乾燥した。サンプルを、上
述のプロテアーゼインヒビター、0.1Mの酢酸ナトリウ
ム、0.1Mのtris、pH7.3を含んだ2mlの溶液に溶解した。
次に、0.2mlのコンドロイチナーゼABC溶液（1.25単位/m
l）を、1.8mlのサンプルに加え、37℃で24時間消化を行
った。次に、サンプルをCL−6Bカラムで分画し、蒸留水
で透析し、凍結乾燥し、そして低pH（1.0）条件下で亜
硝酸で処理した。亜硝酸による処理の後、サンプルを、
CL−6Bカラムで再びクロマトグラフィーにかけた。
セファロースCL−6Bカラムからの35Ｓ硫酸標識画分を、
蒸留水で透析し、そして凍結乾燥した。サンプルを、上
述のプロテアーゼインヒビター、0.1Mの酢酸ナトリウ
ム、0.1Mのtris、pH7.3を含んだ2mlの溶液に溶解した。
次に、0.2mlのコンドロイチナーゼABC溶液（1.25単位/m
l）を、1.8mlのサンプルに加え、37℃で24時間消化を行
った。次に、サンプルをCL−6Bカラムで分画し、蒸留水
で透析し、凍結乾燥し、そして低pH（1.0）条件下で亜
硝酸で処理した。亜硝酸による処理の後、サンプルを、
CL−6Bカラムで再びクロマトグラフィーにかけた。
TGF−βにより誘起されたプロテオグリカン産生の増加
を定量するために、3mlの調整培地をセファロースCL−6
Bカラム（1.3X100cm）中に入れた。このカラムを、4Mの
尿素、0.15MのNaCl、50mMのTris HCl、pH7.2、0.1％（v
/V）のTriton X−100で、流量20ml/時間で溶出し、そし
て3ml/チューブの画分を回収した。各溶出画分の放射活
性を、Beckman LS 2800液体シンチレーションカウンタ
ーにより調べた。
を定量するために、3mlの調整培地をセファロースCL−6
Bカラム（1.3X100cm）中に入れた。このカラムを、4Mの
尿素、0.15MのNaCl、50mMのTris HCl、pH7.2、0.1％（v
/V）のTriton X−100で、流量20ml/時間で溶出し、そし
て3ml/チューブの画分を回収した。各溶出画分の放射活
性を、Beckman LS 2800液体シンチレーションカウンタ
ーにより調べた。
電気泳動分析 サンプルをSDS−PAGEとフルオログラフィーおよびデン
シトメーターにより、上述のように分析した。
シトメーターにより、上述のように分析した。
結果 この実施例はTGF−βは、上皮細胞によるバイグリカ
ン、フィブロネクチンおよびタイプIVコラーゲンの産生
を調節し、一方TGG−βは培養糸球体細胞では、プロテ
オグリカン産生のみに影響することを示している。従っ
て、TGF−βにより調節された、上皮細胞によるマトリ
ックス産生の生合成プロフィールは、糸球体間質細胞に
よるマトリックス産生の生合成プロフィールとは異な
る。これらの結果は、糸球体におけるTGF−βの放出
は、糸球体間質マトリックスの蓄積、および糸球体基底
膜を形成するマトリックス分子の産生の増加を導く。結
果は、表１にまとめた。
ン、フィブロネクチンおよびタイプIVコラーゲンの産生
を調節し、一方TGG−βは培養糸球体細胞では、プロテ
オグリカン産生のみに影響することを示している。従っ
て、TGF−βにより調節された、上皮細胞によるマトリ
ックス産生の生合成プロフィールは、糸球体間質細胞に
よるマトリックス産生の生合成プロフィールとは異な
る。これらの結果は、糸球体におけるTGF−βの放出
は、糸球体間質マトリックスの蓄積、および糸球体基底
膜を形成するマトリックス分子の産生の増加を導く。結
果は、表１にまとめた。
本発明を現在好適な実施態様を参考に記述したが、本発
明の意図から離れることなく種々の改変を行い得ること
を理解されたい。従って、本発明は以下の請求の範囲で
のみ限定される。
明の意図から離れることなく種々の改変を行い得ること
を理解されたい。従って、本発明は以下の請求の範囲で
のみ限定される。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/22 ＡＢＮ ＡＣＥ 39/395 ＡＣＳ Ｄ ＡＤＵ Ｎ Ｃ０７Ｋ 16/24 8318−4Ｈ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＣＤ ＡＢＸ 37/24 ＡＢＮ (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖ ｏｌ．261，Ｎｏ．９（1986），Ｐ．4337 −4345 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．83（1986），Ｐ. 4167−4171 Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏ ｌ．83（1989），Ｐ．1661−1666 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．27 （1988），Ｐ．739−746
Claims (11)
- 【請求項１】組織中のプロテオグリカンを含む細胞外マ
トリックスの蓄積により特徴付けられる病気を処置する
ための組成物であって、トランスフォーミング増殖因子
β（TGF−β）のプロテオグリカン刺激活性を抑制する
物質を有効な量で含む、組成物。 - 【請求項２】前記物質が、抗TGF−β抗体である、請求
項１に記載の組成物。 - 【請求項３】前記物質が、PDGFである、請求項１に記載
の組成物。 - 【請求項４】前記物質が、Arg−Gly−Asp含有ペプチド
である、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項５】前記病気が、糸球体腎炎、成人性呼吸困難
症候群、肝硬変、線維性の癌、肺線維症、動脈硬化、心
筋梗塞後の疾患、心臓線維症、血管形成術後の再狭窄、
腎臓間隙性の線維症およびはん痕、からなる群から選択
される、請求項１に記載の組成物。 - 【請求項６】組織中でのプロテオグリカンを含む細胞外
マトリックスの蓄積を阻害するための組成物であって、
組織中のTGF−βのプロテオグリカン刺激活性を抑制す
る物質を有効な量で含む、組成物。 - 【請求項７】前記物質が、抗TGF−β抗体である、請求
項６に記載の組成物。 - 【請求項８】前記物質が、PDGFである、請求項６に記載
の組成物。 - 【請求項９】前記物質が、Arg−Gly−Asp含有ペプチド
である、請求項６に記載の組成物。 - 【請求項１０】前記組織が、腎臓、肺、肝臓、および皮
膚の細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項
６に記載の組成物。 - 【請求項１１】TGF−βのプロテオグリカン刺激活性を
阻害し、約108あるいはそれ以上の親和性を有し、ラジ
オイムノアッセイによる測定で1:30,000あるいはそれ以
上の力価を有し、そして、TGF−βからの直鎖状ペプチ
ドで動物を免疫することによって産生される、抗体。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41508189A | 1989-09-29 | 1989-09-29 | |
| US41665689A | 1989-10-03 | 1989-10-03 | |
| US415081 | 1989-10-03 | ||
| US416656 | 1989-10-03 | ||
| PCT/US1990/005566 WO1991004748A1 (en) | 1989-09-29 | 1990-09-27 | INHIBITING TRANSFORMING GROWTH FACTOR β TO PREVENT ACCUMULATION OF EXTRACELLULAR MATRIX |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05503076A JPH05503076A (ja) | 1993-05-27 |
| JPH0780780B2 true JPH0780780B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=27022856
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2514972A Expired - Fee Related JPH0780780B2 (ja) | 1989-09-29 | 1990-09-27 | 細胞外マトリックスの蓄積防止のためのトランスフォーミング増殖因子βの阻害 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0775742A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0780780B2 (ja) |
| AT (1) | ATE154514T1 (ja) |
| AU (1) | AU654938B2 (ja) |
| CA (1) | CA2065860C (ja) |
| DE (1) | DE69030956T2 (ja) |
| DK (1) | DK0494264T3 (ja) |
| FI (1) | FI921353L (ja) |
| NO (1) | NO921119D0 (ja) |
| WO (1) | WO1991004748A1 (ja) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9106678D0 (en) * | 1991-03-28 | 1991-05-15 | Ferguson Mark W J | Wound healing |
| JP3854307B2 (ja) * | 1991-12-04 | 2006-12-06 | ザ バーナム インスティテュート | 細胞外マトリックスの蓄積を防止するためのトランスフォーミング増殖因子βの阻害 |
| GB9205800D0 (en) * | 1992-03-17 | 1992-04-29 | British Tech Group | Treatment of fibrotic disorders |
| AU3943793A (en) * | 1992-04-01 | 1993-11-08 | Whittier Institute For Diabetes And Endocrinology, The | Methods of inhibiting or enhancing scar formation in the CNS |
| US5395825A (en) * | 1993-03-10 | 1995-03-07 | Yale University | Fertility regulation with transforming growth factor β |
| US5453492A (en) * | 1993-07-28 | 1995-09-26 | La Jolla Cancer Research Foundation | 60 kDa transforming growth factor-β-binding protein and its use to detect or purify TGF-β |
| JPH09505057A (ja) * | 1993-11-19 | 1997-05-20 | ザ・ユニバーシティ・オブ・シドニー | 白内障を予防または制御するための方法 |
| DE69513158T2 (de) * | 1994-03-29 | 2000-05-04 | The Victoria University Of Manchester, Manchester | Wundheilung |
| US6207816B1 (en) * | 1995-06-02 | 2001-03-27 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | High affinity oligonucleotide ligands to growth factors |
| GB2304045A (en) † | 1995-08-04 | 1997-03-12 | Univ Manchester | Betaglycan compositions for promoting the healing of wounds and fibrotic diseases |
| GB9601081D0 (en) * | 1995-10-06 | 1996-03-20 | Cambridge Antibody Tech | Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods |
| US7368111B2 (en) | 1995-10-06 | 2008-05-06 | Cambridge Antibody Technology Limited | Human antibodies specific for TGFβ2 |
| AU2008200019B2 (en) * | 1999-01-05 | 2009-10-08 | American National Red Cross | Methods for treating conditions associated with the accumulation of excess extracellular matrix |
| CA2358400C (en) * | 1999-01-05 | 2012-05-15 | Nancy A. Noble | Methods for treating conditions associated with the accumulation of excess extracellular matrix |
| US7763580B2 (en) | 1999-01-05 | 2010-07-27 | University Of Utah Research Foundation | Methods for treating conditions associated with the accumulation of excess extracellular matrix |
| US6492497B1 (en) | 1999-04-30 | 2002-12-10 | Cambridge Antibody Technology Limited | Specific binding members for TGFbeta1 |
| CA2400628A1 (en) | 2000-03-09 | 2001-09-13 | Genzyme Corporation | Use of tgf-beta antagonists to treat or to prevent loss of renal function |
| NZ550217A (en) | 2004-03-31 | 2009-11-27 | Genentech Inc | Humanized anti-TGF-beta antibodies |
| JP4566605B2 (ja) * | 2004-04-02 | 2010-10-20 | 有限会社開発顧問室 | 短鎖ペプチドを有効成分とするコラーゲン合成阻害剤およびその製造方法 |
| JP2009221164A (ja) | 2008-03-17 | 2009-10-01 | Nitto Denko Corp | 肺線維症処置剤 |
| DK2730277T3 (da) | 2004-12-22 | 2020-04-06 | Nitto Denko Corp | Lægemiddelbærer og lægemiddelbærerkit til at inhibere fibrose |
| JP5602365B2 (ja) | 2005-10-25 | 2014-10-08 | ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ | マルファン症候群及び関連疾患を治療するための方法及び組成物。 |
| US9572886B2 (en) | 2005-12-22 | 2017-02-21 | Nitto Denko Corporation | Agent for treating myelofibrosis |
| US8454952B2 (en) | 2006-03-13 | 2013-06-04 | The Johns Hopkins University | Augmentation of endothelial thromboresistance |
| PL2083863T3 (pl) | 2006-10-03 | 2015-08-31 | Genzyme Corp | Przeciwciała przeciwko TGF-beta do stosowania w leczeniu niemowląt obarczonych ryzykiem rozwinięcia się dysplazji oskrzelowo-płucnej |
| JP5950428B2 (ja) | 2010-08-05 | 2016-07-13 | 日東電工株式会社 | 線維化組織から正常組織を再生するための組成物 |
| WO2012090997A1 (ja) | 2010-12-27 | 2012-07-05 | 京都府公立大学法人 | ｉＰＳ細胞とその製造法 |
| AU2012261933B2 (en) | 2011-06-03 | 2017-06-15 | Xoma Technology Ltd. | Antibodies specific for TGF-beta |
| EP2737083A1 (en) | 2011-07-27 | 2014-06-04 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique) | Methods for diagnosing and treating myhre syndrome |
| CA2853484C (en) | 2011-10-26 | 2018-08-21 | Seattle Children's Research Institute | Cysteamine in the treatment of fibrotic disease |
| WO2013100208A1 (ja) | 2011-12-28 | 2013-07-04 | 京都府公立大学法人 | 角膜内皮細胞の培養正常化 |
| JP6340162B2 (ja) | 2012-12-20 | 2018-06-06 | 日東電工株式会社 | アポトーシス誘導剤 |
| CA2927898C (en) | 2013-10-31 | 2021-11-16 | Kyoto Prefectural Public University Corporation | Therapeutic drug for diseases related to endoplasmic reticulum cell death in corneal endothelium |
| CN106164089B (zh) | 2014-04-02 | 2020-11-03 | 日东电工株式会社 | 靶向分子及其用途 |
| KR102256453B1 (ko) | 2014-04-07 | 2021-05-25 | 닛토덴코 가부시키가이샤 | 소수성 약물 전달용 신규한 폴리머계 하이드로트로프 |
| US10092891B2 (en) | 2014-04-25 | 2018-10-09 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Controlling the activity of growth factors, particularly TGF-β, in vivo |
| WO2016187312A1 (en) | 2015-05-18 | 2016-11-24 | The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Methods and compositions for treating an alphavirus infection |
| US11246883B2 (en) * | 2016-09-30 | 2022-02-15 | Academia Sinica | Microrna let-7 and transforming growth factor beta receptor III axis as target for cardiac injuries |
| CN114364691B (zh) * | 2019-07-31 | 2023-12-12 | 马克斯·普朗克科学促进学会 | 作为纤维化基质积累的抑制剂的肽 |
| EP3771464A1 (en) * | 2019-07-31 | 2021-02-03 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Peptides as inhibitor of fibrotic matrix accumulation |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5352664A (en) * | 1986-10-31 | 1994-10-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Thrombin derived polypeptides; compositions and methods for use |
| US5384309A (en) * | 1989-07-17 | 1995-01-24 | Genentech, Inc. | Cyclized peptides and their use as platelet aggregation inhibitors |
-
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-
1992
- 1992-03-20 NO NO921119A patent/NO921119D0/no unknown
Non-Patent Citations (11)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７（１９８８），Ｐ．７３９−７４６ |
| BIOCHEMISTRY=1988 * |
| Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．８３（１９８９），Ｐ．１６６１−１６６６ |
| J.CLIN.INVEST.=1989 * |
| J.CLIN.INVEST=1989 * |
| KIDNEY INTERNATIONAL=1989 * |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８３（１９８６），Ｐ．４１６７−４１７１ |
| PROC.NATL.ACAD.SCI.USA=1986 * |
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1986 * |
| THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1988 * |
| ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６１，Ｎｏ．９（１９８６），Ｐ．４３３７−４３４５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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