JPH0780781B2 - グラニユロサイト−マクロフア−ジ コロニ−刺激 因子によるマクロフア−ジ殺腫瘍作用の活性化 - Google Patents

グラニユロサイト−マクロフア−ジ コロニ−刺激 因子によるマクロフア−ジ殺腫瘍作用の活性化

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JPH0780781B2
JPH0780781B2 JP61191561A JP19156186A JPH0780781B2 JP H0780781 B2 JPH0780781 B2 JP H0780781B2 JP 61191561 A JP61191561 A JP 61191561A JP 19156186 A JP19156186 A JP 19156186A JP H0780781 B2 JPH0780781 B2 JP H0780781B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はマクロフアージの活性化に関し、より詳細に
は、マクロフアージおよび前駆体モノサイトを単にグラ
ニユロサイト−マクロフアージ コロニー刺激因子（以
下、GM−CSFと呼ぶ）で刺激することにより、殺腫瘍活
性をあたえることに関する。
（従来技術） マクロフアージは骨髄に由来する血液中のモノサイトか
ら発達する、活発に動く、比較的大きい（10〜20μｍ）
食細胞である。マクロフアージは、活性化により、膜の
しわ発生、過酸化物の同化、Ia抗原の発現増大およびプ
ラスミノーゲンの分泌増大などをふくむ数種の機能的，
生化学的および形態的変化をうけることが観察されてい
る。またマクロフアージは免疫系の重要要素と考えられ
ている。活性化されるとマクロフアージは外来の粒子や
老化細胞の破壊に関連すると考えられており、最近では
新生物による病気に耐性をあたえ、および／または除去
することがつきとめられている。これらの活性を発揮す
る活性化マクロフアージおよび前駆体モノサイトの発生
には、有効な活性化信号および受容単核食細胞の共存が
必要である。
マクロフアージの活性化はマクロフアージ活性化因子ま
たはMAFと呼ばれるある種のリンフオカインにより誘発
されることは一般に認められている。カメロン（Camero
n）等、J.Clin.Invest.,63:977（1979）；マンタバニ
（Mantayani）等、Int.S.Cancer,25:691（1980）；およ
びクライネルマン（Kleinerman）等、J.Clin.Invest.,7
2:304（1983）を参照。
MAFが他のものとは別のリンフオカインであるか又は全
体的にもしくは部分的に他のリンフオカインでできてい
るかは解明されていない。或る研究者はネズミの系では
MAFがガンマ−インターフエロン（IFN−γ）から構成さ
れていると示唆している。ロバートおよびバシル（Robe
rts and Vasil）,J.Interferon Res.,2:519（1982）お
よびスベデルスキー（Svedersky）等、J.Exp.Med.,159:
812（1984）を参照。
然しながらIFN−γ以外のリンフオカインもマクロフア
ージを腫瘍細胞を殺しうる程度まで活性化する可能性が
あると考えられている。マクロフアージは表皮細胞を刺
激し、傷の治癒を助け、炎症や発熱の原因となることが
知られているリンフオカイン−インターロイキン１（IL
−イ）を生産する。オノザキ（Onozaki）等、J.Immuno
l.,135:314（1958）は、最近IL−１も新鮮なモノサイト
の殺腫瘍細胞活性を増大させることを示唆している。
マクロフアージおよび前駆体モノサイトもまた種々の物
質での処理により活性化されて殺腫瘍細胞作用を示しう
ると報告されている。例えばバクテリア産物リポポリサ
ツカライド（LPS）〔ゾーン（Sone）等,Cancer Res.,4
2:2227（1982）〕、ムラミルジペプチド（MDP）のよう
なペプチドグリカン〔ナガオ（Nagao）等,Infec.Immu
n.,24:304（1979），クライナー（Kleiner）等,Cancer
Res.,43:2010（1983）〕。
他のマクロフアージ活性化物質には、腫瘍プロモーター
・フオルボール・ミリステート・アセテート（PMA），
ピツク（Pick）等,Ann.N.Y.Acad.Sci.,332:378（1979）
およびイオノフオア類，ピツク等（同上）およびフンド
（Hund）等,Nature（ロンドン）,265:543（1979）があ
る。
最近の報告によれば、マクロフアージが非特異的殺腫瘍
活性を発揮するための効果的活性化は単一の信号の結果
ではなく、一連の反応が必要であることが示唆された。
メルツアー（Meltzer）は『リンフオカイン』，ピツク
およびランデイー（Pick and Lasndy）編，アカデミツ
ク プレス，ニユーヨーク，第319〜343頁のなかで、マ
クロフアージが活性化されて殺腫瘍活性を示すには、反
応場所、例えば感染部位に血液のモノサイトが補給また
は集積され、モノサイトがその場所で能力ある単核食細
胞に分化すると仮定してる。この最初のモノサイトの分
化段階の後、モノサイトはリンフオカインからの最初の
信号によつて受容状態にとプライミングされる。このプ
ライムされたマクロフアージが最終的に成熟して細胞毒
性を有するには、例えばLPSから由来する第二の信号を
通した引金が必要である。一定レベルのマクロフアージ
活性化に必要なプライミング信号（リンフオカイン）と
引金信号の濃度は、これらを直列に使用すると、これら
の信号を単独で使用した場合に比べて遥かに低く、これ
らの信号の間には相乗作用的強力が存在することが示唆
される。
LPSとJFN−γについてもリンフオカイン−LPSと似た関
係が報告されている。シユルツ（Schultz）,J.Interfer
on Res.,2:459（1982）。組み換えDNA技術は、インビト
ロ細胞バイオアツセイの発達とともに、IFN−γ,IL−１
および他のリンフオカインのcDNAのクローニングをもた
らした。高度に純粋な組み換え由来のIFN−γはそのMAF
活性に関する従来の報告を確証し、さらに非特異的殺腫
瘍活性を発揮するために効果的にIFN−γを誘発するた
めにはLPSのような第二の引金信号が必要であるという
報告も確証された。
本発明は、GM−CSFを使用してマクロフアージおよび前
駆体モノサイトを刺激し、非特異的殺腫瘍活性を仲介さ
せることに関し、この活性化は共同刺激因子、例えばLP
SまたはIFN−γの存在には依存しない。GM−CSFは特定
の種類のコロニー刺激因子（CSF）である。CSFはリンフ
オカインの仲間であり骨髄中に見出される親細胞を特定
の種類の成熟血液細胞への分化を誘発する。この親細胞
から生じる成熟血液細胞の特定種類は、存在するCSFの
種類に依存する。例えば、エリスロポエチンは親細胞を
赤血球に成熟させ、一方トロンボポエチンは親細胞を血
小板への過程へ誘導すると信じられている。同様にグラ
ニユロサイト−マクロフアージコロニーの形成は、GM−
CSFの存在に依存する。GM−CSFも含めたCSFが骨髄親細
胞から白血球への成熟および増殖へと誘発する能力は充
分知られているが、GM−CSFが単独でマクロフアージま
たは前駆体モノサイトを活性化して、非特異的殺腫瘍活
性に介在することは従来知られていない。
（発明の目的） 本発明によれば、マクロフアージまたはモノサイト前駆
体がGM−CSF信号のみにより、活性化され非特異的殺腫
瘍活性を介在する。活性化マクロフアージまたはモノサ
イト前駆体は、インビボまたはインビトロで腫瘍細胞を
不活性化するために使用出来る。腫瘍で苦しんでいる患
者の体内からマクロフアージ，モノサイトまたはその前
駆体を取り出し、該細胞を治療有効量のGM−CSFととも
に培養することにより、刺激して殺腫瘍活性化を発現さ
せることにより、該患者を治療することができる。その
後刺激された細胞をその患者に投与し、活性化細胞によ
り該患者を苦しめている腫瘍細胞を探しだして破壊する
ことができる。別の方法として、GM−CSFを直接静注，
皮下注射，腹腔内注射または筋肉内注射によりまたは鼻
腔からの吸入により患者に投与してもよい。本発明によ
れば活性化マクロフアージを使用して、癌患者はエンド
トキシン，放射活性物質または他の有害な物質に接する
ことなく治療できることが重要である。
本発明に使用する充分な量の均一なGM−CSFは組換えDNA
技術により製造できる。GM−CSFをコードする遺伝子を
単離し、組み換え蛋白質を高いレベルで発現できる系で
使用するために遺伝子工学的に処理する。発現宿主から
回収したGM−CSFを逆相高性能液体クロマトグラフイー
で均質に精製する。
活性化されたマクロフアージまたは前駆体モノサイトが
特定の腫瘍を破壊する効果を証明する方法は、マクロフ
アージまたはモノサイト前駆体を種々の濃度のGM−CSF
とともに培養する工程をふくむ。適当な培養期間の後、
GM−CSFを除き、次に標的腫瘍細胞を放射活性で標識し
てから、前記活性化マクロフアージエフエクター（攻
撃）細胞を作用させる。さらに培養したのち、破壊され
た標的細胞を取り除き、残存する標的細胞を溶解して、
活性化マクロフアージへの暴露に対して生き残つた細胞
の数を定量的指標として計数した。
前駆体モノサイトの調製 末梢血液モノサイトの形のマクロフアージをフイコール
およびパーコール分離を含む標準的技術で精製し、引き
続くGM−CSFでの活性化に使用した。この操作における
最上のモノサイト層を培地にプレーテイングし、次いで
非付着性細胞を除去し、のこりのモノレヤー細胞をGM−
CSFおよび他のLPSやIFN−γをふくむ活性化剤の添加に
よつて活性化できるようにした。エンドトキシンなどの
混在を防止するため、細胞分離工程に使用した各試薬は
リムラス・アメボサイト・リゼート（Limulus Ameobocy
te Lysate）で試験した。更に、細胞集団はエンドトキ
シンを含まない緩衝液および培地で調製した。
末梢血液から単離するかわりに、モノサイトまたは成熟
マクロフアージは他の供給源、例えば脾臓細胞，リンパ
節細胞または肺洗浄物に由来しても良い。
組換えGM−CSFの調製およびGM−CSF遺伝子のクローニン
グ GM−CSFは生体内では非常に少量しか生産されない。本
発明によれば、組換え技術により、モノサイトおよびマ
クロフアージの活性化に使用するための比較的多量の高
度純化GM−CSFが生産できる。そのような蛋白質生産の
ための組換えDNA技術に関する議論は、Science,196,（1
977年４月）の論説および追加論文に記載されている。
この参考文献で論じられている組換えDNA技術を利用す
るためGM−CSFをコードする遺伝子をcDNAライブラリー
から、例えばニツクトランスレーシヨンされたcDNAプロ
ーブを使つてまず単離する必要がある。そのような標識
プローブは、ネズミGM−CSFのヌクレオチド配列部分に
相当する合成オリゴヌクレオチドプローブを使用し、ネ
ズミGM−CSFのcDNAライブラリーから誘導された。
ヒトGM−CSF遺伝子の分子クローンを単離するために、
リンフオーマ細胞、例えばHUT−102,JurkatまたはHL60
または他の種類の供給源例えばヒト末梢血液単核球細胞
から全RNAを抽出した。鳥のミエロブラスト−シスウイ
ルス（AMV）の逆転写酵素を使用してポリアデニル化mRN
Aの逆転写によりcDNAライブラリーを作成した。このDNA
をDNAポリメラーゼＩを用いて二重鎖にし、適当なクロ
ーニングベクター、例えばプラスミド，バクテリオフア
ージまたはコスミツド中に挿入した。次いで得られた組
換えクローニングベクターを適当な宿主、例えば大腸菌
（Escherichia coli（E.coli））、イーストまたは他の
単細胞生物の形質転換に使用した。
形質転換宿主を同定し、グループに分けてプールした。
これらのプールから調製したプラスミドDNAを32Ｐで放
射標識したニツクトランスレート化cDNAネズミGM−CSF
プローブとハイブリツド形成させた。プローブに陽性の
信号を与えたクロンーンのプールを同定し、次いで候補
のプールをさらに分割し、ハイブリツド形成スクリーニ
ングを繰り返した。最後にヒトGM−CSF遺伝子に相当す
る単一の形質転換体が同定された。この形質転換体から
プラスミドDNAを調製し、例えばサンガー等、Proc.Nat
l.Acad.Sci.（U.S.A.）,70:5463により、提唱された標
準的チエインターミネーシヨン法を用いるDNA配列決定
により同定した。
第１図はヒトGM−CSF遺伝子のヌクレオチド配列を示
す。ヒトGM−CSF遺伝子のコード領域はヌクレオチドNO.
14からヌクレオチドNo.394におよぶ。ヌクレオチド配列
から決定した相当するアミノ酸配列は、関連コドンの下
に示す。同定された陽性コロニーから調製されE.coli中
に形質転換され、pHG23と命名されたプラスミドDNAはア
メリカン・タイプカルチユア・コレクシヨン（ATCC），
〔12301パークローンドライブ，ロツクビル，メリーラ
ンド 20852 米国〕に受託番号No.39900として寄託され
ている。
機能性GM−CSFの発現 宿主中のpHG23中に含まれるGM−CSF遺伝子の発現によ
り、機能性GM−CSFを製造し、発現生産物が寒天中で骨
髄細胞コロニーの増殖を刺激す能力を試験した。第１図
に示すGM−CSF遺伝子の実質的に完全コード領域であるc
DNAフラグメント（Sfa NIからNcoIまでのフラグメン
ト）を酵母細胞からGM−CSFの合成および分泌を指令す
るようにデザインした発現ベクター（例えば第２図に示
すようなpYαfGM−２と命名されたベクター）中に挿入
した。例えばpYαfGM−２のような発現ベクターは、好
ましくは複製起点およびアンピシリン−耐性遺伝子（Ap
γ）を含むプラスミドpBR322由来の配列（第２図の太線
部分）を含む。理想的には、発現ベクターは酵母からの
配列例えば選択マーカーとしてのトリプトフアン−１遺
伝子（TRP−１）および複製の２μ酵母オリジンをも含
む。発現ベクターはまた好ましくは更に、酵母pre−pro
−α接合因子（α−フアクター）（点線枠部分）を効果
的プロモーターとして、酵母宿主中でGM−CSFの合成お
よび分泌を指令するリーダー配列（その後に第１図のGM
−CSFのコード領域が続く（ハツチング枠部分））とと
もに含む。α−フアクター遺伝子の構造は、クルジヤン
およびヘルスコビツツ（Kurjan and Herskowitz）,Cel
l,30:933−9438（1982）に記載されている。
pYαfGM−２発現プラスミドを適当な株の酵母（S.cerev
isiae）中に形質転換した。好ましい酵母株はNo.79,X21
81−1B,DBY746,YNN280および20B−12が含まれる。これ
らの株は、α−フアクタ−プロモーターとの適合性およ
びTrp+形質転換体の選択に関して、全てα,Trp1,Leu2で
ある。これらの株は全て一般に入手可能であり、例えば
ストレインNo.79はYeast Genetic Stock Center,Depart
ment of Biophysics and Medical Physics,University
of California,Berkeley,California 94702から入手出
来る。
bIL−２遺伝子を含む組換え発現プラスミドによる酵母
宿主の形質転換は、スフエロプラストを形成させ、次い
でプラスミド取り込みの前に洗浄する公知の方法で行つ
た。この方法のための処方は確立されている。例えば、
ベツグス（Beggs）,Nature（London）,275:104（1978）
およびヒンネン等,Proc.Natl.Acad.Sci.（U.S.A）,75:1
929（1978）を参照。
酵母醗酵上澄の生物学的活性をヒト骨髄細胞からのグラ
ニユロサイトおよびマクロフアージタイプコロニーの混
合形成の能力に関して検定した。対照として、プラスミ
ドpYαfGM−２と同じ構造であるが、GM−CSF配列を欠失
したプラスミドpYαｆもまた酵母宿主に形質転換して醗
酵上澄の生物学的活性を検定した。pYαfGM−２の上澄
は骨髄アツセイにおいて高レベルのGM−CSF活性の合成
を指令することが見出され（培養1ml当たり1.2×106コ
ロニー形成単位（CFU−c/ml））、これに対して、pYα
ｆ対照プラスミドから誘導された上澄には活性は全く検
出されなかつた。
組換えGM−CSFの精製 発現宿主細胞の上澄の中に含まれる組換えGM−CSFは、
逆相高性能の液体クロマトグラフイー（HPLC）で実質的
に均一に精製した。本発明で使用するHPLCの方法におい
ては、好ましくは逆相、テトラメチル，オクタデシル，
オクチルメチルまたはジフエニル−結合シリカカラムで
あつて、GM−CSF蛋白質への使用が最適であるほど充分
に大きい孔径、即ち少なくとも300Åのものである。
本発明で使用しうる逆相HPLCカラムは市販されている。
この目的のために好ましいカラムは、セパレーシヨンズ
グループ（Separations Group）,Hesperia,CAから市
販されているビダツク（Vydac）系列のカラムである。
例えば、本発明は、平均粒子サイズ30ないし44ミクロン
に選別された孔径300Åのシリカゲルの表面に結合され
たシロキサン（シリカン−酸素−シリカン）によつて共
有結合したテトラメチルシラン基よりなるビダツクC4ま
たはC18吸着逆相カラムを使用できる。
カラムに適用する前に、発現されたGM−CSFを適当な
酸、例えばトリフルオロ酢酸（TFA）を使つて酸性にす
る。HPLCカラムからの蛋白質の溶出は、公知の方法で行
う。カラムからの結合蛋白質を除去するための溶出の適
当な方法はアセトニトリルの直線勾配の使用を含む。こ
の目的のための好ましい勾配は、TFA（pH2.0−2.1）中
の０−100％（vol/vol）アセトニトリル勾配である。
溶出された蛋白質は当業者に公知の検出手段で都合よく
モニターできる。例えばHPLCカラムから溶出されたフラ
クシヨン中の蛋白質の相対濃度は、溶出された材料を光
波長214ナノメーターの自動紫外線スペクトロフオトメ
ーターで吸光度を測定することによつて決定することが
できる。適当な自動紫外線光吸収検出手段は、Milford,
MEのウオーターズ アソシエート社（Waters Associate
s）から入手できる。
HPLCから回収したフラクツシヨンにつき、後記の実施例
４に示すとおり、フレオレスカミンアツセイおよびSDS
（ドデシル硫酸ナトリウム）ポリアクリルアミドゲル電
気泳動およびそれに続く銀染色で蛋白質の検出を行う。
回収されたGM−CSFはFxn57と命名され、前記および実施
例３のようにして骨髄コロニー形成アツセイにより、生
物学的活性を調べる。
もし、最初のHPLCで充分な蛋白質の精製が果たされなか
つたときは、同じカラムまたは異なるタイプのカラムを
使用して操作を繰り返すことが出来る。さらに同一また
は異なる溶出剤を使用してよい。HPLCを二段階で実施す
ることによつて、GM−SCFは生物学的活性が単一対称ピ
ークを示すまでの均一度に精製された。第５図に示すと
おり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分子量
約21,000および17,000ダルトンのGM−CSF活性を持つ二
つのバンドが同定された。これらのバンドは、酵母が製
造したグリコシル化（21,000）および非グリコシル化
（17,000）GM−CSFに相当する。骨髄コロニー形成アツ
セイにおいて、Fxn57の活性程度は1.5×107CFU−c/mlで
あつた。この均質GM−CSFの比活性は約1.5×106CFU−c/
μｇ蛋白質または3.0×1016CFU−c/モルであつた。
標的細胞の調製 モノサイト／マクロフアージの殺腫瘍状態への活性化は
種々のタイプの腫瘍細胞を使用してアツセイした；例え
ばA375ヒトメラノーマ細胞ライン（ATCC No.CRL161
9），ヒト膀胱鱗癌（bladder squamous carcinoma）SCa
BER（ATCC No.THB3），ヒト星細胞腫膠芽腫Ｕ−87MGお
よびＵ−373 GM（ATCC No.HTB 14および17）、ヒトエビ
ング（Ewingu）ザルコーマEsa−１およびSK−ES−２（A
TCC No.HTB83およびHTB87）、ヒト悪性メラノーマSK−M
EL−28およびSL−MEL−31（ATCC No.HTB72およびHTB7
3）、ヒト肝臓癌SK−Hep−１（ATCC No.HTB−52）、ヒ
ト膵臓癌MIA PACA−２（ATCC No.CRL−1420）およびヒ
ト膀胱癌5637（ATCC No.HTB−９）を使用した。アツセ
イに先立つて標的細胞を種々の添加物、例えば胎児牛血
清（FCS）で強化した培地中でモノレヤーに増殖させ
た。次に標的細胞を例えば〔125I〕ヨードウリジン〔（
125I）IUdR〕で放射標識した。標識方法の標準手順は、
クライナーマン（Kleinerman）等、前述、およびオノザ
キ、前述、に記載されている。
殺腫瘍活性のアツセイ 候補アクチベーター物質、即ち、GM−CSF,IFN−γ,LPS
の種々の濃度を、上記で用意したプレーテイングされた
モノサイトに加えた。適当な培養期間、即ち24時間後
に、試験物質を除去し、培養ウエルに放射標識標的細胞
を加えた。初期インキユベーシヨン期間を更に置いた
後、培養上澄を除去して新鮮な培地に交換した。次いで
最終培養期間の後、活性化モノサイトで殺された標的細
胞を除去し、各ウエル中の残存生存細胞を適当な試薬、
例えばNaOHで溶解する。次いで溶解物の放射活性をガン
マカウンターで測定する。放射標識標的細胞を含むが活
性化モノサイトを含まないウエルを標的細胞の活性の対
照として用いる。
活性化モノサイトに介在される殺細胞活性は次のように
計算される： 第３図および第４図は、種々の濃度の組換えヒトGM−CS
F,LPS,IFN−γまたはLPSとIFN−γとともに活性化した
ヒト末梢血液モノサイトの殺腫瘍活性を説明するもので
ある。特に第３図は、LPSおよびIFN−γの単独およびマ
クロフアージ介在腫瘍標的破壊を誘発するために組合せ
たLPSおよびIFN−γの用量依存性効果を示す。第３図は
また、組換えGM−CSFを含む種々の濃度の酵母上澄の活
性も示す。第３図に描かれているとおり、この酵母上澄
は1:500（200CFU−c/ml）の希釈でマクロフアージを活
性化して約65％の特異的殺細胞性を発揮した。これもま
た第３図に記載されているとおり、対照酵母発酵上澄
は、マクロフアージ細胞毒性を誘発することはできなか
つた。粗酵母上澄は、約１−２×105CFU−c/mlのタイタ
ーを有していた。
第４図は、精製組換えヒトGM−CSFの用量依存力価の全
範囲を示している。第４図に説明したとおり、マクロフ
アージ介在腫瘍細胞殺細胞性の最大誘発の1/2は、均一G
M−CSFを含むカラムフラクシヨンの約1:1,000,000希釈
（15CFU−c/ml）で生じた。IFN−γ,LPSおよびIFN−γ
と組合せたLPSの殺細胞性を説明する対照データもまた
第４図に示す。
上記から明らかなとおり、GM−CSFはモノサイトの殺腫
瘍細胞活性を誘発する単一信号として効果的に作用し
た。このようなGM−CSFの生物学的活性は、従来知られ
ていなかつた。
腫瘍患者の治療 上記のような調製した精製組換えGM−CSFは、腫瘍患者
または哺乳動物を種々の治療法で治療するために使用で
きる。治療を要する患者に治療有効量のGM−CSFを一般
的な種々の経路、例えば非経口または経皮膚投与法で投
与できる。一般に、組換えGM−CSFは１日当り患者体重1
kgにつき、約1.0ないし106μｇの量で投与できる。好ま
しくは、治療はこの範囲の低用量で開始して、望まれる
治療効果が達成される用量まで増加される。さらに、用
量の変更は種々の因子、例えば治療される患者の状態に
よつても必要になろ。いずれにしても、投与責任者が各
患者について適当な用量を決定するであろう。
非経口投与のためには、組換えGM−CSFは、例えば皮
下，筋注，腹腔，または静注により、単一もしくは複数
用量で患者に投与される。別法として、GM−CSFはエー
ロゾル吸入，経皮，経口腔または直腸坐剤として投与し
てもよい。注射用投与のためには、組換えGM−CSFのゴ
マ油，ピーナツ油または水性プロピングリコール中の溶
液ならびに蒸留水，血清アルブミン，リンゲル液，ハン
クス液，その他の無菌，非毒性，非アレルギー性溶液を
使用できる。そのような溶液は必要に応じて適当に緩衝
化でき、また液体希釈剤は十分量の食塩またはグルコー
スで等張にしておくこともできる。
別の治療方法として、マクロフアージまたはその前駆体
細胞を提供者から単離し、該細胞を治療有効量のGM−CS
Fとともに培養することによつて、殺腫瘍活性をもつよ
うに刺激することができる。この活性化マクロフアージ
もしくは前駆体細胞を、次に上記技術の一つを用いて受
容者に投与することができる。全ての場合ではないが、
典型的には提供者と受容者は同一個人である。
本発明の治療方法は、実質的に全ての型の腫瘍、特に固
型癌に対して採用可能である。そのような腫瘍には、膀
胱，腎臓，鱗状細胞，肺，肝臓，胸部，および大腸の各
所の癌を全て含む。腫瘍には、全てのメラノーマやザル
コーマも含まれる。
以下の実施例により、本発明の方法および発明物を詳述
する。実施例は単に例示の目的で記載するものである；
本発明を説明し、当業者が本発明を追試および利用する
助けとするために記載する。実施例によつて本発明の範
囲を限定しようとするものではなく、特許権成立後の発
明の範囲は、特許請求の範囲によつて定められる。
実施例１ 末梢血液モノサイトの調製 リムラス・アメボサイト・リゼート〔ホイツトテーカー
・エム・エイ・バイオプロダクツ（Whittaker M.A.Biop
roducts），ウオーカースビル,MA〕を使用してパイロジ
エンを含まないことを調べた試薬を使用して、末梢血液
モノサイトのバフイーコート（白血球）部分〔ポートラ
ンド，オレゴンの赤十字から入手〕を精製した。各バフ
イーコートを、ロスウエル・パーク・メモリアル・イン
スチチユート（RPMI）−1640培地とヘパリン（50U/ml,
シグマ社，セントルイス,MO）で希釈して細胞200mlと
し、アイソリンフ（Isolymph）〔ギヤラード−シユレジ
ンガー（Gallard−Schlesinger），カールプレース，ニ
ユーヨーク）上に重ね、1400×ｇで25分間遠心した。層
間の細胞（単核白血球）を洗浄して、４〜５×107細胞/
2mlの濃度で連続パーコール（フアルマシア・フアイン
・ケミカルズ）上に重ねて、200×ｇで20分間４℃で遠
心し、モノサイトを残りの単核白血球から分離した。得
られた頂部のモノサイト層を回収し、５％FSCを含むRPM
I−1640で洗浄し、RPMI−1640および５％FCSとともに96
穴平底マイクロタイタープレート〔コスター（Costa
r）、ケムブリツジ、MA〕中に１〜２×105細胞／ウエル
の濃度でプレーテイングした。37℃で１時間インキユベ
ートした後、18ゲージ針を使つて非付着細胞を吸引除去
し、次いでモノサイト層を血清不含のRPMI−1640培地で
２回洗浄し、これにより、モノサイトに種々濃度の候補
アクチベーター、例えばGM−CSF,IFN−γ,LPSまたはIFN
−γと組合せたLPSよりなる試験サンプルを、以下に詳
述する如く添加する準備を終了した。
実施例２ 組換えGM−CSFの調製 GM−CSF遺伝子の実質的完全コード領域および３′−隣
接領域を第１図のcDNAクローンから取り出し、これを使
用して酵母宿主細胞中でGM−CSFの発現を指令させるた
めの、pYαfGM−２と命名された組換え発現プラスミド
を形成した。pYαfGM−２発現プラスミドは、受託番号N
o.53157でATCCに寄託された。第２図に示される如く、p
YαfGM−２は、プラスミドpBR322からの複製起点および
Apγ抵抗遺伝子を包含する（太線部）。この発現プラス
ミドは酵母２μ環の複製起点および形質転換酵母宿主の
選択のためのTrpI遺伝子（TRP−〔Trp−栄養要求株〕、
第２図における細線部）も有する。この発現プラスミド
はさらに、GM−CSFの転写および分泌を指令するために
使用する酵母α−因子プロモーターおよびリーダー配列
（点枠部）も含む。GM−CSF配列（ハツチング枠部）
は、後に詳述する如く、合成オリゴヌクレオチド（空枠
部）によつて、α−因子配列と融合されている。
上に述べたとおり、GM−CSF遺伝子のSfaNIからNcoI部位
までのコード領域は、pHG23クローンから、SfaNIおよび
NcoI制限酵素を使用して標準手法、例えばアニアチル
等、モレキユラークローニング，アラボラトリーマニユ
アル，コールドスプリングハーバーラボラトリー，コー
ルドスプリングハーバー,N.Y.に記載された手法で除去
された。SfaNI酵素は、pHG23クローンからGM−CSF遺伝
子を開裂するが、その部位は成熟蛋白質（ヌクレオチド
No.14）のコード領域の５′末端から２ヌクレオチド下
流である；何故なら、ヌクレオチドNo.14には、厳密に
相当する制限部位が存在しないからである。成熟GM−CS
F遺伝子のコード領域の５′末端部に再付加するため、
および第二α−因子プロセシング部位を付加して成熟型
GM−CSFの分泌のためのシグナル配列の完全なプロセシ
ングを得るため、一つのオリゴヌクレオチドを化学合成
した。このオリゴヌクレオチドの組成は、下記表１およ
び第２図（空枠部）に示すとおり、HindIII接着５′末
端を有し、これに続くTCT TTG GAT AAA AGAの配列より
なるカテプシンＢ様成熟サイト、それに続く成熟GM−CS
F蛋白質の最初の二つのアミノ酸残基をコードするSfaNI
3′接着末端を有する。表１に示すオリグヌクレオチド
は、ヌード（Sood）等,Nucl.Acad.Res.,4:2557（1977）
およびヒロセ（Hirose）等,Tet.Lett.,28:2449（1978）
により記載されているトリエステル法で化学合成され
た；このオリゴヌクレオチドは他の方法、例えばホスホ
ジエステル法で調製もできる。
表１ ５′−A GCT TCT TTG GAT AAA AGA GC −３′ AGA AAC CTA TTT TCT CGT GGG Ser Leu Asp Lys Arg Ala Pro 同じ発現ベクターの製造のため他の標準的組換えDNA技
術が使用できること、および上記詳述の製法は説明のた
めのもので、pYαfGM−２発現ベクターへの挿入のため
または他のバクテリアもしくは哺乳動物ベクター中での
発現のための種々の方法の非限定的例示にすぎないこと
を理解すべきである。
pYαfGM−２ベクターは、標準技術でTrp+形質転換体の
選択のため、S.セレビシエの酵母株79（α,Trp1−1,Leu
2−１）中に形質転換した。形質転換の前に、79株を選
択培地（YNB−trp,0.67％イーストナイトロジエンベー
ス（デイフコラブズ，デトロイト,MI）,0.5％カザミノ
酸,2％グルコース,10μg/mlアデニンおよび20μg/mlウ
ラシル）または富化培地（YPD,1％イーストエキス,2％
ペプトンおよび２％グルコース,80μg/mlアデニンおよ
び80μg/mlウラシル補強）のいずれかで増殖させた。細
胞を22℃で1000×g,5分間遠心して収穫し、次いで得ら
れたペレツトを滅菌蒸留水で洗浄した。
次いで酵母細胞を1/10容量のSED（1Mソルビトール,25mM
エチレンジアミンテトラアセテート（EDTA）〔pH8.
0〕，および50mMジチオスレイトール）に濃度を高めて
懸濁し、30℃で10分間インキユベートした。細胞−バツ
フアー混合物を次に５分間300×ｇで遠心した。ペレツ
トを１度1/10容量の1Mソルビトールで洗浄し、細胞をSC
E（1Mソルビトール,0.1Mクエン酸ナトリウム〔pH5.8〕,
0.01MEDTA）20ml中に再懸濁した。細胞壁を破壊するた
め、グルスラーゼを10-3容量で溶液に加え、次いで時々
おだやかに振りながら30℃で30分間インキユベートし
た。スフエロプラストの存在は、10μｌの酵母細胞を５
％SDS（w/v）１滴中に希釈し、顕微鏡スライド上で400
倍位相コントラストでゴーストの存在を観察して確認し
た。細胞混合物を次いで300×ｇで３分間遠心した。得
られたペレツトを1/10容量の1Mソルビトールで２回、そ
してCaS（1Mソルビトール,10mMCaCl2）で１回洗浄し
た。
次に、ベツグス（Beggs）（前術）の方法を応用して、
先に製造したプラスミドベクターで形質転換した。ペレ
ツト化したスフエロプラストを1/200容量のCaS中に懸濁
し、100μｌのアリコートに分けて1.5mlエツペンドルフ
管に入れた。各アリコートに１〜10μｌのプラスミドDN
A（0.5ないし5ng）を添加した。混合物を室温で10分間
インキユベートし、次いで各アリコートへDNAの取り込
みを促進するため1mlのPEG（20％PEG4000,10mMCaCl2,10
mMトリス−HCl〔pH7.4〕）を加えた。室温で10分間置い
た後、混合物を５分間350×ｇで遠心した。得られたペ
レツトを150μｌのSOS（10mlの2Mソルビトール,6.7mlYE
PD〔１％（w/v）イーストエキス,2％（w/v）ペプトン,2
％（w/v）グリコース〕,0.13mlの1MCaCl2,27μｌの１％
トリプトフアンおよび3.7mlの水）中に再懸濁させた。
この混合物を30℃で20分間インキユベートした。次いで
細胞のプレーテイングを行つた。
プレーテイング前に、プロトプラスト/DNA混合物の選択
プレートを37℃で予備インキユベートした。18.2mlのソ
ルビトール,2mgの寒天,0.6gのデイフコイーストナイト
ロジエンベース（アミノ酸不含）,2gのグルコース,0.1m
lの１％アデニン,0.4mlの１％ウラシルおよび必要なア
ミノ酸よりなる3mlの溶融重層用寒天（45℃）を、各ア
リコートの形質転換細胞に加え、試験管内容物を上記選
択プレート上に注加した。プレートを30℃で２ないし４
日間インキユベートした。このTrpマイナス培地中で増
殖するコロニーが、Trp遺伝子を有するプラスミド即
ち、形質転換されたプラスミドを含んでいた。
生物学的および殺腫瘍アツセイの前に、形質転換体を、
20〜50mlの富化培地中で30℃で定常段階まで増殖させ
た。収穫の時点でプロテアーゼインヒビターのフエニル
メチルスルホニル・フルオリド（PMSF）およびペプスタ
チンＡを、終濃度が夫々1mMおよび10μＭとなるよう添
加した。次いで細胞を400×ｇの遠心分離で除去し、培
地を0.45μセルロースアセテートフイルター（コーニン
グ・グラス・ワークス，コーニング,NY）で過した。
除菌した上澄を４℃で保存した。
実施例３ コロニーアツセイ 実施例３における酵母の培養物から収穫したヒトGM−CS
Fの存在を、培養物上澄が寒天中でヒト骨髄細胞コロニ
ーの増殖を刺激する能力の検定により確認した。この検
定で使用するため、健康提供者の腸骨稜からのヒト骨髄
をヘパリン化シリンジで採取した。この骨髄を室温でリ
ン酸緩衝塩溶液（PBS）で1:3に希釈し、54％パーコール
（フアルマシア・フアイン・ケミカルス）の溶液上へ重
ねた。500×ｇで20分間室温で遠心分離した後、層間部
分を回収し、20倍量のPBSで洗浄した。次に懸濁液を室
温で250×g,10分間遠心した。次に細胞をヌクレオチド
を含むα−ミニマル・エツセンシヤル・メデイウム（α
−Mem,ギブコ）10mlに再懸濁し、細胞数と生存数を測定
した。次にFCSを加え、細胞懸濁液をアツセイのときま
で氷上に保存した。
アツセイにおいては、上記のように調製した骨髄細胞
を、次の組成のインキユベーシヨン培地に最終濃度１×
105/mlとなうように添加した： （ａ）28.1％FCS,0.7×10-4Ｍの２−メルカプトエタノ
ール,0.12mg/mlアスパラギン,0.7mg/mlグルタミン,150
単位のペニシリンG,150単位のストレプトマイシン，ヌ
クレオチド含有の1.1×α−MEM,および2.2×ビタミン
（ギブコ）を含む溶液７部；および（ｂ）1.4％バクト
−アガー溶液（デイフコ）３部。培養物を５％CO2の存
在する湿潤空気下で37℃でインキユベートした。７ない
し14日間の培養の後、コロニーの数およびタイプ（グラ
ニユロサイト，マクロフアージまたは混合グラニユロサ
イト−マクロフアージ）を決定した。本発明者らは、pY
αfGM−２クローンからのGM−CSF遺伝子が1.25×106コ
ロニー形成単位／105（CFU−c/ml）の高レベルでGM−CS
F活性の生産を指令することを見出した。この活性レベ
ルは、最大コロニー数の50％を与える希釈の逆数を50倍
して求めた値である。本発明者らは、１×105骨髄細胞
からの平均コロニー数は96±29であることを見出した。
組換えGM−CSFにより14日目に形成されたコロニーは、
区別可能であり、次の三種のタイプよりなつていた：約
1/3の混合グラニユロサイト−マクロフアージコロニ
ー；約1/3のかたまつたグラニユロサイトコロニー；お
よび約1/3の分散したマクロフアージコロニー。
本発明の発現系の対照として、GM−CSF配列を欠くこと
以外はpYαfGM−２と同一のプラスミドも酵母79株中に
形質転換した。この酵母からの培養上澄は、骨髄コロニ
ー形成試験でGM−CSF活性を示さなかつた。
実施例４ 組換えGM−CSFの精製 分泌された組換えGM−CSFを含有する実施例２からの培
地をTFA中で１％にして、0.45μのフイルター（コーニ
ング・グラス・ワークス）で過した。次いでこの培地
を直接にビダツクC4逆相カラム（10μパツキング付きの
1.0×30cmステンレススチールカラムまたはウオーター
ズ・ラジアル・コンプレツシヨン・カートリツジ（Wate
rs radial compression cartridge）（ウオーターズ・
アソシエート，ミルフオード,ME）に50μビダツクC4パ
ツキングを付けたカラム）へ、ミルトン・ロイ・ポンプ
（Milton Roy pump）〔ラブ・データ・コントロール（L
ab.Data Control），リベリア・ビーチ,FL〕を使つて、
5ml/分の流速で送つた。１度に１までの培地を適用
し、カラムへの全蛋白負荷量は、一般に約20mgであつ
た。このカラムを0.1％TFAで洗浄して214nmの吸光度が
ベースライン（蛋白負荷前）にもどるまで洗浄を続け、
非結合サンプル成分を除去した。結合蛋白質の溶出は、
0.1％TFA中の０−95％（ｖ−ｖ）アセトニトリルの直線
勾配（１％アセトニトリル／分）で行つた。この勾配
は、モデル680グラジエントフオーマー,2M−45ポンプお
よび214nmでモニターするモデル414デイテクターにより
構成されたウオーターズ・リクイド・クロマトグラフに
よつて作成した。ピークの蛋白フラクシヨンは50ないし
60％アセトニトリルで見られた。
第１回のHPLCから得れたGM−CSFを含むピークフラクシ
ヨンを集めて0.1％TFA水溶液（v/v）で1:3に希釈し、こ
の活性部分を、同様のTFAとアセトニトリルの勾配で、
ビダツクC18カラム（3.9mm×15cmカラム,5μパツキン
グ）での再クロマトグラフイーおよび再溶出した。
各フラクシヨンの蛋白質をフルオレスカミンのアツセイ
により分析した。また、ピークフラクツシヨンは再度SD
Sポリアクリルアミドゲル電気泳動およびひき続く銀染
色によつて分析した。この電気泳動を行うにあたり、溶
出の間に各フラクシヨンから20μｌ分を取り出して、そ
の各々に10％SDS2mlを添加した後真空乾燥した。乾燥残
渣を、0.0625Mトリス（pH6.8）;2％SDS（w/v）;10％グ
リセロール（v/v）;5％２−メルカプトエタノール（v/
v）よりなる非還元性サンプル緩衝液40μｌに溶解し
た。この溶液を３分間煮沸し、レムリ（Laemmli）,Natu
re（London）,227:680（1970）に記載された方法による
12％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動を行つた。各
フラクシヨン番号についてゲルサンプルをオークリー
（Oakley）等,Anal.Biochem.,105:361−364（1980）に
記載された方法で銀染色した。GM−CSFの実質的均一性
は、電気泳動および銀染色によつて確認され、それによ
ればグリコシル化（21,000ダルトン）および非グリコシ
ル化（17,000ダルトン）のGM−CSFに相当する二つの蛋
白バンドを生じた（第５図参照）。この均一物質の活性
を前記実施例３のコロニー形成試験で分析したところ、
約1.5×107CFU-c/mlであり、比活性は1.5×106CFU-c／
μｇ蛋白質であつた。pI値は約5.0ないし5.4であつた。
実施例５ 標識標的細胞の調製 標的細胞は、５％血清強化RPMI1640培地中、５％CO2を
含む湿潤空気中で37℃に保持した。培養標的細胞が対数
増殖期にあるとき、細胞毒性試験を行つた。標的細胞
は、ヒトメラノーマ細胞ラインA375（ATCC No.CRL161
9）、ヒト肝臓癌細胞ラインSK−Hep−１（ATCC No.HTB
−52）、ヒト膵臓癌MIA−PACA−２（ATCC No.CRL−142
0）およびヒト膀胱癌5637（ATCC No.HTB−９）を含む。
対数増殖期の標的細胞を125Ｉ−IUdRで放射標識した。
放射標識操作において、125Ｉ−IUdR（0.3μCi/ml;比活
性200mCi/ml;ニユーイングランド・ニユークリアー，ボ
ストン,MA）を含む５％FCS強化RPMI培地中で37℃,24時
間インキユベートした。次に細胞を２回洗つて未結合放
射標識を除き0.25％トリプシン（デイフコ・ラブス，デ
トロイト,MI）および0.02％EDTAによるトリプシン処理
を１分間行つて収穫した。標識細胞を５％FCSで強化し
たRPMI−1640培地に再懸濁した。
実施例６ 殺腫瘍活性のアツセイ 殺腫瘍活性のアツセイ操作において、実施例４からの組
換えGM−CSFの試験サンプルの種々の濃度／希釈のもの2
00μｌ、精製天然IFN−γ〔メロイ・ラボラトリーズ（M
eloy Laboratories），スプリングフイールド,VA）,LPS
（デイフコ・ラブズ.,デトロイト,MI,E.coli LPS−Ｎ）
およびIFN−γと組合せたLPSを、プレートにまかれたモ
ノサイトを含む培養ウエルに添加した。実施例１で記載
したとおり、モノサイトに試験サンプルを加える前に、
非付着モノサイト細胞は18ゲージ針で吸引して培養ウエ
ルから除去し、次いでモノレヤーを血清不含のRPMI−16
40で２回ゆすいだ。GM−CSFに関して、アツセイは種々
の希釈度の、実施例２で製造したGM−CSFプラスミドを
含む酵母の生産する上澄（第３図）および実施例５で製
造した精製組換えGM−CSF（第４図）の両方について行
つた。第３図および第４図には、LPS,IFN−γおよびIFN
−γと一緒にしたLPSの希釈物も示されている。対照と
して、GM−CSFプラスミドを含まない酵母が生産した上
澄のアツセイも行つた。試験サンプルを静止中のモノサ
イトと24時間インキユベートした後、試験サンプルを吸
引除去した。
約104個の125Ｉ−UdR−標識標的細胞（実施例５からの
もの）を各モノサイトのウエルに添加し、初期の標的−
エフエクター（活性化モノサイト）の比率を1:10ないし
1:20にした。また、放射標識標的細胞単独についても、
別の対照群としてプレーテイングした。このアツセイは
付着標的細胞の溶解を測定するものであり、そのために
はエフエクター細胞と標的細胞との細胞−細胞接触が必
要であるため、24時間後に培養上澄を吸引除去して新た
なRPMI−1640培地に置き代えることにより、付着せずに
この試験で殺され得ない細胞により生じる可能性のある
誤差を防止した。さらに48時間後にモノレヤーを激しく
ゆすいで、モノサイトにより殺された標的細胞を除去し
た。各ウエル中に残存する付着生存細胞を50μｌの0.5M
NaOHで溶解した。綿棒で残存放射活性細胞を集め、放射
活性をγカウンターで測定した。次の式を用いてモノサ
イト介在細胞毒性を次の式によつて測定した： 第３図および第４図にアツセイの結果を示す。第３図に
示すとおり、また予測されるとおり、LPSおよびIFN−γ
は殺腫瘍活性を介在する程度にはマクロフアージを活性
化しなかつた。さらに既に報告されているとおり、マク
ロフアージ活性化剤としてのIFN−γは、少量のLPSと共
に加えたときのみ効果を示した。第３図に更に示すとお
り、GM−CSFプラスミドを含む酵母が生産した上澄は、
マスロフアージの腫瘍細胞を殺す作用を誘発したが、対
照上澄（GM−CSFプラスミドを含まない酵母が生産した
もの）は、マスロフアージの細胞毒性を誘発しなかつ
た。
第４図は精製組換えGM−CSFのドーズタイトレーシヨン
の全コースを示す。第４図に示すとおり、1:500,000の
希釈においてもなお、精製組換えGM−CSFはマクロフア
ージを活性化して殺腫瘍活性（30CFU−c/ml）を発揮さ
せる能力を有し、生じた特異的殺細胞活性の最大値の半
分の誘発は、約1:1,000,000（15CFU−c/ml）にカラムか
らのフラクシヨンを希釈したとき得られた。第３図にお
けると同様に第４図においてもLPS,IFN−γおよびIFN−
γプラスLPSの適当な対照が示されている。IFN−γと異
なり、GM−CSFは外からのLPSの不存在下でマクロフアー
ジを殺腫瘍性に活性化する効果的単一シグナルとして作
用した。
実施例７ 殺腫瘍活性のアツセイ−ヒト癌細胞ライン 実施例６に記載されている殺腫瘍活性のアツセイを、ヒ
ト膀胱鱗状カルシノーマSCaBER（ATCC No.HTB3）に関し
ても実施した。これらの標的細胞は実施例５に記載され
ているようにして放射標識した。アツセイを実施例６の
方法で、但しA375標的細胞の代りに放射標識したSCaBER
標的細胞を使用して実施した。
実施例８ 殺腫瘍活性のアツセイ−ヒトメラノーマ 実施例６および７の殺腫瘍活性のアツセイ法を、ヒト悪
性ミエローマSK−MEL−28（ATCC No.HTB72）とともに使
用した。標的細胞を実施例５に記載したようにして放射
標識した。アツセイは実施例６および７に記載した方法
で行つたが、標的細胞としてはSK−MEL−28細胞を使用
した。
実施例９ 殺腫瘍活性のアツセイ−ヒトヘパトーマ ヒト肝臓癌SK−Hep−１（ATCC No.HTB−52）に関して
も、実施例６の殺腫瘍活性のサツセイ法を実施した。標
的細胞は実施例５の方法で放射標識した。このアツセイ
においては、GM−CSFは10ng/mlアツセイ容量の濃度で用
いた。各アツセイにおいて約104個の125IUdr−標識標的
細胞を各アツセイで使用して、初期の標的−エフエクタ
ー（活性化モノサイト）細胞の比率を1:20ないし1:30に
した。また、放射標識標的細胞のみも、対照としてプレ
ーテイングした。このアツセイにおいて、GM−CSF活性
化モノサイトは、平均して約14％のレベルの腫瘍細胞の
特異的殺細胞性を介在した。
実施例10 殺腫瘍活性のアツセイ−ヒト膵臓癌 実施例９の殺腫瘍アツセイ法を、ヒト膵臓癌細胞ライン
MIAPACA−２（ATCC No.CRL1420）について行つた。標的
細胞は実施例５に詳述したとおり放射標識した。アツセ
イは実施例９の方法で行つたが、但し標的細胞にはMIAP
ACA−２細胞を用いた。この特定のアツセイにおいて、
生じた細胞毒性の平均パーセントは約38％であつた。
実施例11 殺腫瘍活性のアツセイ−ヒト膀胱癌 実施例９の殺腫瘍活性アツセイを、ヒト膀胱癌細胞ライ
ン5637（ATCC No.HTB−９）についても使用した。標的
細胞は実施例５のようにして標識した。アツセイは実施
例９のようにして行つたが、但し標的細胞には5637細胞
を用いた。このアツセイにおいて、生じた細胞毒性のパ
ーセントは約30％であつた。このアツセイ並びに上述の
アツセイは、GM−CSFがマクロフアージを殺腫瘍性へ活
性化する有効な単独シグナルとして作用することを示し
ている。
【図面の簡単な説明】
第１図は、３′非コード領域を含む、ヒトGM−CSF遺伝
子のヌクレオチド配列および相当するアミノ酸配列を示
す図であり、 第２図は、機能的ヒトGM−CSFを発現させるために宿主
細胞を形質転換するために挿入されたGM−CSF遺伝子の
コード領域を有するpYαfGM−２発現プラスミドの模式
図であり、 第３図は、組換えヒトGM−CSFで活性化されたヒト末梢
血液マクロフアージにより介在される腫瘍細胞の特異的
溶解のパーセントを示すグラフであり、 第４図は、精製された組換えヒトGM−CSFの種々の濃度
で活性化されたヒト末梢血液マクロフアージに介在され
る腫瘍細胞の特異的溶解およびLPS,IFN−γおよびLPSと
組合せたIFN−γで活性化されたマクロフアージに介在
される同様な溶解を示すグラフであり、 第５図は、精製された均一組換えGM−CSFの銀染色され
たポリアクリルアミドゲルバンドを示す電気泳動図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダグラス・ピー・セレッティ アメリカ合衆国ワシントン州98199，シア トル，ウェスト・バートナ 2415 (72)発明者 ポール・ジェイ・コンロン・ザ・サード アメリカ合衆国ワシントン州98105，シア トル，スタンフォード・アベニュー・ノー スイースト 4805 (72)発明者 デービッド・ジェイ・コスマン アメリカ合衆国ワシントン州98102，シア トル，トゥエルヴス・アベニュー・イース ト 310 (72)発明者 ケネス・エッチ・グラブステイン アメリカ合衆国ワシントン州98115，シア トル，ノースイースト・セブンティフィフ ス・ストリート 5829，ナンバー 443 (72)発明者 アルフ・ディー・ラーセン アメリカ合衆国ワシントン州98102，シア トル，サミット・アベニュー・イースト 320，ナンバー 15 (72)発明者 ヴァージニア・エル・プライス アメリカ合衆国ワシントン州98102，シア トル，ボイアー・アベニュー・イースト 2617 (56)参考文献 特表 昭61−501490（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−501259（ＪＰ，Ａ)

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子
    （以下、「GM−CSF」という）を含有する、マクロファ
    ージ系の細胞の殺腫瘍活性の増強剤。
  2. 【請求項２】GM−CSFが組換えDNA技術で製造されたもの
    である、請求項１に記載の殺腫瘍活性増強剤。
  3. 【請求項３】GM−CSFが、骨髄細胞コロニー形成試験で
    測定したとき少なくとも1.5×106コロニー形成単位／μ
    ｇタンパク質の比活性を示すまで精製されたものであ
    る、請求項１または２に記載の殺腫瘍活性増強剤。
  4. 【請求項４】GM−CSFが末梢血液の単球由来である、請
    求項１ないし３のいずれか１項記載の殺腫瘍活性増強
    剤。
  5. 【請求項５】マクロファージ系細胞の２×105細胞あた
    り、0.01ないし100ナノグラムのGM−CSFが含有される、
    請求項１ないし４のいずれか１項に記載の殺腫瘍活性増
    強剤。
  6. 【請求項６】生体外でマクロファージ系の細胞の殺腫瘍
    活性を増強するために使用される、請求項１ないし５の
    いずれか１項に記載の殺腫瘍活性増強剤。
JP61191561A 1985-08-16 1986-08-15 グラニユロサイト−マクロフア−ジ コロニ−刺激 因子によるマクロフア−ジ殺腫瘍作用の活性化 Expired - Lifetime JPH0780781B2 (ja)

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Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2130493C1 (ru) * 1984-07-06 1999-05-20 Новартис Аг Способ получения белка с активностью gm-csf приматов
US5795568A (en) * 1984-09-19 1998-08-18 Novartis Corporation Method of treating infectious disease with GM-CSF
US5837229A (en) * 1985-02-05 1998-11-17 Chiron Corporation Uses of recombinant colony stimulating factor-1
US5104650A (en) * 1985-02-05 1992-04-14 Cetus Corporation Uses of recombinant colony stimulating factor-1
US5422105A (en) * 1985-02-05 1995-06-06 Cetus Oncology Corporation Use of recombinant colony stimulating factor 1
US5556620A (en) * 1985-02-05 1996-09-17 Cetus Oncology Corporation Use of recombinant colony stimulating factor-1 to enhance wound healing
US5093115A (en) 1985-06-11 1992-03-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method of preparing activated killer monocytes for treating colorectal cancer
US5391706A (en) * 1987-07-16 1995-02-21 Schering Plough Corporation Purification of GM-CSF
EP0318184A1 (en) * 1987-11-12 1989-05-31 Schering Corporation Acceleration of bone formation with GM-CSF
BE1002141A5 (fr) * 1988-01-13 1990-07-31 Bartholeyns Jacques Procede de culture et d'activation de cellules humaines et conditionnement pour le traitement du cancer.
JPH01193227A (ja) * 1988-01-29 1989-08-03 Res Dev Corp Of Japan 癌免疫療法補助剤
AU4219689A (en) * 1988-08-19 1990-03-23 Genetics Institute Inc. Treatment for malignant melanoma
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US5178855A (en) * 1989-01-30 1993-01-12 Schering Corporation Treatment of luekocyte dysfunction with GM-CSF
US5154921A (en) * 1990-07-13 1992-10-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Promotion of maturation of hematopoietic progenitor cells
US5199942A (en) * 1991-06-07 1993-04-06 Immunex Corporation Method for improving autologous transplantation
US5904920A (en) * 1991-10-04 1999-05-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Regulation of systemic immune responses utilizing cytokines and antigens
US5637483A (en) * 1991-10-04 1997-06-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Irradiated tumor cell vaccine engineered to express GM-CSF
US5292513A (en) * 1992-05-18 1994-03-08 Anthony G. Gristina Method for nonspecific cellular immune stimulation
US6001351A (en) * 1993-05-18 1999-12-14 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Macrophages, process for preparing the same and their use as active substances of pharmaceutical compositions
US5662899A (en) * 1993-05-18 1997-09-02 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Macrophages, process for preparing the same and their use as active substances of pharmaceutical compositions
US6540994B1 (en) 1997-07-18 2003-04-01 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Macrophages, process for preparing the same and their use as active substances of pharmaceutical compositions
EP0871458B1 (en) 1995-07-21 2002-11-20 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Method of decreasing radiation or radio-mimetic chemotherapy for hematopoietic pluripotent cell engraftment
US5800812A (en) * 1995-09-15 1998-09-01 Yeda Research And Development Co. Ltd. Methods of use of mononuclear phagocytes to promote axonal regeneration
US6267955B1 (en) 1995-09-15 2001-07-31 Yeda Research And Development Co. Ltd. Mononuclear phagocytes and their use to promote axonal regeneration
US5942253A (en) * 1995-10-12 1999-08-24 Immunex Corporation Prolonged release of GM-CSF
US6080409A (en) 1995-12-28 2000-06-27 Dendreon Corporation Immunostimulatory method
US5891432A (en) 1997-07-29 1999-04-06 The Immune Response Corporation Membrane-bound cytokine compositions comprising GM=CSF and methods of modulating an immune response using same
CA2349217C (en) * 1998-11-03 2012-07-31 Johns Hopkins University Cancer-associated antigens and methods of their identification
US7611721B1 (en) 1999-05-13 2009-11-03 Wyeth Holdings Corporation Adjuvant combination formulations
AU1013601A (en) 1999-10-22 2001-05-08 Aventis Pasteur Limited Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens
US6911204B2 (en) 2000-08-11 2005-06-28 Favrille, Inc. Method and composition for altering a B cell mediated pathology
SG143058A1 (en) * 2000-08-11 2008-06-27 Favrille Inc Method and composition for altering a t cell mediated pathology
PE20020530A1 (es) * 2000-11-10 2002-06-18 Wyeth Corp Formulaciones de combinacion adyuvante
US20070128229A1 (en) * 2002-04-12 2007-06-07 Wyeth Surface proteins of Streptococcus pyogenes
JP2004533236A (ja) * 2001-04-13 2004-11-04 ワイエス 化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）の表面タンパク質
CN1636062A (zh) 2001-04-16 2005-07-06 惠氏控股公司 编码多肽抗原的新肺炎链球菌可读框及其应用
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
MXPA04008890A (es) * 2002-03-15 2005-10-18 Wyeth Corp Mutantes de la proteina p4 de haemophilus influenzae no tipicable con actividad enzimatica reducida.
US7785608B2 (en) * 2002-08-30 2010-08-31 Wyeth Holdings Corporation Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease
US7301554B2 (en) * 2002-09-20 2007-11-27 Ricoh Company, Ltd. Light scanning device, scanning line adjusting method, scanning line adjusting control method, image forming apparatus, and image forming method
EP3064215A1 (en) 2002-10-16 2016-09-07 Samuel F. Hunter Method for treatment of demyelinating central nervous system disease
US20040197312A1 (en) 2003-04-02 2004-10-07 Marina Moskalenko Cytokine-expressing cellular vaccine combinations
US8071652B2 (en) * 2003-08-21 2011-12-06 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Method of treating irritable bowel syndrome
UA93854C2 (ru) 2003-12-17 2011-03-25 Вайет Ллк Иммуногенный конъюгат и способ его получения
EP1699810A4 (en) 2003-12-17 2009-10-21 Elan Pharm Inc A BETA IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATE AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF
DE602005018333D1 (de) * 2004-03-15 2010-01-28 Sunesis Pharmaceuticals Inc Sns-595 und anwendungsverfahren
GB0410220D0 (en) 2004-05-07 2004-06-09 Kirkham Lea Ann Mutant pneumolysin proteins
US7674456B2 (en) * 2004-06-14 2010-03-09 Charles Wiseman Breast cancer cell lines and uses thereof
TW200613554A (en) 2004-06-17 2006-05-01 Wyeth Corp Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV
US20060036080A1 (en) * 2004-07-16 2006-02-16 Bossard Mary J Conjugates of GM-CSF moiety and a polymer
US20060062764A1 (en) * 2004-08-25 2006-03-23 Seshidar-Reddy Police Fiber-modified adenoviral vectors for enhanced transduction of tumor cells
US20060057127A1 (en) * 2004-09-10 2006-03-16 Pocheng Liu Cytokine-expressing cellular vaccines for treatment of prostate cancer
BRPI0516974A (pt) 2004-10-21 2008-09-30 Wyeth Corp composição imunogênica compreendendo um polipeptìdeo; um método para induzir uma resposta imune contra staphylococcus epidermidis; um método para induzir uma resposta imune contra staphylococcus aureus; um método para a detecção e/ou identificação de staphylococcus epidermidis; um método para a detecção e/ou identificação de anticorpos para staphylococcus epidermidis
WO2006049599A1 (en) * 2004-10-28 2006-05-11 The General Hospital Corporation Methods of detection and therapy for atheromatous plaques using immune modulation
US20080260650A1 (en) * 2004-10-28 2008-10-23 The General Hospital Corporation Methods of Detection and Therapy of Inflamed Tissues Using Immune Modulation
RU2271392C1 (ru) * 2004-11-15 2006-03-10 Институт Биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFGM17, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pFGM17 - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА
US8580814B2 (en) * 2006-04-03 2013-11-12 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods of using (+)-1,4-dihydro-7-[(3S,4S)-3-methoxy-4-(methylamino)-1-pyrrolidinyl]-4- oxo-1-(2-thiazolyl)-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid for treatment of cancer
US9868961B2 (en) 2006-03-30 2018-01-16 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for localized secretion of anti-CTLA-4 antibodies
US20070231298A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-04 Cell Genesys, Inc. Cytokine-expressing cancer immunotherapy combinations
US7919079B2 (en) * 2006-03-31 2011-04-05 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Cancer immunotherapy compositions and methods of use
TW200806315A (en) 2006-04-26 2008-02-01 Wyeth Corp Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions
CN104027333B (zh) * 2006-06-12 2017-05-17 逊尼希思制药公司 治疗癌症的化合物和组合物
KR101495549B1 (ko) 2006-07-13 2015-02-25 와이어쓰 엘엘씨 당단백질의 생산
US8192951B2 (en) * 2006-11-03 2012-06-05 Wyeth Llc Glycolysis-inhibiting substances in cell culture
AU2007353317B2 (en) * 2006-11-15 2012-09-06 Eli Lilly And Company Methods and compositions for treating influenza
AR064642A1 (es) 2006-12-22 2009-04-15 Wyeth Corp Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi
RU2009132986A (ru) 2007-03-02 2011-04-10 Уайт (Us) Применение меди и глутамата в культуре клеток для производства полипептидов
EP2117579A4 (en) * 2007-03-07 2011-08-24 Mayo Foundation TREATMENT OF CANCER USING A GRANULOCYTIC MACROPHAGE COLONY STIMULATING FACTOR
US20100255513A1 (en) * 2007-03-30 2010-10-07 Denson Lee A Serological markers of inflammatory bowel disease phenotype and disease progression
US20080267935A1 (en) * 2007-04-06 2008-10-30 Cell Genesys, Inc. AraC in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
US20090028857A1 (en) * 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
US8425897B2 (en) * 2007-08-30 2013-04-23 Immutep S.A. Compositions containing LAG-3 and cells that secrete GM-CSF and methods of use
AU2008340319A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Wyeth Llc Genetically modified attenuated vesicular stomatitis virus, compositions and methods of use thereof
RU2010151562A (ru) 2008-06-20 2012-07-27 ВАЙЕТ ЭлЭлСи (US) Композиции и способы применения orf1358 из бета-гемолитических стрептококковых штаммов
CN107050442B (zh) * 2008-11-05 2022-09-13 惠氏有限责任公司 用于预防β-溶血链球菌(BHS)疾病的多组分免疫原性组合物
SA114350400B1 (ar) 2009-06-22 2016-05-26 ويث ال ال سي تركيبات وطرق لتحضير تركيبات مولدة للمناعة لمقترن بولي سكاريد كبسولي للنمط المصلي 5 و 8 من المكورات العنقودية الذهبية
CN102481352A (zh) 2009-06-22 2012-05-30 惠氏有限责任公司 金黄色葡萄球菌抗原的免疫原性组合物
EP2335730A1 (en) 2009-12-18 2011-06-22 Deutsches Krebsforschungszentrum Fusion polypeptides and their use for prevention and treatment of cancer
PT3170508T (pt) 2010-06-04 2020-01-16 Wyeth Llc Formulações de vacinas
RU2580620C2 (ru) 2010-08-23 2016-04-10 ВАЙЕТ ЭлЭлСи СТАБИЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ АНТИГЕНОВ Neisseria meningitidis rLP2086
WO2012032489A1 (en) 2010-09-10 2012-03-15 Wyeth Llc Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens
DK2654784T3 (en) 2010-12-22 2017-02-13 Wyeth Llc STABLE IMMUNOGENIC COMPOSITIONS OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS ANTIGENES
ITMI20111182A1 (it) 2011-06-28 2012-12-29 Canio Buonavoglia Vaccino per coronavirus canino
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
CA2865745C (en) 2012-03-09 2018-01-09 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CN104854128A (zh) 2012-07-19 2015-08-19 硕腾有限责任公司 牛流感病毒组合物
AU2013295770A1 (en) 2012-07-27 2015-01-29 Zoetis Services Llc Tick toxin compositions
ES2933127T3 (es) 2012-12-20 2023-02-01 Pfizer Procedimiento de glucoconjugación
US9724366B2 (en) 2012-12-30 2017-08-08 Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd CD11 B[low] macrophages and conditioned media thereof for treating cancer and/or fibrosis
US9802987B2 (en) 2013-03-08 2017-10-31 Pfizer Inc. Immunogenic fusion polypeptides
WO2014151401A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Zoetis Llc CROSS-PROTECTION OF BOVINES AGAINST B. trehalosi INFECTION BY A MULTI-VALENT VACCINE
DE102013004595A1 (de) 2013-03-15 2014-09-18 Emergent Product Development Germany Gmbh RSV-Impfstoffe
RU2662968C2 (ru) 2013-09-08 2018-07-31 Пфайзер Инк. Иммуногенная композиция против neisseria meningitidis (варианты)
GB201322626D0 (en) 2013-12-19 2014-02-05 Immutep S A Combined preparations for the treatment of cancer
WO2016130569A1 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Mj Biologics, Inc. A composition comprising pedv antigens and methods for making and using the composition
ES2702325T3 (es) 2014-03-11 2019-02-28 Univ Minnesota Vacunas contra el virus de la diarrea epidémica porcina y métodos de uso de las mismas
GB201500374D0 (en) 2015-01-09 2015-02-25 Immutep S A Combined preparations for the treatment of cancer
AU2016221318B2 (en) 2015-02-19 2020-06-25 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
EP3268380B1 (en) 2015-03-12 2018-12-26 Zoetis Services LLC Pyolysin methods and compositions
TWI807252B (zh) 2015-05-04 2023-07-01 美商輝瑞股份有限公司 Ｂ型鏈球菌多醣-蛋白質軛合物、製造軛合物之方法、含軛合物之免疫原性組成物、及其用途
BR112018002919B1 (pt) 2015-08-14 2024-02-27 Zoetis Services Llc Composição imunogênica eficaz compreendendo uma cepa de mycoplasma bovis e usos da mesma para prevenção de doenças causadas por mycoplasma bovis
CA3010977A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Zoetis Services Llc Novel cross protective vaccine compositions for porcine epidemic diarrhea virus
WO2017210215A1 (en) 2016-05-31 2017-12-07 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Zika virus vaccine and methods of production
CA3037544C (en) 2016-10-05 2021-10-12 Zoetis Services Llc Lyophilization methods that provide stably dehydrated protozoans for use as potent live vaccines
US10751402B2 (en) 2016-11-09 2020-08-25 Pfizer Inc. Immunogenic compositions and uses thereof
US10183070B2 (en) 2017-01-31 2019-01-22 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
GB201703529D0 (en) 2017-03-06 2017-04-19 Cambridge Entpr Ltd Vaccine composition
EP4034157A1 (en) 2019-09-27 2022-08-03 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US12570700B2 (en) 2020-04-17 2026-03-10 Regents Of The University Of Minnesota SARS-CoV-2 spike receptor binding domain and compositions and methods thereof
CA3192786A1 (en) 2020-08-26 2022-03-03 Pfizer Inc. Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof
EP4241790A1 (en) 2022-03-07 2023-09-13 InnaTher Gene Therapy S.à.r.l. Expression system for the treatment of cancer
EP4241791A1 (en) 2022-03-07 2023-09-13 InnaTher Gene Therapy S.à.r.l. Combined gene and radio therapy for the treatment of cancer
JP2025532724A (ja) 2022-09-29 2025-10-03 ファイザー・インク Ｒｓｖ ｆタンパク質三量体を含む免疫原性組成物

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4342828A (en) * 1979-07-20 1982-08-03 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Method for producing substance capable of stimulating differentiation and proliferation of human granulopoietic stem cells
US4438032A (en) * 1981-01-30 1984-03-20 The Regents Of The University Of California Unique T-lymphocyte line and products derived therefrom
JPS59137417A (ja) * 1983-01-28 1984-08-07 Morinaga Milk Ind Co Ltd 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法
JPS59169489A (ja) * 1983-03-15 1984-09-25 Otsuka Pharmaceut Co Ltd ヒト培養株化細胞
AU594014B2 (en) * 1984-03-21 1990-03-01 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant DNA molecules
AU588819B2 (en) * 1984-10-29 1989-09-28 Immunex Corporation Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene
EP0202300B1 (en) * 1984-11-20 1992-11-11 Schering Biotech Corporation Cdna clones coding for polypeptides exhibiting human granulocyte macrophage and eosinophil cellular growth factor activity
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
DE3545568A1 (de) * 1985-12-21 1987-07-16 Hoechst Ag Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung

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