DK174603B1 - Anvendelse af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor til fremstilling af et medikament til fremme af tumoricid aktivitet - Google Patents
Anvendelse af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor til fremstilling af et medikament til fremme af tumoricid aktivitet Download PDFInfo
- Publication number
- DK174603B1 DK174603B1 DK198603829A DK382986A DK174603B1 DK 174603 B1 DK174603 B1 DK 174603B1 DK 198603829 A DK198603829 A DK 198603829A DK 382986 A DK382986 A DK 382986A DK 174603 B1 DK174603 B1 DK 174603B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- stimulating factor
- macrophage colony
- granulocyte macrophage
- cells
- csf
- Prior art date
Links
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 title claims abstract description 107
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 title claims abstract description 99
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 36
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 96
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 claims description 12
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 8
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 5
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000006215 rectal suppository Substances 0.000 claims description 2
- 229940100618 rectal suppository Drugs 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 claims 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims 1
- -1 oral administration Substances 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 15
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 5
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 abstract description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 32
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 32
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 29
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 27
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 27
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 26
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 15
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 14
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 7
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 7
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 6
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 201000001531 bladder carcinoma Diseases 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 208000010570 urinary bladder carcinoma Diseases 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- 208000035823 Non-specific autoimmune cerebellar ataxia without characteristic antibodies Diseases 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010293 colony formation assay Methods 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 208000021045 exocrine pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 3
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 101000746372 Mus musculus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 3
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 210000002433 mononuclear leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-1-[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]amino]-5-oxopentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 SBKVPJHMSUXZTA-MEJXFZFPSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100027324 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N Ala-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O WPWUFUBLGADILS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 101001031396 Arabidopsis thaliana Histone H2B.3 Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 208000006168 Ewing Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001622557 Hesperia Species 0.000 description 1
- 101001009252 Homo sapiens 2-hydroxyacyl-CoA lyase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108010038049 Mating Factor Proteins 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100226116 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) esa-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O NLOAIFSWUUFQFR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000036693 Thrombopoietin Human genes 0.000 description 1
- 108010041111 Thrombopoietin Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007825 activation reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 125000006267 biphenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000005757 colony formation Effects 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N disiloxane Chemical class [SiH3]O[SiH3] KPUWHANPEXNPJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- MKZGVLPHKXXSSG-UHFFFAOYSA-N ethyl n-[4-[benzyl(2-phenylethyl)amino]-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-1h-imidazo[4,5-c]pyridin-6-yl]carbamate Chemical compound N=1C(NC(=O)OCC)=CC=2NC(C=3C=CC(=CC=3)C(F)(F)F)=NC=2C=1N(CC=1C=CC=CC=1)CCC1=CC=CC=C1 MKZGVLPHKXXSSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N fluorescamine Chemical compound C12=CC=CC=C2C(=O)OC1(C1=O)OC=C1C1=CC=CC=C1 ZFKJVJIDPQDDFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108010087005 glusulase Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000001981 hip bone Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 1
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 1
- 238000010409 ironing Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N phenylbenzene Natural products C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036316 preload Effects 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000009044 synergistic interaction Effects 0.000 description 1
- 125000003698 tetramethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N tetramethylsilane Chemical group C[Si](C)(C)C CZDYPVPMEAXLPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000000717 tumor promoter Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/828—Cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
DK 174603 B1 i
Den foreliggende opfindelse angår anvendelse af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor (i det følgende "GM-CSF) til fremstilling af et medikament til fremme af tumoricid aktivitet af celler af makro-5 fag herkomst, hvori cellerne af makrofag herkomst udsattes for en virksom mængde af nævnte medikament.
Makrofager er forholdsvis store (10-2 0 μτη) , aktivt motile fagocytiske celler, der udvikles ud fra blodbårne monocyter, som på deres side har deres op-10 rindelse i knoglemarven. Det er blevet iagttaget, at makrofager ved aktivering undergår adskillige funktionelle, biokemiske og morphologiske ændringer, herunder membranrynkning, peroxidelaborering, forøget ekspression af la-antigener og forøget sekretion af 15 plasminogen. Makrofager anses også for at være en nøglekomponent i immunsystemet. I aktiveret tilstand er de blevet sat i forbindelse med ødelæggelse af fremmede partikler og udslidte celler, og de er for nylig blevet identificeret som tilvejebringende resi-20 stens mod og/eller udryddelse af neoplastisk sygdom. Udviklingen af aktiverede makrofager og prækursormo-nocyter, der udvikler disse aktiviteter, kræver samtidig tilstedeværelse af effektive aktiveringssignaler og modtagelige mononukleære fagocyter.
25 Det har været almindeligt accepteret, at akti vering af makrofager kan induceres af visse lymfoki-ner omtalt som makrofag aktiveringsfaktorer eller MAF. Cameron et al., J. Clin. Invest. 63:977 (1979);
Mantavi et al., Int. S. Cancer, 25:691 (1980); og 30 Kleinerman et al., J. Clin. Invest. 72:304 (1983).
Det vides ikke, om MAF er en bestemt lymfokin eller helt eller delvis er opbygget af andre lymfoki-ner. Nogle forskere har foreslået, at MAF i musesy- DK 174603 B1 2 stemet er opbygget af gamma-interferon ("IFN-y"). Se Roberts and Vasil, J. Interferon Res. 2:519 (1982); og Svedersky et al., J. Exp. Med. 159:812 (1984).
Imidlertid menes andre lymfokiner end IFN-γ og-5 så muligvis at aktivere makrofager til det punkt, hvor de er i stand til at dræbe tumorceller. Makrofager producerer lymfokinen interleukin 1 ("IL-1"), der vides at stimulere væksten af hudceller, medvirke til heling af sår og fremkalde inflammation og feber.
10 Onozaki et al., J. Immunol., 135:314 (1985) har for nylig foreslået, at IL-1 også fremmer tumoricid aktivitet af friske monocyter.
Det er blevet rapporteret, at makrofager og prækursormonocyter også kan aktiveres til at udvise 15 tumoricid aktivitet ved behandling med forskellige reagenser, såsom de bakterielle produkter lipopoly-saccharid ("LPS"), Sone et al., Cancer Res., 42:2227 (1982) eller peptidoglycan eller analoge dertil, såsom muramyl-dipeptid ("MDP"), Nagao et al., Infec.
20 Immun., 24:304 (1979), Kleiner et al.. Cancer Res. , 43:2010 (1983). Blandt andre makrofag aktiveringsrea genser er tumorpromotoren phorbol-myristat-acetat ("PMA"), Pick et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 332:378 (1979) og ionoforer, Pick et al., supra, og Hund et 25 al., Nature (London), 265:543 (1979).
De seneste forskningsrapporter har indiceret, at effektiv aktivering af makrofager til at udvise ikke-specifik tumoricid aktivitet ikke er resultatet af et enkelt signal, men kræver en serie af reaktio-30 ner. Meltzer postulerer i "Lymphokines", Pick og Lan-dy, udg., Academic Press, New York, s. 319-343 (1981), at aktiveringen af makrofager til at udvise 3 DK 174603 B1 tumoricid aktivitet kræver rekruttering eller akkumulering af blodmonocyter på reaktionsstedet, såsom ved en infektion, hvorpå monocyterne differentierer til kompetente mononukleære fagocyter. Efter denne indle-5 dende fase af monocytdifferentiering primes monocyterne til en modtagelig tilstand med et initialsignal hidrørende fra en lymfokin. Endelig modning af den fremmede makrofag til cytotoksisk aktivitet kræver udløsning via et andet signal, f.eks. hidrørende fra 10 LPS. Anvendt i forbindelse med hinanden er de koncentrationer, der kræves af primingsignalet (lymfokinen) og udløsningssignalet (LPS) for et givet niveau af makrofag aktivering, meget lavere, end hvis disse signaler anvendtes alene, hvilket indicerer en syner-15 gistisk samvirkning mellem sådanne signaler.
Et forhold lig lymfokin-LPS samarbejdet er blevet rapporteret for LPS og IFN-γ. Schultz, J. Interferon Res., 2:459 (1982). Udviklingen af rekombinant DNA teknologien kombineret med in vitro cellulære 20 bioanalyser har ført til kloning af cDNA'erne af IFN-γ, IL-1 og andre lymfokiner. Tilgængeligheden af meget rent rekombinantafledt IFN-γ har bekræftet tidligere rapporter om dets MAF aktivitet og kravet om et andet udløsningssignal, såsom LPS for effektivt at inducere 25 IFN-γ til at udvise ikke-specifik tumoricid aktivitet.
Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af GM-CSF til stimulering af makrofager til at formidle ikke-specifik tumoricid aktivitet, hvilken aktivering ikke er afhængig af tilstedeværelsen af en 30 costimulator, såsom LPS eller IFN-γ. GM-CSF er en speciel type kolonistimulationsfaktor ("CSF") . CSF henfører til en familie lymfokiner, som får stamfader- DK 174603 B1 4 celler, der findes i knoglemarven, til at differentiere i specifikke typer af modne blodceller. Den særlige type moden blodcelle, der fås fra en stamfadercelle, afhænger af typen af tilstedeværende CSF(er).
5 F.eks. menes erytropoietin, at få stamfaderceller til at modnes til erytrocyter, medens trombopoietin menes at drive stamfaderceller langs trombocytbanen. Tilsvarende afhænger granulocytmakrofagkolonidannelse af tilstedeværelsen af GM-CSF. Selv om CSF's og herunder 10 GM-CSF's evne til at fremkalde modning og proliferation af hvide blodlegemer fra knoglemarvsstamfædre er velkendt, har GM-CSF's kapacitet til særegent at aktivere makrofager til at formidle ikke-specifik tumo-ricid aktivitet hidtil været ukendt.
15 I overensstemmelse med ovenstående aktiveres makrofager til at formidle ikke-specifik tumoricid aktivitet udelukkende ved hjælp af et GM-CSF signal.
De aktiverede makrofager kan anvendes til at inaktivere tumorceller in vivo eller in vitro. Patienter 20 med tumorer kan behandles ved isolering af makrofager, fra patientens krop og derefter stimulere de isolerede celler til at udvise tumoricid aktivitet ved dyrkning af cellerne med en terapeutisk virksom mængde GM-CSF. Derefter kan de stimulerede celler ad-25 ministreres til patienten, hvorefter de aktiverede celler søger ud og ødelægger de tumorer, patienten er hjemsøgt af. Det vil kunne forstås, at i kraft af den foreliggende opfindelse kan tumorpatienter behandles med aktiverede makrofager, uden at patienterne udsæt-30 tes for endotoxiner, radioaktive materialer eller andre skadelige stoffer.
Tilstrækkelige mængder homogen GM-CSF til brug ifølge opfindelsen kan fremstilles ved hjælp af re- 5 DK 174603 B1 kombinant DNA teknikker. Genet, der koder for GM-CSF, isoleres og viderebehandles derefter til brug i systemer, som er i stand til, at udtrykke rekombinant-proteinet på højt niveau. Den fra ekspressionsværter-5 ne udvundne GM-CSF renses til homogenitet ved anvendelse af revers fase HPCL.
En procedure til at vise aktiverede makrofagers effektivitet til at dræbe specielle tumorer indbefatter dyrkning af makrofager med GM-CSF i forskellige 10 koncentrationer. Efter en passende dyrkningsperiode fjernes GM-CSF, og måltumorcellerne udsættes derefter, efter at være blevet radiomærket, for de aktiverede makrofageffektorceller. Efter en yderligere dyrkningsperiode fjernes de målceller, som er blevet 15 dræbt, og de resterende målceller lyseres derefter for at måle resterende tælleværdier som et kvantitativt indeks for antallet af celler, som har overlevet eksponeringen for aktiverede makrofager.
Detaljer vedrørende typiske udførelsesformer af 20 opfindelsen beskrives i det følgende under henvisning til tegningen, hvor figur 1 illustrerer nukleotidsekvensen og den tilsvarende aminosyresekvens af det humane GM-CSF gen, herunder det ikke-kodende 3'område, 25 figur 2 illustrerer pY fGM-2- ekspressionsplasmidet med kodningsområdet af GM-CSF genet indført deri for anvendelse til transformering af værtsceller med henblik på at udtrykke funktionel human GM-CSF, 30 figur 3 er en graf, der illustrerer den speci fikke lyse af tumorceller, som er formidlet af makrofager fra humant, perifert blod aktiveret ved for- DK 174603 B1 6
skellige koncentrationer af renset rekombinant human GM-CSF
figur 4 er en graf, der illustrerer den specifikke lyse af tumorceller, som er formidlet af makro-5 fager fra humant, perifert blod aktiveret ved forskellige koncentrationer af renset rekombinant human GM-CSF og dermed sammenlignelig lyse formidlet af makrofager aktiveret med LPS, IFN-γ og IFN-γ kombineret med LPS, og 10 figur 5 er et fotografi af et sølvfarvet po- lyacrylamidgelbånd af renset homogen rekombinant GM-CSF.
Fremstilling af prækursormonocyter 15 Makrofager i form af monocyter fra perifert blod rensedes med henblik på efterfølgende aktivering med GM-CSF under anvendelse af standardteknikker indbefattende Ficoll og Percell separation. Det ved disse procedurer opnåede topmonocytlag udstryges i medi-20 um, hvorefter ikke-vedhæftende celler fjernes, således at de tilbageværende monolag kan aktiveres ved tilsætning af GM-CSF og andre mulige aktiveringsmidler, herunder LPS og IFN-γ. For at gardere sig mod tilstedeværelsen af kontaminanter, såsom et endoto-25 xin, testedes de ved celleseparationsprocessen anvendte reagenser med "Limulus Ameobocyte Lysate".
Desuden fremstilledes cellepopulationer med endoto-xinfrie puffere og medier.
I stedet for at blive isoleret fra perifert 30 blod kan monocyter eller modne makrofager fås fra andre kilder, såsom miltceller, lymfekirtelceller eller lungeudskylninger.
7 DK 174603 B1
Fremstilling af rekombinant GM-CSF; kloning af GM-CSF gen GM-CSF produceres kun i ganske små mængder in vivo, men der kan fremstilles forholdsvis store mæng-5 der meget rent GM-CSF til brug ved aktivering af mo-nocyter og makrofager ved hjælp af rekombinantteknikker. En diskussion af sådanne rekombinant DNA teknikker til proteinfremstilling anføres i de redaktionelle og underbyggende artikler og i bind 196 af Science 10 (April 1977). For at drage fordel af de i denne reference omtalte rekombinant DNA teknikker må genet, der koder for GM-CSF, først isoleres fra et cDNA bibliotek, f.eks. med en nick-translateret cDNA probe. Den mærkede probe fås fra et muse GM-CSF cDNA bibliotek 15 ved anvendelse af en syntetisk oligonukleotidprobe svarende til afsnittet af muse GM-CSF's nukleotidse-kvens.
For at isolere den molekylære klon af det humane GM-CSF gen ekstraheres alt RNA fra lymfomcelleli-20 nier, såsom HUT-102, Jurkat eller HL60 eller fra andre typer kilder, såsom mononukleære celler fra humant perifert blod. Polyadenyleret mRNA isoleres fra den totale RNA ekstrakt. Et cDNA bibliotek konstrueres ved revers transkription af det polyadenylerede 25 mRNA med enzymet avianmyeloblastosis-virus ("AMV") revers transkriptase. DNA'et gøres dobbeltstrenget med DNA polymerase I og indføres i en passende kloningsvektor, såsom et plasmid, en bakteriofag eller et kosmid. Resulterende rekombinante kloningsvektorer 30 anvendes derefter til transformering af en passende vært, såsom Escherichia coli ("E.coli"), gær eller en anden enkeltcellet organisme.
8 DK 174603 B1
Transformerede værter identificeres og samles i forråd. Plasmid DNA fremstillet ud fra disse forråd hybridiseres med en nick-translateret cDNA muse GM-CSF probe, der er radiomærket med 32P. Det eller de 5 forråd af kloner, som giver et positivt signal over for proben, identificeres, hvorefter det lovende forråd underinddeles, og hybridiseringsscreening gentages. En enkelt transformant svarende til det humane GM-CSF gen identificeres til sidst. Plasmid DNA frem-10 stilles ud fra denne transformant og karakteriseres ved DNA sekvensanalyse, f.eks, under anvendelse af standardkædetermineringsmetoder, som dem der oprindeligt blev udviklet af Sanger et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. (U.S.A.), 70:5463 (1977).
15 Figur 1 illustrerer i den ovre linie nukleotid- sekvensen af det humane GM-CSF gen. Kodningsområdet af det humane GM-CSF gen strækker sig fra nukleotid nr. 14 til nukleotid nr. 394. Den tilsvarende amino-syresekvens bestemt ud fra nukleotidsekvensen anføres 20 nedenunder de relevante kodoner. Modent protein begynder ved stjernen (*) . Plasmid DNA betegnet pHG23 fremstillet ud fra cDNA'et fra den identificerede positive koloni og transformeret i E. coli er deponeret i overensstemmelse med Budapesttraktatens bestemmel-25 ser ved American Type Culture Collection ("ATCC"), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A., under accessionsnr. 39900.
Ekspression af funktionel GM-CSF 30 Funktionel GM-CSF fremstilles ved ekspression af det i pHG23 i værtsceller indeholdte GM-CSF gen og testes derefter for det udtrykte produkts evne til at stimulere væksten af knoglemarvskolonier i agar. Et 9 DK 174603 B1 cDNA fragment af i det væsentlige hele kodningsområdet af det i figur 1 viste GM-CSF gen (Sfa NI til Nco
1 fragmentet) indføres i en ekspressionsvektor udformet til at dirigere syntese og udskillelse af GM-CSF
5 fra gærværtsceller, f.eks. en vektor betegnet pYafGM- 2 som vist i figur 2. Ekspressionsvektoren, såsom pYafGM-2 indeholder fortrinsvis sekvenser hidrørende fra plasmid pBR 332 (vist ved tyk linie i figur 2) indbefattende et replikationsområde og ampicillin- 10 resistensgenet (Apr) . I det ideelle tilfælde indeholder ekspressionsvektoren også sekvenser fra gær, f.eks. tryptofan-1 genet (TRP-1) som en udvælgelig markør og 2u gærreplikationsområdet (afsnit vist ved tynd linie). Ekspressionsvektoren indbefatter for-15 trinsvis yderligere præ/pro-α parringsfaktoren ("a-faktor") fra gær (prikket kasse) som en effektiv promotor sammen med ledesekvenser til at styre syntesen og udskillelsen af GM-CSF i gærværter efterfulgt af sekvensen for kodning s området af GM-CSF vist i figur 20 1 (skraveret kasse). a-faktorgenets struktur omtales i Kurjan og Herkowitz, Cell, 30:933-943 (1982) .
pYafGM-2 ekspressionsplasmidet transformeres i en passende stamme af Saccharomyces cerevisiae ("S.cerevisiae"). Blandt foretrukne stammer er 25 gærstammerne nr. 79, X2181-1B, DBY746, YNN280 og 20B- 12. Disse stammer er alle a, Trp I, Leu 2 for kompatibilitet med oc-faktorpromotoren og for udvælgelse af Trp+-transformanter. Disse stammer er alle udbredt tilgængelige, f.eks. kan stamme 79 fås fra Yeast Ge-30 netic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California, Berkeley, California 94702.
10 DK 174603 B1
Transformering af gærværter med det rekombinan-te ekspressionsplasmid indeholdende bIL-2 genet gennemføres i henhold til velkendte procedurer, ved hvilke sfæroplaster dannes og derefter vaskes før 5 plasmidoptagning. Der er etableret standardforskrifter for denne procedure. Se f.eks. Beggs, Nature (London) , 275:104 (1978), og Hinnen et al., Proc.
Natl - Acad. Sci. (U.S.A.), 75:1929 (1978).
Gærfermenteringssupernatanter analyseres for 10 biologisk aktivitet ved hjælp af deres evne til at dirigere dannelsen af blandede kolonier af granulo-cyt- og makrofagtype fra celler fra human knoglemarv.
Som kontrol transformeredes også plasmid pYaf af samme konstruktion som pYafGM-2, men uden GM-CSF sekven-15 serne i en gærvært og fermenteringssupernatanten testedes for biologisk aktivitet. pYafGM-2 supernatan-ten fandtes at dirigere syntese af høje niveauer af GM-CSF aktivitet ved knoglemarvsanalysen (1,2 x 106 kolonidannende enheder per ml kultur ("CFU-20 c/ml11)), .medens der ikke påvistes nogen aktivitet fra supernatanten hidrørende fra pYaf-kontrolplasmidet.
Rensning af rekombinant GM-CSF
Det i supernatanten fra ekspressionsværtscel-25 lerne indeholdte rekombinant GM-CSF renses til den i det væsentlige er homogen ved revers fase HPLC. De anvendte HPLC procedurer gør fortrinsvis brug af en revers fase tetramethyl-, octadecyl-, octylmethyl-eller diphenyl-bundet siliciumoxidsøjle med en pore-30 størrelse, som er tilstrækkelig stor.
11 DK 174603 B1
Egnede reversfase HPLC-søjler til denne brug kan fås i handelen. En foretrukket søjle til dette formål er "Vydac®" søjleserien, der kan fås i handelen fra Separations Group, Hesperia, CA. F.eks. kan 5 der benyttes "Vydac® C4 eller C18" -adsorbent revers-fasesøjler bestående af tetramethylsilangrupper bundet kovalent ved hjælp af siloxan (silican-oxygen-silican) bundet til overfladen af silicagel med en porediameter på 300 Å, der er blevet klassificeret 10 til en middelpartikelstørrelse fra 30 til 44 μπι til at kunne udnyttes optimalt med proteinet GM-CSF, dvs. en porestørrelse på mindst 300 Å.
Før den sættes til søjlen, gøres den udtrykte GM-CSF sur med en passende syre, såsom trifluoreddi-15 kesyre ("TFA"). Elueringen af proteiner fra HPLC-søjlen udføres på en måde, der er velkendt inden for området. En egnet elueringsprocedure til fjernelse af de bundne proteiner fra søjlen indebærer brug af en lineær radient gradient af acetonitril. En foretruk-20 ket gradient til dette formål er 0-100 vol/vol% acetonitril gradient i TFA (pH 2,0-2,1).
Det eluerede protein kan bekvemt overvåges med påvisningssystemer, der er velkendte inden for området. F.eks. kan de relative proteinkoncentrationer i 25 fraktioner elueret fra HPLC-søjlen bestemmes ved måling af det eluerede materiales absorbans i et automatiseret UV-lysspektrofotometer ved en lysbølgelængde på 214 nanometer. Et passende automatiseret UV-lysabsorbanspåvisningsapparat kan fås fra Waters As-30 sociates, Milford, ME.
12 DK 174603 B1
Fraktioner udvundet ved HPLC proceduren analyseres for protein ved hjælp af fluorescamin-analysen og ved hjælp af SDS (natriumdodecyl-sulphat)polyacrylamid-gelelektroforese efterfulgt af 5 sølvfarvning som beskrevet i eksempel 4 nedenfor. Det udvundne GM-CSF betegnet Fxn 57 analyseres derefter for biologisk aktivitet under anvendelse af den ovenfor og i eksempel 3 nedenfor omtalte knoglemarvskolonidannelsesanalyse .
10 Hvis der ikke opnås tilstrækkelig proteinrens ning ved den indledende HPLC procedure, kan den gentages ved anvendelse af samme søjle eller en anden søjletype. Desuden kan der benyttes samme eller et andet elueringsmiddel. Ved at udføre HPLC i to trin 15 rensedes GM-CSF til homogenitet som en enkelt symmetrisk top af biologisk aktivitet. Som vist i figur 5 identificeredes der ved polyacrylamidgelelektroforese to bånd af GM-CSF aktivitet med molekylvægte på ca.
21.000 og 17.000 dalton. Disse bånd svarer til glyco-20 sylerede (21.000) og uglycosylerede (17.000) typer af GM-CSF produceret af gær. Ved knoglemarvskolonidannelsesanalysen fandtes aktivitetsniveauet af Fxn 57 at være 1,5 x 107 CFU-c/ml. Den specifikke aktivitet af denne homogene GM-CSF fandtes at være ca. 1,5 x 106 25 CFU-c/^g protein, eller 3,0 x 1016 CFU-c/mol.
Fremstilling af målceller
Aktivering af makrofager til tumoricid tilstand analyseres med hensyn til forskellige typer af tumor-30 celler, herunder f.eks. A375 human myelom cellelinien (ATCC nr. CRL 1619), den humane blæreskel-carcinom SCaBER (ATCC nr. HTB3) , de humane astrocytomglio-bastomer U-87 MG og U-373 MG (henholdsvis ATCC nr.
13 DK 174603 B1 HTB 14 og 17) , de humane Ewing sarcomer Esa-1 og SKES-2 (ATCC nr. HTB 83 og HTB 87) , de humane maline melanomer SK-MEL-28 og SK-MEL-3L (ATCC nr. HTB 72 og HTB 73) , den humane levercarcinom SK-Hep-l {ATCC nr.
5 HTB-52), den humane pancreascarcinom MIA PACA-2 (ATCC nr. CRL-1420) og den humane blærecarcinom 5637 (ATCC nr. HTB-9). Før analyse dyrkes målcellerne i monolag i medium suppleret med forskellige additiver, såsom kalvefosterserum ("FCS"). Derefter radiomærkes mål-10 cellerne, f.eks. med [l25I] ioddeoxyuridin (" [12SI] lUdR"). En standardforskrift for mærkningsproceduren anføres i Kleinerman et al., supra og Onozaki, supra.
Analyse for tumoricid aktivitet 15 Forskellige koncentrationer af testprøver af lovende aktivatorsubstanser, dvs. GM-CSF, IFN-γ, LPS sættes til de ovenfor fremstillede udstrøgne makrofager. Efter en passende dyrkningsperiode, dvs. 24 timer, fjernes testprøven, og radiomærkede målceller 20 sættes til kulturbrøndene. Efter en endelig dyrkningsperiode fjernes målceller dræbt af de aktiverede makrofager, og de resterende levedygtige celler i hver brønd lyseres med et passende reagens, såsom NaOH. Lysatets radioaktivitet måles derefter i en 25 gammatæller. Brønde, der indeholder radiomærkede målceller, men ikke-aktiverede makrofager, tjener som kontrol for målcellelevedygtigheden.
14 DK 174603 B1
Den af de aktiverede makrofager formidlede cy-totoksiske aktivitet beregnes som følger·.
Procent spontan cytotoksicitet = 5 cpm i målceller dyrket med makrofager 100 - -:- x 100 cpm i målceller alene
Procent specifik cytotoksicitet formidlet af aktive-10 rede monocyter = cpm i målceller dyrket med aktiverede makrofaqe^ _ Γ, 71 .-——~ x 100 cpm i målceller ayr^et med kontrolmakrofager l 15
Figur 3 og 4 illustrerer den tumoricide aktivitet af makrofager fra humant perifert blod aktiveret med forskellige koncentrationer af rekombinant human GM-CSF, LPS, IFN-γ eller LPS sammen med IFN-γ. Figur 3 20 illustrerer således den dosisafhængige kapacitet af LPS og IFN-γ til individuelt eller i kombination at inducere makrofagformidlet tumormåldestruktion. Figur 3 viser også aktiviteten ved forskellige koncentrationer af gærsupernatant indeholdende rekombinant GM-25 CSF. Som vist i figur 3 stimulerede sådan gærsupernatant ved en fortynding på 1:500 (200 CFU-c/ml) makrofager til at udvikle ca. 65% specifik cytotoksicitet.
Som ligeledes anført i figur 3 var kontrolgærfermen-teringssupernatant ikke i stand til at fremkalde 30 makrofag cytotoksicitet. Rå gærsupernatant har en titer på ca. 1-2 x 105 CFU-c/ml.
15 DK 174603 B1
Figur 4 viser et fuldt forløb af dosisreaktionstitrering af renset rekombinant human GM-CSF. Som vist i figur 4 indtræffer der en halv-maksimal fremkaldelse af makrofagformidlet tumorcellecytotoksici-5 tet ved en fortynding af søjlefraktionen indeholdende homogen GM-CSF på ca. 1:1.000.000 (15 CFU-c/ml). Kon troldata, der illustrerer cytotoksiciteten af IFN-γ, LPS og LPS i kombination med IFN-γ vises også i figur 4. · 10 Som det fremgår af det foregående, fungerede GM-CSF effektivt som et særegent signal til at få mo-nocyter til at udvise tumoricid aktivitet. Dette er en biologisk egenskab ved GM-CSF, som ikke hidtil har været kendt.
15
Behandling af tumorpatienter
Renset rekombinant GM-CSF som fremstillet ovenfor kan anvendes til at behandle humane patienter eller andre pattedyr, der lider af tumorer, ved anven-20 delse af forskellige terapiprocedurer. Terapeutisk virksomme doser af GM-CSF kan administreres til et individ med behov for behandling ad en række forskellige konventionelle veje, såsom parenteralt eller transdermalt. I almindelighed kan den rekombinante 25 GM-CSF administreres i doser på ca. 1,0 til 10s /^g/kg legemsvægt af individet per dag. Behandling påbegyndes fortrinsvis ved et lavere niveau i dette dosisinterval og øges derefter, indtil den ønskede terapeutiske effekt opnås. Der vil desuden nødvendigvis ind-30 træffe variationer i dosis i afhængighed af forskellige faktorer, f.eks. tilstanden af individet, som behandles. Den person, der er ansvarlig for admini- 16 DK 174603 B1 streringen, vil i alle tilfælde bestemme den passende dosis for det enkelte individ.
Til parenteral administrering kan den rekombi-nante GM-CSF indføres i individet i enkelte eller 5 multiple doser, f.eks. ved hjælp af subkutan, intra-muskulær, intraperitoneal, eller intravenøs injektion. Som alternativ vil GM-CSF kunne indføres via aerosol inhalation, transdermal eller transbukal absorption eller rektalt suppositorium. Til administre-10 ring ved injektion kan opløsninger af rekombinant GM-CSF i sesamolie, jordnøddeolie eller vandig propy-lenglycol anvendes, såvel som sterile ikke-toksiske, ikke-allergene opløsninger af destilleret, serumalbumin, Ringer's opløsning, Hank's opløsning etc. Sådan-15 ne opløsninger vil om nødvendigt kunne forpufres på passende måde, og det flydende fortyndingsmiddel først gøres isotonisk med en tilstrækkelig mængde saline eller glucose.
Som en behandlingsforskrift kan makrofager iso-20 leres fra en donor og stimuleres til tumoricid aktivitet ved at dyrke cellerne med en terapeutisk virksom mængde GM-CSF. De aktiverede makrofager kan derefter administreres til en recipient ved anvendelse af en af de ovenfor omtalte teknikker. Typisk, men 25 ikke i alle tilfælde, er donoren og recipienten samme individ.
De foreliggende behandlingsprocedurer kan anvendes i forbindelse med praktisk taget alle typer af tumorer, specielt "massive" tumorer. Blandt sådanne 30 tumorer er alle carcinomer, såsom blære, nyre, skelceller, lunge, lever, bryst og kolon. Sådanne tumorer indbefatter også eventuelle melanomer eller sarcomer.
17 DK 174603 B1
Opfindelsen illustreres nærmere i de følgende eksempler.
Eksempel 1 5 Fremstilling af makrofager fra perifert blod
Den del af makrofager fra perifert blod (opnået fra Portland, Oregon, Red Cross) der udgjorde det gule lag rensedes under anvendelse af pyrogen-fri reagenser målt ved hjælp af "Limulus Ameobocyte Lysate" 10 {Whittaker M.A. BioProducts, Walkersville, MD) . Hvert brungult lag fortyndedes i "Roswell Park Memorial Institute ("RPMI")-1640" medium med heparin (50 U/ml,
Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) til 200 ml af celler og lagdeltes på "Isolymph®" (Gallard-Schlesinger, 15 Carle Place, NY) og centrifugeredes derefter ved 1400 x g i 25 min. Grænsefladecellerne (mononukleære leu-kocyter) vaskedes og lagdeltes derefter ved en koncentration fra 4 til 5 x 107 celler i 2 ml på kontinuerte "Percoll®" (Pharmacia Fine Chemicals) gradienter 20 og centrifugeredes derefter ved 200 x g og 4°C i 20 min. for at adskille makrofagerne fra resten af de mononukleære leukocyter. Det resulterende topmakro-faglag opsamledes, vaskedes i "RPMI-1640" med 5% FCS og pletteredes derefter i en koncentration fra 1 til 25 2 x 105 celler per brønd i fladbundede 96-brønds "Microtiter" plader (Costar, Cambridge, MA) sammen med "RPMI-1640" og 5% FCS. Efter inkubation i 1 time ved 37°C fjernedes de ikke-vedhæftede celler ved sugning med en 18 gauge nål, hvorefter makrofaglagene 30 skylledes to gange med serumfrit "RPMI-1640" medium, hvorved makrofagerne gjordes klar til tilsætning af testprøver bestående af forskellige koncentrationer 18 DK 174603 B1 af formodede aktivatorer, såsom GM-CSF, IFN-γ. LPS eller LPS i kombination med IFN-γ som omtalt nærmere nedenfor .
5 Eksempel 2
Fremstilling af rekombinant GM-CSF
I det væsentlige hele GM-CSF-genets kodningsområde og en del af dets 3'-flankeområde fjernedes fra cDNA klonen ifølge figur 1 og anvendtes til dannelse 10 af et rekombinant ekspressionsplasmid betegnet pYotfGM-2 til at styre GM-CSF ekspression i gær-værtsceller. pYafGM-2 ekspressionsplasmidet er deponeret i overensstemmelse med Budapesttraktatens bestemmelser ved ATCC under accessionsnr. 53157. Som 15 vist i figur 2 indbefatter pYafGM-2 et replika-tionsområde og et Apr resistensgen fra plasmid pBR322 (vist ved tyk streg). Ekspressionsplasmidet indbefatter også 2u cirkelreplikationsområdet for gær og et Trp I gen til udvælgelse af transformerede gærværter 20 (TRP - [Trp - auxotrofe] , afsnit vist ved tynd streg i figur 2). Ekspressionsplasmidet indbefatter yderligere gær a-faktorpromotor- og ledesekvenserne (prikket kasseafsnit) til brug ved styring af transkrip-tion og udskillelse af GM-CSF. GM-CSF sekvenserne 25 (skraveret kasseafsnit) er fusioneret med a-faktorsekvenserne med et syntetisk oligonukleotid (åbent kasseafsnit) som omtalt nærmere nedenfor.
Som nævnt ovenfor fjernedes GM-CSF genets kodningsområde fra Sfa NI til Nco I stedet fra pHG 23 30 klonerne ved anvendelse af Sfa NI og Nco I restriktionsenzymer ved en standardforskrift, f.eks. som anført i Maniatis et al., Molecular Cloning, A Labora- 19 DK 174603 B1 tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. Sfa NI enzymet spalter GM-CSF genet fra pHG23 klonen på et sted, der befinder sig to nukleotider nedstrøms fra 5'terminalen af det område, 5 der koder for det modne protein (nukleotid nr. 14), da der ikke fandtes noget restriktionssted, som svarede præcist til nukleotid nr. 14. Et oligonukleotid syntetiseredes kemisk for igen at tilføje 5'- terminal-afsnittet af det modne GM-CSF gens kodningsområde 10 og også for at tilføje et andet a-faktor-behandlingssted for at opnå fuldstændig behandling af signalsekvensen for udskillelse af den modne form af GM-CSF. Sammensætningen af oligonukleotidet som vist i tabel I nedenfor og i figur 2 (åbent kasseafsnit) , 15 indbefatter en Hind III komplementær 5'-terminal efterfulgt af et Cathepsin-B-lignende modningssted opbygget af sekvensen: TCT TTG GAT AAA AGA efterfulgt af en Sfa NI komplementær 3'-terminal, der koder for de første to aminosyrerester i det modne GM-CSF pro-20 tein. Selv om det i tabel I viste oligonukleotid syntetiseredes kemisk ved triester-teknikken som beskrevet i detaljer af Sood et al., Nuel. Acad. Res., 4:2557 (1977) og Hirose et al., Tet. Lett., 28:2449 (1978) må det forstås, at oligonukleotidet kan frem-25 stilles på andre måder, såsom ved phosphodiester-metoden.
Tabel 1 30 5'- A GCT TCT TTG GAT AA A AGA GC -3'
AGA AAC CTA TTT TCT CGT GGG
Ser Leu Asp Lys A.rg Ala Pro 20 DK 174603 B1
Det må forstås, at andre rekombinant DNA standardteknikker vil kunne anvendes til at frembringe samme ekspressionsvektor, og at den konstruktion, der er beskrevet i detaljer ovenfor, er en illustre-5 rende repræsentant for forskellige strategier, som ville kunne anvendes til fremstilling af et GM-CSF cDNA fragment til indføring i pYocfGM-2 ekspressionsvektoren eller til ekspression i andre bakterie- eller pattedyrsvektorer.
10 pYafGM-2 vektoren transformeredes i gærstamme 79 (a, Trp 1-1, Leu 2-1) af S. cerevisiae for udvæl gelse af Trp+ transformanter ved hjælp af standardteknikker. Forud for transformering dyrkedes stamme 79 enten i selektive medier (YNB-trp, bestående af 0,67% 15 gærnitrogenbase (Difco Labs., Detroit, MI), 0,5% (Ca-samino-syrer, 2% glucose, 10 mikrogram/milliliter C^g/ml") adenin og 20 μg/ml uracil) eller i rigt medium (YPD, bestående af 1% gærekstrakt, 2% pepton og 2% glucose suppleret med 80 pg/ml adenin og 80 μg/ml 20 uracil). Celler høstedes ved centrifugering ved 1000 x g og 22°C i 5 min., hvorefter den resulterende pille vaskedes med sterilt destilleret vand.
Gærcellerne koncentreredes derefter ved re-suspendering i 1/10 vol. SED (1 M sorbitol, 25 mM 2 5 ethylendiamintetracetat ("EDTA") [pH 8,0 og 50 mM dithiothreitol] og inkubation ved 30°C i 10 min. Derefter centrifugeredes celle-puffer-blandingen i 5 min. ved 300 x g. Pillen vaskedes en gang med 1/10 vol 1 M sorbitol, og cellerne resuspenderedes i 20 ml 30 SCE (1 M sorbitol, 0,1 M natriumcitrat [pH 5,8], 0,01 M EDTA) . Glusulase sattes i en mængde på 10 3 vol til opløsningen for at nedbryde cellevæggene, hvorefter 21 DK 174603 B1 opløsningen inkuberedes ved 30°C i 30 min. under lejlighedsvis forsigtig rystning. Tilstedeværelsen af sfæroplaster analyseredes ved fortynding af 10 mikro-liter ("μΐ") af gærcellerne i en dråbe af 5 vægt/vol% 5 SDS på et mikroskopobjektglas for at undersøge for "skygger” ved 400 x fasekontrast. Derefter centrifugeredes celleblandingen ved 300 x g i 3 min. Den resulterende pille vaskedes to gange med 1/10 vol. 1M sorbitol og derefter en gang med CaS (1 M sorbitol, 10 10 mM CaCl2) .
Derefter transformeredes gærsfæroplasterne med den tidligere fremstillede plasmidvektor ved en procedure på grundlag af Beggs, supra. De pelletiserede sfæroplaster suspenderedes i 1/200 vol CaS og opdel-15 tes i 100 mikroliter portioner i 1,5 ml Eppendorf rør. Fra 1 til 10 μΐ af plasmid DNA'et sattes til hver portion (0,5 til 5 μ9) . Blandingen inkuberedes ved stuetemperatur i 10 min., hvorefter 1 ml PEG {20% PEG 4000, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl [pH 7,4] sattes til 20 hver portion for at fremme DNA optagelsen. Efter 10 min. ved stuetemperatur centrifugeredes blandingen i 5 min. ved 300 x g. Den resulterende pille resuspen-deredes i 150 μΐ SOS (10 ml 2 M sorbitol, 6,7 ml YEPD [1% (vægt/vol) gærekstrakt, 2% (vægt/vol) pepton, 2% 25 (vægt/vol) glucose], 0,13 ml 1 M CaCl2, 27 μΐ 1% tryp-tofan og 3,7 ml vand). Denne blanding inkuberedes ved 30°C i 20 min. Derefter blev cellerne udstrøget.
Før udstrygning præinkuberedes de selektive protoplast/DNA blandingsplader ved 37°C. 3 ml smeltet 30 topagar (45°C) sammensat af 18,2 ml sorbitol, 2 g agar, 0,6 g "Difco" gærnitrogenbase (uden aminosyrer) , 2 g glucose, 0,1 ml 1% adenin, 0,4 ml 1% uracil 22 DK 174603 B1 og aminosyrer efter behov sattes derefter til hver portion af transformerede celler, og rørenes indhold hældtes på de selektive plader. Derefter inkuberedes pladerne fra 2 til 4 dage ved 30°C. Kolonier, som ud-5 vikledes i Trp minus-mediet, indeholdt plasmider, der havde Trp 1 genet, dvs. sådanne, som er transformeret .
Før biologisk og tumoricid analyse dyrkedes trans formanterne i 20 til 50 ral rigt medium ved 30°C 10 til stationær fase.
På udvindingstidspunktet tilsattes proteasein-hibitorerne phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) og
Pepstatin A til en slutkoncentration på henholdsvis 1 mM og 1 μηη. Cellerne fjernedes derefter ved centrifu-15 gering ved 300 x g, og mediet filtreredes gennem et 0,45 μπ\ celluloseacetatf ilter (Corning Glass Works, NY). De sterile supernatanter opbevaredes ved 4°C.
Eksempel 3 20 Kolonianalyse
Tilstedeværelsen af human GM-CSF udvundet fra gærkulturerne i eksempel 2 bekræftedes ved analyse af supernatanternes evne til at stimulere vækst af humane knoglemarvskolonier i agar. Til brug ved analysen 25 opsamledes human knoglemarv fra hoftebensranden på voksne donorer i en hepariniseret injektionssprøjte.
Marven fortyndedes i forholdet 1:3 med phosphat-for pufret saltopløsning (PBS) ved stuetemperatur og lagdeltes på en opløsning af 54% "Percoll®11 (Pharmacia 30 Fine Chemicals) . Efter centrifugering ved 500 x g ved stuetemperatur i 20 min. opsamledes grænsefladen og vaskedes med 20 volumener PBS. Derefter centrifu- 23 DK 174603 B1 geredes suspensionen ved 250 x g ved stuetemperatur i 10 min. Så resuspenderedes cellerne i 10 ml "a-Minimal Essential Medium" med nukleotider ("α-Mem",
Gibco) med henblik på celletælling og bestemmelse af 5 levedygtighed. Derefter tilsattes FCS, og cellesuspensionen opbevaredes på is, indtil analysen udførtes.
Ved analysen tilsattes knoglemarvsceller behandlet som ovenfor til en slut koncentrat ion på 1 x 10 105/ml til et inkubationsmedium bestående af: (a) 7 dele af en opløsning indeholdende 28% FCS, 0,7 x 10'4 M 2-mercaptoethanol, 0,12 mg/ml asparagin, 0,7 mg/ml glutamin, 150 enheder penicillin G, 150 enheder streptomycin, 1,1 x a-MEM med nukleotider og 2,2 x 15 vitaminer (Gibco), og (b) 3 dele af en 1,4% bakto- agar-opløsning (Difco). Kulturerne inkuberedes ved 37°C i en fugtet atmosfære i nærvær af 5% C02. Efter 7 til 14 dages dyrkning bestemtes antallet af kolonier og deres type, enten granulocyt, makrofag eller blan-20 det granulocyt-makrofag. Opfinderne fandt, at GNI-CSP genet fra pYafGM-2 kloner dirigerede syntese af GM-CSP aktivitet i et højt niveau på 1,25 x 106 koloni dannende enheder per 105 (CFU-c/ml). Dette aktivitetsniveau blev bestemt ved at multiplicere det resiprok-25 ke af fortyndingen, der gav 50% af det maksimale koloni antal, med 50. Opfinderne nåede frem til, at det gennemsnitlige antal kolonier fra 1 x 105 knoglemarvsceller var 96 ± 29. De kolonier, der efter 14 dage var dannet med den rekombinante GM-CSF, var veldefi-30 nerede og bestod af 3 typer: Ca. 1/3 blandede granu-locyt-makrofag-kolonier, ca. 1/3 tætte granulocytko-lonier og ca. 1/3 spredte makrofagkolonier.
24 DK 174603 B1
Som en kontrol af ekspressionssystemet transformeredes et plasmid identisk med pYa-fGM-2, men uden GM-CSF sekvenserne også i gærstamme 79. Kultur-supernatanten fra gæren frembragte ikke nogen GM-CSF 5 aktivitet ved knoglemarvskolonidannelsesanalysen.
Eksempel 4
Rensning af rekombinant GM-CSF
Mediet fra eksempel 2 indeholdende udskilt re-10 kombinant GM-CSF bragtes til 1% i TFA og filtreredes derefter gennem 0,45 μτη filter (Corning Glass Works,
New York}. Derefter pumpedes mediet direkte i en "Vy-dac® C411 reversfasesøjle (1,0 x 30 cm rustfrit stål med 10 μιη pakning eller "Waters®" radiale kompressi-15 onspatron [Waters Associate, Milford, ME] pakket med 50 μπι "Vydac® C4" pakning) under anvendelse af en "Milton Roy" pumpe (Lab. Data Control, Riveria Beach, FL) ved en strømningshastighed på 5 ml/min. Op til 1 1 medium tilsattes på en gang, og den samlede prote-20 inbelastning på søjlen fandtes i almindelighed at være omkring 20 mg. Belastningssøjlen vaskedes med 0,1% TFA for at fjerne ubundne prøvekomponenter, indtil absorbansen ved 214 nm faldt til basislinieværdier (værdier før belastning). Eluering af det bundne pro-25 tein opnåedes med en lineær gradient af 0 til 95% acetonitril i 0,1 vol/vol% TFA med en hastighed på 1% acetonitril/ml. Gradienten dannedes med en "Waters®" væskekromatograf bestående af en "Model 680" gradientdanner, 2 ”M-45" pumper og en "Model 414" detek-30 tor, der overvågede ved 214 nm. Topproteinf rakt ioner iagttoges ved fra 55 til 60% acetonitril.
25 DK 174603 B1
Topfraktionerne indeholdende GM-CSF fra den første HPLC procedure opsamledes og fortyndedes i forholdet 1:3 i 0,1 vol/vol% TFA i H20, hvorefter aktiviteten underkastedes rekromatografi og re-eluering 5 med samme gradient af TFA og acetonitril på en "Vy-dac® C18" søjle (3,9 ml x 15 cm søjle, 5 μπι pakning). Topfraktioner iagttoges ved fra 55 til 60% acetonitril .
Fraktioner analyseredes for protein ved fluo-10 rescaminanalyse. Desuden analyseredes topfraktioner igen ved SDS polyacrylamid gelelektroforese efterfulgt af sølvfarvning. Ved elektroforeseprocessen tørres 20 μΐ portioner af de under elueringsproceduren opsamlede fraktioner under vacuum efter tilsætning af 15 2 ml 10% SDS til hver portion. Den tørrede remanens opløstes i 40 μΐ ikke-reducerende prøvepuffer sammensat af 0,0625 M Tris (pH 6,8), 2 vægt/vol% SDS, 10 vol/vol% glycerol og 5 vol/vol% 2-mercaptoethanol. Opløsningen kogtes i 3 min., hvorefter den underka-20 stedes elektroforese på 12% polyacrylamidgel ved den af Laemmli, Nature (London), 227:680 (1970) beskrevne metode. Gelprøverne for de individuelle fraktionstal sølvfarvedes ved den af Oakley et al., Anal. Bio-chem., 105:361-364 (1980) beskrevne metode. Essentiel 25 homogenitet af GM-CSF bekræftedes ved elektroforesen og sølvfarvningen, som gav to proteinbånd svarende til glycosylerede (21.000 dalton) og ikke-glycosylerede (17.000 dalton) typer af GM-CSF, figur 5. Aktiviteten af dette homogene materiale bestemt 30 ved den i eksempel 3 ovenfor beskrevne kolonidannelsesanalyse fandtes at være ca. 1,5 x 107 CFU"°/ml med 26 DK 174603 B1 en specifik aktivitet på 1,5 x ΙΟ6 CFU'c/^g af protein, pi værdien fandtes at være ca. fra 5,0 til 5,4.
Eksempel 5 5 Fremstilling af mærkede målceller Målceller opbevaredes i "RPMI 1640" medium suppleret med 5% ved 37°C i en fugtet atmosfære indeholdende 5% CO2 - Cytotoksicitetsanalyse udførtes, når de dyrkede målceller var i deres eksponentielle vækstfa-10 se. Målcellerne indbefattede den humane melanomcelle-linie A375 (ATCC nr. CRL 1619) , den humane levercar-cinomcellelinie SK-Hep-1 (ATCC nr. HTB-52), den humane pancreascarcinom MIA-PACA-2 (ATCC nr. CRL-1420) og den humane blærecarcinom 5637 (ATCC nr. HTB-9).
15 De eksponentielt voksende målceller radiomærke- des med 125I-IUdR. Ved radiomærkningsproceduren inkuberedes målcellerne ved 37°C i 24 timer i RPMI medium suppleret med 5% FCS medium indeholdende 12SI-IUdR (0,3 μ^/τηΐ; specifik aktivitet, 200 mCi/ml; New Eng-20 land Nuclear, Boston, MA). Derefter vaskedes cellerne to gange for at fjerne ubundet radiomærkat og høste-des derefter ved 1 minuts trypsinisering med 0,25% trypsin (Difco Labs, Detroit, MI) og 0,02% EDTA. De mærkede celler resuspenderedes i RPMI-1640 medium 25 suppleret med 5% FCS.
Eksempel 6
Analyser for tumoricid aktivitet
Ved tumoricid analyseproceduren sattes 200 μΐ 30 volumener af forskellige koncentrationer/fortyndinger af testprøver af rekombinant GM-CSF fra eksempel 4, renset naturel IFN-γ (Meloy Laboratories, Springfield, 27 DK 174603 B1 VA) , LPS (Difco Labs., Detroit, MI, E, coli LPS-N) og LPS kombineret med IFN-γ til dyrkningsbrøndene indeholdende de udstrøgne makrofager. Som nævnt i eksempel 1 fjernedes ikke-vedhæftende makrofagceller fra 5 dyrkningsbrøndene ved udsugning med en 18 gauge nål, før testprøverne sattes til makrofagerne, hvorefter monolagene skylledes to gange med serumfrit "RPMI-1640". For GM-CSF's vedkommende udførtes analyser med forskellige fortyndinger af både supernatant produce-10 ret med gær indeholdende GM-CSF plasmidet som fremstillet i eksempel 2 ovenfor (figur 3) og renset re-kombinant GM-CSF som fremstillet i eksempel 5 (figur 4) . Fortyndingerne af LPS, IFN-γ og LPS sammen med IFN-γ anføres også i figur 3 og 4. Som kontrol udfør-15 tes analyser med supernatant er produceret med gær, som ikke indeholdt GM-CSF plasmidet. Efter 24 timers inkubation af testprøver med hvilende makrofager sugedes testprøverne fra.
Ca. 104 1251-UdR-mærkede målceller fra eksempel 20 5 sattes til hver af makrofagbrøndene til opnåelse af et indledende mål-til-effektor (aktiveret makrofag) celleforhold mellem 1:10 og 1:20. Desuden blev radiomærkede målceller udstrøget alene som en yderligere kontrolgruppe. Da analysen måler lyse af vedhæftende 25 målceller, hvorved celle-til-cellekontakt mellem ef-fektor- og målceller er påkrævet, blev kultursuperna-tanterne suget fra efter 24 timer og erstattet med frisk "RPMI-1640" medium for at eliminere potentielle fejl på grund af celler, som ikke hang ved, men ikke 30 nødvendigvis blev dræbt ved analysen. Efter yderligere 48 timer skylledes monolagene kraftigt for at fjerne målceller dræbt af makrofagerne. De vedhæften- 28 DK 174603 B1 de levedygtige celler, som blev tilbage i hver brønd, lyseredes med 50 μΐ 0,5 M NaOH. De resterende tællinger opsamledes med en bomuldstampon, hvorefter radioaktiviteten måltes med en gammatæller. Den procentu-5 elle makrofagformidiede cytotoksicitet beregnedes i henhold til formlen:
Procent udviklet cytotoksicitet = 10 100 - cpm 1 dyrket med stimulerede makrofager cpoi i målceller: dyrket med hvilende makrofager * 10°
Analyseresultaterne er indeholdt i figur 3 og 4. Som vist i figur 3 og som forventet aktiverede LPS t 15 og IFN-γ inteferon makrofager til det punkt, hvor de formidler tumoricid aktivitet. Desuden var som tidligere rapporteret IFN-γ's effektivitet som makrofagak-tivator kun signifikant, når den tilsattes sammen med en lille mængde LPS. Som yderligere vist i figur 3 20 var supernatant produceret med gær indeholdende GM-CSF plasmidet effektivt til at få makrofager til at dræbe tumorceller, medens kontrolsupernatant (produceret med gær, som ikke indeholder GM-CSF plasmidet) ikke var i stand til at fremkalde makrofag cytotoksi-25 citet.
Figur 4 viser et fuldt forløb af dosistitrering af renset rekombinant GM-CSF. Som vist i figur 4 havde renset rekombinant GM-CSF selv ved en fortynding på 1:500.000 en evne til at aktivere makrofager til 30 at udtrykke tumoricid aktivitet (30 CFU-c/ml), og halv-maksimal fremkaldelse af udviklet specifik cytotoksicitet indtraf ved en fortynding af søjlefraktio- 29 DK 174603 B1 nen på ca. 1:1.000.000 (15 CFU-c/ml) . Som i figur 3 vises der også i figur 4 passende kontrolprøver af LPS, IFN-γ og IFN-γ plus LPS. Til forskel fra IFN-y tjente GM-CSF som et effektivt enkeltsignal til 5 aktivering af makrofager til tumoricid aktivitet i fravær af exogent LPS.
Eksempel 7
Analyse for tumoricid aktivitet - human carcinom-10 cellelinie
Den i eksempel 6 anførte analyse for tumoricid aktivitet gennemføres også med hensyn til den humane blæreskeicarcinom SCaBER (ATCC nr. HTB 3) . Disse målceller radiomaerkes som beskrevet i eksempel 5. Analy-15 sen udføres under anvendelse af samme procedure som beskrevet i eksempel 6 med undtagelse af, at der i stedet for A375 målcellerne anvendes radiomærkede SCaBER målceller.
20 Eksempel 8
Analyse for tumoricid aktivitet - human myelom
Tumoricid analyseproceduren i eksempel 6 og 7 anvendes i forbindelse med den humane maligne myelom SK-MEL-28 (ATCC nr. HTB 72) . Målcellerne radiomaerkes 25 som beskrevet i eksempel 5. Analysen udføres på samme måde som anført i eksempel 6 og 7 med undtagelse af, at SK-MEL-28 celler anvendes som målceller.
Eksempel 9 30 Analyse for tumoricid aktivitet - human hepatom
Den i eksempel 6 anførte analyse for tumoricid aktivitet udførtes også med hensyn til den humane le-vercarcinom SK-Hep-1 (ATCC nr. HTB-52). Målcellerne 30 DK 174603 B1 radiomærkedes på samme måde som beskrevet i eksempel 5. Ved analysen anvendtes GM-CSF i en koncentration på 10 nanogram per milliliter (ng/ml) analysevolumen.
Ca. 104 125IUdr-mærkede målceller anvendtes ved hver 5 analyse til opnåelse af et indledende mål:effektor (aktiveret monocyt) celleforhold mellem 1:20 og 1:30.
Som kontrol blev radiomærkede målceller også udstrøget alene. Ved denne analyse fandtes de GM-CSF-aktiverede monocyter i gennemsnit at formidle speci-10 fik cytotoksicitet af tumorcellerne ved et niveau på ca. 14%.
Eksempel 10
Analyse for tumoricid aktivitet - human pancreascar-15 cinom
Tumoricidanalyseproceduren i eksempel 9 anvendtes i forbindelse med den humane pancreascarcinom cellelinie MIA PACA-2 (ATCC nr. CRL 1420). Målcellerne radiomærkedes som beskrevet i eksempel 5. Analysen 2 0 udførtes på den i eksempel 9 anførte måde med undtagelse af, at MIA PACA-2 cellerne-anvendtes som målceller. Ved denne specielle analyse fandtes den gennemsnitlige procentuelle genererede cytoksicitet at være ca. 38%.
25
Eksempel 11
Analyse for tumoricid aktivitet - human blærecarcinom Tumoricidanalyseproceduren i eksempel 9 anvendtes også i forbindelse med den humane blærecarcinom-30 cellelinie 5637 (ATCC nr. ETB-9). Målcellerne mærkedes som beskrevet i eksempel 5. Analysen udførtes på samme måde som anført i eksempel 9 med undtagelse af, at 5637 celler anvendtes som målceller. Ved denne DK 174603 B1 31 specielle analyse fandtes den procentuelle genererede cytotoksicitet at være ca. 30%. Denne specielle analyse og de ovenfor anførte viser, at GM-CSF tjente som effektivt enkeltsignal til aktivering af makrofa-5 ger til tumoricid aktivitet.
10 15 20 25 30
Claims (14)
- 32 DK 174603 B1
- 1. Anvendelse af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor til fremstilling af et medikament til fremme af tumoricid aktivitet af celler af makro- 5 fag herkomst, hvori cellerne af makrofag herkomst udsættes for en virksom mængde af nævnte medikament.
- 2. Anvendelse af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor ifølge krav 1, hvori fremgangsmåden til fremme af tumoricid aktivitet af cellerne af 10 makrofag herkomst omfatter: a) Isolering af celler af makrofag herkomst fra kroppen; b) de isolerede celler kontaktes med en virksom mængde af en granulocyt makrofag kolonisti - 15 mulerende faktor; og c) derefter indføres cellerne i en recipients krop.
- 3. Anvendelse af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor ifølge krav 1, hvori fremgangsmåden 20 til fremme af tumoricid aktivitet af celler af makrofag herkomst omfatter indføring i kroppen af et menneske, en effektiv mængde af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor.
- 4. Anvendelse af granulocyt makrofag kolonisti- 25 mulerende faktor ifølge krav 3, hvor medikamentet fremstilles til administrering ved injektion, oral administrering, aerosol inhalation, transdermal eller transbukal absorption eller ved rektal suppositorium.
- 5. Anvendelse af granulocyt makrofag kolonisti- 30 mulerende faktor ifølge krav 4, hvor medikamentet fremstilles til administrering ved subkutan, intra-muskulær, intraperitoneal eller intravenøs injektion. 33 DK 174603 B1
- 6. Anvendelse af granulocyt makrofag stimulerende faktor til fremstillingen af et medikament til cancerterapi.
- 7. Anvendelse af granulocyt makrofag stimule-5 rende faktor ifølge krav 6, hvori fremgangsmåden til cancerterapi omfatter trinnene med indføring i kroppen af et menneske af en virksom mængde af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor.
- 8. Anvendelse af granulocyt makrofag kolonisti-10 mulerende faktor ifølge et vilkårligt af kravene 1-7, hvori den granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor er fremstillet ved rekombinant DNA teknikker.
- 9. Anvendelsen af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor ifølge et vilkårligt af kravene 15 1-8, hvor den granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor er oprenset til en specifik aktivitet på mindst 1,5 x 106 kolonidannende enheder pr. μg protein som bestemt ved knoglemarvskolonidannende analyse.
- 10. Anvendelsen af granulocyt makrofag koloni-20 stimulerende faktor ifølge et vilkårligt af kravene 1-5 eller krav 9 afhængig af kravene 1-5, hvori makrofagerne er afledt fra perifere blodmonocytter.
- 11. Anvendelsen af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor ifølge et vilkårligt af kravene 25 1-10, hvori fra 0,01 til 100 nanogram granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor anvendes per 2 x lo5 celler af makrofag herkomst.
- 12. Anvendelsen ifølge et vilkårligt af kravene 1-11, hvori den granulocyt makrofag kolonistimuleren- 30 de faktor er human granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor. DK 174603 B1 * 1° I pSfa NI 30 50 70 CTCCAGCATCTCTCCACCCGCCCCCTCGCCCACCCCCACCACACACCCCTCCCACCATCTCAATCCCATCCACGAC CysSerlleSerAlaProAlaArgSerProSerProSerThrGlnProTrpCluHisVelAsnAlalleClnGlu 10 20 90 110 130 150 GCCCGCCGTCTCCTGAACCTCAGTAGACACACTGCTCCTCACATCAATGAAACACTAGAAGTCATCTCACAAATG AlaArgArgLeuLeuAsnLeuSerArgAspTh rAlaAlaCluMetAsnCluTh rVølCluVa II leSerG lulle t
- 30 A0 170 190 210 TTTGACCTCCACCAGCCGACCTGCCTACACACCCGCCTCCACCTGTACAAGCAGCCCCTGCCCCCCACCCTCACC PheAspLeuClnCluProThrCysLeuClnThrArgLeuCluLeuTyrLysGlnClyLeuArgClySerLeuThr 50 60 70 230 250 270 290 AAGCTCAAGGGCCCCTTCACCATGATCCCCACCCACTACAAACACCACTGCCCTCCAACCCCGCAAACTTCCTCT LysLeuLysClyProLeuThrMetHetAlaSerHisTyrLysGlnHisCysProProThrProGluThrSerCys 80 90 310 330 350 370 CCAACCCACATTATCACCTTTCAAAGTTTCAAAGACAACCTGAACCACTTTCTGCTTCTCATCCCCTTTGACTGCTGG AlaThrGlnIleIleThrPheCluSerPheI.ysGluAsnLeuLysAspPheLeul,eoValIleProPheAspCysTrp 100 110 120 390 410 430 450 GAGCCAGTCCACCAGTCACACCGGCCACATGAGGCTGCCCAACCCGCGCAGCTGCTCTCTCATGAAACAAGAGCTAG GluProValGlnCluEnd 470 490 510 530 AAACTCACGATCCTCATCTTGGACCCACCAACGCCTCCCCCACACCCATGCrCGGACrCGCCTGCACTGCCTCGCCA Nco I 550 570 590 CACTCACCTCATACAGGCATGCCACAAGAATGGGATATTTATACTGACAAATACTGATATTATATATTATATTT 610 630 650 II»··« TAAATAATTTAATTTAATTTAATTTAATTTAATTCACTAATTACTATTATTACC FIG.I DK 174603 B1 ___PfAOZZT Apr Ny\ i \??p [ pVafCM-2 V f'/vwoTzr ZrøPZ _/ CA/soZ) Cxf MW£> tø '(SfaA/Z) I t J \ ^ ^ \ ^ /}GCfrcr77$ GAPAAAAØAGC . AGA AAC CTA T7T 7C7CG7GGC 5e/- Jj?u AsplysA/y^/aPro CK FAKTOR behandling i /μ- >· li "*** i ®- I I i I I "· I I ^ i %ta~ Φ Φ Φ Φ 1:: 11 „ 1111 !((IH j j 11* * —VÅ til.....-Jtl fH.....--^ ^ /P* ^ /0^ a%i/a%(^%}i 'éw/wM /zwjm/axv m ' ^ ^ /+ ^ i roRTYNDINGfe AF GERSUPER- ^TOK ° O-//)g/m i 1 NATANT INDEHOLDENDE GM-CSF K />5- i I $/*7<^Γ i I i i i i I lil ZOO /00 so ZS /ZS KOLONIDANNENDE ENHEDER - Cføf KONCENTRATION AF AKTIVERINGSMIDDEL ί/00- 9ύ~ % 80- I 70- g 6°- ./OO////??£ I c50- ·--+0' /”$/ I 40- g 3° ~ »X. . O. //75 S ifc- ^x lA ft Nv S /0 - X /ooa/m£ di /ύ \ Jrfti-d' C#p L 1 „ ||| III,in I I 2X/03 SX/O3 3.2X/O*/.32/3^ SX/O^ 2X/0** ax/o6 RECIPROKKE FORTYNDINGER AF RENSET HUMAN OI-CSF •il* i T i I i I > 1 I I y.s-χ/σ3 A9x/o3 4é9 //S’ 30 ys /.<? KOLONIDANNENDE ENHEDER - <?/m£ DK 174603 B1 ^Mrxl0"3 I!-92.5 -66 -45 I 31 -21.5 I—14.4 S.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76689385A | 1985-08-16 | 1985-08-16 | |
| US76689385 | 1985-08-16 | ||
| US88899586 | 1986-07-31 | ||
| US06/888,995 US5078996A (en) | 1985-08-16 | 1986-07-31 | Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK382986D0 DK382986D0 (da) | 1986-08-11 |
| DK382986A DK382986A (da) | 1987-02-17 |
| DK174603B1 true DK174603B1 (da) | 2003-07-14 |
Family
ID=27117812
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198603829A DK174603B1 (da) | 1985-08-16 | 1986-08-11 | Anvendelse af granulocyt makrofag kolonistimulerende faktor til fremstilling af et medikament til fremme af tumoricid aktivitet |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5078996A (da) |
| EP (1) | EP0211684B1 (da) |
| JP (1) | JPH0780781B2 (da) |
| AT (1) | ATE77958T1 (da) |
| AU (1) | AU586876B2 (da) |
| CA (1) | CA1341142C (da) |
| DE (1) | DE3685918T2 (da) |
| DK (1) | DK174603B1 (da) |
Families Citing this family (114)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2130493C1 (ru) * | 1984-07-06 | 1999-05-20 | Новартис Аг | Способ получения белка с активностью gm-csf приматов |
| US5795568A (en) * | 1984-09-19 | 1998-08-18 | Novartis Corporation | Method of treating infectious disease with GM-CSF |
| US5837229A (en) * | 1985-02-05 | 1998-11-17 | Chiron Corporation | Uses of recombinant colony stimulating factor-1 |
| US5104650A (en) * | 1985-02-05 | 1992-04-14 | Cetus Corporation | Uses of recombinant colony stimulating factor-1 |
| US5422105A (en) * | 1985-02-05 | 1995-06-06 | Cetus Oncology Corporation | Use of recombinant colony stimulating factor 1 |
| US5556620A (en) * | 1985-02-05 | 1996-09-17 | Cetus Oncology Corporation | Use of recombinant colony stimulating factor-1 to enhance wound healing |
| US5093115A (en) | 1985-06-11 | 1992-03-03 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of preparing activated killer monocytes for treating colorectal cancer |
| US5391706A (en) * | 1987-07-16 | 1995-02-21 | Schering Plough Corporation | Purification of GM-CSF |
| EP0318184A1 (en) * | 1987-11-12 | 1989-05-31 | Schering Corporation | Acceleration of bone formation with GM-CSF |
| BE1002141A5 (fr) * | 1988-01-13 | 1990-07-31 | Bartholeyns Jacques | Procede de culture et d'activation de cellules humaines et conditionnement pour le traitement du cancer. |
| JPH01193227A (ja) * | 1988-01-29 | 1989-08-03 | Res Dev Corp Of Japan | 癌免疫療法補助剤 |
| AU4219689A (en) * | 1988-08-19 | 1990-03-23 | Genetics Institute Inc. | Treatment for malignant melanoma |
| GB8824591D0 (en) * | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Fractionation process |
| US5178855A (en) * | 1989-01-30 | 1993-01-12 | Schering Corporation | Treatment of luekocyte dysfunction with GM-CSF |
| US5154921A (en) * | 1990-07-13 | 1992-10-13 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Promotion of maturation of hematopoietic progenitor cells |
| US5199942A (en) * | 1991-06-07 | 1993-04-06 | Immunex Corporation | Method for improving autologous transplantation |
| US5904920A (en) * | 1991-10-04 | 1999-05-18 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Regulation of systemic immune responses utilizing cytokines and antigens |
| US5637483A (en) * | 1991-10-04 | 1997-06-10 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Irradiated tumor cell vaccine engineered to express GM-CSF |
| US5292513A (en) * | 1992-05-18 | 1994-03-08 | Anthony G. Gristina | Method for nonspecific cellular immune stimulation |
| US6001351A (en) * | 1993-05-18 | 1999-12-14 | I.D.M. Immuno-Designed Molecules | Macrophages, process for preparing the same and their use as active substances of pharmaceutical compositions |
| US5662899A (en) * | 1993-05-18 | 1997-09-02 | I.D.M. Immuno-Designed Molecules | Macrophages, process for preparing the same and their use as active substances of pharmaceutical compositions |
| US6540994B1 (en) | 1997-07-18 | 2003-04-01 | I.D.M. Immuno-Designed Molecules | Macrophages, process for preparing the same and their use as active substances of pharmaceutical compositions |
| EP0871458B1 (en) | 1995-07-21 | 2002-11-20 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Method of decreasing radiation or radio-mimetic chemotherapy for hematopoietic pluripotent cell engraftment |
| US5800812A (en) * | 1995-09-15 | 1998-09-01 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of use of mononuclear phagocytes to promote axonal regeneration |
| US6267955B1 (en) | 1995-09-15 | 2001-07-31 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Mononuclear phagocytes and their use to promote axonal regeneration |
| US5942253A (en) * | 1995-10-12 | 1999-08-24 | Immunex Corporation | Prolonged release of GM-CSF |
| US6080409A (en) | 1995-12-28 | 2000-06-27 | Dendreon Corporation | Immunostimulatory method |
| US5891432A (en) | 1997-07-29 | 1999-04-06 | The Immune Response Corporation | Membrane-bound cytokine compositions comprising GM=CSF and methods of modulating an immune response using same |
| CA2349217C (en) * | 1998-11-03 | 2012-07-31 | Johns Hopkins University | Cancer-associated antigens and methods of their identification |
| US7611721B1 (en) | 1999-05-13 | 2009-11-03 | Wyeth Holdings Corporation | Adjuvant combination formulations |
| AU1013601A (en) | 1999-10-22 | 2001-05-08 | Aventis Pasteur Limited | Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens |
| US6911204B2 (en) | 2000-08-11 | 2005-06-28 | Favrille, Inc. | Method and composition for altering a B cell mediated pathology |
| SG143058A1 (en) * | 2000-08-11 | 2008-06-27 | Favrille Inc | Method and composition for altering a t cell mediated pathology |
| PE20020530A1 (es) * | 2000-11-10 | 2002-06-18 | Wyeth Corp | Formulaciones de combinacion adyuvante |
| US20070128229A1 (en) * | 2002-04-12 | 2007-06-07 | Wyeth | Surface proteins of Streptococcus pyogenes |
| JP2004533236A (ja) * | 2001-04-13 | 2004-11-04 | ワイエス | 化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）の表面タンパク質 |
| CN1636062A (zh) | 2001-04-16 | 2005-07-06 | 惠氏控股公司 | 编码多肽抗原的新肺炎链球菌可读框及其应用 |
| MX339524B (es) | 2001-10-11 | 2016-05-30 | Wyeth Corp | Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica. |
| MXPA04008890A (es) * | 2002-03-15 | 2005-10-18 | Wyeth Corp | Mutantes de la proteina p4 de haemophilus influenzae no tipicable con actividad enzimatica reducida. |
| US7785608B2 (en) * | 2002-08-30 | 2010-08-31 | Wyeth Holdings Corporation | Immunogenic compositions for the prevention and treatment of meningococcal disease |
| US7301554B2 (en) * | 2002-09-20 | 2007-11-27 | Ricoh Company, Ltd. | Light scanning device, scanning line adjusting method, scanning line adjusting control method, image forming apparatus, and image forming method |
| EP3064215A1 (en) | 2002-10-16 | 2016-09-07 | Samuel F. Hunter | Method for treatment of demyelinating central nervous system disease |
| US20040197312A1 (en) | 2003-04-02 | 2004-10-07 | Marina Moskalenko | Cytokine-expressing cellular vaccine combinations |
| US8071652B2 (en) * | 2003-08-21 | 2011-12-06 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Method of treating irritable bowel syndrome |
| UA93854C2 (ru) | 2003-12-17 | 2011-03-25 | Вайет Ллк | Иммуногенный конъюгат и способ его получения |
| EP1699810A4 (en) | 2003-12-17 | 2009-10-21 | Elan Pharm Inc | A BETA IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATE AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF |
| DE602005018333D1 (de) * | 2004-03-15 | 2010-01-28 | Sunesis Pharmaceuticals Inc | Sns-595 und anwendungsverfahren |
| GB0410220D0 (en) | 2004-05-07 | 2004-06-09 | Kirkham Lea Ann | Mutant pneumolysin proteins |
| US7674456B2 (en) * | 2004-06-14 | 2010-03-09 | Charles Wiseman | Breast cancer cell lines and uses thereof |
| TW200613554A (en) | 2004-06-17 | 2006-05-01 | Wyeth Corp | Plasmid having three complete transcriptional units and immunogenic compositions for inducing an immune response to HIV |
| US20060036080A1 (en) * | 2004-07-16 | 2006-02-16 | Bossard Mary J | Conjugates of GM-CSF moiety and a polymer |
| US20060062764A1 (en) * | 2004-08-25 | 2006-03-23 | Seshidar-Reddy Police | Fiber-modified adenoviral vectors for enhanced transduction of tumor cells |
| US20060057127A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-16 | Pocheng Liu | Cytokine-expressing cellular vaccines for treatment of prostate cancer |
| BRPI0516974A (pt) | 2004-10-21 | 2008-09-30 | Wyeth Corp | composição imunogênica compreendendo um polipeptìdeo; um método para induzir uma resposta imune contra staphylococcus epidermidis; um método para induzir uma resposta imune contra staphylococcus aureus; um método para a detecção e/ou identificação de staphylococcus epidermidis; um método para a detecção e/ou identificação de anticorpos para staphylococcus epidermidis |
| WO2006049599A1 (en) * | 2004-10-28 | 2006-05-11 | The General Hospital Corporation | Methods of detection and therapy for atheromatous plaques using immune modulation |
| US20080260650A1 (en) * | 2004-10-28 | 2008-10-23 | The General Hospital Corporation | Methods of Detection and Therapy of Inflamed Tissues Using Immune Modulation |
| RU2271392C1 (ru) * | 2004-11-15 | 2006-03-10 | Институт Биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFGM17, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pFGM17 - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА |
| US8580814B2 (en) * | 2006-04-03 | 2013-11-12 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using (+)-1,4-dihydro-7-[(3S,4S)-3-methoxy-4-(methylamino)-1-pyrrolidinyl]-4- oxo-1-(2-thiazolyl)-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid for treatment of cancer |
| US9868961B2 (en) | 2006-03-30 | 2018-01-16 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for localized secretion of anti-CTLA-4 antibodies |
| US20070231298A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-04 | Cell Genesys, Inc. | Cytokine-expressing cancer immunotherapy combinations |
| US7919079B2 (en) * | 2006-03-31 | 2011-04-05 | Biosante Pharmaceuticals, Inc. | Cancer immunotherapy compositions and methods of use |
| TW200806315A (en) | 2006-04-26 | 2008-02-01 | Wyeth Corp | Novel formulations which stabilize and inhibit precipitation of immunogenic compositions |
| CN104027333B (zh) * | 2006-06-12 | 2017-05-17 | 逊尼希思制药公司 | 治疗癌症的化合物和组合物 |
| KR101495549B1 (ko) | 2006-07-13 | 2015-02-25 | 와이어쓰 엘엘씨 | 당단백질의 생산 |
| US8192951B2 (en) * | 2006-11-03 | 2012-06-05 | Wyeth Llc | Glycolysis-inhibiting substances in cell culture |
| AU2007353317B2 (en) * | 2006-11-15 | 2012-09-06 | Eli Lilly And Company | Methods and compositions for treating influenza |
| AR064642A1 (es) | 2006-12-22 | 2009-04-15 | Wyeth Corp | Polinucleotido vector que lo comprende celula recombinante que comprende el vector polipeptido , anticuerpo , composicion que comprende el polinucleotido , vector , celula recombinante polipeptido o anticuerpo , uso de la composicion y metodo para preparar la composicion misma y preparar una composi |
| RU2009132986A (ru) | 2007-03-02 | 2011-04-10 | Уайт (Us) | Применение меди и глутамата в культуре клеток для производства полипептидов |
| EP2117579A4 (en) * | 2007-03-07 | 2011-08-24 | Mayo Foundation | TREATMENT OF CANCER USING A GRANULOCYTIC MACROPHAGE COLONY STIMULATING FACTOR |
| US20100255513A1 (en) * | 2007-03-30 | 2010-10-07 | Denson Lee A | Serological markers of inflammatory bowel disease phenotype and disease progression |
| US20080267935A1 (en) * | 2007-04-06 | 2008-10-30 | Cell Genesys, Inc. | AraC in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof |
| US20090028857A1 (en) * | 2007-07-23 | 2009-01-29 | Cell Genesys, Inc. | Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof |
| US8425897B2 (en) * | 2007-08-30 | 2013-04-23 | Immutep S.A. | Compositions containing LAG-3 and cells that secrete GM-CSF and methods of use |
| AU2008340319A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Wyeth Llc | Genetically modified attenuated vesicular stomatitis virus, compositions and methods of use thereof |
| RU2010151562A (ru) | 2008-06-20 | 2012-07-27 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи (US) | Композиции и способы применения orf1358 из бета-гемолитических стрептококковых штаммов |
| CN107050442B (zh) * | 2008-11-05 | 2022-09-13 | 惠氏有限责任公司 | 用于预防β-溶血链球菌(BHS)疾病的多组分免疫原性组合物 |
| SA114350400B1 (ar) | 2009-06-22 | 2016-05-26 | ويث ال ال سي | تركيبات وطرق لتحضير تركيبات مولدة للمناعة لمقترن بولي سكاريد كبسولي للنمط المصلي 5 و 8 من المكورات العنقودية الذهبية |
| CN102481352A (zh) | 2009-06-22 | 2012-05-30 | 惠氏有限责任公司 | 金黄色葡萄球菌抗原的免疫原性组合物 |
| EP2335730A1 (en) | 2009-12-18 | 2011-06-22 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Fusion polypeptides and their use for prevention and treatment of cancer |
| PT3170508T (pt) | 2010-06-04 | 2020-01-16 | Wyeth Llc | Formulações de vacinas |
| RU2580620C2 (ru) | 2010-08-23 | 2016-04-10 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи | СТАБИЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ АНТИГЕНОВ Neisseria meningitidis rLP2086 |
| WO2012032489A1 (en) | 2010-09-10 | 2012-03-15 | Wyeth Llc | Non-lipidated variants of neisseria meningitidis orf2086 antigens |
| DK2654784T3 (da) | 2010-12-22 | 2017-02-13 | Wyeth Llc | Stabile immunogene sammensætninger af staphylococcus aureus-antigener |
| ITMI20111182A1 (it) | 2011-06-28 | 2012-12-29 | Canio Buonavoglia | Vaccino per coronavirus canino |
| SA115360586B1 (ar) | 2012-03-09 | 2017-04-12 | فايزر انك | تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها |
| CA2865745C (en) | 2012-03-09 | 2018-01-09 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| CN104854128A (zh) | 2012-07-19 | 2015-08-19 | 硕腾有限责任公司 | 牛流感病毒组合物 |
| AU2013295770A1 (en) | 2012-07-27 | 2015-01-29 | Zoetis Services Llc | Tick toxin compositions |
| ES2933127T3 (es) | 2012-12-20 | 2023-02-01 | Pfizer | Procedimiento de glucoconjugación |
| US9724366B2 (en) | 2012-12-30 | 2017-08-08 | Carmel-Haifa University Economic Corporation Ltd | CD11 B[low] macrophages and conditioned media thereof for treating cancer and/or fibrosis |
| US9802987B2 (en) | 2013-03-08 | 2017-10-31 | Pfizer Inc. | Immunogenic fusion polypeptides |
| WO2014151401A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Zoetis Llc | CROSS-PROTECTION OF BOVINES AGAINST B. trehalosi INFECTION BY A MULTI-VALENT VACCINE |
| DE102013004595A1 (de) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Emergent Product Development Germany Gmbh | RSV-Impfstoffe |
| RU2662968C2 (ru) | 2013-09-08 | 2018-07-31 | Пфайзер Инк. | Иммуногенная композиция против neisseria meningitidis (варианты) |
| GB201322626D0 (en) | 2013-12-19 | 2014-02-05 | Immutep S A | Combined preparations for the treatment of cancer |
| WO2016130569A1 (en) | 2015-02-09 | 2016-08-18 | Mj Biologics, Inc. | A composition comprising pedv antigens and methods for making and using the composition |
| ES2702325T3 (es) | 2014-03-11 | 2019-02-28 | Univ Minnesota | Vacunas contra el virus de la diarrea epidémica porcina y métodos de uso de las mismas |
| GB201500374D0 (en) | 2015-01-09 | 2015-02-25 | Immutep S A | Combined preparations for the treatment of cancer |
| AU2016221318B2 (en) | 2015-02-19 | 2020-06-25 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| EP3268380B1 (en) | 2015-03-12 | 2018-12-26 | Zoetis Services LLC | Pyolysin methods and compositions |
| TWI807252B (zh) | 2015-05-04 | 2023-07-01 | 美商輝瑞股份有限公司 | Ｂ型鏈球菌多醣-蛋白質軛合物、製造軛合物之方法、含軛合物之免疫原性組成物、及其用途 |
| BR112018002919B1 (pt) | 2015-08-14 | 2024-02-27 | Zoetis Services Llc | Composição imunogênica eficaz compreendendo uma cepa de mycoplasma bovis e usos da mesma para prevenção de doenças causadas por mycoplasma bovis |
| CA3010977A1 (en) | 2016-01-11 | 2017-07-20 | Zoetis Services Llc | Novel cross protective vaccine compositions for porcine epidemic diarrhea virus |
| WO2017210215A1 (en) | 2016-05-31 | 2017-12-07 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Zika virus vaccine and methods of production |
| CA3037544C (en) | 2016-10-05 | 2021-10-12 | Zoetis Services Llc | Lyophilization methods that provide stably dehydrated protozoans for use as potent live vaccines |
| US10751402B2 (en) | 2016-11-09 | 2020-08-25 | Pfizer Inc. | Immunogenic compositions and uses thereof |
| US10183070B2 (en) | 2017-01-31 | 2019-01-22 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| GB201703529D0 (en) | 2017-03-06 | 2017-04-19 | Cambridge Entpr Ltd | Vaccine composition |
| EP4034157A1 (en) | 2019-09-27 | 2022-08-03 | Pfizer Inc. | Neisseria meningitidis compositions and methods thereof |
| US12570700B2 (en) | 2020-04-17 | 2026-03-10 | Regents Of The University Of Minnesota | SARS-CoV-2 spike receptor binding domain and compositions and methods thereof |
| CA3192786A1 (en) | 2020-08-26 | 2022-03-03 | Pfizer Inc. | Group b streptococcus polysaccharide-protein conjugates, methods for producing conjugates, immunogenic compositions comprising conjugates, and uses thereof |
| EP4241790A1 (en) | 2022-03-07 | 2023-09-13 | InnaTher Gene Therapy S.à.r.l. | Expression system for the treatment of cancer |
| EP4241791A1 (en) | 2022-03-07 | 2023-09-13 | InnaTher Gene Therapy S.à.r.l. | Combined gene and radio therapy for the treatment of cancer |
| JP2025532724A (ja) | 2022-09-29 | 2025-10-03 | ファイザー・インク | Ｒｓｖ ｆタンパク質三量体を含む免疫原性組成物 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4342828A (en) * | 1979-07-20 | 1982-08-03 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Method for producing substance capable of stimulating differentiation and proliferation of human granulopoietic stem cells |
| US4438032A (en) * | 1981-01-30 | 1984-03-20 | The Regents Of The University Of California | Unique T-lymphocyte line and products derived therefrom |
| JPS59137417A (ja) * | 1983-01-28 | 1984-08-07 | Morinaga Milk Ind Co Ltd | 人尿由来コロニ−形成刺激因子及びカリクレインの製造法 |
| JPS59169489A (ja) * | 1983-03-15 | 1984-09-25 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | ヒト培養株化細胞 |
| AU594014B2 (en) * | 1984-03-21 | 1990-03-01 | Research Corporation Technologies, Inc. | Recombinant DNA molecules |
| AU588819B2 (en) * | 1984-10-29 | 1989-09-28 | Immunex Corporation | Cloning of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor gene |
| EP0202300B1 (en) * | 1984-11-20 | 1992-11-11 | Schering Biotech Corporation | Cdna clones coding for polypeptides exhibiting human granulocyte macrophage and eosinophil cellular growth factor activity |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| DE3545568A1 (de) * | 1985-12-21 | 1987-07-16 | Hoechst Ag | Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung |
-
1986
- 1986-07-31 US US06/888,995 patent/US5078996A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-08 AU AU61031/86A patent/AU586876B2/en not_active Expired
- 1986-08-11 DK DK198603829A patent/DK174603B1/da not_active IP Right Cessation
- 1986-08-15 JP JP61191561A patent/JPH0780781B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-15 DE DE8686306304T patent/DE3685918T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-15 EP EP86306304A patent/EP0211684B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-15 CA CA000516034A patent/CA1341142C/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-15 AT AT86306304T patent/ATE77958T1/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK382986D0 (da) | 1986-08-11 |
| EP0211684B1 (en) | 1992-07-08 |
| ATE77958T1 (de) | 1992-07-15 |
| AU6103186A (en) | 1987-02-19 |
| DE3685918D1 (de) | 1992-08-13 |
| DK382986A (da) | 1987-02-17 |
| EP0211684A3 (en) | 1988-06-08 |
| CA1341142C (en) | 2000-11-21 |
| US5078996A (en) | 1992-01-07 |
| DE3685918T2 (de) | 1993-02-04 |
| JPS6289621A (ja) | 1987-04-24 |
| AU586876B2 (en) | 1989-07-27 |
| JPH0780781B2 (ja) | 1995-08-30 |
| EP0211684A2 (en) | 1987-02-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5078996A (en) | Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor | |
| Strieter et al. | Human alveolar macrophage gene expression of interleukin-8 by tumor necrosis factor-α, lipopolysaccharide, and interleukin-1 β | |
| Cavaillon et al. | Cytokine response by monocytes and macrophages to free and lipoprotein-bound lipopolysaccharide | |
| Krishnan et al. | Alveolar macrophages in AIDS patients: increased spontaneous tumour necrosis factor‐alpha production in Pneumocystis carinii pneumonia | |
| Levitz et al. | Production of tumor necrosis factor alpha in human leukocytes stimulated by Cryptococcus neoformans | |
| Standiford et al. | Macrophage inflammatory protein-1 alpha expression in interstitial lung disease. | |
| DK171647B1 (da) | Polypeptid, der er et interleukin-1 alfa-derivat, gen, der koder for polypeptidet, vektor indeholde nde genet, mikroorganisme indeholdende vektoren, og lægemiddel indeholdende polypeptidet | |
| EP0317568B1 (en) | Use of granulocyte macrophage colony stimulating factor to prepare a medicament for treating bacterial infections | |
| US6103234A (en) | Composition comprising an antibody to macrophage-derived inflammatory mediator (MIP-2) | |
| US5925568A (en) | Release and mobilization of haematopoietic cells | |
| DK168048B1 (da) | Renset human interleukin-1, dets fremstilling og anvendelse i farmaceutiske praeparater | |
| US20160122391A1 (en) | Short beta-defensin-derived peptides | |
| JPH04504111A (ja) | ヒトマクロファージ遊走阻止因子 | |
| KR100837898B1 (ko) | 다발성 경화증의 치료에서 사용되는 케모킨 변이체 | |
| Yamaguchi et al. | Haemopoietic growth factors induce human basophil migration in vitro | |
| Maestrelli et al. | The identification and partial characterization of a human mononuclear cell-derived neutrophil chemotactic factor apparently distinct from IL-1, IL-2, GM-CSF, TNF and IFN-gamma | |
| Kapp et al. | Granulocyte-activating mediators (GRAM) II. Generation by human epidermal cells-relation to GM-CSF | |
| HUP0102975A2 (hu) | Kemotaxis-gátló Staphylococcus protein (CHIPS) és annak alkalmazása | |
| KR20160134989A (ko) | 인간 인터류킨-2 단백질을 포함하는 약학조성물 | |
| Launois et al. | IL-6 production in response to purified mycobacterial heat-shock proteins and to antigen 85 in leprosy | |
| SCHRöDER et al. | RANTES, A Novel Eosinophil‐Chemotactic Cytokine | |
| US5703206A (en) | Macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2) | |
| JPH06253832A (ja) | 抗腫瘍性リンホカインの１種であるロイコレギュリン及びその治療用途 | |
| Ananthakrishnan et al. | Studies on the Australia antigen: I. Associations between Australia antigen and leprosy | |
| Nagata et al. | Tumor necrosis factor alpha induces migration of human eosinophils |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |