JPH0780911B2 - 新規ヒトニューロキニン−１レセプター短形 - Google Patents
新規ヒトニューロキニン−１レセプター短形Info
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- JPH0780911B2 JPH0780911B2 JP4124922A JP12492292A JPH0780911B2 JP H0780911 B2 JPH0780911 B2 JP H0780911B2 JP 4124922 A JP4124922 A JP 4124922A JP 12492292 A JP12492292 A JP 12492292A JP H0780911 B2 JPH0780911 B2 JP H0780911B2
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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Description
【０００１】本発明はクローン化ヒトニューロキニン−
１レセプター短形（ヒトＮＫ１ＲｓＦ）及び組換えヒト
ＮＫ１ＲｓＦに関する。J.ヨコタら（ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー、第２６４巻、第１７
６４９頁、１９８９年）〔J. Yokota, et al., J. Bio
l. Chem., 264:17649 (1989) 〕はクローン化ラットニ
ューロキニン−１レセプターについて報告した。N.P.ゲ
ラード（N. P. Gerard) ら（ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー、第２６５巻、第２０４５５
頁、１９９０年）はヒトニューロキニン−２レセプター
について報告した。クローン化ラット及びウシニューロ
キニン−２レセプターも同様に報告された。各々Y.サシ
及びS.ナカニシ（バイオケミカル・アンド・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、第１６５
巻、第６９５頁、１９８９年）〔Y. Sasi, and S. Naka
nishi, Biochem Biophys.Res. Comm., 165:695 (198
9)〕及びY.マスら（ネーチャー、第３２９巻、第８３６
頁、１９８７年）〔Y. Masu, et al., Nature, 329:836
(1987) 〕参照。クローン化ラットニューロキニン−３
レセプターもR.シゲモトら（ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー）第２６５巻、第６２３頁、１
９９０年により報告された。しかしながら、前記文献は
いずれも本発明について開示又は示唆していない。
１レセプター短形（ヒトＮＫ１ＲｓＦ）及び組換えヒト
ＮＫ１ＲｓＦに関する。J.ヨコタら（ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー、第２６４巻、第１７
６４９頁、１９８９年）〔J. Yokota, et al., J. Bio
l. Chem., 264:17649 (1989) 〕はクローン化ラットニ
ューロキニン−１レセプターについて報告した。N.P.ゲ
ラード（N. P. Gerard) ら（ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー、第２６５巻、第２０４５５
頁、１９９０年）はヒトニューロキニン−２レセプター
について報告した。クローン化ラット及びウシニューロ
キニン−２レセプターも同様に報告された。各々Y.サシ
及びS.ナカニシ（バイオケミカル・アンド・バイオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーションズ、第１６５
巻、第６９５頁、１９８９年）〔Y. Sasi, and S. Naka
nishi, Biochem Biophys.Res. Comm., 165:695 (198
9)〕及びY.マスら（ネーチャー、第３２９巻、第８３６
頁、１９８７年）〔Y. Masu, et al., Nature, 329:836
(1987) 〕参照。クローン化ラットニューロキニン−３
レセプターもR.シゲモトら（ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー）第２６５巻、第６２３頁、１
９９０年により報告された。しかしながら、前記文献は
いずれも本発明について開示又は示唆していない。
【０００２】サブスタンスＰはタキキニン群のペプチド
に属する天然ウンデカペプチドである。サブスタンスＰ
（サブスタンスＰ）は哺乳動物で産生される薬理学上活
性な神経ペプチドである。その特徴的アミノ酸配列は米
国特許第4,680,283 号明細書に示されている。当業界で
周知のように、サブスタンスＰ及び他のタキキニンは多
くの疾患の病態生理に関与している。サブスタンスＰは
痛み又は片頭痛の伝達〔B. E. B.サンドバーグら、ジャ
ーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、第２５
巻、第１００９頁、１９８２年（B. E. B. Sandberg et
al., Journal ofMedicinal Chemistry, Vol. 25, p.10
09 (1982)）参照〕並びに不安症及び精神分裂病のよう
な中枢神経系障害、喘息のような呼吸疾患及びリウマチ
様関節炎のような炎症疾患、潰瘍性腸炎及びクローン病
等のようなＧＩ管の胃腸障害及び疾患〔D.レゴリ、“群
発性頭痛に関する動向”、F.シクテリら編集、エルセビ
ア・サイエンティフィック・パブリッシャーズ、アムス
テルダム、１９８７年、第８５−９５頁（D. Regoli in
"Trends in Cluster Headache," edited by F. Sicute
ri et al., Elsevier Scientific Publishers, Amsterd
am, 1987, pp. 85-95)参照〕に関与することが示されて
いる。
に属する天然ウンデカペプチドである。サブスタンスＰ
（サブスタンスＰ）は哺乳動物で産生される薬理学上活
性な神経ペプチドである。その特徴的アミノ酸配列は米
国特許第4,680,283 号明細書に示されている。当業界で
周知のように、サブスタンスＰ及び他のタキキニンは多
くの疾患の病態生理に関与している。サブスタンスＰは
痛み又は片頭痛の伝達〔B. E. B.サンドバーグら、ジャ
ーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー、第２５
巻、第１００９頁、１９８２年（B. E. B. Sandberg et
al., Journal ofMedicinal Chemistry, Vol. 25, p.10
09 (1982)）参照〕並びに不安症及び精神分裂病のよう
な中枢神経系障害、喘息のような呼吸疾患及びリウマチ
様関節炎のような炎症疾患、潰瘍性腸炎及びクローン病
等のようなＧＩ管の胃腸障害及び疾患〔D.レゴリ、“群
発性頭痛に関する動向”、F.シクテリら編集、エルセビ
ア・サイエンティフィック・パブリッシャーズ、アムス
テルダム、１９８７年、第８５−９５頁（D. Regoli in
"Trends in Cluster Headache," edited by F. Sicute
ri et al., Elsevier Scientific Publishers, Amsterd
am, 1987, pp. 85-95)参照〕に関与することが示されて
いる。
【０００３】本発明は体液中におけるサブスタンスＰ活
性を測定するために使用できるアッセイプロトコールに
も関する。そのアッセイはサブスタンスＰレセプターと
結合する物質を同定及び評価する上でも使用できる。こ
のため、そのアッセイはサブスタンスＰ拮抗剤を同定し
てそれらの結合親和性を評価するために使用できる。他
の方法としてはM.A.カシエリ（M. A. Cascieri) ら（ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２
５８−５２５８頁、１９８３年）により記載されたもの
がある。このような方法の使用により、サブスタンスＰ
拮抗剤が同定された。例えば、R.M.スナイダーら（サイ
エンス、第２５１巻、第４３５頁、１９９１年１月）
〔R. M. Snider, et al., Science, 251:435 (Jan. 199
1)〕及びS.マクリーン（S. McLean)ら（サイエンス、第
２５１巻、第４３７頁、１９９１年１月）参照。更に、
参考のためここに組込まれる１９９０年５月３１日付で
公開された国際出願ＷＯ第９０／０５５２５号明細書参
照。現在までの方法は、動物レセプター（動物ＮＫ１
Ｒ、ＮＫ２Ｒ又はＮＫ３Ｒ）活性がヒトニューロキニン
−１レセプターを正確に反映していないために、部分的
に劣ることがわかった。更に、この開示前にはヒトＮＫ
１Ｒは精製された形で又はＮＫ２Ｒ及び／又はＮＫ３Ｒ
から実質上単離された形では入手できなかった。このよ
うなニューロキニンレセプター源を使用してはヒトＮＫ
１Ｒ、特にＮＫ１ＲｓＦに関する親和性を正確に表すこ
とができない。
性を測定するために使用できるアッセイプロトコールに
も関する。そのアッセイはサブスタンスＰレセプターと
結合する物質を同定及び評価する上でも使用できる。こ
のため、そのアッセイはサブスタンスＰ拮抗剤を同定し
てそれらの結合親和性を評価するために使用できる。他
の方法としてはM.A.カシエリ（M. A. Cascieri) ら（ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２
５８−５２５８頁、１９８３年）により記載されたもの
がある。このような方法の使用により、サブスタンスＰ
拮抗剤が同定された。例えば、R.M.スナイダーら（サイ
エンス、第２５１巻、第４３５頁、１９９１年１月）
〔R. M. Snider, et al., Science, 251:435 (Jan. 199
1)〕及びS.マクリーン（S. McLean)ら（サイエンス、第
２５１巻、第４３７頁、１９９１年１月）参照。更に、
参考のためここに組込まれる１９９０年５月３１日付で
公開された国際出願ＷＯ第９０／０５５２５号明細書参
照。現在までの方法は、動物レセプター（動物ＮＫ１
Ｒ、ＮＫ２Ｒ又はＮＫ３Ｒ）活性がヒトニューロキニン
−１レセプターを正確に反映していないために、部分的
に劣ることがわかった。更に、この開示前にはヒトＮＫ
１Ｒは精製された形で又はＮＫ２Ｒ及び／又はＮＫ３Ｒ
から実質上単離された形では入手できなかった。このよ
うなニューロキニンレセプター源を使用してはヒトＮＫ
１Ｒ、特にＮＫ１ＲｓＦに関する親和性を正確に表すこ
とができない。
【０００４】本発明にはポリメラーゼ連鎖反応技術（Ｐ
ＣＲ）で製造された組換えヒトニューロキニン−１レセ
プター短形（ヒトＮＫ１ＲｓＦ）が開示されている。ヒ
トＮＫ１ＲｓＦ相補的ＤＮＡの完全配列；ＣＨＯ（チャ
イニーズハムスター卵巣細胞系）安定発現系を含めた発
現系；及びＣＨＯ発現系を用いるアッセイも開示されて
いる。ＮＫ１ＲｓＦはサブスタンスＰレセプターと結合
するものを同定及び評価するアッセイに用いることがで
きる。そのアッセイは関節炎患者における診断及び治療
においてサブスタンスＰの体液濃度を測定するため用い
ることもできる。
ＣＲ）で製造された組換えヒトニューロキニン−１レセ
プター短形（ヒトＮＫ１ＲｓＦ）が開示されている。ヒ
トＮＫ１ＲｓＦ相補的ＤＮＡの完全配列；ＣＨＯ（チャ
イニーズハムスター卵巣細胞系）安定発現系を含めた発
現系；及びＣＨＯ発現系を用いるアッセイも開示されて
いる。ＮＫ１ＲｓＦはサブスタンスＰレセプターと結合
するものを同定及び評価するアッセイに用いることがで
きる。そのアッセイは関節炎患者における診断及び治療
においてサブスタンスＰの体液濃度を測定するため用い
ることもできる。
【０００５】以下本発明を詳細に説明する。本発明の一
態様はヒトニューロキニン−１レセプター短形に関し、
そのレセプターは他のヒトレセプタータンパク質を含ま
ない。１クラスにおいて、この態様は他のヒトタンパク
質を含まないヒトニューロキニン−１レセプター短形に
関する。このクラス内で、この態様はグリオブラストー
マのようなヒト細胞からのヒトニューロキニン−１レセ
プター短形に関し、そのレセプターは他のタンパク質を
含まないものである。第二のクラスにおいて、この態様
は図１及び図２で示された３１１アミノ酸配列からなる
タンパク質に関するが、そのタンパク質は他のヒトレセ
プタータンパク質を含まない。第二クラス内で、この態
様は図１及び図２で示されるような３１１アミノ酸配列
であるタンパク質に関する。第一態様は細胞ニューロキ
ニン−１レセプター短形へのサブスタンスＰの結合を阻
害するための医薬組成物にも関するが、その組成物は有
効量のニューロキニン−１レセプター短形を含む。第一
態様はこのような阻害の必要な患者において細胞ヒトニ
ューロキニン−１レセプター短形へのサブスタンスＰの
結合を阻害するための方法にも関し、その方法は有効量
のヒトニューロキニン−１レセプター短形を投与するこ
とを包含する。インビボでのニューロキニン−１レセプ
ター短形へのサブスタンスＰの結合に拮抗することよう
な医薬組成物及び方法の使用は、参考のためここに組込
まれる、例えばR.M.スナイダーら（サイエンス、第２５
１巻、第４３５頁、１９９１年１月）；S.マクリーンら
（サイエンス・第２５１巻、第４３７頁、１９９１年１
月）；１９９０年５月３１日付で公開された国際出願Ｗ
Ｏ第９０／０５５２５号明細書により開示されている。
ヒトニューロキニンレセプター短形の効果的量を投与す
ることは基本的に同一の手法で行なわれる。
態様はヒトニューロキニン−１レセプター短形に関し、
そのレセプターは他のヒトレセプタータンパク質を含ま
ない。１クラスにおいて、この態様は他のヒトタンパク
質を含まないヒトニューロキニン−１レセプター短形に
関する。このクラス内で、この態様はグリオブラストー
マのようなヒト細胞からのヒトニューロキニン−１レセ
プター短形に関し、そのレセプターは他のタンパク質を
含まないものである。第二のクラスにおいて、この態様
は図１及び図２で示された３１１アミノ酸配列からなる
タンパク質に関するが、そのタンパク質は他のヒトレセ
プタータンパク質を含まない。第二クラス内で、この態
様は図１及び図２で示されるような３１１アミノ酸配列
であるタンパク質に関する。第一態様は細胞ニューロキ
ニン−１レセプター短形へのサブスタンスＰの結合を阻
害するための医薬組成物にも関するが、その組成物は有
効量のニューロキニン−１レセプター短形を含む。第一
態様はこのような阻害の必要な患者において細胞ヒトニ
ューロキニン−１レセプター短形へのサブスタンスＰの
結合を阻害するための方法にも関し、その方法は有効量
のヒトニューロキニン−１レセプター短形を投与するこ
とを包含する。インビボでのニューロキニン−１レセプ
ター短形へのサブスタンスＰの結合に拮抗することよう
な医薬組成物及び方法の使用は、参考のためここに組込
まれる、例えばR.M.スナイダーら（サイエンス、第２５
１巻、第４３５頁、１９９１年１月）；S.マクリーンら
（サイエンス・第２５１巻、第４３７頁、１９９１年１
月）；１９９０年５月３１日付で公開された国際出願Ｗ
Ｏ第９０／０５５２５号明細書により開示されている。
ヒトニューロキニンレセプター短形の効果的量を投与す
ることは基本的に同一の手法で行なわれる。
【０００６】第二態様はヒトニューロキニンレセプター
をコードするＤＮＡ配列、その相補的ＤＮＡに関する
が、そのＤＮＡ、配列は他のヒトＤＮＡ配列を含まな
い。当業者にとり明らかなように、特定のアミノ酸に翻
訳されるコドンの組には相当の重複性が存在する。した
がって、本発明にはＤＮＡ配列に従って翻訳されたアミ
ノ酸配列が変らないようにコドンが別のコドンで置き換
えられた他の塩基配列も含む。本明細書の目的から、１
以上のこのような置換されたコドンを有する配列は縮重
変異体として定義される。当業者が機能性に影響を与え
ないと考える、ロイシンに代わるバリン、リジンに代わ
るアルギニン及びグルタミンに代わるアスパラギンのよ
うな変異（個々のアミノ酸の交換）も含まれる。本発明
の第二態様の１クラスは図３で示されるようにヌクレオ
チド１２３で始まりヌクレオチド１０５５で終わる相補
的ＤＮＡのヌクレオチド配列に関する。第二態様のこの
クラスには配列番号１
をコードするＤＮＡ配列、その相補的ＤＮＡに関する
が、そのＤＮＡ、配列は他のヒトＤＮＡ配列を含まな
い。当業者にとり明らかなように、特定のアミノ酸に翻
訳されるコドンの組には相当の重複性が存在する。した
がって、本発明にはＤＮＡ配列に従って翻訳されたアミ
ノ酸配列が変らないようにコドンが別のコドンで置き換
えられた他の塩基配列も含む。本明細書の目的から、１
以上のこのような置換されたコドンを有する配列は縮重
変異体として定義される。当業者が機能性に影響を与え
ないと考える、ロイシンに代わるバリン、リジンに代わ
るアルギニン及びグルタミンに代わるアスパラギンのよ
うな変異（個々のアミノ酸の交換）も含まれる。本発明
の第二態様の１クラスは図３で示されるようにヌクレオ
チド１２３で始まりヌクレオチド１０５５で終わる相補
的ＤＮＡのヌクレオチド配列に関する。第二態様のこの
クラスには配列番号１
【化６】 又はその縮重変異体を更に含むＤＮＡ配列がある。本発
明の第二態様は図３で示されたような相補的ＤＮＡの部
分的ヌクレオチド配列又はその縮重変異体に関する。本
発明の第三態様はヒトニューロキニン−１レセプター短
形の発現系に関する。
明の第二態様は図３で示されたような相補的ＤＮＡの部
分的ヌクレオチド配列又はその縮重変異体に関する。本
発明の第三態様はヒトニューロキニン−１レセプター短
形の発現系に関する。
【０００７】本発明のこの第三態様の１クラスは： (a) ｐＲｃＣＭＶのような哺乳動物発現ベクター及び (b) ヒトニューロキニン−１レセプター短形タンパク質
をコードする塩基配列からなるプラスミドに関する。第
三態様のこのクラスにおいて、ニューロキニン−１レセ
プター短形をコードする塩基配列は図３で示されたよう
にヌクレオチド１２３で始まりヌクレオチド１０５５で
終わる相補的ＤＮＡのヌクレオチド配列を包含する。本
発明のこの第三態様の第二クラスはサル腎臓細胞系（Ｃ
ＯＳ）におけるヒトニューロキニン−１レセプター短形
（ＮＫ１Ｒ）の一過性発現用の系に関する。このシステ
ムはヒトニューロキニンレセプター短形（ヒトＮＫ１Ｒ
ｓＦ）ｃＤＮＡを含むベクターからなる。本発明のこの
第三態様の第三クラスはチャイニーズハムスター卵巣細
胞系（ＣＨＯ）におけるヒトニューロキニン−１レセプ
ター短形発現用の系に関し、その系はヒトニューロキニ
ンレセプター（ＮＫ１ＲｓＦ）ｃＤＮＡを含むベクター
からなる。第三態様のこのクラスには、発現系が： (a) ｐＲｃＣＭＶのような哺乳動物発現ベクター及び (b) ヒトニューロキニン−１レセプター短形タンパク質
をコードする塩基配列、からなるプラスミドを含むサブ
クラスがある。このサブクラスにおいて、ニューロキニ
ン−１レセプター短形発現システムはニューロキニン−
１レセプター短形をコードする塩基配列は図３で示され
たようにヌクレオチド１２３で始まりヌクレオチド１０
５５で終わる相補的ＤＮＡのヌクレオチド配列を包含し
する。
をコードする塩基配列からなるプラスミドに関する。第
三態様のこのクラスにおいて、ニューロキニン−１レセ
プター短形をコードする塩基配列は図３で示されたよう
にヌクレオチド１２３で始まりヌクレオチド１０５５で
終わる相補的ＤＮＡのヌクレオチド配列を包含する。本
発明のこの第三態様の第二クラスはサル腎臓細胞系（Ｃ
ＯＳ）におけるヒトニューロキニン−１レセプター短形
（ＮＫ１Ｒ）の一過性発現用の系に関する。このシステ
ムはヒトニューロキニンレセプター短形（ヒトＮＫ１Ｒ
ｓＦ）ｃＤＮＡを含むベクターからなる。本発明のこの
第三態様の第三クラスはチャイニーズハムスター卵巣細
胞系（ＣＨＯ）におけるヒトニューロキニン−１レセプ
ター短形発現用の系に関し、その系はヒトニューロキニ
ンレセプター（ＮＫ１ＲｓＦ）ｃＤＮＡを含むベクター
からなる。第三態様のこのクラスには、発現系が： (a) ｐＲｃＣＭＶのような哺乳動物発現ベクター及び (b) ヒトニューロキニン−１レセプター短形タンパク質
をコードする塩基配列、からなるプラスミドを含むサブ
クラスがある。このサブクラスにおいて、ニューロキニ
ン−１レセプター短形発現システムはニューロキニン−
１レセプター短形をコードする塩基配列は図３で示され
たようにヌクレオチド１２３で始まりヌクレオチド１０
５５で終わる相補的ＤＮＡのヌクレオチド配列を包含し
する。
【０００８】本発明の第四態様は、ヒトニューロキニン
−１レセプター短形および／またはＮＫ１ＲｓＦに対す
る試験サンプルの結合親和性を測定するために前記発現
系のいずれかを用いる方法に関する。１クラスにおい
て、この態様は： (a) ｐＲｃＣＭＶのようなほ乳類発現ベクター及び (b) ヒトニューロキニン−１レセプター短形タンパク質
についてコードする塩基配列からなるプラスミドを移植
されたチャイニーズハムスター卵巣細胞系を用いる方法
に関し、その方法は： (1) 上記ＣＨＯ細胞でヒトニューロキニン−１レセプタ
ー短形を発現させる； (2) 125Ｉ−サブスタンスＰ及び上記細胞含有溶液に試
験サンプルを加える； (3) 工程１の産物をインキュベートする（そのインキュ
ベートで上記ヒトニューロキニン−１レセプター短形を
発現させる上で有効であり、しかも上記ヒトニューロキ
ニン−１レセプター短形への上記 125Ｉ−サブスタンス
Ｐ及び上記試験サンプルの競合的結合を起させる）； (4) 上記ヒトニューロキニン−１レセプター短形に競合
した上記 125Ｉ−サブスタンスＰを、結合していない上
記 125Ｉ−サブスタンスＰから分離する； (5) 上記ヒトニューロキニン−１レセプター短形に結合
した上記 125Ｉ−サブスタンスＰの放射能を測定する。
−１レセプター短形および／またはＮＫ１ＲｓＦに対す
る試験サンプルの結合親和性を測定するために前記発現
系のいずれかを用いる方法に関する。１クラスにおい
て、この態様は： (a) ｐＲｃＣＭＶのようなほ乳類発現ベクター及び (b) ヒトニューロキニン−１レセプター短形タンパク質
についてコードする塩基配列からなるプラスミドを移植
されたチャイニーズハムスター卵巣細胞系を用いる方法
に関し、その方法は： (1) 上記ＣＨＯ細胞でヒトニューロキニン−１レセプタ
ー短形を発現させる； (2) 125Ｉ−サブスタンスＰ及び上記細胞含有溶液に試
験サンプルを加える； (3) 工程１の産物をインキュベートする（そのインキュ
ベートで上記ヒトニューロキニン−１レセプター短形を
発現させる上で有効であり、しかも上記ヒトニューロキ
ニン−１レセプター短形への上記 125Ｉ−サブスタンス
Ｐ及び上記試験サンプルの競合的結合を起させる）； (4) 上記ヒトニューロキニン−１レセプター短形に競合
した上記 125Ｉ−サブスタンスＰを、結合していない上
記 125Ｉ−サブスタンスＰから分離する； (5) 上記ヒトニューロキニン−１レセプター短形に結合
した上記 125Ｉ−サブスタンスＰの放射能を測定する。
【０００９】第二クラスにおいて、この態様は： (a) ｐＲｃＣＭＶのようなほ乳類発現ベクター及び (b) ヒトニューロキニン−１レセプター短形タンパク質
をコードする塩基配列からなるプラスミドを移植された
サル腎臓細胞（ＣＯＳ）を用いる方法に関し、 その方法は： (1) 上記ＣＯＳ細胞でヒトニューロキニン−１レセプタ
ー短形を発現させる； (2) 125 Ｉ−サブスタンスＰと該細胞を含む溶液に試験
サンプルを加える。 (3) 工程（2)の産物をインキュベートっする。このイン
キュベーションは該ヒトニューロキニンレセプター短形
を発現させ、125 Ｉ−サブスタンスＰと試験サンプルを
ヒトニューロキニンレセプター短形に競合的に結合させ
るのに効果的である； (4) ヒトニューロキニンレセプター短形に結合した125
Ｉ−サブスタンスＰと結合しなかった125 Ｉ−サブスタ
ンスＰとを分離する； (5) ヒトニューロキニンレセプター短形に結合した125
Ｉ−サブスタンスＰの放射活性を測定する。
をコードする塩基配列からなるプラスミドを移植された
サル腎臓細胞（ＣＯＳ）を用いる方法に関し、 その方法は： (1) 上記ＣＯＳ細胞でヒトニューロキニン−１レセプタ
ー短形を発現させる； (2) 125 Ｉ−サブスタンスＰと該細胞を含む溶液に試験
サンプルを加える。 (3) 工程（2)の産物をインキュベートっする。このイン
キュベーションは該ヒトニューロキニンレセプター短形
を発現させ、125 Ｉ−サブスタンスＰと試験サンプルを
ヒトニューロキニンレセプター短形に競合的に結合させ
るのに効果的である； (4) ヒトニューロキニンレセプター短形に結合した125
Ｉ−サブスタンスＰと結合しなかった125 Ｉ−サブスタ
ンスＰとを分離する； (5) ヒトニューロキニンレセプター短形に結合した125
Ｉ−サブスタンスＰの放射活性を測定する。
【００１０】第三クラスにおいて、この態様は： (a) ｐＲｃＣＭＶのようなほ乳類発現ベクター及び (b) ヒトニューロキニン−１レセプター短形タンパク質
をコードする塩基配列からなるプラスミドを移植された
チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯ）を用いる
方法に関し、その方法は： (1) 上記ＣＨＯ細胞でヒトニューロキニン−１レセプタ
ー短形を発現させる； (2) 工程（1)の産物を 3Ｈ−ミオイノシトールで平衡化
する； (3) 工程（2)の産物を洗浄する； (4) １０mM LiCl存在下で工程（3)の産物を試験サンプ
ルと共にインキュベートし、イノシトールモノホスフェ
ートを産生させる； (5) イノシトールモノホスフェートを測定する。
をコードする塩基配列からなるプラスミドを移植された
チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯ）を用いる
方法に関し、その方法は： (1) 上記ＣＨＯ細胞でヒトニューロキニン−１レセプタ
ー短形を発現させる； (2) 工程（1)の産物を 3Ｈ−ミオイノシトールで平衡化
する； (3) 工程（2)の産物を洗浄する； (4) １０mM LiCl存在下で工程（3)の産物を試験サンプ
ルと共にインキュベートし、イノシトールモノホスフェ
ートを産生させる； (5) イノシトールモノホスフェートを測定する。
【００１１】概観すると、本発明はヒトニューロキニン
−１レセプター短形（ヒトＮＫ１ＲｓＦ）相補的ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）をそのタンパク質配列又は遺伝子配列につ
いての予備知識なしに単離する方法を記載している。ヒ
トＮＫ１ＲｓＦは神経伝達物質のサブスタンスＰに関す
る膜レセプターである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）技術をヒトＮＫ１ＲｃＤＮＡの単離に用いた。その
アプローチにおいて、本出願人らがヒトＮＫ１Ｒに類似
していると考えたラットＮＫ１Ｒの領域を確認し、それ
らの領域に相当するオリゴヌクレオチドプライマーをデ
ザインして、ＰＣＲ増幅をヒト細胞からＮＫ１ＲｃＤＮ
ＡｓＦの一部を得るために行い、そのＤＮＡ配列を決定
した。ヒトＮＫ１ｓＦＲｃＤＮＡの残りの部分はヒトＮ
Ｋ１ＲｓＦｃＤＮＡの前記配列情報を利用してヒトｃＤ
ＮＡライブラリーから得られた。
−１レセプター短形（ヒトＮＫ１ＲｓＦ）相補的ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ）をそのタンパク質配列又は遺伝子配列につ
いての予備知識なしに単離する方法を記載している。ヒ
トＮＫ１ＲｓＦは神経伝達物質のサブスタンスＰに関す
る膜レセプターである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）技術をヒトＮＫ１ＲｃＤＮＡの単離に用いた。その
アプローチにおいて、本出願人らがヒトＮＫ１Ｒに類似
していると考えたラットＮＫ１Ｒの領域を確認し、それ
らの領域に相当するオリゴヌクレオチドプライマーをデ
ザインして、ＰＣＲ増幅をヒト細胞からＮＫ１ＲｃＤＮ
ＡｓＦの一部を得るために行い、そのＤＮＡ配列を決定
した。ヒトＮＫ１ｓＦＲｃＤＮＡの残りの部分はヒトＮ
Ｋ１ＲｓＦｃＤＮＡの前記配列情報を利用してヒトｃＤ
ＮＡライブラリーから得られた。
【００１２】ヒトＮＫ１ＲｓＦｃＤＮＡの完全配列を決
定し、それがコードするタンパク質配列が求められた。
特に、このような配列情報は新規サブスタンスＰ拮抗剤
を開発するプロセスで有用である。３種の異種発現系が
クローン化ヒトＮＫ１ＲｓＦｃＤＮＡを発現させるため
に用いられた。アフリカツメガエル卵母細胞発現系では
ヒトＮＫ１Ｒｓの生理学的機能を調べることができる。
ＣＯＳ（サル腎臓細胞系）発現系はヒトＮＫ１Ｒｓのリ
ガンド結合性を測定するために用いることができる。Ｃ
ＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）安定発現系
は、サブスタンスＰレセプターと結合する潜在的治療剤
又は他の物質を同定するための天然産物のスクリーニン
グに適している。この細胞系は関節炎患者におけるサブ
スタンスＰの体液濃度を測定するためのアッセイキット
としても使用できる。アッセイプロトコールではサブス
タンスＰ拮抗剤の結合親和性及び拮抗活性を測定するた
めに、異種発現されたヒトＮＫ１Ｒｓを用いる。
定し、それがコードするタンパク質配列が求められた。
特に、このような配列情報は新規サブスタンスＰ拮抗剤
を開発するプロセスで有用である。３種の異種発現系が
クローン化ヒトＮＫ１ＲｓＦｃＤＮＡを発現させるため
に用いられた。アフリカツメガエル卵母細胞発現系では
ヒトＮＫ１Ｒｓの生理学的機能を調べることができる。
ＣＯＳ（サル腎臓細胞系）発現系はヒトＮＫ１Ｒｓのリ
ガンド結合性を測定するために用いることができる。Ｃ
ＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞系）安定発現系
は、サブスタンスＰレセプターと結合する潜在的治療剤
又は他の物質を同定するための天然産物のスクリーニン
グに適している。この細胞系は関節炎患者におけるサブ
スタンスＰの体液濃度を測定するためのアッセイキット
としても使用できる。アッセイプロトコールではサブス
タンスＰ拮抗剤の結合親和性及び拮抗活性を測定するた
めに、異種発現されたヒトＮＫ１Ｒｓを用いる。
【００１３】1) ヒトＮＫ１ＲｓＦｃＤＮＡの単離 当業者には評価されるであろうが、これまでＮＫ１Ｒは
単一形で存在すると信じられてきた。したがって、単一
ＭＫ１Ｒ型を単離するような作戦をとった。驚くべきこ
とに、発明者は完全長のＮＫＲ１とＮＫＲ１短形の両方
を発見した。後者はこれまで知られていないレセプター
のサブタイプを構成すると考えられる。ヒトＮＫ１Ｒｃ
ＤＮＡをその配列情報の非存在下で単離するため、３工
程で３種の別々の、しかしオーバーラップするｃＤＮＡ
クローンを得る方法を開発した。（ｉ）我々はヒトＮＫ
１Ｒｓの中心コア領域をコードするｃＤＮＡクローンを
単離するため同種クローニング戦略〔オハラら、１９８
９年、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Proc. Nat. Acad. Sci)、第８
６巻、第５６７３−５６７７頁〕を採用したが、但しそ
の際にヒトＮＫ１Ｒｓ配列はある領域においてラットＮ
Ｋ１Ｒの公表された配列（ヨコタら、１９８９年、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６
４巻、第１７６４９−１７６５２頁）に類似しており、
そこで適切なＰＣＲプライマーがデザインできると仮定
した。ヒトｍＲＮＡからヒトＮＫ１Ｒの中心膜貫通コア
領域をコードするｃＤＮＡを得るためラットの配列に相
当する縮重プライマーを用いてＰＣＲ増幅〔ムリス及び
ファルーナ、１９８７年、メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー、第１５５巻、第３３５頁（Mullis and Faloon
a, 1987，Meth. Enzymol., 155:335)〕を行った。（ii)
ヒトＮＫ１Ｒにおけるコア領域の配列を決定した後、
ヒト配列に相当する新規プライマーがデザインされ、第
二相同ＰＣＲ増幅がラットＮＫ１ＲｓＦのＮ末端配列に
相当する縮重プライマーと共にコア領域におけるヒトプ
ライマーを用いて行われた。こうしてヒトＮＫ１ＲのＮ
末端領域をコードするｃＤＮＡがヒトｍＲＮＡから得ら
れ、その配列が決定された。（iii)アンカー化ＰＣＲ戦
略がヒトＮＫ１ＲのＣ末端領域についてコードするｃＤ
ＮＡを単離するために開発されたが、その方法ではヒト
ＮＫ１ＲｓＦのコア領域に相当するプライマーとクロー
ニングベクターの配列に相当するプライマーと共に用い
てヒトｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを得た。この
作戦を用いＮＫ１ＲとＮＫ１ＲｓＦの両方が単離され
た。ヒトＮＫ１ＲｓＦをコードするｃＤＮＡの真正さに
ついて確認するため、５′及び３′の非翻訳領域からの
プライマーを用いて独立ＰＣＲ増幅を行って単一工程で
全鎖長ｃＤＮＡを得た。
単一形で存在すると信じられてきた。したがって、単一
ＭＫ１Ｒ型を単離するような作戦をとった。驚くべきこ
とに、発明者は完全長のＮＫＲ１とＮＫＲ１短形の両方
を発見した。後者はこれまで知られていないレセプター
のサブタイプを構成すると考えられる。ヒトＮＫ１Ｒｃ
ＤＮＡをその配列情報の非存在下で単離するため、３工
程で３種の別々の、しかしオーバーラップするｃＤＮＡ
クローンを得る方法を開発した。（ｉ）我々はヒトＮＫ
１Ｒｓの中心コア領域をコードするｃＤＮＡクローンを
単離するため同種クローニング戦略〔オハラら、１９８
９年、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス（Proc. Nat. Acad. Sci)、第８
６巻、第５６７３−５６７７頁〕を採用したが、但しそ
の際にヒトＮＫ１Ｒｓ配列はある領域においてラットＮ
Ｋ１Ｒの公表された配列（ヨコタら、１９８９年、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２６
４巻、第１７６４９−１７６５２頁）に類似しており、
そこで適切なＰＣＲプライマーがデザインできると仮定
した。ヒトｍＲＮＡからヒトＮＫ１Ｒの中心膜貫通コア
領域をコードするｃＤＮＡを得るためラットの配列に相
当する縮重プライマーを用いてＰＣＲ増幅〔ムリス及び
ファルーナ、１９８７年、メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー、第１５５巻、第３３５頁（Mullis and Faloon
a, 1987，Meth. Enzymol., 155:335)〕を行った。（ii)
ヒトＮＫ１Ｒにおけるコア領域の配列を決定した後、
ヒト配列に相当する新規プライマーがデザインされ、第
二相同ＰＣＲ増幅がラットＮＫ１ＲｓＦのＮ末端配列に
相当する縮重プライマーと共にコア領域におけるヒトプ
ライマーを用いて行われた。こうしてヒトＮＫ１ＲのＮ
末端領域をコードするｃＤＮＡがヒトｍＲＮＡから得ら
れ、その配列が決定された。（iii)アンカー化ＰＣＲ戦
略がヒトＮＫ１ＲのＣ末端領域についてコードするｃＤ
ＮＡを単離するために開発されたが、その方法ではヒト
ＮＫ１ＲｓＦのコア領域に相当するプライマーとクロー
ニングベクターの配列に相当するプライマーと共に用い
てヒトｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを得た。この
作戦を用いＮＫ１ＲとＮＫ１ＲｓＦの両方が単離され
た。ヒトＮＫ１ＲｓＦをコードするｃＤＮＡの真正さに
ついて確認するため、５′及び３′の非翻訳領域からの
プライマーを用いて独立ＰＣＲ増幅を行って単一工程で
全鎖長ｃＤＮＡを得た。
【００１４】2) クローン化ヒトＮＫ１ＲｓＦの発現 ３種の発現系がクローン化ヒトＮＫ１ＲｓＦのために開
発された。アフリカツメガエル卵母細胞における一過性
発現がクローン化ｃＤＮＡからのインビトロ転写ｍＲＮ
Ａの顕微注入から生じた〔ミシガン州、アナーバー、ゼ
ノパス・ワン（XENOPUS ONE)からのアフリカツメガエ
ル〕。この系ではリガンド結合によるＮＫ１ＲｓＦ活性
化の生物学的効果を調べることができる。もう１つの一
過性発現系であるＣＯＳ（サル腎臓細胞系、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５１、ＡＴＣＣロックビルＭＤ）における発
現は哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ）中へウイルスプロ
モーターのコントロール下にあるクローン化ｃＤＮＡを
トランスフェクトした結果である。トランスフェクトさ
れた細胞は様々なリガンドに対するヒトＮＫ１ＲｓＦの
結合親和性の測定に適している。哺乳動物細胞（例え
ば、ＣＨＯ、チャイニーズハムスター卵巣細胞系、ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ９０９６、ＡＴＣＣロックビルＭＤ）にお
けるヒトＮＫ１ＲｓＦの安定発現は宿主細胞の染色体中
へトランスフェクトされたｃＤＮＡが組込まれて得られ
た。これらの安定な細胞系はクローン化ヒトＮＫ１Ｒｓ
Ｆを構成的に発現しており、無限に増殖させることがで
きる。したがって、安定発現系は大規模薬物スクリーニ
ングにとって非常に有用であり、患者のバイオプシーサ
ンプル中における物質濃度Ｐを測定するために用いるこ
とができる。
発された。アフリカツメガエル卵母細胞における一過性
発現がクローン化ｃＤＮＡからのインビトロ転写ｍＲＮ
Ａの顕微注入から生じた〔ミシガン州、アナーバー、ゼ
ノパス・ワン（XENOPUS ONE)からのアフリカツメガエ
ル〕。この系ではリガンド結合によるＮＫ１ＲｓＦ活性
化の生物学的効果を調べることができる。もう１つの一
過性発現系であるＣＯＳ（サル腎臓細胞系、ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１６５１、ＡＴＣＣロックビルＭＤ）における発
現は哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ）中へウイルスプロ
モーターのコントロール下にあるクローン化ｃＤＮＡを
トランスフェクトした結果である。トランスフェクトさ
れた細胞は様々なリガンドに対するヒトＮＫ１ＲｓＦの
結合親和性の測定に適している。哺乳動物細胞（例え
ば、ＣＨＯ、チャイニーズハムスター卵巣細胞系、ＡＴ
ＣＣ ＣＲＬ９０９６、ＡＴＣＣロックビルＭＤ）にお
けるヒトＮＫ１ＲｓＦの安定発現は宿主細胞の染色体中
へトランスフェクトされたｃＤＮＡが組込まれて得られ
た。これらの安定な細胞系はクローン化ヒトＮＫ１Ｒｓ
Ｆを構成的に発現しており、無限に増殖させることがで
きる。したがって、安定発現系は大規模薬物スクリーニ
ングにとって非常に有用であり、患者のバイオプシーサ
ンプル中における物質濃度Ｐを測定するために用いるこ
とができる。
【００１５】クローン化ヒトＮＫ１ＲｓＦを発現する安
定細胞系を確立するため、そのｃＤＮＡをベクターｐＲ
ｃＣＭＶ〔インビトロゲン（INVITROGEN）〕に組込んで
サブクローニングした。アフリカツメガエル卵母細胞で
発現されたヒトＮＫ１ＲｓＦの電気生理学的アッセイ
は、ＮＫ１ＲｓＦがサブスタンスＰが結合するとホスホ
リパーゼＣを活性化し、そのホスホリパーゼＣがイノシ
トールトリホスフェート（ＩＰ3)を増加させ、細胞内膜
上のＩＰ3 ゲートカルシウムチャンネルを通じて細胞内
カルシウム濃度を増加させるという事実に基づいてい
た。カルシウム増加は細胞膜上のカルシウムゲートCl-
チャンネルを活性化して、２本の電極電圧クランプで測
定可能なCl- 電流を生じさせる。
定細胞系を確立するため、そのｃＤＮＡをベクターｐＲ
ｃＣＭＶ〔インビトロゲン（INVITROGEN）〕に組込んで
サブクローニングした。アフリカツメガエル卵母細胞で
発現されたヒトＮＫ１ＲｓＦの電気生理学的アッセイ
は、ＮＫ１ＲｓＦがサブスタンスＰが結合するとホスホ
リパーゼＣを活性化し、そのホスホリパーゼＣがイノシ
トールトリホスフェート（ＩＰ3)を増加させ、細胞内膜
上のＩＰ3 ゲートカルシウムチャンネルを通じて細胞内
カルシウム濃度を増加させるという事実に基づいてい
た。カルシウム増加は細胞膜上のカルシウムゲートCl-
チャンネルを活性化して、２本の電極電圧クランプで測
定可能なCl- 電流を生じさせる。
【００１６】ＣＯＳ又はＣＨＯで発現されたヒトＮＫ１
ＲｓＦの結合アッセイは、ヒトＮＫ１ＲｓＦとの結合に
関して未標識サブスタンスＰ又は他のいずれかのリガン
ドと競合する放射線標識リガンドとして 125Ｉ−サブス
タンスＰ(125Ｉ−ＳＰ、デュポン、ボストン、ＭＡ）を
使用することに基づいている。ＣＯＳ又はＣＨＯの単層
細胞培養物は非酵素溶液〔スペシャルティ・メディア
（SPECIALTY MEDIA)、ラバレッティ、ＮＪ〕で解離さ
せ、細胞懸濁液２００μｌが約１０，０００cpm の特異
的 125Ｉ−ＳＰ結合性を示すように適量の結合緩衝液
（pH７．５の５０mMトリス、５mM MnCl2 、１５０mM
NaCl、０．０４mg／mlバシトラシン、０．００４mg／ml
ロイペプチン、０．２mg／mlＢＳＡ、０．０１mMホスホ
ラミドン）に再懸濁された。ＣＨＯ細胞でのＮＫ１Ｒｓ
ＦによるホスホリパーゼＣの活性化はＩＰ3 の分解産物
であるイノシトールモノホスフェートの蓄積量を調べる
ことで測定できる。クローン化ヒトＮＫ１ＲｓＦを発現
する安定ＣＨＯ細胞系を用いた大規模薬物スクリーニン
グの他にも別の応用も容易に考えられる。例えば、安定
細胞系はバイオプシーサンプルからのサブスタンスＰ濃
度を測定する結合アッセイで用いることができる。ヒト
ＮＫ１ＲｓＦタンパク質はまた、いくつかの神経性炎症
疾患においてサブスタンスＰ濃度を減少させるため患者
に注射してもよい。以下の実施例は本発明を説明する目
的であって、本発明の範囲または精神を限定するものと
解釈されてはならない。
ＲｓＦの結合アッセイは、ヒトＮＫ１ＲｓＦとの結合に
関して未標識サブスタンスＰ又は他のいずれかのリガン
ドと競合する放射線標識リガンドとして 125Ｉ−サブス
タンスＰ(125Ｉ−ＳＰ、デュポン、ボストン、ＭＡ）を
使用することに基づいている。ＣＯＳ又はＣＨＯの単層
細胞培養物は非酵素溶液〔スペシャルティ・メディア
（SPECIALTY MEDIA)、ラバレッティ、ＮＪ〕で解離さ
せ、細胞懸濁液２００μｌが約１０，０００cpm の特異
的 125Ｉ−ＳＰ結合性を示すように適量の結合緩衝液
（pH７．５の５０mMトリス、５mM MnCl2 、１５０mM
NaCl、０．０４mg／mlバシトラシン、０．００４mg／ml
ロイペプチン、０．２mg／mlＢＳＡ、０．０１mMホスホ
ラミドン）に再懸濁された。ＣＨＯ細胞でのＮＫ１Ｒｓ
ＦによるホスホリパーゼＣの活性化はＩＰ3 の分解産物
であるイノシトールモノホスフェートの蓄積量を調べる
ことで測定できる。クローン化ヒトＮＫ１ＲｓＦを発現
する安定ＣＨＯ細胞系を用いた大規模薬物スクリーニン
グの他にも別の応用も容易に考えられる。例えば、安定
細胞系はバイオプシーサンプルからのサブスタンスＰ濃
度を測定する結合アッセイで用いることができる。ヒト
ＮＫ１ＲｓＦタンパク質はまた、いくつかの神経性炎症
疾患においてサブスタンスＰ濃度を減少させるため患者
に注射してもよい。以下の実施例は本発明を説明する目
的であって、本発明の範囲または精神を限定するものと
解釈されてはならない。
【００１７】実施例１ 工程Ａ： ヒトＮＫ１ＲｓＦの中心コア領域をコードするｃＤＮＡ
を得る第一工程において、ファーストトラック（FASTTR
ACK)法〔インビトロテゲン（INVITROGEN) 、サンディエ
ゴ、ＣＡ〕により３種のグリオブラストーマ細胞系Ｔ９
８Ｇ、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１及びＵ８７ＭＧ（アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、Ｍ
Ｄから得た）からヒトｍＲＮＡを得た。ヒトｍＲＮＡ４
μｇからの第一鎖ｃＤＮＡの合成は、ＢＲＬｃＤＮＡ合
成システム〔ＢＲＬ、ライフ・テクノロジー社（LIFE T
ECHNOLOGIES, Inc.)、ゲイザースバーグ、ＭＤ〕のプロ
トコールに従い全量２０μｌでオリゴ（ｄＴ）プライマ
ーにより開始した。第一鎖ｃＤＮＡ１０μｌをテンプレ
ートとし、ジーンアンプ（GENEAMP)プロトコール〔パー
キン・エルマー・シータス（PERKIN ELMER CETUS) 、ノ
ーウォーク、ＣＴ〕に従い全量１００μｌで３種のラッ
トプライマー（５０pmol rspr 2s４、５０pmol rspr 2s
４ｈ及び１００pmol rspr 7a２；それらの配列に関して
は表Ｉ参照）と共に一次ＰＣＲを行った。３０サイクル
のＰＣＲを下記パラメーターで行った：９４℃で１分間
の変性、４０℃で２分間のアニーリング、７２℃で４分
間の伸長と２秒間の自動伸長。一次ＰＣＲ産物１０μｌ
を同サイクリング条件下で二次ＰＣＲ増幅において同プ
ライマーと共に鋳型として用い、ＤＮＡを更に増幅させ
た。
を得る第一工程において、ファーストトラック（FASTTR
ACK)法〔インビトロテゲン（INVITROGEN) 、サンディエ
ゴ、ＣＡ〕により３種のグリオブラストーマ細胞系Ｔ９
８Ｇ、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１及びＵ８７ＭＧ（アメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、Ｍ
Ｄから得た）からヒトｍＲＮＡを得た。ヒトｍＲＮＡ４
μｇからの第一鎖ｃＤＮＡの合成は、ＢＲＬｃＤＮＡ合
成システム〔ＢＲＬ、ライフ・テクノロジー社（LIFE T
ECHNOLOGIES, Inc.)、ゲイザースバーグ、ＭＤ〕のプロ
トコールに従い全量２０μｌでオリゴ（ｄＴ）プライマ
ーにより開始した。第一鎖ｃＤＮＡ１０μｌをテンプレ
ートとし、ジーンアンプ（GENEAMP)プロトコール〔パー
キン・エルマー・シータス（PERKIN ELMER CETUS) 、ノ
ーウォーク、ＣＴ〕に従い全量１００μｌで３種のラッ
トプライマー（５０pmol rspr 2s４、５０pmol rspr 2s
４ｈ及び１００pmol rspr 7a２；それらの配列に関して
は表Ｉ参照）と共に一次ＰＣＲを行った。３０サイクル
のＰＣＲを下記パラメーターで行った：９４℃で１分間
の変性、４０℃で２分間のアニーリング、７２℃で４分
間の伸長と２秒間の自動伸長。一次ＰＣＲ産物１０μｌ
を同サイクリング条件下で二次ＰＣＲ増幅において同プ
ライマーと共に鋳型として用い、ＤＮＡを更に増幅させ
た。
【００１８】二次ＰＣＲ産物１０μｌを、下記パラメー
ター：９４℃で１分間の変性、４５℃で２分間のアニー
リング及び７２℃で４分間の伸長と２秒間の自動伸長に
より３０サイクルで行う三次ＰＣＲ増幅において３種の
ラットプライマー（５０pmolrspr 2s４、５０pmol rspr
2s４ｈ、５０pmol rspr 7al 及び５０pmol rspr 7al
h）と共に鋳型として用いた。三次ＰＣＲ産物をアガロ
ースゲル電気泳動で分析したところ、６００bp ＤＮＡ
断片を含むことがわかった。このＤＮＡ断片をゲルから
切出し、ジーンクリーン（GENECLEAN)（バイオ１０１、
ラジョラ、ＣＡ）で精製し、リン酸化し、プラスミドベ
クターブルースクリプトＳＫ＋（BLUESCRIPT SK + ）
〔ストラタジーン（STRATAGENE) 、ラホヤ、ＣＡ〕のＳ
maＩ部位に組込んでサブクローニングした。ＤＮＡ配列
はシークエナーゼ（Sequenase)ジデオキシ法（ＵＳＢ
Ｃ、クリーブランド、ＯＨ）で決定した。配列決定分析
によればこのｃＤＮＡ断片はアミノ酸９１〜２８０のラ
ットＮＫ１ＲｓＦの中心コア領域と類似している（ヌク
レオチドレベルで相同率９０％）。
ター：９４℃で１分間の変性、４５℃で２分間のアニー
リング及び７２℃で４分間の伸長と２秒間の自動伸長に
より３０サイクルで行う三次ＰＣＲ増幅において３種の
ラットプライマー（５０pmolrspr 2s４、５０pmol rspr
2s４ｈ、５０pmol rspr 7al 及び５０pmol rspr 7al
h）と共に鋳型として用いた。三次ＰＣＲ産物をアガロ
ースゲル電気泳動で分析したところ、６００bp ＤＮＡ
断片を含むことがわかった。このＤＮＡ断片をゲルから
切出し、ジーンクリーン（GENECLEAN)（バイオ１０１、
ラジョラ、ＣＡ）で精製し、リン酸化し、プラスミドベ
クターブルースクリプトＳＫ＋（BLUESCRIPT SK + ）
〔ストラタジーン（STRATAGENE) 、ラホヤ、ＣＡ〕のＳ
maＩ部位に組込んでサブクローニングした。ＤＮＡ配列
はシークエナーゼ（Sequenase)ジデオキシ法（ＵＳＢ
Ｃ、クリーブランド、ＯＨ）で決定した。配列決定分析
によればこのｃＤＮＡ断片はアミノ酸９１〜２８０のラ
ットＮＫ１ＲｓＦの中心コア領域と類似している（ヌク
レオチドレベルで相同率９０％）。
【００１９】工程Ｂ： ヒトＮＫ１ＲｓＦのコア領域配列の決定後、５種のアン
チセンスプライマーをヒト配列に基づき合成した（hspr
3a5、hspr 5al、hspr 5a2、hspr 6al及びhspr6a2；そ
れらの配列に関しては表II参照）。これらのプライマー
はヒトＮＫ１ＲｓＦのＮ末端ｃＤＮＡ配列を得るために
用いられる。ヒトグリオブラストーマｍＲＮＡ１μｇ及
び各々の上記プライマー６μＭをＢＲＬｃＤＮＡ合成プ
ロトコールに従い全量２０μｌとして第一鎖ｃＤＮＡ合
成に用いた。ｃＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽
出し、エタノールで沈降させ、水３０μｌに溶解した。
ｃＤＮＡ１０μｌを鋳型とし２種のラットプライマー
（５０pmol rsprn及び５０pmol rsprnh)及び１種のヒト
プライマー（１５０pmol rspr 3a5)を用い全量１０μｌ
で第一次ＰＣＲ増幅を行った。３０回のサイクルを下記
パラメーターで行った；９４℃、１分間の変性、５５℃
１分間のアニーリング及び７２℃３分間の伸長。次いで
一次ＰＣＲ産物５μｌを鋳型とし、２種のラットプライ
マー（５０pmolrsprn及び５０pmol rsprnh)及び１種の
ヒトプライマー（１００pmol rspr 3a4)を用い、同パラ
メーターで３０サイクルの二次ＰＣＲ増幅を行った。二
次ＰＣＲ産物２μｌを鋳型として用い２種のラットプラ
イマー（５０pmol rsprn及び５０pmol rsprnh)及び１種
のヒトプライマーを用いて同パラメーターで３０サイク
ルの三次ＰＣＲ増幅を行った。三次ＰＣＲ産物はアガロ
ースゲル電気泳動で分析したところ、５００bp断片を含
むことがわかった。このＤＮＡ断片はヒトオリゴヌクレ
オチド（hspr 3a2）とハイブリッド形成できるが、これ
はそれが非特異的副産物でないことを示す。このＤＮＡ
断片をゲルから切出し、ジーンクリーン（バイオ１０
１）で精製し、リン酸化し、ブルースクリプトＳＫ＋ベ
クターのＳmaＩ部位に組込んでサブクローニングした。
ＤＮＡ配列分析によれば、この断片はヒトＮＫ１ＲｓＦ
のＮ末端領域をコードし、５′非翻訳配列も含むことを
示した。
チセンスプライマーをヒト配列に基づき合成した（hspr
3a5、hspr 5al、hspr 5a2、hspr 6al及びhspr6a2；そ
れらの配列に関しては表II参照）。これらのプライマー
はヒトＮＫ１ＲｓＦのＮ末端ｃＤＮＡ配列を得るために
用いられる。ヒトグリオブラストーマｍＲＮＡ１μｇ及
び各々の上記プライマー６μＭをＢＲＬｃＤＮＡ合成プ
ロトコールに従い全量２０μｌとして第一鎖ｃＤＮＡ合
成に用いた。ｃＤＮＡをフェノール−クロロホルムで抽
出し、エタノールで沈降させ、水３０μｌに溶解した。
ｃＤＮＡ１０μｌを鋳型とし２種のラットプライマー
（５０pmol rsprn及び５０pmol rsprnh)及び１種のヒト
プライマー（１５０pmol rspr 3a5)を用い全量１０μｌ
で第一次ＰＣＲ増幅を行った。３０回のサイクルを下記
パラメーターで行った；９４℃、１分間の変性、５５℃
１分間のアニーリング及び７２℃３分間の伸長。次いで
一次ＰＣＲ産物５μｌを鋳型とし、２種のラットプライ
マー（５０pmolrsprn及び５０pmol rsprnh)及び１種の
ヒトプライマー（１００pmol rspr 3a4)を用い、同パラ
メーターで３０サイクルの二次ＰＣＲ増幅を行った。二
次ＰＣＲ産物２μｌを鋳型として用い２種のラットプラ
イマー（５０pmol rsprn及び５０pmol rsprnh)及び１種
のヒトプライマーを用いて同パラメーターで３０サイク
ルの三次ＰＣＲ増幅を行った。三次ＰＣＲ産物はアガロ
ースゲル電気泳動で分析したところ、５００bp断片を含
むことがわかった。このＤＮＡ断片はヒトオリゴヌクレ
オチド（hspr 3a2）とハイブリッド形成できるが、これ
はそれが非特異的副産物でないことを示す。このＤＮＡ
断片をゲルから切出し、ジーンクリーン（バイオ１０
１）で精製し、リン酸化し、ブルースクリプトＳＫ＋ベ
クターのＳmaＩ部位に組込んでサブクローニングした。
ＤＮＡ配列分析によれば、この断片はヒトＮＫ１ＲｓＦ
のＮ末端領域をコードし、５′非翻訳配列も含むことを
示した。
【００２０】工程Ｃ： 第３の工程においては、ヒトセンスプライマーとベクタ
ー配列に対応するプライマーを用いてヒトＮＫ１ＲｓＦ
のＣ末端領域をコードするｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラ
リーから得るアンカーＰＣＲプロトコールを開発した。
ＢＲＬｃＤＮＡ合成プロトコールに従いオリゴ（ｄＴ）
２．５μｇでヒトグリオブラストーマｍＲＮＡ３μｇを
プライム化し、全量５０μｌで第１鎖ｃＤＮＡ合成を行
ない、ついで第２鎖ｃＤＮＡ合成を行なった。次いでｃ
ＤＮＡ産物を７０℃で１０分間加熱した。二本鎖ｃＤＮ
Ａの収量は１．２５μＭの32Ｐ−α−ｄＣＴＰをトレー
サーとして反応に取込ませることで調べた。Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ４μｌを反応混合液に加え、３７℃で１０
分間インキュベートした。２５０mM ＥＤＴＡ１６μｌ
を加え、フェノール／CHCl3 で抽出し、エタノールで沈
降させて反応を停止させた。ｃＤＮＡをＨＥ緩衝液（１
０mM ＨＥＰＥＳ−１mM ＥＤＴＡ）５０μｌに溶解し
た。小サイズｃＤＮＡはセレクト−Ｄ（ＲＦ）スピンカ
ラム（Select-D(RF) SPINCOLUMN ）（５′ＴＯ３′、ボ
ールダー、ＣＯ）で除去し、大サイズｃＤＮＡをエタノ
ールで沈降させて、水３６μｌに溶解した。０．２Ｍト
リス−１０mMスペルミジン−１mM ＥＤＴＡ（pH７．
５）４μｌを管に加え、７０℃で１分間加熱した。ｃＤ
ＮＡは平滑末端キナーゼ緩衝液（pH９．５の０．５Ｍト
リス、０．１Ｍ MgCl2 、５０mM ＤＴＴ、５０％グリ
セロール）５μｌ、１０mM ＡＴＰ２．５μｌ、ポリヌ
クレオチドキナーゼ２．５μｌを加えて３７℃で３０分
間インキュベートすることによりリン酸化した。ｃＤＮ
Ａをフェノール／CHCl3 で抽出し、エタノールで沈降
し、プロメガＥcoＲＩリンカー結合プロトコール〔プロ
メガ（PROMEGA)、マジソン、ＷＩ〕に従いＥcoＲＩリン
カーに結合させた。次いでリンカー結合ｃＤＮＡをブル
ースクリプトＳＫ＋ベクターの子ウシ腸ホスファターゼ
で処理したＥcoＲＩ部位と結合させた。結合プラスミド
ＤＮＡ１μｌを鋳型として用い２種のヒトプライマー
（５０pmol hspr 6s１及び５０pmol hspr 6s２）及び１
００pmolのベクター特異的プライマーｔ３（ストラタジ
ーンから入手）と共に３０サイクルの一次ＰＣＲを行っ
た。反応パラメーターは９４℃で１分間の変性、５５℃
で２分間のアニーリング及び７２℃で４分間の伸長と２
秒間の自動伸長である。一次ＰＣＲ産物１μｌを鋳型と
し１種のヒトプライマー（１００pmol hspr 6s３）及び
同様のベクター特異的プライマーｔ３と共に同条件下で
３０サイクルの二次ＰＣＲを行った。二次ＰＣＲ産物１
μｌを鋳型とし１種のヒトプライマー（１００pmolhspr
6s４）及び１００pmolのベクター特異的プライマーＳ
Ｋ（ストラタジーン）と共に同条件下で３０サイクルの
三次ＰＣＲを行った。ヒトオリゴプローブ hspr 6s５と
もハイブリッド形成する７８０bpＤＡＮ断片を検出し
た。このＤＮＡ断片をアガロースゲルから切出し、ジー
ンクリーン（バイオ１０１）で精製し、リン酸化し、ブ
ルースクリプトＳＫ＋ベクターのＳmaＩ部位に組込んで
サブクローニングした。ＤＮＡ配列分析によれば、それ
はヒトＮＫ１ＲｓＦのＣ末端領域をコードし、３′非翻
訳配列を含むことを示した。
ー配列に対応するプライマーを用いてヒトＮＫ１ＲｓＦ
のＣ末端領域をコードするｃＤＮＡをｃＤＮＡライブラ
リーから得るアンカーＰＣＲプロトコールを開発した。
ＢＲＬｃＤＮＡ合成プロトコールに従いオリゴ（ｄＴ）
２．５μｇでヒトグリオブラストーマｍＲＮＡ３μｇを
プライム化し、全量５０μｌで第１鎖ｃＤＮＡ合成を行
ない、ついで第２鎖ｃＤＮＡ合成を行なった。次いでｃ
ＤＮＡ産物を７０℃で１０分間加熱した。二本鎖ｃＤＮ
Ａの収量は１．２５μＭの32Ｐ−α−ｄＣＴＰをトレー
サーとして反応に取込ませることで調べた。Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ４μｌを反応混合液に加え、３７℃で１０
分間インキュベートした。２５０mM ＥＤＴＡ１６μｌ
を加え、フェノール／CHCl3 で抽出し、エタノールで沈
降させて反応を停止させた。ｃＤＮＡをＨＥ緩衝液（１
０mM ＨＥＰＥＳ−１mM ＥＤＴＡ）５０μｌに溶解し
た。小サイズｃＤＮＡはセレクト−Ｄ（ＲＦ）スピンカ
ラム（Select-D(RF) SPINCOLUMN ）（５′ＴＯ３′、ボ
ールダー、ＣＯ）で除去し、大サイズｃＤＮＡをエタノ
ールで沈降させて、水３６μｌに溶解した。０．２Ｍト
リス−１０mMスペルミジン−１mM ＥＤＴＡ（pH７．
５）４μｌを管に加え、７０℃で１分間加熱した。ｃＤ
ＮＡは平滑末端キナーゼ緩衝液（pH９．５の０．５Ｍト
リス、０．１Ｍ MgCl2 、５０mM ＤＴＴ、５０％グリ
セロール）５μｌ、１０mM ＡＴＰ２．５μｌ、ポリヌ
クレオチドキナーゼ２．５μｌを加えて３７℃で３０分
間インキュベートすることによりリン酸化した。ｃＤＮ
Ａをフェノール／CHCl3 で抽出し、エタノールで沈降
し、プロメガＥcoＲＩリンカー結合プロトコール〔プロ
メガ（PROMEGA)、マジソン、ＷＩ〕に従いＥcoＲＩリン
カーに結合させた。次いでリンカー結合ｃＤＮＡをブル
ースクリプトＳＫ＋ベクターの子ウシ腸ホスファターゼ
で処理したＥcoＲＩ部位と結合させた。結合プラスミド
ＤＮＡ１μｌを鋳型として用い２種のヒトプライマー
（５０pmol hspr 6s１及び５０pmol hspr 6s２）及び１
００pmolのベクター特異的プライマーｔ３（ストラタジ
ーンから入手）と共に３０サイクルの一次ＰＣＲを行っ
た。反応パラメーターは９４℃で１分間の変性、５５℃
で２分間のアニーリング及び７２℃で４分間の伸長と２
秒間の自動伸長である。一次ＰＣＲ産物１μｌを鋳型と
し１種のヒトプライマー（１００pmol hspr 6s３）及び
同様のベクター特異的プライマーｔ３と共に同条件下で
３０サイクルの二次ＰＣＲを行った。二次ＰＣＲ産物１
μｌを鋳型とし１種のヒトプライマー（１００pmolhspr
6s４）及び１００pmolのベクター特異的プライマーＳ
Ｋ（ストラタジーン）と共に同条件下で３０サイクルの
三次ＰＣＲを行った。ヒトオリゴプローブ hspr 6s５と
もハイブリッド形成する７８０bpＤＡＮ断片を検出し
た。このＤＮＡ断片をアガロースゲルから切出し、ジー
ンクリーン（バイオ１０１）で精製し、リン酸化し、ブ
ルースクリプトＳＫ＋ベクターのＳmaＩ部位に組込んで
サブクローニングした。ＤＮＡ配列分析によれば、それ
はヒトＮＫ１ＲｓＦのＣ末端領域をコードし、３′非翻
訳配列を含むことを示した。
【００２１】工程Ｄ： ヒトＮＫ１ＲｓＦをコードする３種の異なるが互いにオ
ーバーラップしているｃＤＮＡクローンが前記で単離さ
れかつ別のプレ−ｍＲＮＡスプライシングの可能性が存
在することから、全鎖長ｃＤＮＡ配列の真正性を確認す
るためには全鎖長ｃＤＮＡを直接単離することが必要で
ある。前記配列の非翻訳領域配列に基づき、全鎖長ｃＤ
ＮＡを生じるプライマーを合成した。パーキン・エルマ
ー・シータスＲＮＡ ＰＣＲ増幅キット（パーキン・エ
ルマー・シータス）を用いて、ｃＤＮＡを５０pmolのヒ
トプライマー hspr 3uta５と共に全量２０μｌでヒトグ
リオブラストーマｍＲＮＡ１．５μｇから合成した。第
一鎖ｃＤＮＡの半分を鋳型として用い、２種のヒトプラ
イマー（５０pmol hspr 3uta５、５０pmol hspr 5uts
１）と共に３０サイクルの一次ＰＣＲ増幅を行った。パ
ラメーターは９４℃で１分間の変性、５５℃で２分間の
アニーリング及び２秒間の自動伸長を伴う５５℃で４分
間の伸長である。一次ＰＣＲ産物１０μｌを鋳型として
用い同条件下で３０サイクルの二次ＰＣＲ増幅を行っ
た。プライマーは２種のヒトプライマー（５０pmol hsp
r 12utal６及び５０pmol hspr 5uts1 ）である。パラメ
ーターは９４℃１分の変性；５５℃２分のアニーリン
グ；５５℃４分の伸長と２秒の自動伸長である。第一次
ＰＣＲ産物の１０μｌを鋳型として用い、２種のヒトプ
ライマー（50 pmole hspr12uta2 と50 pmol hspr5uts2)
を用い同条件で３０サイクルの第二次ＰＣＲ増幅を行な
った、１１００bpＤＮＡ断片をアガロースゲルから切出
し、ジーンクリーン（バイオ１０１）で精製し、制限エ
ンドヌクレアーゼＥcoＲＩ及びＮotＩで切断し、ブルー
スクリプトベクターＳＫ＋に組込んでサブクローニング
した。ＤＮＡ配列分析によりクローン化ヒトＮＫ１Ｒｓ
ＦｃＤＮＡの一般構造を確認した。ヒトＮＫ１ＲｓＦｃ
ＤＮＡの配列は図３に示されている。表Ｉ：ラットＮＫ
１ＲｓＦ配列に基づくプライマー。一部のプライマーに
おける最後の文字“ｈ”はヒトコドンバイアスが組込ま
れたことを示す〔ラザ、１９８５年、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー、第１８３巻、第１−１
２頁（Lathe, 1985, J. Mol. Biol., 183:1-12）〕。ラ
ットｃＤＮＡ配列における位置番号はヨコタら（ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１９８９
年、第２６４巻、第１７６４９−１７６５２頁）により
規定された。
ーバーラップしているｃＤＮＡクローンが前記で単離さ
れかつ別のプレ−ｍＲＮＡスプライシングの可能性が存
在することから、全鎖長ｃＤＮＡ配列の真正性を確認す
るためには全鎖長ｃＤＮＡを直接単離することが必要で
ある。前記配列の非翻訳領域配列に基づき、全鎖長ｃＤ
ＮＡを生じるプライマーを合成した。パーキン・エルマ
ー・シータスＲＮＡ ＰＣＲ増幅キット（パーキン・エ
ルマー・シータス）を用いて、ｃＤＮＡを５０pmolのヒ
トプライマー hspr 3uta５と共に全量２０μｌでヒトグ
リオブラストーマｍＲＮＡ１．５μｇから合成した。第
一鎖ｃＤＮＡの半分を鋳型として用い、２種のヒトプラ
イマー（５０pmol hspr 3uta５、５０pmol hspr 5uts
１）と共に３０サイクルの一次ＰＣＲ増幅を行った。パ
ラメーターは９４℃で１分間の変性、５５℃で２分間の
アニーリング及び２秒間の自動伸長を伴う５５℃で４分
間の伸長である。一次ＰＣＲ産物１０μｌを鋳型として
用い同条件下で３０サイクルの二次ＰＣＲ増幅を行っ
た。プライマーは２種のヒトプライマー（５０pmol hsp
r 12utal６及び５０pmol hspr 5uts1 ）である。パラメ
ーターは９４℃１分の変性；５５℃２分のアニーリン
グ；５５℃４分の伸長と２秒の自動伸長である。第一次
ＰＣＲ産物の１０μｌを鋳型として用い、２種のヒトプ
ライマー（50 pmole hspr12uta2 と50 pmol hspr5uts2)
を用い同条件で３０サイクルの第二次ＰＣＲ増幅を行な
った、１１００bpＤＮＡ断片をアガロースゲルから切出
し、ジーンクリーン（バイオ１０１）で精製し、制限エ
ンドヌクレアーゼＥcoＲＩ及びＮotＩで切断し、ブルー
スクリプトベクターＳＫ＋に組込んでサブクローニング
した。ＤＮＡ配列分析によりクローン化ヒトＮＫ１Ｒｓ
ＦｃＤＮＡの一般構造を確認した。ヒトＮＫ１ＲｓＦｃ
ＤＮＡの配列は図３に示されている。表Ｉ：ラットＮＫ
１ＲｓＦ配列に基づくプライマー。一部のプライマーに
おける最後の文字“ｈ”はヒトコドンバイアスが組込ま
れたことを示す〔ラザ、１９８５年、ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー、第１８３巻、第１−１
２頁（Lathe, 1985, J. Mol. Biol., 183:1-12）〕。ラ
ットｃＤＮＡ配列における位置番号はヨコタら（ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、１９８９
年、第２６４巻、第１７６４９−１７６５２頁）により
規定された。
【化７】 表II：ヒトＮＫ１ＲｓＦｃＤＮＡ配列に基づくプライマ
ー。位置番号はここで示した配列で規定される。括弧内
のヌクレオチドはヒトＮＫ１ＲｓＦｃＤＮＡに存在しな
い；それらはサブクローニング目的用の制限部位であ
る。
ー。位置番号はここで示した配列で規定される。括弧内
のヌクレオチドはヒトＮＫ１ＲｓＦｃＤＮＡに存在しな
い；それらはサブクローニング目的用の制限部位であ
る。
【化８】
【００２２】実施例２ アフリカツメガエル卵母細胞における発現 アフリカツメガエル卵母細胞でヒトＮＫ１ＲｓＦｃＤＮ
Ａを発現させるため、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲ
ＮＡ合成を開始させるためのＴ７プロモーターを含むイ
ンビトロ転写用ベクターブルースクリプトＳＫ＋（スト
ラタジーン）にｃＤＮＡを組込んでクローニングした。
Ｔ７プロモーターの下流にヒトＮＫ１ＲｓＦｃＤＮＡを
含む直鎖プラスミドＤＮＡ１μｇをインビトロの転写反
応に用いた（pH７．５の４０mMトリス、５０mM NaCl、
８mM MgCl2 、２mMスペルミジン、０．４mM ＣＴＰ、
０．４mM ＡＴＰ、０．４mM ＵＴＰ、０．１６mM Ｇ
ＴＰ、２．５μｌＣＡＰアナログ（ストラタジーン）、
３０mM ＤＴＴ、１Ｕ ＲＮアーゼブロックII（RNase
Block II）（ストラタジーン）、０．８３pmol32Ｐ−α
−ＣＴＰ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ２５Ｕ含有）。反
応管を３７℃で１時間インキュベートした。32Ｐ−α−
ＣＴＰのＲＮＡ内取込みで定量したところ通常ＲＮＡ５
μｇが合成された。ＲＮＡ合成後、ブラスミドＤＮＡは
１０Ｕの RNaseを含まないＤＮアーゼ及び１ＵのＲＮア
ーゼブロックIIを加えることで除去した。反応混合物を
フェノール／CHCl3 で抽出し、取込まれなかったヌクレ
オチドをセレクト−Ｄ（ＲＦ）スピンカラム（５′ＴＯ
３′）で除去した。ＲＮＡ転写体をエタノールで２回沈
降し、ＲＮアーゼを含まない水に溶解させた。卵母細胞
をアフリカツメガエルから取出し、１９℃で４時間にわ
たりＯＲ−２緩衝液（８２．５mM NaCl、２mM KCl 、
１mM MgCl2 、５mM ＨＥＰＥＳ、pH７．４）中２mg／
mlコラゲナーゼ〔比活性＜０．３Ｕ／mg、ベーリンガー
・マンハイム、インジアナポリス、ＩＮ〕で処理した。
解離した卵母細胞は注入の前に１．８mMCaCl2 、０．５
mg／mlゲンタマイシン及び０．５mMテオフィリンを加え
たＯＲ−２緩衝液中１９℃で一夜インキュベートした。
ＲＮＡ転写体の一部の２ng含有液５０μｌを各卵母細胞
に注入した。注入された卵母細胞を２日間１９℃でイン
キュベートしたのち電気生理学的に記録したアッセイ法
に関しては実施例２参照）。
Ａを発現させるため、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによるＲ
ＮＡ合成を開始させるためのＴ７プロモーターを含むイ
ンビトロ転写用ベクターブルースクリプトＳＫ＋（スト
ラタジーン）にｃＤＮＡを組込んでクローニングした。
Ｔ７プロモーターの下流にヒトＮＫ１ＲｓＦｃＤＮＡを
含む直鎖プラスミドＤＮＡ１μｇをインビトロの転写反
応に用いた（pH７．５の４０mMトリス、５０mM NaCl、
８mM MgCl2 、２mMスペルミジン、０．４mM ＣＴＰ、
０．４mM ＡＴＰ、０．４mM ＵＴＰ、０．１６mM Ｇ
ＴＰ、２．５μｌＣＡＰアナログ（ストラタジーン）、
３０mM ＤＴＴ、１Ｕ ＲＮアーゼブロックII（RNase
Block II）（ストラタジーン）、０．８３pmol32Ｐ−α
−ＣＴＰ及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼ２５Ｕ含有）。反
応管を３７℃で１時間インキュベートした。32Ｐ−α−
ＣＴＰのＲＮＡ内取込みで定量したところ通常ＲＮＡ５
μｇが合成された。ＲＮＡ合成後、ブラスミドＤＮＡは
１０Ｕの RNaseを含まないＤＮアーゼ及び１ＵのＲＮア
ーゼブロックIIを加えることで除去した。反応混合物を
フェノール／CHCl3 で抽出し、取込まれなかったヌクレ
オチドをセレクト−Ｄ（ＲＦ）スピンカラム（５′ＴＯ
３′）で除去した。ＲＮＡ転写体をエタノールで２回沈
降し、ＲＮアーゼを含まない水に溶解させた。卵母細胞
をアフリカツメガエルから取出し、１９℃で４時間にわ
たりＯＲ−２緩衝液（８２．５mM NaCl、２mM KCl 、
１mM MgCl2 、５mM ＨＥＰＥＳ、pH７．４）中２mg／
mlコラゲナーゼ〔比活性＜０．３Ｕ／mg、ベーリンガー
・マンハイム、インジアナポリス、ＩＮ〕で処理した。
解離した卵母細胞は注入の前に１．８mMCaCl2 、０．５
mg／mlゲンタマイシン及び０．５mMテオフィリンを加え
たＯＲ−２緩衝液中１９℃で一夜インキュベートした。
ＲＮＡ転写体の一部の２ng含有液５０μｌを各卵母細胞
に注入した。注入された卵母細胞を２日間１９℃でイン
キュベートしたのち電気生理学的に記録したアッセイ法
に関しては実施例２参照）。
【００２３】ＣＯＳにおける発現 ＣＯＳで一過性にヒトＮＫ１ＲｓＦを発現させるため、
ｃＤＮＡを発現ベクターｐＣＤＭ９にクローニングし
た。ｐＣＤＭ９は、アンピシリン耐性遺伝子（ブルース
クリプトＳＫ＋からのヌクレオチド１９７３−２９６
４）をＳacII部位に挿入してｐＣＤＭ８（インビトロゲ
ン）から誘導された。エクロトロポレーションによる１
千万個のＣＯＳ細胞へのプラスミドＤＮＡ２０μｇのト
ランスフェクトは、ＩＢＩジーンザッパー（IBI GENEZA
PPER）（ＩＢＩ、ニューヘブン、ＣＴ）を用い、２６０
Ｖ及び９５０μＦでトランスフェクト緩衝液（１３５mM
NaCl、１．２mM CaCl2 、１．２mM MgCl2 、２．４
mM K2HPO4、０．６mM KH2PO4、１０mMグルコース、１
０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．４）８００μｌ中で行った。
結合アッセイ前に細胞は５％ CO2中、３７℃で３日間に
わたり１０％牛胎児血清、２mMグルタミン、１００Ｕ／
mlペニシリン−ストレプトマイシン及び９０％ＤＭＥＭ
培地〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、グランドアイランド、Ｎ
Ｙ〕中でインキュベートした。
ｃＤＮＡを発現ベクターｐＣＤＭ９にクローニングし
た。ｐＣＤＭ９は、アンピシリン耐性遺伝子（ブルース
クリプトＳＫ＋からのヌクレオチド１９７３−２９６
４）をＳacII部位に挿入してｐＣＤＭ８（インビトロゲ
ン）から誘導された。エクロトロポレーションによる１
千万個のＣＯＳ細胞へのプラスミドＤＮＡ２０μｇのト
ランスフェクトは、ＩＢＩジーンザッパー（IBI GENEZA
PPER）（ＩＢＩ、ニューヘブン、ＣＴ）を用い、２６０
Ｖ及び９５０μＦでトランスフェクト緩衝液（１３５mM
NaCl、１．２mM CaCl2 、１．２mM MgCl2 、２．４
mM K2HPO4、０．６mM KH2PO4、１０mMグルコース、１
０mM ＨＥＰＥＳ、pH７．４）８００μｌ中で行った。
結合アッセイ前に細胞は５％ CO2中、３７℃で３日間に
わたり１０％牛胎児血清、２mMグルタミン、１００Ｕ／
mlペニシリン−ストレプトマイシン及び９０％ＤＭＥＭ
培地〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、グランドアイランド、Ｎ
Ｙ〕中でインキュベートした。
【００２４】ＣＨＯにおける安定発現 クローン化ヒトＮＫ１ＲｓＦを発現する安定細胞系を確
立するため、ｃＤＮＡをベクターｐＲｃＣＭＶ（インビ
トロゲン）に組込んでサブクローニングした。ＣＨＯ細
胞中へのプラスミドＤＮＡ２０μｇのトランスフェクト
はエレクトロポレーションにより行った（ＩＢＩジーン
ザッパー（ＩＢＩ）を用いて３００Ｖ及び９５０μＦで
０．６２５mg／mlニシン精子ＤＮＡを加えたトランスフ
ェクト緩衝液８００μｌ中で行った）トランスフェクト
された細胞をコロニーが認められるまで５％ CO2中３７
℃においてＣＨＯ培地〔１０％牛胎児血清、１００Ｕ／
mlペニシリン−ストレプトマイシン、２mMグルタミン、
１／５００ヒポキサンチン−チミジン（ＡＴＣＣ）、９
０％ＩＭＤＭ培地（ＪＲＨバイオサイエンス、レネキ
サ、ＫＳ）、０．７mg／mlＧ４１８（ギブコ）〕中でイ
ンキュベートした。各コロニーを単離し、増殖させた。
最大数のヒトＮＫ１ＲｓＦを有する細胞クローンを次の
実施例２のアッセイに用いるために選択した。
立するため、ｃＤＮＡをベクターｐＲｃＣＭＶ（インビ
トロゲン）に組込んでサブクローニングした。ＣＨＯ細
胞中へのプラスミドＤＮＡ２０μｇのトランスフェクト
はエレクトロポレーションにより行った（ＩＢＩジーン
ザッパー（ＩＢＩ）を用いて３００Ｖ及び９５０μＦで
０．６２５mg／mlニシン精子ＤＮＡを加えたトランスフ
ェクト緩衝液８００μｌ中で行った）トランスフェクト
された細胞をコロニーが認められるまで５％ CO2中３７
℃においてＣＨＯ培地〔１０％牛胎児血清、１００Ｕ／
mlペニシリン−ストレプトマイシン、２mMグルタミン、
１／５００ヒポキサンチン−チミジン（ＡＴＣＣ）、９
０％ＩＭＤＭ培地（ＪＲＨバイオサイエンス、レネキ
サ、ＫＳ）、０．７mg／mlＧ４１８（ギブコ）〕中でイ
ンキュベートした。各コロニーを単離し、増殖させた。
最大数のヒトＮＫ１ＲｓＦを有する細胞クローンを次の
実施例２のアッセイに用いるために選択した。
【００２５】実施例３ 卵母細胞を用いたアッセイプロトコール 卵母細胞をモデル８５００細胞内プレアンプ−クランプ
〔ダガン（DAGAN)、ミネアポリス、ＭＮ〕により−８０
mVで電圧クランプした。記録室を記録緩衝液（９６mM
NaCl、２mM KCl 、１．８mM CaCl2 、５mM ＨＥＰＥ
Ｓ、pH７．４）で連続灌流した。サブスタンスＰ（０．
１nM〜１０００nM）を記録室に加えてCl- 電流を発生さ
せた。少なくとも３つの卵母細胞を各濃度に関して測定
した。サブスタンスＰに対する応答の阻害を調べればい
かなる潜在的サブスタンスＰ拮抗剤の拮抗活性も評価で
きる。同様に、ＮＫ１作動剤は非注入卵母細胞には作用
しないがＮＫ１ＲおよびＮＫ１ＲｓＦｍＲＮＡを注入さ
れた卵母細胞における応答を促進しうるそれらの能力に
より同定できる。図５に示すように、長短両形のＮＫ１
Ｒにより仲介されるホスホリパーゼＣの活性はアゴニス
トであるサブスタンスＰに対し、異なる感受性を示す。
〔ダガン（DAGAN)、ミネアポリス、ＭＮ〕により−８０
mVで電圧クランプした。記録室を記録緩衝液（９６mM
NaCl、２mM KCl 、１．８mM CaCl2 、５mM ＨＥＰＥ
Ｓ、pH７．４）で連続灌流した。サブスタンスＰ（０．
１nM〜１０００nM）を記録室に加えてCl- 電流を発生さ
せた。少なくとも３つの卵母細胞を各濃度に関して測定
した。サブスタンスＰに対する応答の阻害を調べればい
かなる潜在的サブスタンスＰ拮抗剤の拮抗活性も評価で
きる。同様に、ＮＫ１作動剤は非注入卵母細胞には作用
しないがＮＫ１ＲおよびＮＫ１ＲｓＦｍＲＮＡを注入さ
れた卵母細胞における応答を促進しうるそれらの能力に
より同定できる。図５に示すように、長短両形のＮＫ１
Ｒにより仲介されるホスホリパーゼＣの活性はアゴニス
トであるサブスタンスＰに対し、異なる感受性を示す。
【００２６】ＣＯＳ又はＣＨＯを用いたアッセイプロト
コール ＣＯＳ（又はＣＨＯ）で発現されたヒトＮＫ１ＲｓＦの
結合アッセイは、ヒトＮＫ１ＲｓＦとの結合に関して未
標識サブスタンスＰ又は他のリガンドと競合する放射線
標識リガンドとして 125Ｉ−サブスタンスＰ(125Ｉ−Ｓ
Ｐ、デュポン、ボストン、ＭＡ）を使用することに基づ
いている。ＣＯＳ又はＣＨＯの単層細胞培養物を非酵素
溶液（スペシャルティ・メディア・ラバレッティ、Ｎ
Ｊ）中で解離させ、細胞懸濁液２００μｌが約１０，０
００cpm の特定的 125Ｉ−ＳＰ結合性を示すように適量
の結合緩衝液（pH７．５の５０mMトリス、５mM MnC
l2 、１５０mM NaCl、０．０４mg／mlバシトラシン、
０．００４mg／mlロイペプチン、０．２mg／mlＢＳＡ、
０．０１mMホスホラミドン）に再懸濁した（約５０，０
００〜２００，０００細胞）。結合アッセイにおいて、
細胞２００μｌを１．５〜２．５nM 125Ｉ−ＳＰ２０μ
ｌ及び未標識サブスタンスＰ又は他のいずれかの試験化
合物２０μｌ含有の管に加えた。管を静かに振盪しなが
ら４℃又は室温で１時間インキュベートした。０．１％
ポリエチレンイミンでぬらしたＧＦ／Ｃフィルター〔ブ
ランデル（BRANDEL)、ゲイザースバーク、ＭＤ〕により
未結合放射能から結合放射能を分離した。そのフィルタ
ーを洗浄緩衝液（pH７．５の５０mMトリス、５mM MnCl
2 、１５０mM NaCl）３mlで３回洗浄し、その放射能を
ガンマカウンターで測定した。これらの発現系を用いた
この方法の例としては図４で示された結果がある。これ
らの結果はサブスタンスＰが長短両方のヒトＮＫ１Ｒに
対し、異なる結合親和性を有することを示す。
コール ＣＯＳ（又はＣＨＯ）で発現されたヒトＮＫ１ＲｓＦの
結合アッセイは、ヒトＮＫ１ＲｓＦとの結合に関して未
標識サブスタンスＰ又は他のリガンドと競合する放射線
標識リガンドとして 125Ｉ−サブスタンスＰ(125Ｉ−Ｓ
Ｐ、デュポン、ボストン、ＭＡ）を使用することに基づ
いている。ＣＯＳ又はＣＨＯの単層細胞培養物を非酵素
溶液（スペシャルティ・メディア・ラバレッティ、Ｎ
Ｊ）中で解離させ、細胞懸濁液２００μｌが約１０，０
００cpm の特定的 125Ｉ−ＳＰ結合性を示すように適量
の結合緩衝液（pH７．５の５０mMトリス、５mM MnC
l2 、１５０mM NaCl、０．０４mg／mlバシトラシン、
０．００４mg／mlロイペプチン、０．２mg／mlＢＳＡ、
０．０１mMホスホラミドン）に再懸濁した（約５０，０
００〜２００，０００細胞）。結合アッセイにおいて、
細胞２００μｌを１．５〜２．５nM 125Ｉ−ＳＰ２０μ
ｌ及び未標識サブスタンスＰ又は他のいずれかの試験化
合物２０μｌ含有の管に加えた。管を静かに振盪しなが
ら４℃又は室温で１時間インキュベートした。０．１％
ポリエチレンイミンでぬらしたＧＦ／Ｃフィルター〔ブ
ランデル（BRANDEL)、ゲイザースバーク、ＭＤ〕により
未結合放射能から結合放射能を分離した。そのフィルタ
ーを洗浄緩衝液（pH７．５の５０mMトリス、５mM MnCl
2 、１５０mM NaCl）３mlで３回洗浄し、その放射能を
ガンマカウンターで測定した。これらの発現系を用いた
この方法の例としては図４で示された結果がある。これ
らの結果はサブスタンスＰが長短両方のヒトＮＫ１Ｒに
対し、異なる結合親和性を有することを示す。
【００２７】代替プロトコール ＮＫ１ＲによるホスホリパーゼＣの活性化はＩＰ3 の分
解産物であるイノシトールモノホスフェートの蓄積量を
調べることによってもＣＨＯ細胞において測定できる。
ＣＨＯ細胞を２５０，０００細胞／ウェルで１２穴プレ
ートに接種した。ＣＨＯ培地で４日間インキュベート
後、細胞に０．０２５μCi／mlの 3Ｈ−ミオイノシトー
ルを加え一晩インキュベートした。細胞外放射能をリン
酸緩衝液で洗浄することにより除去した。LiClを拮抗剤
と共にまたはそれなしでウェルに最終濃度０．１mMで加
え、３７℃で１５分間インキュベートを続けた。サブス
タンスＰをウェルに最終濃度０．３nMで加えてヒトＮＫ
１Ｒを活性化させた。３７℃で３０分間のインキュベー
ト後に培地を除去し０．１Ｎ HCl を加えた。各ウェル
を４℃で超音波処理し、CHCl3 ／メタノール（１：１）
で抽出した。水相を１mlダウエックスＡＧ１×８イオン
交換カラムにかけ、カラムを０．１Ｎギ酸次に０．０２
５Ｍギ酸アンモニウム−０．１Ｎギ酸で洗浄した。イノ
シトールモノホスフェートを０．２Ｍギ酸アンモニウム
−０．１Ｎギ酸で溶出させ、ベータカウンターで定量し
た。以上の明細書は説明の目的でおかれた実施例ととも
に本発明の原理を開示するものであり、本発明の実行に
あたっては、ここに記載されたすべての通常の変法、応
用、改善、省略、手順・プロトコルの追加は特許請求の
範囲の範囲に入り、同等と見なされることは理解される
であろう。
解産物であるイノシトールモノホスフェートの蓄積量を
調べることによってもＣＨＯ細胞において測定できる。
ＣＨＯ細胞を２５０，０００細胞／ウェルで１２穴プレ
ートに接種した。ＣＨＯ培地で４日間インキュベート
後、細胞に０．０２５μCi／mlの 3Ｈ−ミオイノシトー
ルを加え一晩インキュベートした。細胞外放射能をリン
酸緩衝液で洗浄することにより除去した。LiClを拮抗剤
と共にまたはそれなしでウェルに最終濃度０．１mMで加
え、３７℃で１５分間インキュベートを続けた。サブス
タンスＰをウェルに最終濃度０．３nMで加えてヒトＮＫ
１Ｒを活性化させた。３７℃で３０分間のインキュベー
ト後に培地を除去し０．１Ｎ HCl を加えた。各ウェル
を４℃で超音波処理し、CHCl3 ／メタノール（１：１）
で抽出した。水相を１mlダウエックスＡＧ１×８イオン
交換カラムにかけ、カラムを０．１Ｎギ酸次に０．０２
５Ｍギ酸アンモニウム−０．１Ｎギ酸で洗浄した。イノ
シトールモノホスフェートを０．２Ｍギ酸アンモニウム
−０．１Ｎギ酸で溶出させ、ベータカウンターで定量し
た。以上の明細書は説明の目的でおかれた実施例ととも
に本発明の原理を開示するものであり、本発明の実行に
あたっては、ここに記載されたすべての通常の変法、応
用、改善、省略、手順・プロトコルの追加は特許請求の
範囲の範囲に入り、同等と見なされることは理解される
であろう。
【００２８】配列番号：１ 配列の長さ：１２２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化９】
【００２９】配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１０】
【００３０】配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１１】
【００３１】配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状配列：
【化１２】
【００３２】配列番号：５ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１３】
【００３３】配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１４】
【００３４】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１５】
【００３５】配列番号：８ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１６】
【００３６】配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１７】
【００３７】配列番号：１０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１８】
【００３８】配列番号：１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化１９】
【００３９】配列番号：１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２０】
【００４０】配列番号：１３ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２１】
【００４１】配列番号：１４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２２】
【００４２】配列番号：１５ 配列の長さ： ２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２３】
【００４３】配列番号１６： 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２４】
【００４４】配列番号：１７ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２５】
【００４５】配列番号：１８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２６】
【００４６】配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２７】
【００４７】配列番号：２０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２８】
【００４８】配列番号：２１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化２９】
【００４９】配列番号：２２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３０】
【００５０】配列番号：２３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３１】
【００５１】配列番号：２４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３２】
【００５２】配列番号：２５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３３】
【００５３】配列番号：２６ 配列の長さ：３１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３４】
【化３５】
【００５４】配列番号：２７ 配列の長さ：１２６９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列：
【化３６】
【図１】ヒトニューロキノンレセプター短形の全鎖長ア
ミノ酸配列を示す図である。
ミノ酸配列を示す図である。
【図２】クローン化ヒトニューロキノン−１レセプター
短形相補的ＤＮＡの全鎖長ヌクレオチド配列を示す図で
ある。
短形相補的ＤＮＡの全鎖長ヌクレオチド配列を示す図で
ある。
【図３】図２の続きである。
【図４】ＣＯＳアッセイにおける、物質Ｐ（ＳＰ）に対
するヒトニューロキノン−１レセプター長形（ＮＫ１
Ｒ）と短形（ＮＫ１ＲｓＦ）との結合親和性を示すグラ
フである。
するヒトニューロキノン−１レセプター長形（ＮＫ１
Ｒ）と短形（ＮＫ１ＲｓＦ）との結合親和性を示すグラ
フである。
【図５】ニューロキニン−１レセプター短形および長形
によるホスホリパーゼＣの活性化をしめすグラフであ
る。
によるホスホリパーゼＣの活性化をしめすグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ 9453−4Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＥ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ツン ミン フォング アメリカ合衆国，08873 ニュージャーシ ィ，ソマーセット，ボルトン コート 38 (56)参考文献 ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯ ＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｖ ＯＬ．264，ＮＯ．30，Ｐ．17649−17652 ＳＣＩＥＮＣＥ，ＶＯＬ．247，Ｐ．958 −962
Claims (7)
- 【請求項１】 下記アミノ酸配列（配列番号２６）を有
するヒトニューロキニン−１−レセプター短形タンパク
質。 【化１】 【化２】 - 【請求項２】 下記核酸配列（配列番号２８）を有し、
ヒトニューロキニン−１−レセプター短形をコードする
ＤＮＡ分子またはその対応縮重変異体。 【化３】 - 【請求項３】 下記核酸配列（配列番号２７）配列を有
し、ヒトニューロキニン−１−レセプター短形をコード
するＤＮＡ分子またはその対応縮重変異体。 【化４】 【化５】 - 【請求項４】 （ａ）哺乳動物用発現ベクター、および （ｂ）ヒトニューロキニン−１−レセプター短形をコー
ドするＤＮＡ（配列番号２８）または対応する縮重変異
体ＤＮＡ、 からなるプラスミド。 - 【請求項５】（ａ）ベクターｐＲｃＣＭＶ、および （ｂ）ヒトニューロキニン−１−レセプター短形をコー
ドするＤＮＡ（配列番号２８）または対応する縮重変異
体ＤＮＡ、 からなるプラスミド。 - 【請求項６】 請求項４記載のプラスミドを移植された
チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯ）を用いる
方法であって、 （１）ＣＨＯ細胞でヒトニューロキニン−１−レセプタ
ー短形を発現させる； （２）125Ｉ−サブスタンスＰ（サブスタンスＰ）及び
ＣＨＯ細胞が入った溶液に試験サンプルを加える； （３）工程（２）の産物をインキュベートし、そのイン
キュベートによりヒトニューロキニン−１レセプター短
形の125Ｉ−サブスタンスＰおよび試験サンプルの競合
的結合を起こさせる； （４）ヒトニューロキニン−１レセプター短形に結合し
た125Ｉ−サブスタンスＰを結合していない125Ｉ−サブ
スタンスＰから分離する； （５）ヒトニューロキニン−１レセプター短形に結合し
た125Ｉ−サブスタンスＰの量を測定する； ことからなる方法。 - 【請求項７】 請求項４記載のプラスミドを移植された
チャイニーズハムスター卵巣細胞系（ＣＨＯ）を用いる
方法であって125Ｉ−サブスタンスＰの量を測定する方
法であって、 （１）ＣＨＯ細胞でヒトニューロキニン−１レセプター
短形を発現させる； （２）工程（１）の産物を3Ｈ−ミオイノシトールで平
衡化する； （３）工程（２）の産物を洗浄する； （４）水性ＬｉＣｌ存在下で工程（３）の産物を試験サ
ンプルとともにインキュベートし、3Ｈ−イノシトール
モノホスフェートを産生させる； （５）3Ｈ−イノシトールモノホスフェートを測定す
る； ことからなる方法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US70193791A | 1991-05-17 | 1991-05-17 | |
| US70193091A | 1991-05-17 | 1991-05-17 | |
| US07/701,935 US5336595A (en) | 1991-05-17 | 1991-05-17 | Method of using human neurokinin-1 receptor short form |
| US701935 | 1991-05-17 | ||
| US701930 | 1991-05-17 | ||
| US701937 | 1991-05-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05262797A JPH05262797A (ja) | 1993-10-12 |
| JPH0780911B2 true JPH0780911B2 (ja) | 1995-08-30 |
Family
ID=27418734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4124922A Expired - Lifetime JPH0780911B2 (ja) | 1991-05-17 | 1992-05-18 | 新規ヒトニューロキニン−１レセプター短形 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0514207A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0780911B2 (ja) |
| CA (1) | CA2068372A1 (ja) |
-
1992
- 1992-05-11 CA CA002068372A patent/CA2068372A1/en not_active Abandoned
- 1992-05-15 EP EP19920304432 patent/EP0514207A3/en not_active Withdrawn
- 1992-05-18 JP JP4124922A patent/JPH0780911B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＳＣＩＥＮＣＥ，ＶＯＬ．２４７，Ｐ．９５８−９６２ |
| ＴＨＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，ＶＯＬ．２６４，ＮＯ．３０，Ｐ．１７６４９−１７６５２ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0514207A2 (en) | 1992-11-19 |
| CA2068372A1 (en) | 1992-11-18 |
| JPH05262797A (ja) | 1993-10-12 |
| EP0514207A3 (en) | 1993-07-14 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 19960313 |