JPH08507441A - ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体組成物およびそれらの使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のαおよびβサブユニットをコードする核酸，前記核酸を含有する哺乳類および両生類細胞，αおよびβサブユニットを製造する方法，ならびに組換え（すなわち，単離されたまたは実質的に純粋な）α（とくにα₄およびα₇）およびβサブユニット（とくにβ₄）が提供される．さらに，サブユニットの組合せ（すなわち，α₁，α₂，α₃，α₄および／またはα₇サブユニットとβ₄サブユニットの組合せ；β₂，β₃および／またはβ₄サブユニットとα₄および/またはα₇サブユニットの組合せ）が提供される．

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体組成物 およびそれらの使用方法 本発明はヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体タンパク質サブユニ ットをコードする核酸，ならびにそれらのタンパク質自体に関する．とくにヒト 神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体αサブユニットをコードする核酸， αサブユニットタンパク質，βサブユニットをコードする核酸，βサブユニット タンパク質，およびそれらの複合体が提供される． 発明の背景 リガンド依存性イオンチャンネルは中枢神経系の細胞間における連絡の手段を提 供する．これらのチャンネルは，ある細胞によって放出されるシグナル（たとえ ば神経伝達物質と呼ばれる化学物質）を，標的細胞の膜に沿って伝導する電気シ グナルに変換する．中枢および末梢神経系には様々な神経伝達物質および神経伝 達物質受容体が存在する．神経筋および神経細胞起源のニコチン性アセチルコリ ン受容体（NAChR）を含む５種類のリガンド依存性受容体ファミリーが同定され ている〔Stroudら（１９９０）Biochemistry ２９：１１００９−１１０２３〕 ．しかしながら，多様な受容体が神経系の異なる領域において神経伝達物質また は他の調節リガンドに対して異なる応答を発生する様式についてはほとんど理解 されていない． ニコチン性アセチルコリン受容体（NAChR）は，神経筋および神経細胞起源の 多重サブユニットタンパク質である．これらの受容体は，神経伝達物質アセチル コリン（ACh）との相互作用によって神経と筋の間および神経細胞間のシナプス 伝達を仲介するリガンド依存性イオンチャンネルを形成する．ニコチン性アセチ ルコリン受容体（NAChR）には様々なサブユニットが存在するので様々なNAChR組 成物（すなわち，サブユニットの複合体）が存在する．異なるNAChR組成物は各 種リガンドに対して異なる特異性を発揮し，したがって，薬理学的に区別される ．すなわち，脊椎動物の交感神経節における脊椎動物神経筋接合部および脊椎動 物中 枢神経系に発現されるニコチン性アセチルコリン受容体は，様々なNAChR組成物 に結合する各種リガンドの作用に基づいて識別されている．たとえば，神経筋接 合部におけるニコチン性アセチルコリン受容体の活性化を遮断するコブラのα− ニューロトキシンは異なる神経細胞に由来する数種の細胞系で発現される一部の 神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体の活性化は遮断しない． 筋のNAChRは，化学量論的にα₂β（γまたはε）δの割合の５つのサブユニッ トから構成される糖タンパク質である．これらのサブユニットは，それぞれ約５ ０〜６０キロダルトン（kd）の質量を有し，異なる遺伝子によってコードされて いる．α₂β（γまたはε）δ複合体は，２個のリガンド結合部位と１個のリガ ンド依存性膜貫通チャンネルを含む機能性受容体を形成する．コリン作動性アゴ ニストと相互作用すると，筋ニコチン性AChRはナトリウムイオンを伝導する．ナ トリウムイオンの流入は形質膜を横切って維持されている正常イオン勾配を急速 に短絡させ，膜は脱分極される．膜を横切る電位差が低下することによって化学 シグナルは電気シグナルに変換され，これが神経筋接合部において筋収縮を指示 する． 機能性の筋ニコチン性アセチルコリン受容体はこれまで，αβδγサブユニッ ト，αβγサブユニット，αβδサブユニット，αδγサブユニットまたはαδ サブユニットにより形成されていて，１つのサブユニットのみで形成された受容 体は知られていない〔Kurosakiら（１９８７）FEBS Lett.２１４：２５３−２５ ８；Camachoら（１９９３）J.Neuroscience１３：６０５−６１３〕．これに反 し，機能性の神経細胞性AChR（nAChR）は，αサブユニット単独またはαおよび βサブユニットの組合せから形成させることができる．大きい方のαサブユニッ トは一般にACh結合サブユニットと考えられ，低分子量のβサブユニットはAChを 結合する能力をもたないことが明確に証明されているわけではないが，一般に構 造サブユニットであると考えられている．機能性イオンチャンネルの形成に関与 するそれぞれのサブユニットは，それらが生成したチャンネルの構造に寄与する 限り，それらのACh結合能力（またはその欠如）とは無関係に「構造」サブユニ ットである．同じくリガンド依存性イオンチャンネルである神経細胞性AChR（nA ChR）は自律神経系の神経節および中枢神経系において（ここでそれらはシグ ナル伝達を仲介する），後シナプス部位（ここでそれらは伝達を調節する）なら びに前および外シナプス部位（ここではさらに別の機能をもつと思われる）に発 現する． NAChRをコードする核酸はいくつかの起源から単離されている．これらの研究 から得られた情報に基づき，筋，自律神経神経節および中枢神経系において発現 されるNAChRは機能的に異なることが少し前に明らかにされている．この機能的 多様性の少なくとも一部は存在する多数の異なるNAChRサブユニットによるもの と考えられる．しかしながら，とくに神経細胞においてどのようにして（あるい はどの）NAChRサブユニットが結合してユニークなNAChRサブタイプが生成するの かについては不完全な理解しかない．実際，ある種のNAChRサブタイプのみがア ルツハイマー病のような疾患に関与していることが証明されている．しかし同種 の組織または細胞型からのNAChRが種を越えて同じかどうかも明らかではない． したがって，ヒト神経細胞性NAChRサブユニットそれぞれをコードする核酸， このようなサブユニットを含む組換え細胞およびそれらから調製される受容体の 単離および特徴の解明の必要がある．ヒト神経細胞性AChRの機能を検討し，疾患 特異的な薬理活性物質を得るためにはまた単離された（好ましくは精製された） ヒト神経細胞性ニコチン性AChRおよび単離された（好ましくは精製された）ヒト 神経細胞性ニコチン性AChRサブユニットを得る必要がある．さらに，このような 薬理活性物質を同定するためのアッセイの開発も必要である． このような核酸，細胞，受容体サブユニットまた受容体組成物の利用が可能に なれば，非ヒトnNAChRデータまたはヒトもしくは非ヒト筋もしくは神経節NAChR データから導かれる予測に基づくヒトnNAChRの構造および機能に関する推論の不 確かさが排除されることになる． したがって，本発明の目的は，ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容 体のサブユニットをコードする核酸を単離し，その特徴を明らかにすることにあ る．本発明の目的はまた，ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体サブ ユニットの組換え製造方法を提供することにある．さらに本発明の目的は，精製 された受容体サブユニットを提供すること，およびヒト神経細胞性AChRの活性を 修飾する化合物を同定するために化合物をスクリーニングする方法を提供するこ とにある． これらの目的および他の目的は，明細書および請求の範囲をさらに検討すれば 本技術分野の熟練者には明白であろう． 発明の簡単な説明 本発明によれば，神経細胞性NAChRの，新規なヒトαおよびβサブユニットを コードする単離された核酸が提供される．とくに，神経細胞性NAChRのヒトα₄， α₇およびβ₄サブユニットをコードする単離されたDNAが提供される．メッセン ジャーRNAおよび上述の核酸によりコードされるポリペプチドも提供される． さらに本発明によれば，α₄，α₇およびβ₄サブユニットを含む組換えヒト神 経細胞性ニコチン性AChRサブユニット，ならびにそれらの製造方法が提供される ．さらに，少なくとも１種のヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユニットを含有 する組換えヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体，ならびにそれらの 製造方法が提供される．さらに，宿主細胞によってコードされる１種または２種 以上のNAChRサブユニットおよび異種DNAまたはRNA（すなわち，宿主細胞中に導 入された，本明細書に記載のDNAまたはRNA）によってコードされる１種または２ 種以上のnNAChRサブユニットの混合物を含有する組換え神経細胞性ニコチン性AC hR，ならびにそれらの製造方法が提供される． 上述のサブユニットをコードするDNAを含有するプラスミドも提供される．上 述のDNA，mRNAまたはプラスミドを含有する組換え細胞も本発明によって提供さ れる．このような細胞はたとえば，DNAの複製，ヒトNAChRサブユニットおよび組 換え受容体の製造，ならびに１種または２種以上のヒトサブユニットを含む受容 体を発現する細胞の製造に有用である． 本発明はまた，機能性のニコチン性アセチルコリン受容体を発現する細胞を同 定する方法を提供する．NAChRの活性を修飾する化合物を同定する方法も提供さ れる． 本発明によって提供されるDNA，mRNA，ベクター，受容体サブユニット，受容 体サブユニット複合体および細胞は，選ばれた神経細胞性ニコチン性AChRサブユ ニットおよびそれらの特定の複合体，ならびにその受容体サブユニットに対する 抗体の製造を可能にする．これは，その存在が単一のNAChRサブユニットの解析 を妨害する多くの他の受容体タンパク質を実質的に夾雑しない合成または組換え 受容体および受容体サブユニットの調製手段を提供するものである．所望の受容 体サブユニットが利用できれば，特定の受容体サブタイプに対する薬物の効果の 観察，したがってヒトに特異的なまたヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブタイプ に特異的な試験システムにおける薬物の初期のインビトロスクリーニングの実施 が可能になる． サブユニット特異的抗体が利用できれば，各種サブユニットの（たとえば正常 および疾患脳組織における）分布および発現密度をモニターする免疫組織化学的 技術の適用が可能になる．このような抗体があれば，診断的および治療的適用に 使用することもできる． 特定の受容体組成物に対する薬物の作用を測定するためにインビトロで薬物を スクリーニングできれば，受容体サブタイプ特異的なまたは疾患特異的な薬物の 開発およびスクリーニングが可能になる．また，単一の受容体サブユニットまた は特定の受容体サブユニット組成物を様々な潜在的アゴニストまたはアンタゴニ ストで試験することにより，個々のサブユニットの機能および活性に関する付加 的情報が得られ，１種または２種以上の受容体サブタイプと極めて特異的に相互 作用できる化合物の同定および設計が可能になる．得られた薬物は，様々なサブ タイプを発現する細胞でのスクリーニングによって同定された薬物よりも望まし くない副作用は少ない筈である． さらに，様々な疾患状態の薬物の開発および治療的処置の関連において，ヒト nNAChRサブユニットをコードする核酸が利用できれば，ある種の疾患状態の出現 に関係するこのような遺伝子の変化（たとえば突然変異）の同定が可能になる． さらに，このような変異を合成ＤＮＡ配列に特異的に導入し，ついでこれを実験 動物またはインビトロアッセイ系に導入してそれらの効果を測定することができ るようにした疾患状態の動物モデルの作成が可能になる． 図面の簡単な説明 図１は２つのpCMVプロモーターベースのベクター，pCMV−Ｔ７−２およびpCMV −Ｔ７−３の制限地図を提示する． 発明の詳細な説明 本発明において，本発明者らは，神経細胞性NAChRの新規なヒトαおよびβサ ブユニットをコードする核酸を単離し，その特徴を明らかにした．本明細書には とくに，神経細胞性NAChRのヒトα₄，α₇およびβ₄サブユニットをコードする単 離されたDNAについて記載される．組換えメッセンジャーRNA（mRNA）および上述 の核酸によってコードされる組換えポリペプチドも提供される． 本明細書において用いられる，DNA，RNA，ポリペプチドまたはタンパク質の修 飾語としての単離された（または，実質的に純粋な）の語は，そのように指摘さ れたDNA，RNA，ポリペプチドまたはタンパク質がそれらのインビボにおける細胞 性環境から人工的努力によって分離されたことを意味する．したがって，本明細 書で用いられる，単離された（または，実質的に純粋な）DNAの語は本技術分野 の熟練者によって使用される標準技術に従って精製されたDNAを意味する〔たと えばManiatisら（１９８２） Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold S pring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY参照〕． 同様に，本明細書に用いられる，DNA，RNA，ポリペプチドまたはタンパク質の 修飾語としての「組換え」の語は，そのように指摘されたDNA，RNA，ポリペプチ ドまたはタンパク質が人工的努力によって，たとえばクローニング，組換え発現 等によって調製されたことを意味する．したがって，本明細書で用いられる組換 えタンパク質の語はたとえば，人工的努力により，宿主に添加された核酸のその 組換え宿主による発現で産生されたタンパク質を意味する． 本明細書で用いられるヒトαサブユニット遺伝子とは，ヒト神経細胞性ニコチ ン性アセチルコリン受容体のαサブユニットをコードする遺伝子である．αサブ ユニットはAChが結合するNAChRのサブユニットである．Denerisら〔Tips（１９ ９１）１２：３４−４０〕によれば推定nNAChRサブユニットに「α」の名が割当 てられたのは，そのサブユニットの推定細胞外ドメイン中における電気魚αサブ ユニット〔Nodaら（１９８２）Nature２９９：７９３−７９７参照〕のシステイ ン１９２および１９３と同種の隣接システイン残基の保存に基づくものである． 本明細書で用いられるαサブユニットは，本明細書に開示されたnNAChRのαサブ ユニットをコードする核酸（または寄託クローン）の少なくとも一つに高い緊縮 条件下にハイブリダイズする核酸によってコードされるヒトnNAChRサブユニット を意味する．αサブユニットはまた，生理学的条件および生理学的濃度で，βサ ブユニットの任意の存在下に（すなわち一部のαサブユニットは単独で機能する が，他はβサブユニットの存在を必要とする）AChに結合し，一般的には，本明 細書に記載の方法または本技術分野の熟練者に知られた方法で評価して機能性の AChRを形成する． また上に定義したαサブユニットをコードするが，遺伝子コードの縮重によっ て，特定のハイブリダイゼーション条件では開示された核酸または寄託されたク ローンに必ずしもハイブリダイズしない核酸によってコードされるαサブユニッ トも意図される．このようなサブユニットも，一般的には１種または２種以上の βサブユニットとともに，本明細書に記載の方法または本技術分野の熟練者に知 られた方法で評価して機能性の受容体の形成に参画する．通常，αサブユニット が別のスプライシングから生じるRNAによってコードされたαサブユニット（す なわちスプライス変異体）ではない限り，αをコードする核酸とそれによりコー ドされるαサブユニットは，ここに開示もしくは寄託されたαサブユニット核酸 （およびそれによってコードされたタンパク質）の少なくとも一つと，実質的な 配列ホモロジーを有する．スプライス変異体をコードするDNAまたはRNAは本発明 で提供されたDNAまたはRNAとの全体的なホモロジーは９０％未満であってもよい が，ここに記載されたDNAフラグメントまたは寄託されたクローンとほぼ１００ ％のホモロジーを示す領域を包含し，開始および終止コドンを含み機能性αサブ ユニットをコードするオープンリーディングフレームをコードするものである． 本明細書で用いられるスプライス変異体の語はゲノムDNAの一次転写体の差別 的プロセッシングによって生じる変異NAChRサブユニットをコードする核酸を意 味し，これにより２以上のタイプのmRNAの産生が起こる．差別的プロセッシング を受けたゲノムDNAに由来するcDNAは，アミノ酸が完全に同一な領域と異なるア ミノ酸配列を有する領域とをもつNAChRサブユニットをコードすることになる． すなわち，同じゲノム配列が多重の類似したmRNAおよびタンパク質の産生を導く ことができる．得られたmRNAおよびタンパク質の両者を本明細書では「スプライ ス変異体」と呼ぶ． 本明細書で用いられるハイブリダイゼーションの緊縮度の語はポリ核酸ハイブ リドが安定な条件を意味する．本技術分野の熟練者には既知のように，ハイブリ ドの安定性はそのハイブリドの融点（Ｔ_m）に反映される．Ｔ_mは次式， 81.5℃−16.6（log₁₀〔Na⁺〕）＋0.41（％Ｇ＋Ｃ）−600／l で近似できる．式中，ｌはヌクレオチド中のハイブリドの長さである．Ｔ_mは配 列ホモロジーが１％低下する毎に約１〜１．５℃ずつ低下する．一般に，ハイブ リドの安定性はナトリウムイオン濃度および温度の関数である．通常，ハイブリ ダイゼーション反応は低い緊縮条件下に行われ，ついで異なるより高い緊縮度で 洗浄される．ハイブリダイゼーションの緊縮度の値はこのような洗浄条件に関係 する．すなわち，ここでは以下のように使用される． （１）高い緊縮度は，０．０１８Ｍ NaCl中６５℃で安定なハイブリドを形成 する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する（すな わち，ハイブリドが０．０１８Ｍ NaCl中６５℃で不安定であれば，それはここ で意図されたような高い緊縮条件下に安定ではないことになる）．高い緊縮条件 はたとえば，５０％ホルムアミド，５×デンハルト溶液，５×SSPE，０．２％SD S中４２℃でのハイブリダイゼーション，ついで０．１×SSPEおよび０．１％SDS 中６５℃での洗浄によって提供できる． （２）中等度の緊縮度は50％ホルムアミド，５×デンハルト溶液，５×SSPE， ０．２％SDS中４２℃でのハイブリダイゼーション，ついで０．２×SSPE，０． ２％SDS中６５℃での洗浄と同等の条件を意味する． （３）低い緊縮度は１０％ホルムアミド，５×デンハルト溶液，６×SSPE，０ ．２％SDS中でのハイブリダイゼーション，ついで１×SSPE，０．２％SDS中５０ ℃での洗浄と同等の条件を意味する． これらの条件は各種の緩衝液および温度を用いて再現することが可能であり， また必ずしも正確である必要はないものである． デンハルト溶液およびSSPE（たとえば，Sambrook，Fritsch & Maniatis，in：Molecular Cloning，A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Pr ess，１９８９参照）は他の適当なハイブリダイゼーション緩衝液と同様に，本 技術分野の熟練者にはよく知られている．たとえば，SSPEは，pH７．４のリン酸 緩衝０．１８Ｍ NaClである．SSPEはたとえば，１７５．３ｇのNaCl，２７．６ ｇのNaH₂PO₄および７．４ｇのEDTAを８００mlの水に溶解し，pHを７．４に調整 しついで水を加えて１Ｌとした２０×保存溶液として調製することが可能である ．デンハルト溶液〔Denhardt（１９６６）Biochem.Biophys.Commun．２３：６４ １参照〕は，たとえば，５ｇのFicoll（４００型，Pharmacia LKB Biotechnolog y,INC.，Piscataway NJ），５ｇのポリビニルピロリドン，５ｇのウシ血清アル ブミン（分画Ｖ；Sigma，St.Louis MO）を混合し，水で５００mlとし，ろ過して 粒状物質を除去することにより５０×保存溶液として調製できる． 本明細書で用いられる「実質的な配列ホモロジー」の句は，本明細書に開示さ れた実際の配列からわずかな重要ではない配列変動しかないDNAのヌクレオチド 配列，RNAのリボヌクレオチド配列，またはタンパク質のアミノ酸配列を意味す る．実質的な配列ホモロジーを有する種は開示された配列と均等であるとみなさ れ，添付の請求の範囲内に包含される．この場合，「わずかな重要ではない配列 変動」とは，「相同な」配列，すなわち本明細書に開示され請求されたDNA，RNA またはタンパク質と実質的なホモロジーを有する配列が本明細書に開示され請求 された配列と機能的に均等であることを意味する．機能的に均等な配列は，本明 細書に開示され請求された核酸およびアミノ酸組成物と実質的に同一の組成物を 製造するために実質的に同様に機能する．とくに，機能的に均等な核酸は本明細 書に開示されたのと同じタンパク質をコードするか，または保存的なアミノ酸変 化，たとえば非極性残基の他の非極性残基による置換または荷電残基の同じ荷電 残基による置換を有するタンパク質をコードする．これらの変化には，本技術分 野の熟練者によりタンパク質の三次構造を実質的に変化させない変化として知ら れている変化が包含される． 実際上は，実質的に同じ配列の語は，２つのタンパク質をコードするDNAまた はRNAが高い緊縮条件下にハイブリダイズし，同一のアミノ酸配列を有するか， またはそれらの構造もしくは機能を変化させない配列変化を有するタンパク質を コードすることを意味する．ここで用いられる実質的に同一のヌクレオチド配列 は少なくとも約９０％の同一性をもち，実質的に同一のアミノ酸配列は９５％を 越えるアミノ酸同一性を有する．しかしながら，スプライス変異体として生じた 上記レベルに満たないホモロジーを含むタンパク質（およびこのようなタンパク 質をコードするDNAまたはRNA）または保存的アミノ酸置換（または縮重コドンの 置換）によって修飾されたタンパク質（およびこのようなタンパク質をコードす るDNAまたはRNA）は本発明の範囲内に含む意図である． 本明細書で用いられる「α₄サブユニットDNA」の語は同一の名称の神経細胞性 ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするDNAを意味する．こ のようなDNAは多くの方法で，たとえば そのDNAは配列番号：６に掲げたアミノ酸配列をコードする，または そのDNAはATCC受入番号６９２３９号として寄託されたクローンHnAChRα４． ２によってコードされるアミノ酸配列をコードする，または そのDNAの５’ヌクレオチドは，ATCC受入番号６９１５２号として寄託された クローンHnAChRα４．１によってコードされるアミノ酸配列をコードすることに より特性づけることができる． 現時点で好ましいα₄−コードDNAは次のように，すなわち， そのDNAは配列番号：５に掲げたコード配列（好ましくはその実質的に全コー ド配列，すなわちヌクレオチド１７３−２０５６）に高い緊縮条件下にハイブリ ダイズできる，または そのDNAは，高い緊縮条件下にATCC受入番号６９２３９号として寄託されたク ローンHnAChRα４．２のα₄−コード挿入体の配列（好ましくはその実質的に全 配列）にハイブリダイズできる，または そのDNAの５’ヌクレオチドは高い緊縮条件下にATCC受入番号６９１５２号と して寄託されたクローンHnAChRα４．１のα₄−コード挿入体の配列にハイブリ ダイズできることにより特性づけることができる． とくに好ましい本発明のα₄−コードDNAは次のように，すなわち， 配列番号：５に掲げたコード領域（すなわちそのヌクレオチド１７３−２０５ ６）と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するDNA，または， ATCC受入番号６９２３９号として寄託されたクローンHnAChRα４．２のα₄− コード挿入体と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するDNA，または， ATCC受入番号６９１５２号として寄託されたクローンHnAChRα４．１のα₄− コード挿入体と実質的に同一のヌクレオチド配列を有するDNAとして特性づけら れる． 通常，α₄サブユニットがスプライス変異体として生じるのでなければ，α₄− コードDNAは本明細書に開示され請求されたα₄−DNAと実質的な（すなわち約９ ０％を越える）配列ホモロジーを有する．スプライス変異体をコードするDNAも しくはRNAはここに提供されたDNAまたはRNAと全体的配列に９０％未満のホモロ ジーをもてばよいが，このようなスプライス変異体は上述のDNAとほぼ１００％ のホモロジーの領域を含むことになる． 本明細書で用いられる「α₇サブユニットDNA」の語は同一の名称の神経細胞性 ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするDNAを意味する．こ のようなDNAは多くの方法で，たとえばそのDNAのヌクレオチドは配列番号：８に 掲げたアミノ酸配列をコードすることにより特性づけることができる．現時点で 好ましいα₇−コードDNAは配列番号：７に掲げたコード配列（好ましくはその実 質的に全コード配列，すなわち，ヌクレオチド７３−１５８１）に高い緊縮条件 下にハイブリダイズするDNAとして特性づけることができる．とくに好ましい本 発明のα₇−コードDNAは配列番号：７に掲げたコード配列（すなわち，そのヌク レオチド７３−１５８1）と実質的に同一のヌクレオチド配列をもつDNAとして特 性づけられる． 通常，α₇サブユニットがスプライス変異体として生じるのでなければ，α₇− コードDNAは本明細書に開示され請求されたα₇−DNAと実質的な（すなわち約９ ０％を越える）配列ホモロジーを共有する．スプライス変異体をコードするDNA またはRNAはここに提供されたDNAまたはRNAと全体的配列に９０％未満のホモロ ジーをもてばよいが，このようなDNAは上述のDNAとほぼ１００％のホモロジーの 領域を含むことになる． 上述のDNAから誘導されるα₇サブユニットは神経毒素であるα−ブンガロトキ シン（α−bgtx）に結合することが期待される．α₇サブユニットを含むAChRの 活性はα−bgtxとの相互作用で阻害される筈である．配列番号：８に掲げたアミ ノ酸残基２１０から２１７はα−bgtxの結合に重要な要素であると考えられる〔 たとえば，Chargeauxら（１９９２）１３：２９９−３０１参照〕． 本明細書で用いられるヒトβサブユニット遺伝子とはヒト神経細胞性ニコチン 性アセチルコリン受容体のβサブユニットをコードする遺伝子である．Deneris ら（前出）によれば推定nNAChRサブユニットに「β」の名称が割当てられたのは 隣接システイン残基（それらはαサブユニットの特徴である）の欠如に基づくも のである．βサブユニットは構造NAChRサブユニットと呼ばれることが多い（β サブユニットはACh結合性ももつことが可能であるが）．βサブユニットが適当 なαサブユニットと複合することによって機能性受容体の形成が導かれる．本明 細書で用いられるβサブユニットの語は，高い緊縮条件下において，本明細書に 開示された少なくとも一つのnNAChRコードDNA（もしくは寄託されたクローン） にハイブリダイズするDNAによってコードされるnNAChRサブユニットを意味する ．βサブユニットは適当なαサブユニットと，本明細書に記載の方法または本技 術分野の熟練者に知られた方法で評価して，機能性のNAChRを形成する． また上に定義したβサブユニットをコードするDNAによってコードされるが， 遺伝子コードの縮重により，特定のハイブリダイゼーション条件では，開示され たDNAまたは寄託されたクローンに必ずしもハイブリダイズしないβサブユニッ トも意図される．このようなサブユニットも，適当なαサブユニットと結合し， 本明細書に記載の方法または本技術分野の熟練者に知られた方法で評価して機能 性の受容体を形成する．通常，スプライス変異体として生じるRNAによりコード されたβサブユニットではない限り，βをコードするDNAとそれによりコードさ れるβサブユニットは，ここに記載されたβをコードするDNAおよびβサブユニ ットタンパク質と実質的な配列ホモロジーを共有する．スプライス変異体をコー ドするDNAまたはRNAは，ここに提供されるDNAまたはRNAとの全体的なホモロジー は９０％未満であるが，ここに記載されたDNAとほぼ１００％のホモロジーを示 す領域を包含する． 本明細書で用いられる「β₄サブユニットDNA」の語は同一名称の神経細胞性ニ コチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするDNAを意味する．この ようなDNAは多くの方法で，たとえばそのDNAのヌクレオチドが配列番号：１２に 掲げたアミノ酸配列をコードすることにより特性づけることができる．現時点で 好ましいβ₄−コードDNAは配列番号：１１に掲げたコード配列（好ましく はその実質的に全コード配列，すなわちヌクレオチド８７−１５８３）に高い緊 縮条件下にハイブリダイズするDNAとして特性づけることができる．とくに好ま しい本発明のβ₄コードDNAは配列番号：１１に掲げた配列と実質的に同一のヌク レオチド配列を有するDNAとして特性づけられる． 通常，β₄サブユニットがスプライス変異体として生じるのでなければ，β₄− コードDNAはここに記載または寄託されたβ₄−DNAと実質的な（すなわち，約９ ０％を越える）配列ホモロジーを有する．スプライス変異体をコードするDNAも しくはRNAはここに提供されたDNAもしくはRNAと全体的配列に９０％未満のホモ ロジーをもてばよいが，このようなDNAは上述のDNAとほぼ１００％のホモロジー の領域を含むことになる． ヒト神経細胞性ニコチン性AChRαおよびβサブユニットをコードするDNAは， 適当なハイブリダイゼーション条件下に適当なヒトcDNAまたはヒトゲノムライブ ラリーを，本明細書に開示されたDNA（配列番号：５，７または１１のいずれか から誘導されるヌクレオチドを含む）または本明細書に記載の寄託されたクロー ンのいずれか（たとえば，ATCC受付番号６９２３９号または６９１５２号）でス クリーニングすることによって単離できる．適当なライブラリーは神経組織サン プル，海馬組織または細胞系たとえばヒト神経芽細胞腫細胞系IMR３２（ATCC受 付番号CCL１２７号）等から調製できる．ライブラリーは好ましくはその全サブ ユニットコード配列を包含するDNAの部分でスクリーニングされ，またライブラ リーは適当なプローブでスクリーニングできる． ここで用いられるプローブは，配列番号：１，３，５，７，９もしくは１１の いずれかまたは本明細書に記載の寄託されたクローンのいずれか（たとえば，AT CC受付番号６９２３９号または６９１５２号）の中に認められる任意の１４塩基 と同一（またはそれと相補性）の少なくとも１４個の連続塩基を含むヌクレオチ ドの配列を有する一本鎖DNAまたはRNAである．プローブを構築するのに好ましい 領域には，膜貫通ドメインをコードすると推定される配列，細胞内ループをコー ドすると推定される配列，シグナル配列，アセチルコリン（ACh）およびα−ブ ンガロトキシン（α−bgtx）結合部位等がある．アミノ酸２１０−２２０は通常 ，AChおよびα−bgtxの結合に関与する．このような領域からなると推測さ れる他の好ましいプローブのための凡そのアミノ酸残基を以下の表に示す． 別法として，DNAの部分は特定のライブラリー中の選択されたフラグメントを 増幅するためにプライマーとして使用できる． ライブラリーのスクリーニング後に，ハイブリダイゼーションシグナルを検出 することによって陽性クローンが同定される．同定されたクローンは制限酵素地 図の作成および／またはDNA配列解析によって特性づけられ，ついで本明細書に 掲げられた配列または本明細書に記載された寄託クローンとの比較によりそれら が完全なαまたはβサブユニットをコードするDNAを含むか否かを確認するため に試験する．選ばれたクローンが不完全である場合には，それらを用いて重複す るクローンを得るために同一のまたは別のライブラリーを再スクリーニングする ．所望により全αまたはβサブユニットをコードする重複クローンが得られるま で，ライブラリーを陽性クローンで再スクリーニングすることができる．ライブ ラリーがcDNAライブラリーである場合には，重複クローンはオープンリーディン グフレームを包含する．ライブラリーがゲノムである場合には，重複クローンは エクソンおよびイントロンを包含する．いずれの場合も，完全クローンは本発明 によって提供されるDNAおよびコードされたタンパク質との比較によって同定で きる． 様々なヒトnNAChRαおよびβサブユニットをコードする相補性DNAクローンが 単離されている．各サブユニットは異なる遺伝子によってコードされているもの と思われる．ここに提供されたDNAクローンは，各サブユニットをコードするゲ ノムクローンの単離に，また異なる神経組織から調製されたライブラリーをスク リーニングすることによってスプライス変異体の単離に使用できる．本技術分野 においてよく知られている核酸増幅技術がヒトNAChRサブユニットのスプライス 変異体の探索に用いられる．これは，分岐配列を取囲むDNA配列に基づくオリゴ ヌクレオチドをヒトRNAまたはゲノムDNAを増幅するためのプライマーとして用い ることによって達成される．増幅生成物のサイズおよび配列決定により，スプラ イス変異体の存在を明らかにすることができる．さらに，ハイブリダイゼーショ ンによるヒトゲノムDNA配列の単離により，ヒトNAChRサブユニットをコードする 転写体の異なるスプライス変異体に相当する，イントロンで分離された多重エク ソンを含有するDNAを得ることができる． すべてのサブユニットがすべての神経組織またはすべての脳部分で発現される わけではないことが明らかにされている．すなわち，特定のサブユニットまたは このようなサブユニットのスプライス変異体を単離するためには，様々の神経細 胞または神経組織から調製されたライブラリーをスクリーニングすることが好ま しい．各サブユニットをコードするDNAを得るための好ましいライブラリーには ，ヒトのα₄およびα₅コードDNAを単離するための海馬，ヒトα₃，α₅，α₇およ びβコードDNAを単離するためのIMR３２（ヒトの神経芽細胞腫細胞，ATCC受入番 号：CCL １２７），α₂およびβ₂コードDNAを単離するための視床等が包含され る． ヒト神経細胞性ニコチン性AChRの発現の分布は，このような受容体のラットに おける分布とは異なるように思われる．たとえばラットα₄サブユニットをコー ドするRNAはラット視床に豊富であるが，ラット海馬には豊富ではない〔たとえ ば，Wadaら（１９８９）J．Comp．Neurol．２８４：３１４−３３５参照〕．し かしながらヒト視床ライブラリーからはα₄コードクローンを得ることができな かった．その代わりヒトα₄クローンは結局ヒト海馬ライブラリーから得られた ．すなわちヒトおよびラットにおけるα₄−nNAChRサブユニットの分布は全く異 なるように思われる． ラットα₃サブユニットは視床で豊富に発現され，脳幹で弱く発現されるCNS− 関連サブユニットと考えられる〔たとえば，Boulterら（１９８６）Nature３１ ９：３６８−３７４；Boulterら（１９８７）Proc．Natl.Acad.Sci.USA ８４： ７７６３−７７６７；Wadaら（１９８９）J．Comp.Neurol．２８４：３１４−３ ３５参照〕．しかしながら，ヒトニコチン性AChRα₃サブユニットをコードするD NAをクローニングする努力にもかかわらず，視床ライブラリーを含めて数種のヒ トライブラリーのスクリーニングは成功しなかった．驚くべきことに，ヒトα₃ サブユニットをコードするクローンは最終的に，ほとんど機能性ニコチン性アセ チルコリン受容体の発現はないと報告されていた脳幹ライブラリーおよびIMR細 胞から得られた〔たとえば，Gottiら（１９８６）Biochem．Biophys.Res.Commun ．１３７：１１４１−１１４７，およびClementiら（１９８６）J．Neurochem． ４７：２９１−２９７参照〕． ラットα₇サブユニット転写体は，海馬で豊富に発現されると報告されている 〔Seguelaら（１９９３）J.Neurosci．１３：５９６−６０４参照〕．ヒトα₇サ ブユニットをコードするDNAをヒト海馬ライブラリー（１×１０⁶リコンビナント ）からクローニングする努力は成功しなかった．驚くべきことに，ヒトNAChRα₇ サブユニットをコードするクローンは最終的にIMR細胞cDNAライブラリーから得 られた． 上述のヌクレオチド配列は，さらに操作するためベクター中に導入することが できる．本明細書で用いられるベクター（またはプラスミド）は異種DNAをその 発現または複製用に細胞中に導入するために使用される個別の要素を意味する． このようなビヒクルの選択および使用は本技術分野の技術レベル内にある． 本明細書で用いられる異種または外来DNAおよびRNAは互いに同義で，それが存 在する細胞のゲノムの部分として天然には存在しないDNAまたはRNAあるいはそれ が天然に存在する位置とは異なるゲノム中の位置に見出されるDNAまたはRNAを意 味する．通常，異種または外来DNAおよびRNAとは，宿主細胞に内因性ではなくそ の細胞に人工的に導入されたDNAまたはRNAを意味する．異種DNAの例にはヒト神 経細胞性ニコチン性AChRサブユニットをコードするDNA，転写，翻訳または他の 調節可能な生物学的プロセスに影響して内因性DNAの発現を仲介または変化させ るRNAまたはタンパク質をコードするDNA等が包含される．異種DNAを発現する細 胞は同一のまたは異なる発現産物をコードするDNAを含有することができる．異 種DNAは必ずしも発現される必要はなく，宿主細胞のゲノム中に挿入されていて もまたエピソームとして保持されていてもよい． 発現ベクターはDNAを発現できるベクターであり，そのDNAはこのようなDNAフ ラグメントの発現に影響できるたとえばプロモーター領域のような調節配列と操 作性に連結している．すなわち，発現ベクターは適当な宿主細胞に導入するとク ローン化された核酸の発現を生じる組換えDNAまたはRNA構築体，たとえばプラス ミド，ファージ，組換えウイルスまたは他のベクターを意味する．適当な発現ベ クターは本技術分野の熟練者にはよく知られていて，真核細胞および／または原 核細胞中で複製可能なベクターおよびエピソーム性を維持するベクターまたは宿 主ゲノム中に組み込まれるベクターを包含する．本発明のAChRサブユニットの真 核細胞とくに哺乳類動物細胞中での発現に現時点で好ましいプラスミドには， サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター含有ベクター，たとえばpCMV，pcDNA l等，ならびにMMTVプロモーター含有ベクターたとえばpMAMneo等が包含される． 本発明に用いられるプロモーター領域の語は，それが操作性に連結するDNAの 転写を制御するDNAのセグメントを意味する．プロモーター領域はRNAポリメラー ゼの認識，結合および転写開始に十分な特異的配列を包含する．プロモーター領 域のこの部分はプロモーターと呼ばれる．さらにプロモーター領域はRNAのこの 認識，結合および転写開始活性を調節する配列を包含する．これらの配列はシス に働く因子でもトランスに働く因子に応答性であってもよい．プロモーターはそ の調節の性質により，構成的でも調節的でもよい．本発明の実施に際して使用が 意図されるプロモーターの例にはSV４０初期プロモーター，サイトメガロウイル ス（CMV）プロモーター，マウス乳癌ウイルス（MMTV）ステロイド誘導性プロモ ーター，モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）プロモーター等が包含される． ここで用いられる「操作性に連結」の語は，ヌクレオチドの調節およびエフェク ター配列，たとえばプロモーター，エンハンサー，転写および翻訳停止部位，な らびに他のシグナル配列と核酸の機能的関係を意味する．たとえば，プロモータ ーへの核酸の操作性連結とは，このような核酸の転写がその核酸を特異的に認識 し，それに結合し，それを転写するRNAポリメラーゼによってプロモーターから 開始されるような核酸とプロモーターの間の物理的および機能的関係を意味する ．発現および／またはインビトロ転写を至適化するためには，余分の潜在的な別 の翻訳開始（すなわちスタート）コドンまたは転写もしくは翻訳のいずれかのレ ベルでの発現の妨害または低下を生じる他の配列を除去するため，クローンの５ ’および／または３’非翻訳部分を排除または変化させることが必要な場合があ る．別法としてコンセンサスリボソーム結合部位〔たとえば，Kozak（１９９１ ）J.Biol．Chem．２６６：１９８６７−１９８７０参照〕を開始コドンの５’直 前に挿入して発現を増強することができる．さらに，両生生物の卵母細胞中での NAChRの発現では，至適なタンパク質の産生のために，サブユニットコード配列 をアフリカツメガエルのβグロビン遺伝子５’および３’非翻訳配列で取り囲む ことが望ましい．たとえば，NAChRサブユニットコード配列は，ベクターpSP ６ ４Ｔ〔Krieg & Melton（１９８４）Nucl.Acids Res．１２：７０５７−７０７０ 参照〕，pSP ６４の改良型（Promega，Madison，WIから入手可能）中に挿入でき る．コード配列はSP６プロモーターの下流に位置するβグロビン遺伝子５’およ び３’非翻訳配列の間に挿入される．ついで得られたベクターからインビトロ転 写体を生成できる．このような修飾の所望度（または必要性）は経験的に決定す ることができる． ここに記載されたクローン化配列の発現を促進するためには，様々なプロモー ター，エンハンサー，シグナル配列等を使用できることは，本技術分野の熟練者 にはよく知られている．さらに，与えられた構築体に用いられる調節要素は同じ 起源から得る必要はないことも容易にわかる．実際に，与えられた構築体に用い られる調節要素は異なる起源から得ることが可能で，特定の発現構築体中に調節 要素の様々な組合せを結合させることができる． 本明細書で用いられる発現の語はポリ核酸をmRNAに転写し，ペプチド，ポリペ プチドまたはタンパク質に翻訳する過程を意味する．ポリ核酸がゲノムDNAに由 来するならば，発現は，適当な真核宿主細胞または生物が選択された場合，その mRNAのスプライシングを包含する． 哺乳類細胞のトランスフェクションにとくに好ましいベクターは，SV４０初期 プロモーター，マウスdhfr遺伝子，SV４０ポリアデニル化およびスプライシング 部位ならびにそのベクターを細菌中に保持するために必要な配列を含有するpSV ２dhfrベクター，サイトメガロウイルス（CMV）プロモーターベースのベクター たとえばpCDNAl（Invitrogen，San Diego，CA），およびMMTVプロモーターベー スのベクターたとえばpMAMneo（Clontech，Palo Alto，CA）ならびにそれらの修 飾ベクターである． ヒト神経細胞性NAChRサブユニットをコードする全長DNAはベクターpCMV−Ｔ７ ，すなわちCMVプロモーター／エンハンサー，プロモーターの直ぐ下流に位置す るSV４０スプライス／ドナー部位，スプライス／ドナー部位の下流にポリリンカ ー，続いてSV４０ポリアデニル化シグナルを含有するpUC １９ベースの哺乳類細 胞発現ベクター中に挿入された．NAChRサブユニットDNAはCMVプロモーターとSV ４０ポリアデニル化シグナルの間に配置すると，その構築体でトランスフェクト された哺乳類宿主細胞中での外来DNAの構成的発現が与えられる．ヒト NAChRサブユニットをコードするDNAの哺乳類細胞中での誘導可能な発現には，DN AをpMSGのようなプラスミド中に挿入することができる．このプラスミドは機能 性に連結した外来DNAのステロイド誘導性発現のためのマウス乳癌ウイルス（MMT V）プロモーターを含有する．宿主細胞が糖質コルチコイド（すなわちMMTVプロ モーターのインデューサー）の細胞中への取り込みに必要な内因性糖質コルチコ イド受容体を発現しない場合は，さらに糖質コルチコイド受容体をコードするDN A（ATCC受入番号６７２００号）で細胞をトランスフェクトする必要がある．ヒ トα₃，α₄，α₇，β₂ならびにβ₄をコードする全長ヒトDNAクローンもインビト ロ転写体の合成のために，pIBI２４（International Biotechnologies,Inc.，Ne w Haven）またはpCMV−Ｔ７−２中にサブクローニングされた． 本発明の他の実施態様によれば，上述のポリ核酸（すなわちDNAまたはmRNA） を含有する細胞が提供される．DNAを複製してnAChRサブユニットを製造するため には細菌，酵母，両生および哺乳動物細胞のような宿主細胞を使用することがで きる．本明細書に記載の発現ベクターの構築，インビトロ転写体の調製，哺乳類 細胞中へのDNAのトランスフェクション，卵母細胞の注入および受容体発現およ び機能の評価のための電気生理学的および他の解析の方法は，PCT出願PCT/US９ １／０２３１１（現在はWO９１／１５６０２として公開），PCT/US９１／０５６ ２５（現在はWO９２／０２６３９として公開），PCT/US９２／１１０９０（現在 はWO９３／１３４２３として公開），係属中のUS出願０７／５０４，４５５号， ０７／５６３，７５１号および０７／８１２，２５４号にも記載されている．こ れらの出願それぞれの主題はその全文を参照により本明細書に導入する． クローン化されたDNAの適当な発現ベクターへの導入，プラスミドベクターま たはそれぞれ１もしくは２種以上の個別の遺伝子をコードするプラスミドベクタ ーの組合せあるいは線状DNAによる真核細胞のトランスフェクション，ならびに トランスフェクトされた細胞の選択は本技術分野においてよく知られている（た とえば，Sambrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，１９８９参照）．異種DNAは本技術分野の熟 練者に知られた任意の方法，たとえば異種DNAをコードするベクターでのCaPO₄沈 殿〔たとえば，Wiglerら（１９７９）Proc.Natl.Acad.Sci.USA７６：１３７３ −１３７６参照〕またはリポフェクタミン（CIBCO BRL＃１８３２４−０１２） によるトランスフェクションによって宿主細胞導入できる．組換え細胞はついで DNAによってコードされたサブユニットが発現される条件下に培養できる．好ま しい細胞には哺乳類細胞（たとえば，HEK２９３，CHO，GH3およびLtk^-細胞）， 酵母細胞（たとえばメチロトローフ酵母細胞たとえばPichia pastoris），細菌 細胞（たとえばEscherichia coli）等が包含される．とくに好ましい細胞は内因 性または外因性電位依存性カルシウムチャンネルも発現できる細胞である（たと えば，RCT出願US９２／０６９０３，現在はWO９３／０４０８３として公開）． 本発明によって提供される核酸は，酵母細胞〔たとえば，P.pastoris（米国特 許第４，８８２，２７９号，第４，８３７，１４８号，第４，９２９，５５５号 および第４，８５５，２３１号参照），Saccharomyces cerenisiae，Candida tr opicalis，Hansenula polymorpha等〕を含めて真核細胞中において発現させるこ とができるが，本発明によって提供されるヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユ ニットをコードする核酸の発現のためには，市販品を入手できるシステムおよび 他の本技術分野の熟練者に知られているシステムを含めて哺乳類発現システムが 現時点では好ましい．DNAのRNA転写体の発現にはアフリカツメガエル卵母細胞が 好ましい． 好ましい実施態様においては，DNAをベクター中にライゲートし，ついで適当 な宿主細胞中に導入して特定のヒトnNAChR受容体サブユニットまたはサブユニッ トの特定の複合体を発現するトランスフォームされた細胞系を作成する．得られ た細胞系をついで大量に産生させて，受容体機能に対する薬物の効果の再現性あ る定量的解析に使用することができる．他の実施態様においては，各サブユニッ トをコードするDNAのインビトロ転写によりmRNAを産生させる．このmRNAはつい で，単一のサブユニットクローンからのものであれクローンの組合せからのもの であれ，アフリカツメガエル卵母細胞に注入することが可能で，ここでmRNAにヒ ト受容体サブユニットの合成を行わせると，それらが機能性受容体を形成する． 別法として，サブユニットをコードする核酸を直接卵母細胞に注入して，機能性 の受容体を発現させることのできる．トランスフェクトした哺乳類細胞または注 入を行った卵母細胞はついで，本発明によって提供される薬物のスクリーニング 方法に使用できる． ヒト神経細胞性ニコチン性AChRの任意のサブユニットをコードするクローン化 された全長DNAは，真核細胞中での発現のためにプラスミドベクター中に導入す ることができる．このDNAはゲノムDNAでもcDNAでもよい．宿主細胞は少なくとも １種のヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユニットをコードするプラスミド１種 またはその組合せを用いてトランスフェクトされる． DNAまたはRNAを導入できる真核細胞はこのようなDNAまたはRNAによってトラン スフェクト可能な細胞，あるいはこのようなDNAまたはRNAを注入できる細胞であ る．好ましい細胞は，一過性にもしくは安定にトランスフェクトが可能で，また DNAおよびRNAを発現できる細胞である．現時点で最も好ましい細胞は，異種DNA によってコードされる１種または２種以上のサブユニットからなる組換えまたは 異種ヒト神経細胞性ニコチン性AChRを形成できる細胞である．このような細胞は 経験的に同定できるし，またトランスフェクトや注入が容易であることが知られ ている細胞の中から選択できる． DNAの導入に用いられる細胞の例には哺乳類起源の細胞〔たとえば，COS細胞， マウスL細胞，チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞，ヒト胚腎臓細胞，アフ リカミドリザル細胞，GH３細胞および本技術分野の熟練者に知られている他のこ のような細胞〕，両生類細胞（たとえばアフリカツメガエル卵母細胞），酵母細 胞（たとえば，Saccharomyces cerenisiae，Pichia pastoris）等が包含される ．注入されたRNA転写体を発現できる細胞の例には，アフリカツメガエル卵母細 胞がある．DNAのトランスフェクションに好ましい細胞は本技術分野の熟練者に 知られているかまたは経験的に同定が可能であり，HEK ２９３（ATCC受入番号＃ CRL １５７３から入手可能），Ltk^-細胞（ATCC受入番号＃CCL １．３から入手可 能），COS−７細胞（ATCC受入番号＃CRL１６５１から入手可能），GH３ラット脳 下垂体腫瘍細胞（ATCC受入番号＃CCL８２，１から入手可能）およびDG４４細胞 〔dhfr^- CHO細胞，たとえばUrlaubら（１９８６）Cell.Molec.Genet．１２：５ ５５参照〕が包含される．現時点で好ましい細胞は，DG４４細胞，GU３およびHE K２９３細胞であり，懸濁液中での増殖に適合され，液体窒素中で凍結し，つい で解凍し，再増殖できるHEK細胞，がとくに好ましい．HEK ２９３細胞は， たとえば，Gormanの米国特許第５，０２４，９３９号に記載されている〔また， Stillmanら（１９８５）Mol.Cell.Biol.５：２０５１−２０６０参照〕．現時点 で好ましい細胞にはまた，内因性または異種電位依存性カルシウムチャンネルを 発現できる細胞が包含される． 核酸は，本技術分野で既知の方法を用いて，細胞に安定にまたは一過性に導入 することができる．安定にトランスフォームされた哺乳類細胞は，細胞を選択可 能なマーカー遺伝子（たとえば，チミジンキナーゼ，ジヒドロ葉酸リダクターゼ ，ネオマイシン抵抗性等の遺伝子）を含有するベクターで細胞をトランスフェク トし，トランスフェクトされた細胞を，マーカー遺伝子を発現する細胞が選択さ れる条件下に増殖させて調製できる．このような細胞を製造するには，細胞を， 異種DNAによってコードされたヒトサブユニットを含有するヒト神経細胞性ニコ チン性AChRを形成するのに十分な濃度のサブユニットをコードする核酸でトラン スフェクトする必要がある．サブユニットをコードするDNAの正確な量および割 合は経験的に決定され，特定のサブユニットの組合せ，細胞およびアッセイ条件 について至適化される．異種DNAまたはRNAによってコードされるサブユニットの みを含有する神経細胞性ニコチン性AChRを発現する組換え細胞がとくに好ましい ． 異種DNAは細胞内にエピソーム要素として保持されてもよく，また細胞の染色 体DNA中に挿入されていてもよい．得られた組換え細胞はついで，その培養また は副次培養体から培養または副次培養（哺乳類細胞の場合は継代培養）される． 組換え細胞のトランスフェクション，注入および培養の方法は本技術分野の熟練 者にはよく知られている．同様に，ヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユニット は，本技術分野の熟練者によって知られているタンパク質精製法を用いて精製す ることができる．たとえば１種または２種以上のサブユニットに特異的に結合す る抗体または他のリガンドを，サブユニットまたはサブユニットを含むヒト神経 細胞性ニコチン性AChRのアフィニティー精製に使用できる． 本発明のさらに他の実施態様によれば，上述のサブユニットタンパク質に対し て精製された抗体が提供される．このような抗体は，受容体の組織分布，サブユ ニット組成物，機能性ドメインの構造，ならびに診断的応用および治療的応用の 研究に使用することができる．治療的応用に場合には，抗体はモノクローナル抗 体であることが好ましい． 上述の抗体は，本技術分野の熟練者にはよく知られた標準技術により，本発明 のサブユニットまたはその部分を抗体産生のための抗原として用いて調製するこ とができる．抗−ペプチドおよび抗−融合タンパク質抗体の両者を使用できる〔 たとえば，Bahouthら（１９９１）Trends Pharmacol．Sci．vol．１２：３３８ −３４３；Current Protocols in Molecular Biology（Ausubelら編），John Wi ley and Sons，New York（１９８９）〕．免疫原として（合成ペプチドまたは組 換えによって製造された細菌性融合タンパク質としての）NAChRサブユニットの 部分の選択に際して考慮すべき因子には，抗原性，接近可能性（すなわち，細胞 外および細胞内ドメイン），特定のサブユニットに対する一意性等である． サブユニットに特異的な抗体が利用できれば，各種サブユニットの（たとえば 正常および疾患脳組織中の）分布および発現密度をモニターするために，免疫組 織化学的な技術の適用が可能になる．このような抗体はまた診断的および治療的 適用での利用が可能である． 本発明のさらに他の実施態様によれば，本発明の受容体に上述の抗体の有効量 を接触させることによる，その受容体のイオンチャンネル活性を調節する方法が 提供される． 本発明の抗体は，標準方法を用い，たとえば腹腔内，筋肉内，静脈内もしくは 皮下に注射し，また移植もしくは経皮投与様式等により，患者に投与することが できる．本技術分野の熟練者であれば，採用した投与様式に応じて，用量形態， 処置基準等を容易に決定できる． 本発明の一実施態様によれば，また，ヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユニ ットおよび機能性受容体を発現する細胞を製造する方法が提供される．一方法に おいては，宿主細胞は，神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体の少なくと も１種のαサブユニットおよび神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体の少 なくとも１種のβサブユニットをコードするDNAによってトランスフェクトされ る．ノーザンブロットまたはスロットブロット解析のような方法を用いて，αお よび／またはβサブユニットをコードするDNAまたはRNAを含むトランスフェク トされた細胞を選択できる．トランスフェクトされた細胞はまた，NAChRタンパ ク質を発現する細胞を確認するために解析される．解析はたとえば，細胞がアセ チルコリン，ニコチン，またはニコチンアゴニストに結合する能力を，非トラン スフェクト宿主細胞または他の適当な対照細胞のニコチン結合能力と比較しなが ら，ニコチンアゴニストに応答して細胞膜を通過する電流を電気生理学的にモニ ターすること等で測定して実施される． とくに好ましい態様においては，異種DNAを含有する真核細胞がこのDNAを発現 し，組換えの機能性神経細胞性ニコチン性AChRを形成する．さらに好ましい態様 においては，組換えの機能性神経細胞性ニコチン性AChR活性は，それが非トラン スフェクト宿主細胞にはないタイプであるか，または非トランスフェクト細胞で は認められない大きさであることから，容易に検出できる．組換え受容体を含有 するこのような細胞は，たとえばヒト神経細胞性ニコチン性AChRα₃およびβ₄サ ブユニットをコードするDNAで細胞をトランスフォームして，相当するタンパク 質を発現するように調製できる．得られた合成または組換え受容体はα₃および β₄nNAChRサブユニットのみを含有することになる．このような受容体は様々な 適用，たとえば非ヒト受容体またはヒト組織プレパレーションを用いた従来技術 のアッセイシステム中に存在することが多い妨害を含まないアッセイシステムの 材料として有用である．さらに，単一の受容体サブユニットを様々な潜在的アゴ ニストまたはアンタゴニストで試験することによって，個々のサブユニットの機 能および活性に関して付加的な情報を得ることができよう．このような情報は， １種または２種以上の受容体サブユニットと極めて特異的に相互作用できる化合 物の同定を導くことが期待される．このような特異性は医学的に大きな価値があ るものと思われる． 他の態様においては，本発明は，本発明のDNAによってコードされる機能性ペ プチドフラグメントおよび機能性のそれらの複合体からなる．このような機能性 ペプチドフラグメントは本技術分野の熟練者によれば，繁雑な実験をすることな く，NAChRとして機能するためにそのペプチドに必須ではない配列中のアミノ酸 の一部またはすべてを除去することによって製造できる．NAChR機能に必須なア ミノ酸の決定はたとえば，そのペプチドをコードするDNAの系統的な消化および ／またはそのDNAへの欠失の導入によって行われる．修飾された（たとえば，欠 失させたまたは消化した）DNAをたとえば，そのDNAの転写，ついで得られたmRNA をmRNAの翻訳が起こるアフリカツメガエル卵母細胞に導入することによって発現 させる．このようにして卵母細胞中で発現したタンパク質の機能の解析は，その 卵母細胞を，NAChRに結合してそれを機能的に活性化することが知られているリ ガンドに暴露し，ついで卵母細胞をモニターして内因性チャンネルが続いて活性 化されるかどうかを調べることによって達成される．電流が検出されれば，その フラグメントはNAChRとして機能性である． すなわち，１種または２種以上のヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユニット をコードするDNAを，個々のサブユニットおよび機能性NAChRの発現のため，適当 な宿主細胞（たとえば真核細胞または原核細胞）に導入することができる．αお よびβサブユニットの好ましい組合せを細胞中に導入できる．このような組合せ には，α₁，α₂，α₃，α₄，α₅およびα₇の任意の１種または２種以上とβ₂ま たはβ₄との組合せが包含される．α₁についての配列情報はBiochem.Soc.Trans. （１９８９）１７；２１９−２２０に，α₅についての配列情報はProc.Natl.Aca d.Sci.USA（１９９２）８９：１５７２−１５７６に，α₂，α₃，α₄，α₇，β₂ およびβ₄の配列情報は本明細書の配列表に提供されている．現時点で好ましい サブユニットの組合せには，α₁，α₂，α₃またはα₄の１種または２種以上とβ₄ ，またはα₂，α₃またはα₄とβ₂またはβ₄のいずれかとの組合せが包含される ．一部のサブユニットはさらに付加的なサブユニットがなくてもイオン輸送機能 を発揮できる．たとえばα₇サブユニットはβサブユニットが添加されなくても 機能できる． 本明細書で用いられる「α₂サブユニットDNA」の語は，同じ名称のヒト神経細 胞性ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードするDNAを意味し， 高い緊縮条件下に配列番号：１のDNAに，またはATCC受入番号６８２７７号とし て寄託されたクローンのDNAに，または配列番号：２に掲げたアミノ酸配列をコ ードするDNAにハイブリダイズするDNAである．通常，α₂サブユニットがスプラ イス変異体として生じるのでなければ，α₂DNAは本明細書に記載したα₂DNAと実 質的な（すなわち約９０％を越える）配列ホモロジーを有する．スプライス変 異体をコードするDNAまたはRNAは本明細書に記載されたDNAまたはRNAと全体的配 列に９０％未満のホモロジーをもてばよいが，このようなスプライス変異体は上 述のDNAとほぼ１００％のホモロジーの領域を含むものである． 本明細書で用いられる「α₃サブユニットDNA」の語は，同じ名称の神経細胞性 サブユニットをコードするDNAを意味し，高い緊縮条件下に配列番号：３のDNAに ，またはATCC受入番号６８２７８号として寄託されたクローンのDNAに，または 配列番号：４に掲げたアミノ酸配列をコードするDNAにハイブリダイズするDNAで ある．通常，α₃サブユニットがスプライス変異体として生じるのでなければ， α₃DNAは本明細書に記載したα₃DNAと実質的な（すなわち約９０％を越える）配 列ホモロジーを有する．スプライス変異体をコードするDNAまたはRNAは本明細書 に記載されたDNAまたはRNAと全体的配列に９０％未満のホモロジーをもてばよい が，このようなスプライス変異体は上述のDNAとほぼ１００％のホモロジーの領 域を含むものである． 本明細書で用いられる「α₅サブユニットDNA」の語はたとえばChibaら（１９ ９２）Proc.Natl.Acad.Sci.USA８９：１５７２−１５７６に記載されたように， 同じ名称のヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコー ドするDNAを意味する． 本明細書で用いられる「β₂サブユニットDNA」の語は，同じ名称の神経細胞性 サブユニットをコードするDNAを意味し，高い緊縮条件下に配列番号：９のDNAに ，またはATCC受入番号６８２７９号として寄託されたクローンHnAChRβ２のDNA に，または配列番号：１０に掲げたアミノ酸配列をコードするDNAにハイブリダ イズするDNAである．通常，β₂サブユニットがスプライス変異体として生じるの でなければ，β₂DNAは本明細書に記載したβ₂DNAと実質的な（すなわち約９０％ を越える）配列ホモロジーを有する．スプライス変異体をコードするDNAまたはR NAは本明細書に記載されたDNAまたはRNAと全体的配列に９０％未満のホモロジー をもてばよいが，このようなスプライス変異体は上述のDNAとほぼ１００％のホ モロジーの領域を含むものである． ある実施態様においては，異種ヒト神経細胞性ニコチン性AChRをもつ真核細胞 が，細胞中でヒト神経細胞性ニコチン性AChRのサブユニットに翻訳される少なく とも１種のRNA転写体を含有する第一の組成物を細胞に導入することによって製 造される．好ましい実施態様においては，翻訳されるサブユニットはヒト神経細 胞性ニコチン性AChRのαサブユニットを包含する．さらに好ましくは，導入され る組成物はαサブユニットをコードするRNA転写体を含有し，さらにヒト神経細 胞性ニコチン性AChRのβサブユニットをコードするRNA転写体を含有する．RNA転 写体はヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットをコードす るDNAでトランスフェクトされた細胞から，またはサブユニットをコードするDNA のインビトロ転写によって得ることができる．クローン化されたDNAのインビト ロ転写および得られたmRNAの真核細胞への導入の方法は本技術分野においてよく 知られている．本発明によって提供されるヒトnNAChR DNAのインビトロ転写体の 発現には，両生類の卵母細胞がとくに好ましい．イオンチャンネルの研究のため のアフリカツメガエル卵母細胞の使用についての総説としてはたとえば，Dascal （１９８９）CRC Crit.Rev.Biochem．２２：３１７−３８７が参考になる． すなわち，αおよびβサブユニットをコードするDNAまたはRNAの細胞への対ご との（または段階的）導入が可能である．得られた細胞は，本明細書に提供され た方法，または機能性AChR活性の検出する本技術分野の熟練者に知られた方法に よって試験できる．このような試験は機能性AChRを生じるαおよびβサブユニッ ト対ならびに機能性AChRを生じる個々のサブユニットの同定を可能にする． 本明細書で用いられる「組換えまたは異種ヒト神経細胞性ニコチン性AChR」の 語は，受容体タンパク質を発現できる細胞中に導入され，発現された異種DNAに よってコードされる１種または２種以上のサブユニットを含有する受容体を意味 する．組換えヒト神経細胞性ニコチン性AChRはまた，宿主細胞に内因性のDNAに よって産生されるサブユニットを包含してもよい．ある実施態様においては，ヒ ト神経細胞性ニコチン性AChRは，異種DNAによってコードされるサブユニットの みを含有する． 組換え真核細胞上の組換え受容体は，ヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユニ ットをコードするDNAまたはmRNAによってコードされる１種または２種以上のサ ブユニットを含有してもよく，また宿主細胞によってコードされるサブユニット および異種DNAまたはmRNAによってコードされるサブユニットの混合物を含有し ていてもよい．組換え受容体は均一であってもまたサブタイプの混合物であって もよい．多様な種たとえばラットおよびヒトからの受容体をコードするDNAまた はmRNAの混合物を細胞中に導入することもできる．すなわち，α₃およびβ₄サブ ユニットのみを含有する組換え受容体または本明細書に与えられたαおよびβサ ブユニットの任意の他の組合せを発現する細胞を調製することができる．たとえ ば，本発明のα₄および／またはα₇サブユニットは，β₂および／またはβ₄受容 体サブユニットと共発現させることができる．同様に，本発明のβ₄サブユニッ トは，α₂，α₃，α₄，α₅および／またはα₇受容体サブユニットと共発現させ ることができる．前に述べたように，nNAChRサブユニットの一部は他のサブユニ ットがなくても機能性の受容体を形成できるので，機能性受容体の製造には常に 共発現が必要なわけではない． 本明細書で用いられるヒト神経細胞性ニコチン性AChRの活性とは，NAChRに特 徴的な任意の活性を意味する．このような活性は通常，１種または２種以上のイ ンビトロ方法によって測定することが可能で，それは多くの場合，ヒト神経細胞 性ニコチン性AChRのインビボ活性に相当する．このような活性は本技術分野の熟 練者に知られた任意の方法によって，たとえば剌激に応答して組換えチャンネル を流れる電流の量を測定することによって，測定できる． ヒト神経細胞性ニコチン性AChRの存在の決定および／または活性の測定方法に は，ニコチンの結合，⁸⁶Rbイオンの流量，Ca²⁺の流入，細胞の電気生理学的応答 ，細胞からのRNAでトランスフェクトされた卵母細胞の電気生理学的応答等を測 定するアッセイが包含される．とくに，本発明では，AChRのDNAまたはmRNAを含 有する細胞を試験化合物と接触させた場合にAChRが仲介する応答を測定または検 出する方法が提供される． 本明細書において用いられる機能性の神経細胞性ニコチン性AChRとは，本明細 書に開示されたまたは本技術分野の熟練者に知られているインビトロまたはイン ビボアッセイによって評価して神経細胞性ニコチン性AChRを示す受容体である． 本技術分野の熟練者に知られている方法および本発明によって提供された方法に よって評価できるこのような活性をもてば，受容体を機能性と呼ぶのに十分であ る．NAChRタンパク質および／または活性の検出方法には，たとえばニコチンの 結合，⁸⁶Rbイオンの流量，Ca²⁺の流入，１種もしくは２種以上の受容体サブユニ ットをコードする異種DNAまたはmRNAを含有する細胞の電気生理学的応答等を測 定するアッセイが包含される．αおよびβサブユニットのすべての組合せが機能 性受容体を形成するわけではないので，特定のサブユニットおよびそれを産生す る細胞の特性を完全に明らかにするためには，αおよびβサブユニットの多くの 組合せについて試験する必要がある．すなわち，組換えまたは異種ヒト神経細胞 性ニコチン性AChRに関して本明細書で用いられる「機能性」の語は，受容体チャ ンネルが，剌激および／または受容体に親和性を有するリガンドの結合に応答し てヒト神経細胞性ニコチン性AChR透過性イオン，たとえばNa⁺，K⁺，Ca²⁺，また はBa²⁺を提供し，その流入を調節できることを意味する．このような活性は，宿 主細胞によって産生される内因性のニコチン性AChR活性とは，たとえば電気生理 学的に，薬理学的におよび本技術分野の熟練者に知られた他の手段によって識別 できるものであることが好ましい． 本発明の特定の実施態様によれば，組換えヒト神経細胞性ニコチン性AChR発現 哺乳類細胞または卵母細胞は試験化合物と接触させ，その調節作用をついで，試 験化合物の存在下および不存在下におけるAChR仲介の応答を比較することにより または化合物の存在下に対する試験細胞または対照細胞（すなわち，nNAChRを発 現しない細胞）のAChR仲介の応答を比較することにより評価することができる． 本明細書において用いられる「神経細胞性ニコチン性AChRの活性を調節する」 化合物またはシグナルとは，その化合物またはシグナルの存在下とその化合物ま たはシグナルの不存在下でNAChRの活性が異なるようにNAChRの活性を変化させる 化合物またはシグナルを意味する．とくに，このような化合物またはシグナルに はアゴニストおよびアンタゴニストが包含される．アゴニストの語は，AChのよ うに受容体機能を活性化する物質またはシグナルを意味し，アンタゴニストの語 は受容体機能を妨害する物質を意味する．通常，アンタゴニストの作用はアゴニ ストによる活性化の遮断として観察される．アンタゴニストには競合的アンタゴ ニストと非競合的アンタゴニストがある．競合的アンタゴニスト（または競合的 遮断剤）は同一のまたは近接して位置する部位に対するアゴニスト（たとえばリ ガンドまたは神経伝達物質）の特異的な部位またはその付近と相互作用する． 非競合的アンタゴニストまたは遮断剤はアゴニストと相互作用する部位以外の部 位と相互が用して受容体の機能性を不活性化する． 本技術分野の熟練者には明らかなように，ヒト神経細胞性ニコチン性AChR活性 を調節する化合物（たとえばアゴニストおよびアンタゴニスト）を同定するため のアッセイ方法では，一般的に対照との比較が必要である．「対照」細胞または 「対照」培養液の一つのタイプは，試験化合物に暴露される細胞または培養液と 実質的に同様に処理されるが対照培養液は試験化合物には暴露されない細胞また は培養液である．たとえば，電圧固定電気生理学的操作を使用する方法では，細 胞浴の外液を単に交換するだけで同一の細胞を試験化合物の存在下および不存在 下に試験することができる．他のタイプの「対照」細胞または「対照」培養液は トランスフェクトされた細胞と同一の細胞または細胞培養液であるが，対照培養 液に用いられる細胞は機能性のヒト神経細胞性ニコチン性AChRを発現しない．こ の場合には，試験化合物に対する試験細胞の応答は，細胞または各タイプの細胞 の培養液を検定される化合物の存在下に実質的に同一の反応条件に暴露した場合 の試験化合物に対する受容体陰性（対照）細胞の応答（または応答の欠如）と比 較される． 機能性の組換えヒト神経細胞性ニコチン性AChRは，ヒト神経細胞性ニコチン性 AChRの少なくとも１種のαサブユニットまたは１種のαサブユニットと１種のβ サブユニットを包含する．これらのサブユニットを発現する真核細胞はRNA転写 体の注入およびDNAのトランスフェクションによって調製されてきた．このよう な細胞は，１種または２種以上の異種ヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユニッ トを含有するヒト神経細胞性ニコチン性AChRに起因する，ニコチン性AChR活性を 発揮した．たとえば，ヒト神経細胞性ニコチン性AChRα₃およびβ₄サブユニット をコードするDNAのインビトロ転写体を注入したアフリカツメガエル卵母細胞は ，AChRアゴニスト誘導電流を示すのに対し，α₃またはβ₄サブユニットいずれか の転写体単独を注入した細胞では誘導電流は認められなかった．さらに，ヒト神 経細胞性AChRα₃およびβ₄サブユニットをコードするDNAでコトランスフェクト したHEK２９３細胞はAChRアゴニストによって誘導される細胞内カルシウム濃度 の上昇を示すのに対し，対照HEK２９３細胞（すなわち，α₃およびβ₄ をコードするDNAでトランスフェクトしなかった細胞）ではAChRアゴニストによ って誘導される細胞内カルシウム濃度の上昇は認められなかった． 機能性の異種ヒト神経細胞性ニコチン性AChRの活性の測定に関しては，内因性 AChR活性および，所望により，内因性宿主細胞サブユニットおよび異種サブユニ ットの混合物を含有するAChRの活性は，可能であれば，化学的，薬理学的および 電気生理学的手段によって有意な程度まで阻害すべきである． 寄託 寄託されたクローンは，特許手続きのための微生物の寄託の国際的承認に関す るブタペスト条約およびこの条約に基づいて公布された規定の条件でAmerican T ype Culture Collection（ATCC），１２３０１ Parklawn Drive，Rockville，M aryland，U.S.A.２０８５２に寄託された．寄託された材料のサンプルは，上記 条約および規定によりそれらを受取る法律的資格を有する工業所有権局および他 の個人，あるいはアメリカ合衆国，ならびにこの出願もしくはこの出願の優先権 を主張した出願が提出されるかまたはこのような出願に関して付与された特許を 承認する他のすべての国もしくは国際機構の法律または規定によって入手可能で ありまたは入手可能となる．とくに，この出願またはこの出願の優先権を主張し た出願もしくはこの出願がその引例として導入された出願に基づく米国特許の発 行により，寄託された材料の利用に関するすべての制限は最終的に排除される． 例１ ヒトnNAChRサブユニットをコードするDNAの単離 Ａ．ヒトnNAChRβ₄サブユニットをコードするDNA IMR ３２ヒト神経芽細胞腫細胞系（細胞はライブラリーの構築前に１０日間１ mMのジブチルcAMP中で生育させた）から単離されたRNAからのcDNAの合成にはラ ンダムプライマーを使用した．cDNAから構築されたライブラリーをラットニコチ ン性AChRβ₄サブユニットcDNAのフラグメントでスクリーニングした．ハイブリ ダイゼーションは，５×SSPE，５×デンハルト溶液，５０％ホルムアミド，２０ ０μg/mlのニシン精子DNAおよび０．２％SDS中４２℃で実施した．洗浄は０．１ ×SSPE，０．２％SDS中６５℃で行った．プローブにハイブリダイズした５つの クローンを同定した． ５つのクローンはプラーク精製し，制限酵素地図作成およびDNA配列解析によ って性質を調べた．５つのクローン中の一つの挿入DNAがヒトニコチン性AChRの β₄サブユニットの完全コード配列を含有していた（配列番号：１１のヌクレオ チド８７−１５８３参照）．完全長クローンのヌクレオチド配列から推定された アミノ酸配列は，ラットニコチン性AChRβ₄サブユニットDNAから推定されたアミ ノ酸配列と約８２％の同一性を示す．推定されたラットおよびヒトβ₄アミノ酸 配列はいくつかの領域で著しく相違している．すなわち，アミノ酸１−２３（ヒ ト配列はラット配列に対してわずか約３６％の同一性を示す），３５２−４１６ （ヒト配列はラット配列に対してわずか約４８％の同一性を示す）および４１７ −４９２（ヒト配列はラット配列に対してわずか約７８％の同一性を示す）であ る．さらに，ラットβ₄サブユニット中のアミノ酸３７６−３７９はヒトβ₄サブ ユニットには含まれていない． Ｂ．ヒトnNAChRα₇サブユニットをコードするDNA 増幅したIMR ３２細胞のcDNAライブラリー（１×１０⁶組換え体；細胞はライ ブラリーの構築前に１０日間１mMのジブチルcAMP中で処置）をラットニコチン性 AChRα₇サブユニットcDNAのフラグメントでスクリーニングした．ハイブリダイ ゼーション条件は，IMR ３２細胞cDNAライブラリーのラットβ₄サブユニットDNA によるスクリーニングについて上述した条件と同じであった．洗浄は０．２×SS PE，０．２％SDS中６５℃で行った．標識ラットDNAプローブへのハイブリダイゼ ーションにより７個の陽性クローンが同定された．その６個のクローンをプラー ク精製し，制限酵素地図作成およびDNA配列解析により性質を調べた．１つのク ローンがヒトAChR受容体のα₇サブユニット遺伝子の完全コード配列を含有して いた（配列番号：７のヌクレオチド７３−１５８１参照）． Ｃ．ヒトnNAChRα₄サブユニットをコードするDNA ヒト海馬組織から単離されたRNAからのcDNAの合成にはランダムプライマーを 使用した．２．０kbより大きいcDNAをλgt１０ファージベクターに挿入してcDNA ライブラリーを創製した．約１Ｘ１０⁶組換え体をラットニコチン性AChRα₄サブ ユニットをコードするDNAのフラグメントでスクリーニングした．ハイブリダイ ゼーションおよび洗浄条件には，α₇サブユニットcDNAについてのIMR ３２細 胞cDNAライブラリーのスクリーニングに関して上述したのと同一の条件を使用し た．３つのクローンがプローブに強力にハイブリダイズした．これらの３つのク ローン中の２つをKEα４．１およびKEα４．２と命名し，American Type Cultur e Collection（ATCC，Rockville，MD）に寄託し，それぞれ受入番号６９１５２ 号および６９２３９号が割り当てられた． プラーク精製されたクローンの性質を調べたところ，KEα４．２がヒトニコチ ン性AChRα₄サブユニット遺伝子の完全なコード配列を含有していた（このヒト α₄サブユニットcDNAのコード配列は配列番号：５のヌクレオチド１７３−２０ ５６として与えられる）．ヒトおよびラットα₄サブユニットcDNAのコード配列 の５’末端の比較から，とくに顕著な差異は，ラット配列はヒト配列には存在し ない18ヌクレオチドのセグメントを含有することであることがわかる． Ｄ．ヒトnNAChRα₂，α₃およびβ₂サブユニットをコードするDNA ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体α₂，α₃およびβ₂サブユニ ットをコードするDNA，および／またはそれらをコードする核酸を単離するため に使用できるDNA，を含有するプラスミドはAmerican Type Culture Collection （ATCC）に寄託された．クローンの名称および寄託受入番号は次の通りである． さらに，α₂，α₃およびβ₂サブユニットの全長をコードするDNA配列はそれぞ れ，配列番号：１，３および９に掲げる． 例２ 組換えヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユニットの 発現のための構築体の製造 ヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユニットをコードする単離されたcDNAを， 哺乳類宿主細胞中でそのサブユニットを発現に使用するためおよびアフリカツメ ガエル卵母細胞中で発現させるためインビトロ転写体の生成に使用するため，ベ クター中に導入した．構築体の調製には数種の異なるベクターを以下のように利 用した． Ａ．ヒトnNAChRα₃サブユニットの発現のための構築体 ヒト神経細胞性ニコチン性AChRα₃サブユニットをpCMV−Ｔ７−２一般発現ベ クター中にサブクローニングしてpCMV−KEα₃を創製した．プラスミドpCMV−Ｔ ７−２（図１参照）はCMVプロモーター／エンハンサー，プロモーターの直ぐ下 流に位置するSV４０スプライスドナー／スプライスアクセプター部位，SV４０ス プライス部位の下流に位置するＴ７バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモ ーター，Ｔ７プロモーターの下流のSV４０ポリアデニル化シグナル，およびＴ７ プロモーターとポリアデニル化シグナルの間のポリリンカーを含有するpUC １９ −ベースのベクターである．すなわち，このベクターは哺乳類宿主細胞中での異 種DNAの発現に必要なすべての調節要素を含有し，異種DNAはこのベクター中のポ リリンカーに挿入された．Ｔ７プロモーターはポリリンカーの直ぐ上流に位置す るので，さらに，このプラスミドはこのベクター中ポリリンカーにサブクローニ ングされた異種DNAからインビトロ転写体の合成にも使用できる．図１にはまたp CMV−Ｔ７−３の制限酵素地図を示す．このプラスミドは，ポリリンカー中の制 限部位がpCMV−Ｔ７−２における順序と比較して逆の順序であるほかはpCMV−Ｔ ７−２と同一である． 配列番号：３のヌクレオチド２７−１７５７を含有する１．７kb SfiI（ブラ ント末端）／EcoRI DNAフラグメント（すなわち全α₃サブユニットコード配列＋ ５’非翻訳配列の１２ヌクレオチドおよび３’非翻訳配列の２０４ヌクレオチド ）をEcoRV／EcoRI消化pCMV−Ｔ７−２にライゲートしてpCMV−Ｋα₃を生成させ た．プラスミドpCMV−Ｋα₃は哺乳類細胞中におけるα₃サブユニットの発現およ びα₃、サブユニットDNAからインビトロ転写体の生成に使用した． Ｂ．ヒトnNAChRβ₄サブユニットの発現のための構築体 配列番号：１１のヌクレオチド１−１９１５を含有する1.9kb EcoRI DNAフラ グメント（すなわち，全β₄サブユニットコード配列＋５’非翻訳配列の86ヌク レオチドおよび３’非翻訳配列の３３２ヌクレオチド）をEcoRI消化pGEM７Zf（ ＋） （Promega，カタログ＃Ｐ２２５１；Madison，WI）にライゲートした．得られた 構築体，KEβ４．６／pGEMは，２つの縦列β₄サブユニットDNA挿入体（同一方向 性）と操作性に連結したＴ７バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター を含有し，DNAからインビトロ転写体の生成に使用した． 同じ配列番号：１１のヌクレオチド１−１９１５を含有する１．９kb EcoRI D NAフラグメントを単一の挿入体としてEcoRI消化pCMV−Ｔ７−３に挿入し，pCMV −Ｋβ₄を生成させた．プラスミドpCMV−Ｋβ₄は哺乳類細胞中におけるβ₄サブ ユニットの発現およびβ₄サブユニットDNAのインビトロ転写体の生成に使用した ． Ｃ．ヒトnNAChRα₇サブユニットの発現のための構築体 ヒト神経細胞性ニコチン性AChRα₇サブユニットの組換え発現に使用するため に，２種のpCMV−Ｔ７−ベースの構築体を調製した．第一の構築体，pCMV−KEα ７．３は配列番号：７のヌクレオチド１−１８７６を含有する１．９kb XhoI DN Aフラグメント（すなわち，全α₇サブユニットコード配列＋５’非翻訳配列の７ ２ヌクレオチドおよび３’非翻訳配列の２９５ヌクレオチド）をSalI消化pCMV− Ｔ７−３にライゲートして調製した．第二の構築体，pCMV−KEα７は，上述の１ ．９kb XhoIα₇サブユニットDNAフラグメントの５’非翻訳配列をコンセンサス リボソーム結合部位〔５’−GCCACC−３’，Kozak（１９８７）Nucl.Acids Res. １５：８１２５−８１４８〕で置換することによって調製した．得られた修飾フ ラグメントを１．８kb BglII／XhoIフラグメントとしてBglII／SalI−消化pCMV −Ｔ７−２にライゲートして，pCMV−KEα７を創製した．このようにしてpCMV− KEα７には，α₇サブユニットcDNAのコード配列の翻訳開始コドンの直前にコン センサスリボソーム結合部位が配置される． Ｄ．ヒトnNAChRβ₂サブユニットの発現のための構築体 ヒト神経細胞性ニコチン性AChRβ₂サブユニットの部分をコードするDNAフラグ メントを互いにライゲートして，プラスミドpIBI２４（International Biotechn ologies，Inc.，（IBI），New Haven，CT）中に，完全長β₂サブユニットコード 配列を生成させた．得られた構築体，Ｈβ２．１Ｆは配列番号：９のヌクレオチ ド１−２４４８（すなわち，全β₂サブユニットコード配列＋５’非翻訳 配列の２６４ヌクレオチドおよび３’非翻訳配列の６７５ヌクレオチド）をＴ７ プロモーターと操作性に連結して含有する．β₂サブユニットDNAの５’非翻訳配 列は正しい翻訳開始コドン（配列番号：９のヌクレオチド２６５−２６７）の１ １ヌクレオチド上流に始まる潜在的な別の翻訳開始コドン（ATG,配列番号：９の ヌクレオチド２５４−２５６）を含有すること，およびβ₂DNAの翻訳を開始する 上流のATG配列の使用が無効のペプチドの生成を生じる可能性があることから（ 上流のATGは正しいリーディングフレーム内にないので），さらにβ₂をコードす る構築体を次のように調製した．配列番号：９のヌクレオチド２０６−２４４８ を含有する２．２kb KpsI（ブラント末端）／EcoRI DNAフラグメントを，NotI（ ブラント末端）／EcoRI消化pCMV−Ｔ７−３にライゲートして，プラスミドのＴ ７プロモーターに操作性に連結し，pCMV−KEβ２を生成させた．pCMV−KEβ２に 含有されるβ₂サブユニットDNAは正しい翻訳開始コドンの上流の５’非翻訳配列 の５ヌクレオチドを残すのみである． ヒトNAChRβ₂サブユニットをコードするDNAはまた，発現ベクターpSP ６４Ｔ 中にも導入した．ベクターpSP ６４Ｔ〔Krieg & Melton（１９８４）,Nucl.Acid s Res.１２：７０５７−７０７０〕はベクターpSP ６４（Promega）の改良型で ある．ヒトNAChRβ₂サブユニットをコードする配列（コンセンサスリボソーム結 合部位が先行する）＋３’非翻訳領域の４０５ヌクレオチドはアフリカツメガエ ルβグロビン遺伝子からの５’および３’非翻訳配列に隣接する唯一の制限酵素 クローニング部位でpSP ６４Ｔ中に導入された．これらの配列はpSP ６４Ｔ中に 含まれるSP６プロモーターの下流に配置される．得られたベクター，pSP ６４Ｔ −KEβ２RBSIは，MEGAscript SP ６キット（Ambion，カタログ番号１３３０）を 用いて異種DNAのインビトロ転写体の製造のために，SP6転写調節領域と操作性に 連結したヒトβ₂サブユニットコード配列を含有する． Ｅ．ヒトnNAChRα₄サブユニットの発現のための構築体 ヒトnNAChRα₄サブユニットをコードする配列を含むクローンKEα４．２の挿 入体の部分（例１Ｃ参照）を以下のようにして，修飾ベクターpIBI２４に導入し た．ベクターpIBI２４はNotI部位の直ぐ上流のポリリンカー中にコンセンサスリ ボソーム結合部位を挿入して修飾した．ベクターはHindIIIおよびNcoIで消化し た．ヒトnNAChRα₄サブユニットをコードする配列を含むNcoI−HindIIIフラグメ ントは，ヒトnNAChRα₄サブユニットcDNA含有プラスミドをHindIII（これはKEα ４．２の３’非翻訳配列に対して３’側に隣接するポリリンカー中を切断する） で消化し（配列番号：５参照），ついでNcoIで部分消化して（内部のNcoI部位， すなわち配列番号：５の位置１９５６を維持するため）α₄サブユニットコードc DNAの翻訳開始コドンと５’非翻訳配列の接合部で切断して得られた．得られた ３．２５kbフラグメントを，修飾pIBI２４ベクターのHindIII−NcoIフラグメン トとライゲートして，pIBI−KEα４RBSfを創製した．したがって，pIBI−KEα４ RBSfはコンセンサスリボソーム結合部位と，その直後にヒトnNAChRα₄サブユニ ットコード配列（配列番号：５のヌクレオチド１７３−２０５６）および３’非 翻訳配列の約１４００ヌクレオチド（配列番号：５のヌクレオチド２０５７−２ ３６３）を含有する．この構築体はα₄サブユニットコード配列の上流にＴ７プ ロモーターを含有するので，α₄DNAからインビトロ転写体の生成に使用できる． 例３ 組換えヒトニコチン性AChRの卵母細胞中での発現 α₃-，α₇，β₂およびβ₄サブユニットをコードするDNAを含む構築体から調製 したインビトロ転写体をアフリカツメガエル卵母細胞に注入した．二電極電圧固 定法〔たとえば，Stuhmer（１９９２）Meth.Enzymol．２０７：３１９−３３９ 参照〕を用いて卵母細胞の膜電流を電気生理学的に測定した． １．インビトロ転写体の調製 pCMV−KEα３，pCMV−KEβ２，KEβ４．６／pGEMおよびpCMV−KEβ４の組み換 えキャッピング転写体をmCAP RNAキャッピングキット（カタログ番号＃２００３ ５０，Stratagene,Inc.，La Jolla,CA）を用いて線状化プラスミドから合成した ．pCMV−KEα７，pCMV−KEα７．３，pIBI−KEα４RBSfおよびＨβ２．１Ｆの組 換えキャッピング転写体は，線状化プラスミドから，MEGAscriptＴ７インビトロ 転写キットを用い製造業者によって提供されたキャッピング転写プロトコール（ カタログ番号＃１３３４，AMBION,Inc.，Austin,TX）に従って合成した．合成さ れた各転写体の質量はUV吸収によって測定し，各転写体の統合性はアガロースゲ ル を通した電気泳動によって測定した． ２．電気生理学 アフリカツメガエル卵母細胞に，細胞あたりヒトニコチン性AChRサブユニット １２．５，５０または１２５ngを注入した．卵母細胞の調製および注入は，Dasc al（１９８７）Crit.Rev.Biochem．２２：３１７−３８７の記載に従って実施し た．mRNAの注入後２〜６日に二電極電圧固定法を用いて卵母細胞を調べた．１μ Mのアトロピンを含有するリンゲル液（１１５mM NaCl，２．５mM KCl,１．８mM CaCl₂，１０mM HEPES，pH７．３）にｄ−ツボクラリン１００μMを加えたまたは 加えない液に細胞を浸漬した．細胞を−６０〜−８０mVで電圧固定法に付した． データは２〜５HzでAxotapeソフトウエアにより取得した．アゴニストのアセチ ルコリン（ACh），ニコチン，およびシチシンは，０．１μＭ〜１００μＭの範 囲の濃度に添加した．卵母細胞の電気生理学的解析の結果は表１にまとめた． ａ．α₃および／またはβ₄転写体を注入された卵母細胞 １２．５ngのα₃転写体または１２．５ngのβ₄転写体を注入された卵母細胞は ，１００μMまでのACh,ニコチンまたはシチシンの適用に応答しなかった．した がって，これらのサブユニットは機能性の同種因子ニコチン性AChRチャンネルは 形成しないものと思われる．これに反し，１２．５ngまたは１２５ngのα₃転写 体および１２．５ngまたは１２５ngのβ₄転写体を注入した卵母細胞は，試験濃 度（０．１〜１０μM）のACh,ニコチンおよびシチシンに応答して検知可能な内 向き電流を生じた．ニコチンおよびAChの応答に比較してシチシンの応答には速 度論的にある程度の差が観察された．これらのアゴニストの相対強度はシチシン ＞ACh＞ニコチンであり，ラットニコチン性AChRα₃およびβ₄サブユニットの転 写体を注入された卵母細胞についての類似の研究の結果と相違した〔たとえば， Luetjeら（１９９１）J．Neurosci.11：８３７−８４５参照〕． AChおよびニコチンに対する応答はd-ツボクラリンによって再現性よく遮断さ れた．たとえば，AChに対する応答の完全な遮断は100μMのd-ツボクラリンの存 在下に観察された．阻害は可逆性であった．ACh,ニコチンおよびシチシンに対す る応答はまた１００μMのメカミルアミンによって少なくとも部分的に遮断され た． α₃-β₄-注入卵母細胞の１０μM AChに対する電流応答も膜電位に換算して調 べた．これらの実験では，AChの存在下，細胞に段階的に電圧を適用した．電流 と電圧の関係のグラフにはNa⁺，K⁺-透過性チャンネルに認められる典型的な応答 が出現した．たとえば，ゼロ電流レベル（反転電位）は−４０mV未満である．総 電流に対するCa⁺⁺流量の寄与は，外液のカルシウム濃度を変化させて反転電位の 周辺での様々な保持電位において頻回に電流を測定して確認することができる． このような研究では，α₃-β₄-注入卵母細胞のACh処理に応答して発生する電流 を運ぶチャンネルはNa⁺，K⁺およびCa⁺⁺透過性である． 表１に示すように，１２５ngのα₄転写体および１２５ngのβ₄転写体を注入さ れた卵母細胞もアセチルコリンに応答して検知可能な内向き電流を生じた． ｂ．α₇サブユニットを注入された卵母細胞 例２に記載したようにして，ヒト神経細胞性ニコチン性AChRα₇サブユニット の発現に使用するために２つの構築体を調製した．プラスミドpCMV-KE α７．３ は翻訳開始コドンの上流に，５’非翻訳配列の７２ヌクレオチドとともにα₇サ ブユニットコード配列を含有する．プラスミドpCMV-KE α７は５’非翻訳配列を 欠くα₇サブユニットコード配列を含有し，さらにコード配列の直ぐ上流にコン センサスリボソーム結合部位を含む． pCMV-KE α７から合成したα₇転写体１２５ngを注入した卵母細胞は，１０〜 １００μMのAChに応答して内向きの電流を生じた．この応答は１００μMのd-ツ ボクラリンによって遮断された． pCMV-KE α７．３から合成したα₇転写体１２５ngを注入された卵母細胞は，p CMV-KE α７から合成したα₇転写体１２５ngを注入した卵母細胞の場合よりも実 質的に弱いACh−誘導電流を生じた．これらの結果は，５’非翻訳配列の代わり に，リボソーム結合部位を含有するα₇サブユニットDNAから生成したヒト神経細 胞性ニコチン性AChRα₇サブユニット転写体の方が卵母細胞におけるα₇受容体の 発現には好ましいことを示している． ｃ．α₃およびβ₂サブユニット転写体を注入された卵母細胞 例２に記載したようにして，ヒト神経細胞性ニコチン性AChRβ₂サブユニット の発現に使用するために２つの構築体を調製した．プラスミドＨ β２．１ Fは 翻訳開始コドンの上流に，５’非翻訳配列の２６６ヌクレオチドとともにβ₂サ ブユニットコード配列を含有する．プラスミドpCMV-KEβ２は翻訳開始コドンの 上流に，β₂サブユニットコード配列と５’非翻訳配列のわずか５ヌクレオチド を含有する． pCMV-KE α３およびpCMV-KE β２の転写体を注入した卵母細胞は，ニコチン性 AChRアゴニストに応答して実質的に電流は生じなかった．これに反して，pCMV-K E α３とpCMV-KE β２の転写体を注入した卵母細胞は，１００μMのAChに応答し て約２０nAの内向き電流を，３００μMのAChに応答して約８０nAの内向き電流を 生じた．電流応答は１００μMのd-ツボクラリンによって遮断された． 例４ ヒトnNAChRサブユニットの哺乳類細胞中における組換え発現 ヒト胚腎臓（HEK）２９３細胞はヒト神経細胞性ニコチン性AChRα₃およびβ₄ ， またはα₇サブユニットをコードするDNAで一過性にまた安定にトランスフェクト された．一過性のトランスフェクタントについて，様々なアッセイたとえば電気 生理学的方法，Ca²⁺-感受性蛍光指示薬ベースのアッセイおよび［¹²⁵Ｉ］-α-ブ ンガロトキシン結合アッセイを用いてニコチン性AChRの発現を解析した． １．HEK 細胞の一過性トランスフェクション ２回のトランスフェクションを実施した．一つのトランスフェクションでは， HEK細胞をα₃（プラスミドpCMV-KE α３）およびβ₄（プラスミドpCMV-KE α７ ）サブユニットをコードするDNAで一過性にコトランスフェクトした．他のトラ ンスフェクションでは，HEK細胞をα₇サブユニットをコードするDNAで一過性に コトランスフェクトした（プラスミドpCMV-KE α７）．いずれのトランスフェク ションでも約２×１０⁶HEK細胞を標準CaPO₄トランスフェクション操作〔Wigler ら（１９７９）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 76：１３７３−１３７６〕に従っ て指示されたプラスミド１８μgでトランスフェクトした．さらにCMVプロモータ ーに融合した大腸菌βガラクトシダーゼ遺伝子を含むプラスミドpCMVβgal（Clo ntech Laboratories，Palo Alto，CA）２μgをトランスフェクションの効率をモ ニターするためのレポーター遺伝子としてコトランスフェクトした．トランスフ ェクタントについてβガラクトシダーゼの活性を測定して，βガラクトシダーゼ の発現を解析した〔Miller（１９７２）Experimrent in Molecular Genetics， ３５２−３５５頁，Cold Spring Harbor Press〕．トランスフェクタントはまた ，βガラクトシダーゼとX-gal基質が関与する反応の生成物を直接染色すること によってβガラクトシダーゼの発現を解析することもできる〔Jones（１９８６ ）EMBO５：３１３３−３１４２〕． HEK細胞のpCMV-KE α3／pCMV-KE β4によるトランスフェクションの効率は標 準効率の典型であり，HEK細胞のpCMV-KE α７によるトランスフェクションの効 率は標準レベル以下であった． ２．HEK細胞の安定なトランスフェクション HEK細胞をリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いトランスフェクト した〔Current Protocols in Molecular Biology，Vol.l，Wiley Inter-Science ，Supplement 14，Unit９．１，１−９，１，９（１９９０）〕．各１〜２× １０⁶のHEK細胞を含有する１０cmプレートを，１mlのDNA／９．５μg pCMV-KE α３，９．５μg pCMV-KE β４および１μg pSVneo（選択マーカーとして）を含 むリン酸カルシウム沈殿でトランスフェクトした．１μg/mlのＧ４１８を含む培 地中で14日間増殖させるとコロニーが形成し，これらを個々にクローニングシリ ンダーを用いて単離した．単離体を限界希釈に付し，下記のようにスクリーニン グを行って最高レベルのニコチン性AChRを発現した単離体を同定した． ３．トランスフェクタントの解析 ａ．蛍光指示薬ベースのアッセイ リガンド依存性ニコチン性AChRのアゴニストによる活性化は，受容体チャンネ ルを通して，Ca⁺⁺を含む陽イオンの流入を招来する．チャンネルを通しての細胞 内へのCa++の流入は細胞内ストアに含まれるカルシウムの放出を誘導する．１価 の陽イオンのチャンネルを通しての細胞内への流入も，膜の脱分極とそれに続く 電位依存性のカルシウムチャンネルの活性化を通じて細胞質Ca⁺⁺レベルの上昇を 招く．したがって，細胞内カルシウム濃度の一過性の上昇を検出する方法が機能 性ニコチン性AChRの発現の解析に適用できる．細胞内カルシウム濃度の一つの測 定方法はカルシウム感受性蛍光指示薬に依存するものである． カルシウム感受性蛍光指示薬たとえばfluo−３（カタログ番号Ｆ１２４１，Mo lecular Probes，Inc.，Eugene，OR）は膜透過性のアセトキシメチルエステル型 として利用される．指示薬のアセトキシメチルエステル型が細胞内に入った場合 ，エステル基はシトソールエステラーゼによって除去され，この場合，遊離の指 示薬がシトソール中に捕捉される．遊離の指示薬のカルシウムとの相互作用によ り指示薬の蛍光が増大し，したがって，指示薬を含有する細胞の細胞内Ca⁺⁺濃度 は直接，蛍光の増大として表れる．ニコチン性AChRをアッセイするための自動蛍 光検出システムは，同時に譲渡された係属中の米国特許出願（PCT特許出願US９ ２／１１０９０に相当）に記載されている． α₃およびβ₄，サブユニットをコードするDNAで一過性にまたは安定にコトラ ンスフェクトされたHEK細胞について，自動蛍光指示薬ベースのアッセイを用い ，機能性組換えニコチン性AChRの発現を解析した． トタンスフェクトされていないHEK細胞（またはpCMV-Ｔ７-２でトランスフェ ク トされたHEK細胞）およびpCMV-KE α３／pCMV-KE β4とコトランスフェクトされ たHEK細胞を，９６ウエルマイクロタイター皿のウエルにプレーティングし，HB （１２５mM NaCl，５mM KCl，１．８mM CaCl_2,０．６２mM MgSO₄，６mMのグルコ ース，２０mM HEPES，pH7．4）中２０μM fluo−３，０．２％プルロン酸を含む 培地中，２０℃で２時間インキュベートしてfluo−３を負荷した．細胞をついで アッセイ緩衝液（すなわち，HES）で洗浄した．一部のウエルにはアンタゴニス ト，d-ツボクラリンを１０μM最終濃度で添加した．マイクロタイター皿をつい で蛍光プレートリーダー中に置き，ウエルに２００pMのニコチンを添加する前に ，各ウエルの基礎蛍光を測定し，記録した．ニコチンの添加後約６０秒間にわた り反復してウエルの蛍光をモニターした． トタンスフェクトされていないHEK細胞（またはpCMV-Ｔ７-２でトランスフェ クトされたHEK 細胞）の蛍光はニコチンの添加後も変化しなかった．これに反し て，コトランスフェクトした細胞の蛍光は，d-ツボクラリンの不存在下には，ウ エルへのニコチンの添加後に劇的に上昇した．ニコチンの剌激によるこの蛍光の 上昇は，アンタゴニストのd-ツボクラリンに暴露したコトランスフェクト細胞に は認められなかった．これらの結果は，コトランスフェクトされた細胞が，ニコ チンで活性化されd-ツボクラリンで遮断される機能性の組換えAChRを発現するこ とを示している． ｂ．α-ブンガロトキシン結合アッセイ pCMV-KE α７で一過性にトランスフェクトしたHEK細胞について［¹²⁵I］-α- ブンガロトキシン（BgTx）の結合を解析した．トランスフェクトされた全細胞お よびトランスフェクトされた細胞から調製された膜の両者をこれらのアッセイで 調べた．アッセイには陽性対照としてラット脳の膜も包含させた． ラットの脳の膜はHampsonら（１９８７）J．Neurochem．４９：１２０９の方 法によって調製した．膜はpCMV-KE α7でトランスフェクトしたHEK細胞から調製 し，HEK細胞はPerez-Reyesら（１９８９）Nature３４０：２３３の方法に従って プラスミドpUClのみで一過性にトランスフェクトした（陰性対照）．トランスフ ェクトした全細胞および陰性対照細胞は組織培養プレートを０．１％（w/v）BSA を含有するリン酸緩衝食塩溶液でスプレーして得られた．細胞はついで低速 で遠心分離し，１回洗浄し，アッセイ緩衝液（１１８mM NaCl，４．８mM KCl， ２．５mM CaCl₂，１．２mM MgSO₄，２０mM HEPES，０．１％（w/v）BSA，０．０ ５％（w/v）バシトラシンおよび０．５mM PMSF,pH７．５）に再懸濁してカウン トした． ラット脳の膜への［¹²⁵Ｉ］-α-BgTxの特異的結合は，いくつかの改変を加え たほかはほぼMarksら（１９８２）Molec.Pharmacol．２２：５５４−５６４の記 載に従って測定した．膜はアッセイ緩衝液中で２回洗浄した．アッセイは，１２ ×７５mmのポリエチレン試験管を用い総容量０．５mlのアッセイ緩衝液中で実施 した．膜は１０nMの［¹²⁵Ｉ］-α-BgTx（New England Nuvlear，Boston，MA）と １時間３７℃でインキュベートした．ついでアッセイ混合物を２３００×g，４ ℃で１０分間遠心分離した．上清を傾瀉し，ペレットを氷冷アッセイ緩衝液の２ mlアリコートで２回洗浄した．上清を再び傾瀉し，ペレットの放射能をγカウン ターで測定した．非特異的結合は１μMの標識α-BgTxの存在下に測定した．特異 的結合は総結合から非特異的結合を差し引いて求めた．トランスフェクトした細 胞および陰性対照細胞から調製した膜への［¹²⁵Ｉ］-α-BgTxの特異的結合はア ッセイ緩衝液がBSA，バシトラシンおよびPMSHを含有しなかったほかはラット脳 の膜への特異的結合の測定について記載したのと同様にして測定した．トランス フェクトした全細胞および陰性対照全細胞への［¹²⁵Ｉ］-α-BgTxの特異的結合 は，基本的にはラット脳の膜への特異的結合の測定の場合と同様にして測定した ．［¹²⁵Ｉ］-α-BgTxの結合は，膜濃度およびインキュベーション時間の関数と して評価された．ラット脳の膜への［¹²⁵Ｉ］-α-BgTxの結合は膜の量（２５〜 ５００μgの範囲）の増大とともに直線的に増大した．結合の全体的なシグナル 対ノイズ比（すなわち，総結合と非特異的結合の比）は３：１であった．トラン スフェクトされた細胞膜に対する［¹²⁵Ｉ］-α-BgTxの結合はある程度検出され たが，大部分が比特異的結合であり，膜の量を増加させても増大しなかった．ト ランスフェクタントおよび陰性対照細胞への［¹²⁵Ｉ］-α-BgTxの結合は同様で あると思われた． ラット脳の膜ならびにトランスフェクトされた全細胞および陰性対照全細胞へ の［¹²⁵Ｉ］-α-BgTxの結合をモニターするために，３００μgの膜または５００ , ０００個の細胞をそれぞれ１nMまたは１０nMの［¹²⁵Ｉ］-α-BgTxと，３７℃で ，０〜３５０分の様々な時間インキュベートした．アッセイ混合物のアリコート を様々な時点で１．５mlのマイクロ遠心管に移し，遠心分離した．ペレットはア ッセイ緩衝液で２回洗浄した．ラット脳の膜への［¹²⁵Ｉ］-α-BgTxの結合は時 間とともに増加し，３時間後に最大に達した．トランスフェクトされた細胞およ び陰性対照細胞への結合像は同一で，ラット脳の膜の場合とは異なっていた． 例５ nNAChRを発現する細胞系の特性 ヒト神経細胞性ニコチン性AChRをコードするDNAでのトランスフェクションに よって生成した組換え細胞系，たとえば例３の細胞系は，以下の１または２以上 の方法でさらにそれを特性づけることができた． Ａ．αおよび／またはβサブユニットをコードするメッセージの発現のノーザ ンまたはスロットブロット解析 約１×１０⁷個の細胞から全RNAを単離し，各細胞タイプからの１０〜１５μg をノーザンまたはスロットブロット解析に使用した．ヒト神経細胞性NAChR-コー ドプラスミドからの挿入体はニックトランスレーションに付し，プローブとして 使用した．さらに，βアクチン遺伝子配列〔Clevelandら（１９８０）Cell２０ ：９５−１０５〕もニックトランスレーションに付し，各ブロット上のRNAの存 在または不存在を確認するための二重フィルターにおいて，また細胞系間でαま たはβ特異的mRNAレベルにおける差の定量化に使用するラフな標準を与えるため に，対照プローブとして使用した．通常のノーザンまたはスロットブロットハイ ブリダイゼーションおよび洗浄条件は次の通りである． ハイブリダイゼーション：５×SSPE，５×デンハルト溶液，５０％ホルムアミ ド，４２℃，洗浄：０．２×SSPE，０．１％SDS,６５℃． Ｂ．ニコチン結合アッセイ ヒト神経細胞性ニコチン性AChRαまたはαおよびβサブユニットコードDNAに よるトランスフェクションで生成した細胞系について，それらのニコチン結合能 を，たとえば対照細胞系：神経細胞由来の細胞系PC１２〔Boulterら（１９８６ ），前出，ATCC＃CRL １７２１〕およびIMR３２〔Clementiら（１９８６）， Int．J．Neurochem.４７：２９１−２９７，ATCC＃CCL １２７〕，ならびに筋由 来細胞系 BC３Hl〔Patrickら（１９７７），J．Biol．Chem.２５２：２１４３ −２１５３〕と比較して解析した．陰性対照細胞（すなわち，トランスフェクタ ントを作成した宿主細胞）もアッセイに包含させた．アッセイは次のように実施 する． アッセイの直前に，トランスフェクト細胞はプレートから掻き落として採取す る．使用した陽性対照はPC１２，BC3Hl，およびIMR３２である（これらは７日間 新鮮培地で飢餓させた）．対照細胞系は３７℃のアッセイ緩衝液（５０mM Tris/ HCl，１mM MgCl₂，２mM CaCl₂，１２０mM NaCl，３mM EDTA，２mg/mlおよび０． １％アトロピンＦ，pH７．４）中３７℃でリンスして採取する．細胞は洗浄し， １×１０⁶／２５０μlに再懸濁する．各プラスチック試験管に２５０μlの細胞 溶液，１５nM ³H-ニコチンを加え，これに１mMの非標識ニコチンを加えまたは加 えないで，アッセイ緩衝液により最終容量を５００μlとする．トランスフェク トされた細胞系のアッセイでは室温で３０分間インキュベートし，陽性対照細胞 のアッセイでは１℃で，２分間インキュベートする．適当なインキュベーション 時間後に，アッセイ容量の４５０μlアリコートを，０．０５％ポリエチレンイ ミン中，４℃で２４時間インキュベートして前処置したWhatman GF/Cガラス繊維 フィルターを通してろ過する．ついでフィルターを各回４mlの氷冷アッセイ緩衝 液で２回洗浄する．洗浄後，フィルターを乾燥し，５mlのシンチレーション溶液 を含むバイアル中に取り，放射能を測定する． Ｃ． ⁸⁶Rbイオン流量アッセイ トランスフェクトされた細胞および対照細胞中への⁸⁶Rbの流入を仲介するニコ チンまたはニコチンアゴニストおよびアンタゴニストの能力は，細胞表面におけ る機能性AChRの存在の指示を提供することが見出された．⁸⁶Rbイオン流入アッセ イは次のように実施する． １．実験の前夜に，６ウエルのポリリジンコートプレート中に２×１０⁶／ウ エル（すなわち，各ウエルあたり２ml）の細胞をプレーティングする． ２．培地を傾瀉し，プレートを２mlのアッセイ緩衝液（５０mM HEPES，２６０ mスクロース，５．４mM KCl，１．８mM CaCl₂，０．８mM MgSO₄，５．５mMグル コース）により室温で洗浄する． ３．アッセイ緩衝液を傾瀉し，３μCiの⁸⁶Rbを含有するアッセイ緩衝液１mlを ５mMのウアバインおよび最大応答を生じる濃度のアゴニストまたはアンタゴニス チとともに加える． ４．プレートを氷上，１℃で，２分間インキュベートする． ５．緩衝液を廃液容器中に傾瀉して，各ウエルを３mlのアッセイ緩衝液で洗浄 し，ついで各２mlで２回洗浄する． ６．各ウエルあたり２×０．５mの０．２％SDSを加えて細胞を溶解し，５mlの シンチレーション溶液を含むシンチレーションバイアル中に移す． ７．各バイアル中に含まれる放射能を測定し，データを計算する． このアッセイで陽性対照細胞は以下のデータを与えた． Ｄ．ヒト神経細胞性ニコチン性AChRサブユニットコードDNAでトランスフェク トした哺乳類細胞の電気生理学的解析 電気生理学的測定は，組換え受容体の活性の評価，および試験化合物がリガン ド依存性の組換えAChRを介して陽イオンの流入の大きさおよび持続に強化，拮抗 または他の修飾を与える能力の評価に用いた．発現した神経細胞性AChRの機能は 様々な電気生理学的技法，たとえば二電極固定電位法およびパッチクランプ法で 評価できる．AChRに固有の陽イオン伝導チャンネルはアセチルコリン（ACh）ま たはニコチン性コリン作動性アゴニストに応答して開口し，生理的条件下には優 先的にナトリウムおよびカリウムイオンによって行われる膜透過電流を発生させ る．この電流は直接固定電位法でモニターできる．好ましい実施態様においては ，トランスフェクトされた哺乳類細胞または注入された卵母細胞において，AChR アゴニスト依存性の電流の存在が電気生理学的に解析される． 以上，本発明を，一部の好ましい実施態様について詳細に説明したが，その修 飾および改変は，記載され請求された本発明の精神および範囲に包含されるもの であることを理解すべきである． 配列の要約 配列番号：１はヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のα₂サブユ ニットをコードするヌクレオチド配列である． 配列番号：２は配列番号：１に掲げたヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリ ン受容体のα₂サブユニットをコードするヌクレオチド配列から推定されたアミ ノ酸配列である． 配列番号：３はヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のα₃サブユ ニットをコードするヌクレオチド配列である． 配列番号：４は配列番号：３に掲げたヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリ ン受容体のα₃サブユニットをコードするヌクレオチド配列から推定されたアミ ノ酸配列である． 配列番号：５はヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のα₄サブユ ニットをコードするヌクレオチド配列である． 配列番号：６は配列番号：５に掲げたヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリ ン受容体のα₄サブユニットをコードするヌクレオチド配列から推定されたアミ ノ酸配列である． 配列番号：７はヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のα₇サブユ ニットをコードするヌクレオチド配列である． 配列番号：８は配列番号：７に掲げたヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリ ン受容体のα₇サブユニットをコードするヌクレオチド配列から推定されたアミ ノ酸配列である． 配列番号：９はヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のβ₂サブユ ニットをコードするヌクレオチド配列である． 配列番号：１０は配列番号：９に掲げたヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコ リン受容体のβ₂サブユニットをコードするヌクレオチド配列から推定されたア ミノ酸配列である． 配列番号：１１はヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のβ₄サブ ユニットをコードするヌクレオチド配列である． 配列番号：１２は配列番号：１１に掲げたヒト神経細胞性ニコチン性アセチル コリン受容体のβ₄サブユニットをコードするヌクレオチド配列から推定された アミノ酸配列である． 配列表 配列番号：１ 配列の長さ：２２７７ 配列の型：核酸 鎖の数：両者 トポロジー：両者 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１６６．．１７５５ 他の情報：生成物＝α₂サブユニット 配列 配列番号：２ 配列の長さ：５２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：３ 配列の長さ：１７５７ 配列の型：核酸 鎖の数：両者 トポロジー：両者 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３９．．１５５３ 他の情報：生成物＝α₃サブユニット 配列 配列番号：４ 配列の長さ：５０４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：５ 配列の長さ：２３６３ 配列の型：核酸 鎖の数：両者 トポロジー：両者 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１７３．．２０５６ 他の情報：生成物＝α₄サブユニット 配列 配列番号：６ 配列の長さ：６２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：７ 配列の長さ：１８７６ 配列の型：核酸 鎖の数：両者 トポロジー：両者 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：７３．．１５８１ 他の情報：生成物＝α₇サブユニット 配列 配列番号：８ 配列の長さ：５０２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：９ 配列の長さ：２４４８ 配列の型：核酸 鎖の数：両者 トポロジー：両者 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：２６５．．１７７３ 他の情報：生成物＝β₂サブユニット 配列 配列番号：１０ 配列の長さ：５０２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列 配列番号：１１ 配列の長さ：１９１５ 配列の型：核酸 鎖の数：両者 トポロジー：両者 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：８７．．１５８３ 他の情報：生成物＝β₄サブユニット 配列 配列番号：１２ 配列の長さ：４９８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：不明 配列の種類：タンパク質 配列

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年３月３日 【補正内容】 請求の範囲 １．ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のα₄またはα₇サブユニ ットをコードするヌクレオチドの配列からなる単離されたDNA． ２．サブユニットはα₄サブユニットである「請求項１」のDNA． ３．DNAは，配列番号：６に掲げたアミノ酸配列もしくはクローンHnAChRα４ ．２（ATCC受入番号６９２３９）によってコードされるアミノ酸配列をコードす るか，またはDNAの５’ヌクレオチドがクローンHnAChRα４．１（ATCC受入番号 ６９１５２）によってコードされるアミノ酸配列をコードする「請求項２」のDN A. ４．DNAは，配列番号：５に掲げた実質的に全コード配列（ヌクレオチド１８ ４−２０６７）に高い緊縮条件でもしくは，クローンHnAChRα４．２（ATCC受入 番号６９２３９）のα₄コード挿入体の実質的に全配列に高い緊縮条件でハイブ リダイズするか，またはDNAの５’ヌクレオチドがクローンHnAChRα４．１（ATC C受入番号６９１５２）のα₄コード挿入体の配列に高い緊縮条件下にハイブリダ イズする「請求項２」のDNA. ５．DNAは，配列番号：５に掲げたヌクレオチド１８４−２０６７，もしくは クローンHnAChRα４．２（ATCC受入番号６９２３９）のα₄コード挿入体と実質 的に同一のヌクレオチドを有するか，またはDNAの５’ヌクレオチドがクローンH nAChRα４．１（ATCC受入番号６９１５２）のα₄コード挿入体と実質的に同一の 配列を有する「請求項２」のDNA． ６．サブユニットはα₇サブユニットである「請求項１」のDNA． ７．DNAのヌクレオチドは，配列番号：８に掲げたアミノ酸配列をコードする 「請求項６」のDNA． ８．DNAのヌクレオチドは，配列番号：７に掲げた実質的に全コード配列（ヌ クレオチド７３−１５８１）に高い緊縮条件でハイブリダイズする「請求項６」 のDNA． ９．DNAのヌクレオチドは，配列番号：７に掲げたヌクレオチド７３−１５８ １と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する「請求項６」のDNA． 10．ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のβ₄サブユニットをコ ードするヌクレオチドからなる単離されたDNA． 11．DNAのヌクレオチドは，配列番号：１２に掲げたアミノ酸配列をコードす る「請求項１０」のDNA． 12．DNAのヌクレオチドは，配列番号：１１に掲げたヌクレオチド８７からヌ クレオチド約２２７までに高い緊縮条件でハイブリダイズする「請求項１０」の DNA． 13．DNAのヌクレオチドは，配列番号：１１に掲げたヌクレオチド８７−１５ ８３の配列を有する「請求項１０」のDNA． 14．「請求項１」のDNAの少なくとも１種でトランスフォームされた細胞であ って，細菌細胞，真核細胞または両生類卵母細胞である細胞． 15．さらに，ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のβサブユニッ トをコードする少なくとも１種のDNAでトランスフォームされた「請求項１４」 の細胞． 16．さらに，電位依存性カルシウムチャンネルを発現できる特性を有する「請 求項１５」の細胞． 17．βサブユニットはβ₂またはβ₄から選択される「請求項１５」の細胞． 18．βサブユニットはβ₄サブユニットである「請求項１５」の細胞． 19．細胞は，DNAによってコードされる１種または２種以上のサブユニットを 含有する機能性の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体を発現する「請求 項１４」の細胞． 20．細胞は細菌細胞，真核細胞または両生類卵母細胞であり，「請求項１０」 のDNAの少なくとも１種でトランスフォームされた細胞． 21．さらに，ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニッ トをコードする少なくとも１種のDNAでトランスフォームされた「請求項２０」 の細胞． 22．さらに，電位依存性カルシウムチャンネルを発現できる特性を有する「請 求項２１の細胞． 23．αサブユニットは，α₁，α₂，α₃，α₄，α₅またはα₇から選択される「 請求項２１」の細胞． 24．αサブユニットは，α₄またはα₇から選択される「請求項２１」の細胞． 25．ヒトα₃およびヒトβ₄サブユニットをコードするDNAでトランスフォーム される「請求項２１」の細胞． 26．DNAによってコードされる１種または２種以上のサブユニットを含有する 機能性の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体を発現する「請求項２０」 の細胞． 27．ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体の活性を修飾する化合物 を同定する化合物のスクリーニング方法において，その方法は「請求項１５」の 試験細胞中の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体活性に対する化合物の 作用を，対照細胞に対する作用またはその化合物の不存在下における細胞の神経 細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体活性と比較して測定することからなり， この場合，対照細胞は実質的に試験細胞と同一であるが対照細胞はニコチン性ア セチルコリン受容体を発現しない方法． 28．ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体の活性を修飾する化合物 を同定する化合物のスクリーニング方法において，その方法は「請求項２１」の 試験細胞中の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体活性に対する化合物の 作用を，対照細胞に対する作用またはその化合物の不存在下における細胞の神経 細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体活性と比較して測定することからなり， この場合，対照細胞は実質的に試験細胞と同一であるが対照細胞はニコチン性ア セチルコリン受容体を発現しない方法． 29．α₄またはα₇サブユニットから選択される組換えヒト神経細胞性ニコチン 性アセチルコリン受容体サブユニット． 30．「請求項２９」の１種または２種以上のサブユニットからなる組換えヒト 神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体． 31．さらに，少なくとも１種のヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容 体βサブユニットからなる「請求項３０」のヒト神経細胞性ニコチン性アセチル コリン受容体． 32．組換えヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体β₄サブユニット ． 33．「請求項３２」のサブユニットからなる組換えヒト神経細胞性ニコチン性 アセチルコリン受容体． 34．さらに，少なくとも１種のヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容 体αサブユニットからなる「請求項３３」のヒト神経細胞性ニコチン性アセチル コリン受容体． 35．機能性の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットおよび その組合せを同定する方法において（ａ）「請求項１」の少なくとも１種のDNA, またはそれと相補性のRNA,および所望によりヒト神経細胞性ニコチン性アセチル コリン受容体の少なくとも１種のβサブユニットをコードするDNA,またはそれと 相補性のRNAを真核細胞中に導入し，（ｂ）工程（ａ）の細胞中の神経細胞性ニ コチン性アセチルコリン受容体活性を評価することからなり，この場合，活性は 上記導入DNAによってコードされる１種または２種以上のサブユニットを含有す る受容体によって仲介される方法． 36．機能性の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットおよび その組合せを同定する方法において（ａ）「請求項１０」の少なくとも１種のDN A,またはそれと相補性のRNA,およびヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受 容体の少なくとも１種のαサブユニットをコードするDNA,またはそれと相補性の RNAを真核細胞中に導入し，（ｂ）工程（ａ）の細胞中の神経細胞性ニコチン性 アセチルコリン受容体活性を評価することからなり，この場合，活性は上記導入 DNAによってコードされる１種または２種以上のサブユニットを含有する受容体 によって仲介される方法． 37．「請求項１」のDNAによってコードされる単離mRNA． 38．「請求項１０」のDNAによってコードされる単離mRNA． 39．「請求項３７」のmRNAでトランスフォームされた細胞． 40．「請求項３８」のmRNAでトランスフォームされた細胞． 41．さらにヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のβサブユニット をコードするmRNAでトランスフォームされた「請求項３９」の細胞． 42．さらにヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニット をコードするmRNAでトランスフォームされた「請求項４０」の細胞． 43．「請求項２９」のタンパク質またはその免疫原部分に対して生成された抗 体． 44．「請求項３２」のタンパク質またはその免疫原部分に対して生成された抗 体．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＴＪ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 エリス，スチーブン，ビー. アメリカ合衆国92129 カリフォルニア州 サン ディエゴ，オビエド ストリート 8939 (72)発明者 ハーポルド，マイクル，エム. アメリカ合衆国92021 カリフォルニア州 エル カジョン，クリーク ヒルズ ロー ド 15630

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のα₄またはα₇サブユニ ットをコードするヌクレオチドの配列からなる単離されたDNA． ２．サブユニットはα₄サブユニットである「請求項１」のDNA． ３．DNAは，配列番号：６に掲げたアミノ酸配列もしくはクローンHnAChRα４ ．２（ATCC受入番号６９２３９）によってコードされるアミノ酸配列をコードす るか，またはDNAの５’ヌクレオチドがクローンHnAChRα４．１（ATCC受入番号 ６９１５２）によってコードされるアミノ酸配列をコードする「請求項２」のDN A． ４．DNAは，配列番号：５に掲げた実質的に全コード配列（ヌクレオチド１７ ３−２０５６）に高い緊縮条件でもしくは，クローンHnAChRα４．２（ATCC受入 番号６９２３９）のα₄コード挿入体の実質的に全配列に高い緊縮条件でハイブ リダイズするか，またはDNAの５’ヌクレオチドがクローンHnAChRα４．１（ATC C受入番号６９１５２）のα₄コード挿入体の配列に高い緊縮条件下にハイブリダ イズする「請求項２」のDNA． ５．DNAは，配列番号：５に掲げたヌクレオチド１７３−２０５６，もしくは クローンHnAChR α４．２（ATCC受入番号６９２３９）のα₄コード挿入体と実 質的に同一のヌクレオチドを有するか，またはDNAの５’ヌクレオチドがクロー ンHnAChRα４．１（ATCC受入番号６９１５２）のα₄コード挿入体と実質的に同 一の配列を有する「請求項２」のDNA． ６．サブユニットはα₇サブユニットである「請求項１」のDNA． ７．DNAのヌクレオチドは，配列番号：８に掲げたアミノ酸配列をコードする 「請求項６」のDNA． ８．DNAのヌクレオチドは，配列番号：７に掲げた実質的に全コード配列（ヌ クレオチド７３−１５８１）に高い緊縮条件でハイブリダイズする「請求項６」 のDNA． ９．DNAのヌクレオチドは，配列番号：７に掲げたヌクレオチド７３−１５８ １と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する「請求項６」のDNA． 10．ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のβ₄サブユニットをコ ードするヌクレオチドからなる単離されたDNA． 11．DNAのヌクレオチドは，配列番号：１２に掲げたアミノ酸配列をコードす る「請求項１０」のDNA． 12．DNAのヌクレオチドは，配列番号：１１に掲げた実質的に全コード配列（ ヌクレオチド８７−１５８３）に高い緊縮条件でハイブリダイズする「請求項１ ０」のDNA． 13．DNAのヌクレオチドは，配列番号：１１に掲げたヌクレオチド８７−１５ ８３と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する「請求項１０」のDNA． 14．「請求項１」のDNAの少なくとも１種を含有する細胞であって，細菌細胞 ，真核細胞または両生類卵母細胞である細胞． 15．さらに，ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のβサブユニッ トをコードする少なくとも１種のDNAを含有する「請求項１４」の細胞． 16．さらに，電位依存性カルシウムチャンネルを発現できる特性を有する「請 求項１５」の細胞． 17．βサブユニットはβ₂またはβ₄から選択される「請求項１５」の細胞． 18．βサブユニットはβ₄サブユニットである「請求項１５」の細胞． 19．細胞は，DNAによってコードされる１種または２種以上のサブユニットを 含有する機能性の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体を発現する「請求 項１４」の細胞． 20．細胞は細菌細胞，真核細胞または両生類卵母細胞であり，「請求項１０」 のDNAの少なくとも１種を含有する細胞． 21．さらに，ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユニッ トをコードする少なくとも１種のDNAを含有する「請求項２０」の細胞． 22．さらに，電位依存性カルシウムチャンネルを発現できる特性を有する「請 求項２１」の細胞． 23．αサブュニットは，α₁，α₂，α₃，α₄，α₅またはα₇から選択される「 請求項２１」の細胞． 24．αサブユニットは，α₄またはα₇から選択される「請求項２１」の細胞． 25．ヒトα₃およびヒトβ₄サブユニットをコードするDNAを含有する「請求 項２１」の細胞． 26．DNAによってコードされる１種または２種以上のサブユニットを含有する 機能性の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体を発現する「請求項２０」 の細胞． 27．ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体の活性を修飾する化合物 を同定する化合物のスクリーニング方法において，その方法は「請求項１５」の 試験細胞中の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体活性に対する化合物の 作用を，対照細胞に対する作用またはその化合物の不存在下における細胞の神経 細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体活性と比較して測定することからなり， この場合，対照細胞は実質的に試験細胞と同一であるが対照細胞はニコチン性ア セチルコリン受容体を発現しない方法． 28．ヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体の活性を修飾する化合物 を同定する化合物のスクリーニング方法において，その方法は「請求項２１」の 試験細胞中の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体活性に対する化合物の 作用を，対照細胞に対する作用またはその化合物の不存在下における細胞の神経 細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体活性と比較して測定することからなり， この場合，対照細胞は実質的に試験細胞と同一であるが対照細胞はニコチン性ア セチルコリン受容体を発現しない方法． 29．α₄またはα₇サブユニットから選択される組換えヒト神経細胞性ニコチン 性アセチルコリン受容体サブユニット． 30．「請求項２９」の１種または２種以上のサブユニットからなる組換えヒト 神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体． 31．さらに，少なくとも１種のヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容 体βサブユニットからなる「請求項３０」のヒト神経細胞性ニコチン性アセチル コリン受容体． 32．組換えヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体β₄サブユニット ． 33．「請求項３２」のサブユニットからなる組換えヒト神経細胞性ニコチン性 アセチルコリン受容体． 34．さらに，少なくとも１種のヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容 体αサブユニットからなる「請求項３３」のヒト神経細胞性ニコチン性アセチル コリン受容体． 35．機能性の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットおよび その組合せを同定する方法において（ａ）「請求項１」の少なくとも１種のDNA ，またはそれと相補性のRNA,および所望によりヒト神経細胞性ニコチン性アセチ ルコリン受容体の少なくとも１種のβサブユニットをコードするDNA,またはそれ と相補性RNAを真核細胞中に導入し，（ｂ）工程（ａ）の細胞中の神経細胞性ニ コチン性アセチルコリン受容体活性を評価することからなり，この場合，活性は 上記導入DNAによってコードされる１種または２種以上のサブユニットを含有す る受容体によって仲介される方法． 36．機能性の神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットおよび その組合せを同定する方法において（ａ）「請求項１０」の少なくとも１種のDN A,またはそれと相補性のRNA,およびヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受 容体の少なくとも１種のαサブユニットをコードするDNA,またはそれと相補性の RNAを真核細胞中に導入し，（ｂ）工程（ａ）の細胞中の神経細胞性ニコチン性 アセチルコリン受容体活性を評価することからなり，この場合，活性は上記導入 DNAによってコードされる１種または２種以上のサブユニットを含有する受容体 によって仲介される方法． 37．「請求項１」のDNAによってコードされる単離mRNA． 38．「請求項１０」のDNAによってコードされる単離mRNA． 39．「請求項３７」のmRNAを含有する細胞． 40．「請求項３８」のmRNAを含有する細胞． 41．細胞はさらにヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のβサブユ ニットをコードするmRNAを含有する「請求項３９」の細胞． 42．細胞はさらにヒト神経細胞性ニコチン性アセチルコリン受容体のαサブユ ニットをコードするmRNAを含有する「請求項４０」の細胞． 43．「請求項２９」のタンパク質またはその免疫原部分に対して生成された抗 体． 44．「請求項３２」のタンパク質またはその免疫原部分に対して生成された抗 体．